JP2020525049A - 微生物集団の変更及び細菌叢の改変 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)獲得は、Cas1及びCas2による侵入DNAの認識及びプロトスペーサーの切断によって始まり、
(2)プロトスペーサー配列は、リーダー配列に隣接するダイレクトリピートにライゲーションされ、
(3)一本鎖伸長が、CRISPRを修復し、ダイレクトリピートを複製する。
本発明の第1の構成
本発明者らは、以下の特徴のうち1つ又は複数を用いて細菌叢(ヒト、動物又は環境細菌叢)中に一緒に天然に存在する細菌の混合コンソーシアム中の特定の細菌株の集団成長の阻害を初めて実証したと考えている:
・野生型細胞を標的化すること、
・野生型内因性Casヌクレアーゼ活性を利用すること、
・必須及び抗生物質耐性遺伝子を標的化すること
による集団成長阻害であって、
・標的が野生型配列である、集団成長阻害。
・ヒト細菌叢(例えば、腸細菌叢)種の混合集団において細菌成長阻害を標的化することであって、
・集団が3種の異なる種を含む、標的化すること、
・それらの種のうち1種の選択的死滅及びその他の種の細胞を温存することを含むこと、
・このような阻害から温存される系統学的に近縁の種の存在下で細胞成長阻害を標的化すること、
・標的ファーミキューテス門(Firmicutes)の種及び非ファーミキューテス門の種を含む混合集団において細胞成長阻害を標的化すること、
・混合集団中の、特定のファーミキューテス門の株の細胞成長阻害を標的化し、一方で、異なるファーミキューテス門の種を温存すること、
・混合集団中の、特定のグラム陽性細菌株の細胞成長阻害を標的化し、一方で、異なるグラム陽性細菌種を温存すること、
・病原性(ヒトにおいて)細菌種を標的化し、一方で、共生(commensul)ヒト腸内細菌種を温存すること、
・病原性細菌種を標的化し、一方で、プロバイオティック(priobiotic)ヒト腸内細菌種を温存すること、
・表面上の混合細菌集団において細胞成長阻害を標的化すること、
・特定の細菌種が単独で、又はコンソーシアム中で複数のその他の細菌種と混合された場合に少なくとも10倍の成長阻害を達成すること、及び
・特定の細菌種の2種の異なる株の少なくとも10倍の成長阻害を達成すること。
各宿主細胞について、システムが、(i)〜(iv)に記載の構成要素を含み、
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも1つの核酸配列、
(ii)宿主細胞標的配列、並びに宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、前記Casを宿主細胞における標的にガイドして、標的配列を改変する配列を含むHM-crRNAをコードするスペーサー配列(HM-スペーサー)及びリピートを含む遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイ、
(iii)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列、
(iv)システムの前記成分が、宿主細胞と宿主細胞を形質転換する少なくとも1つの核酸ベクター間で分離され、これにより、HM-crRNAが、Casを標的にガイドして、宿主細胞における宿主CRISPR/Casシステムを改変し、
標的配列が、Casにより改変され、これにより、宿主細胞が死滅されるか、又は宿主細胞成長が阻害される、使用。
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも1種の核酸配列、
(ii)宿主細胞標的配列、並びに標的配列を改変するために宿主細胞において宿主標的配列とハイブリダイズして、前記Casを標的にガイドすることが可能である配列を含むHM-crRNAをコードするスペーサー配列(HM-スペーサー)及びリピートを含む遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイ、
(iii)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現させるためのDNA配列、
(iv)システムの前記構成要素は、宿主細胞と、宿主細胞を形質転換でき、それによって、HM-crRNAが、宿主細胞においてCasを標的にガイドして、宿主CRISPR/Casシステムを改変する少なくとも1種の核酸ベクターの間で分離される。
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも1つの核酸配列、
(ii)スペーサー配列(HM-スペーサー)及びHM-crRNAをコードするリピートを含む遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイであって、HM-crRNAが、標的配列を改変するために宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、前記Casを標的にガイドする配列を含む、遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイ、
(iii)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列、
(iv)システムの前記構成要素は、宿主細胞と、宿主細胞を形質転換し、それによって、HM-crRNAが、宿主細胞においてCasを標的にガイドして、標的配列を改変する少なくとも1つの核酸ベクターの間で分離され、
Casヌクレアーゼは、宿主細胞にとって内因性であり、標的配列は、Casによって改変され、それによって、宿主細胞を死滅させる又は宿主細胞成長を低減する、使用。
各ベクターは、細胞において前記ファージの標的ヌクレオチド配列を改変するために、ファージに感染した宿主細胞に導入するための遺伝子操作されたファージ改変(PM)CRISPRアレイを含み、
(a)PM-CRISPRアレイは、PM-crRNAの発現のための1つ又は複数の配列及びファージに感染した宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)PM-crRNAは、標的配列を改変するために感染宿主細胞においてファージ標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能である、方法。
宿主細胞の標的ヌクレオチド配列を改変するための(例えば、第1の構成の使用のための)宿主改変(HM)CRISPR/Casシステムであって、以下の(i)〜(iv)に記載の構成要素を含み:
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも1種の核酸配列、
(ii)スペーサー配列(HM-スペーサー)及びHM-crRNAをコードするリピートを含む遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイであって、HM-crRNAは、標的配列を改変するために宿主細胞において宿主標的配列とハイブリダイズして、前記Casを標的にガイドすることが可能である配列を含む、遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイ、
(iii)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現させるためのDNA配列、
(iv)システムの前記構成要素が、宿主細胞と、宿主細胞を形質転換でき、それによって、HM-crRNAが、宿主細胞においてCasを標的にガイドして、標的配列を改変する少なくとも1種の核酸ベクター間で分離され、
任意選択で、構成要素(i)は、宿主細胞にとって内因性である、システム。
(a)PM-CRISPRアレイは、PM-crRNAの発現のための1種又は複数の配列ファージに感染した宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)PM-crRNAは、標的配列を改変するために感染宿主細胞において、ファージゲノム標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能である。
内因性CRISPR/Casシステムを含む細菌宿主細胞を改変するための遺伝子操作された核酸ベクターであって、
(a)CRISPR/Casシステムにおける使用のための、又は本発明に記載の使用のための、複数の異なるcrRNA(例えば、シングルガイドRNA、すなわち、gRNA)を発現するための核酸配列を含み、
(b)Casヌクレアーゼをコードする核酸配列を欠き、
第1の前記crRNAは、前記宿主細胞において第1の核酸配列とハイブリダイズ可能であり、第2の前記crRNAは、前記宿主細胞において第2の核酸配列とハイブリダイズ可能であり、前記第2の配列は、前記第1の配列とは異なり、
(c)第1の配列は、抗生物質耐性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ、第2の配列は、抗生物質耐性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ、任意選択で、両遺伝子は異なり、
(d)第1の配列は、抗生物質耐性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ、第2の配列は、必須遺伝子又は病原性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ、
(e)第1の配列は、必須遺伝子(又はそのRNA)により含まれ、第2の配列は、必須遺伝子又は病原性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ、又は、
(f)第1の配列は、病原性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ、第2の配列は、必須遺伝子又は病原性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ
ベクター。
宿主細胞において宿主細菌細胞(例えば、上記のような病原性細菌細胞)のゲノム又はウイルス(例えば、ファージ)のゲノムの標的配列を改変するための、遺伝子操作されたCRISPRアレイを含む核酸ベクター(例えば、プラスミド、ウイルス、ファージ又はファージミド)であって、
(a)CRISPRアレイは、crRNA(例えば、gRNAとして提供される)の発現のための1つ又は複数の配列及び宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)crRNAは、標的配列を改変するために、宿主細胞において標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能であり、
(c)アレイは、異なる種の第1及び第2の細菌細胞の間で水平伝達可能であるトランスポゾンにより含まれる
ベクター。
可動遺伝エレメント(MGE)を含む又はからなる遺伝子操作されたCRISPR核酸ベクターであって、MGEは、伝達の起点(oriT)及び宿主細胞において宿主細胞(例えば、病原性細菌細胞)のゲノム又はウイルス(例えば、プロファージ)のゲノムの標的配列を改変するためのCRISPRアレイを含み、
(a)CRISPRアレイは、crRNAの発現のための1つ又は複数の配列及び宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)crRNAは、標的配列を改変するために、宿主細胞において標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能であり、
(c)ベクターは、(i)第1の宿主細胞の第1及び第2の核酸位置の間を伝達可能であり、各位置は、染色体若しくはプラスミド上の位置であり、標的配列は、宿主細胞により含まれるか、又は(ii)第1及び第2の宿主細胞の間を伝達可能であり、標的配列は、第1及び/若しくは第2の宿主細胞により含まれる、
遺伝子操作されたCRISPR核酸ベクター。
工業用又は家庭用のシステムにおける基板の微生物腐食(MIC)又は生物付着を制御する方法であって、基板の表面を、基板のMIC又は生物付着を媒介する第1の微生物種の第1の宿主細胞の集団と接触させ、
(i)集団を、細胞を形質転換又は形質導入することが可能である複数のベクターと接触させる工程であって、各ベクターは、CRISPRアレイを含み、それによってCRISPRアレイは宿主細胞に導入され、
(a)各CRISPRアレイは、crRNAの発現のための1つ又は複数のヌクレオチド配列及び宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)各crRNAは、標的配列を改変するために(例えば、標的配列を切断するために)宿主細胞において、宿主細胞の標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能であり、標的配列は、宿主細胞生存力を媒介するための遺伝子配列である
工程と、
(ii)宿主細胞においてCasの存在下で前記cRNAを発現させ、それによって、宿主細胞において標的配列を改変し、宿主細胞生存力の低減及び前記基板のMIC又は生物付着の制御をもたらす工程と
を含む方法。
粗製油、ガス又は石油化学製品回収、処理、貯蔵又は輸送設備により含まれる基板の微生物腐食(MIC)又は生物付着を制御する方法であって、基板の表面を、第1の宿主細胞の集団と接触させ、第1の宿主細胞は、基板のMIC又は生物付着を媒介する第1の種の硫黄-又は硫酸-還元菌(SRB)、細胞外高分子物質産生菌(EPSB)、酸産生菌(APB)、硫黄-又は硫酸-酸化菌(SOB)、鉄酸化菌(IOB)、マンガン酸化菌(MOB)、アンモニア産生菌(AmPB)又は酢酸産生菌(AcPB)であり、表面及び細胞集団を、海水、淡水、水圧破砕液又は井戸中の液体から選択される液体と接触させる方法であり、
(i)液体を、第1の宿主細胞を形質転換又は形質導入することが可能である複数のベクターと混合することによって、細胞集団をベクターと接触させる工程であって、各ベクターは、CRISPRアレイを含み、それによってCRISPRアレイが宿主細胞中に導入され、
(a)各CRISPRアレイは、crRNAの発現のための1つ又は複数の配列及び宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)各crRNAは、標的配列を改変するために(例えば、標的配列を切断するために)宿主細胞において、宿主細胞の標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能であり、標的配列は、宿主細胞生存力を媒介するための遺伝子配列であり、
(c)(a)の各配列は、第1の宿主細胞におけるそれぞれのcrRNAの発現及び産生のための配列R1-S1-R1'を含み、R1は、第1のCRISPRリピートであり、R1'は、第2のCRISPRリピートであり、R1又はR1'は、任意選択であり、S1は、前記第1の宿主細胞の標的配列に対して80%以上同一であるヌクレオチド配列を含む又はからなる第1のCRISPRスペーサーである
工程と、
(ii)宿主細胞においてCasの存在下で前記cRNAを発現させ、それによって、宿主細胞において標的配列を改変し、宿主細胞生存力の低減及び前記基板のMIC又は生物付着の制御をもたらす工程と
を含む方法。
方法において使用するためのベクターであって、第1の細胞は、硫酸還元菌(SRB)細胞、例えば、デスルホビブリオ属(Desulfovibrio)又はデスルホトマキュラム属(Desulfotomaculum)の細胞であり、ベクターは、SRBを標的化するための1つ又は複数のCRISPRアレイを含み、各アレイは、(a)〜(c)に規定されるとおりである
ベクター。
(i)集団を、細胞を形質転換又は形質導入することが可能である複数のベクターと接触させる工程であって、各ベクターは、CRISPRアレイを含み、それによってCRISPRアレイは、宿主細胞に導入され、
(a)各CRISPRアレイは、crRNAの発現のための1つ又は複数のヌクレオチド配列及び宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)各crRNAは、標的配列を改変するために(例えば、標的配列を切断するために)宿主細胞において、宿主細胞の標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能であり、標的配列は、宿主細胞生存力を媒介するための遺伝子配列である
工程と、
(ii)宿主細胞においてCasの存在下で前記cRNAを発現させ、それによって、宿主細胞において標的配列を改変し、宿主細胞生存力の低減及び前記生物付着の制御をもたらす工程と
を含む方法が提供される。
例えば、船又はボートのバラスト水において細菌生物付着を制御する方法であって、水は、前記生物付着を媒介する第1の微生物種の第1の宿主細胞の集団を含み、
(i)集団を、細胞を形質転換又は形質導入することが可能である複数のベクターと接触させる工程であって、各ベクターは、CRISPRアレイを含み、それによってCRISPRアレイは、宿主細胞に導入され、
(a)各CRISPRアレイは、crRNAの発現のための1つ又は複数の配列及び宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)各crRNAは、標的配列を改変するために(例えば、標的配列を切断するために)宿主細胞において、宿主細胞の標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能であり、標的配列は、宿主細胞生存力を媒介するための遺伝子配列である
工程と、
(ii)宿主細胞においてCasの存在下で前記cRNAを発現させ、それによって、宿主細胞において標的配列を改変し、宿主細胞生存力の低減及び前記生物付着の制御をもたらす工程と
を含む方法が提供される。
(a)CRISPRアレイは、crRNAの発現のための配列及び前記宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)crRNAは、標的配列を改変するために、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能であり、標的配列は、宿主細胞生存力を媒介するためのヌクレオチド配列であり、
(c)(a)の配列は、crRNAの発現及び産生のための配列R1-S1-R1'を含み、R1は、第1のCRISPRリピートであり、R1'は、第2のCRISPRリピートであり、R1又はR1'は、任意選択であり、S1は、宿主細胞標的配列に対して80%以上同一であるヌクレオチド配列を含む又はからなる第1のCRISPRスペーサーである
ベクター。
第1の態様において、
第1のCasをコードする発現可能な遺伝子を改変する方法であって、
(a)ガイドRNA(gRNA1)を、前記遺伝子から発現される第1のCasの存在下でCas遺伝子と組み合わせる工程と、
(b)gRNA1を、前記Cas遺伝子の配列(例えば、そのプロモーター又は第1のCasをコードするDNA配列)とハイブリダイズさせて、第1のCasを遺伝子にガイドさせ、それによって、Casが、Cas遺伝子を改変する工程と
を含む方法。
(a)第1のベクター又は前記組合せのベクターは、第1の部位(CS1)でPS1を改変するための第1のCasをガイドするために所定のプロトスペーサー配列(PS1)と相補的であるガイドRNA(gRNA1、例えば、シングルgRNA)をコードする発現可能なヌクレオチド配列を含み、PS1は、第1のCasに対して同族であるPAM(P1)に隣接するか、又は発現可能な配列は、tracrRNAとともにgRNA1を形成するcrRNAをコードし、
(b)PS1及びP1は、発現可能な第1のCasをコードする遺伝子の配列であり、PS1は、第1のCasによってCS1で改変されることが可能である
第1の核酸ベクター又はベクターの組合せ。
1.4kb超の、CRISPR/Casシステムの構成要素をコードする外因性DNA配列を含む核酸ベクターであって、配列は、宿主細胞(本明細書における任意の細胞、例えば、ヒト、動物又は細菌又は古細菌)において、1つ又は複数のHM-若しくはPM-crRNA又はgRNAを発現するための遺伝子操作されたアレイ又は遺伝子操作された配列(任意選択で、本明細書において記載されるような)を含み、アレイ又は遺伝子操作された配列は、cRNA又はgRNAに対して同族であるCasヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含まず、任意選択で、少なくとも2、3又は4つのcRNA又はgRNAが、外因性DNAによってコードされる、核酸ベクター。
第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
(a)細菌叢細菌の混合集団を、Casヌクレアーゼをコードする複数のベクター及び宿主改変(HM)crRNAと組み合わせる工程と、
(b)宿主細胞においてベクターによってコードされるCas及びHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてベクターによってコードされるCasとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casヌクレアーゼを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
を含み、
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更する、方法。
第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
(a)細菌叢細菌の混合集団を、宿主改変(HM)crRNAをコードする複数のベクターと組み合わせる工程と、
(b)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてCasヌクレアーゼとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
を含み、
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更し、
宿主細胞集団成長を少なくとも5、10-、100、1000、10000、100000又は1000000倍低減する、方法。
第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
(a)細菌叢細菌の混合集団を、宿主改変(HM)crRNAをコードする複数のベクターと組み合わせる工程と、
(b)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてCasヌクレアーゼとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
を含み、
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更し、
表面での宿主細胞集団成長を阻害する、方法。
第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
(a)細菌叢細菌の混合集団を、宿主改変(HM)crRNAをコードする複数のベクターと組み合わせる工程と、
(b)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてCasヌクレアーゼとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
を含み、
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更し、
第1の種は、宿主細胞種の16sリボソームRNAをコードするDNA配列と少なくとも80%同一である16sリボソームRNAをコードするDNA配列を有し、混合集団中の第1の細菌の成長は、前記HMシステムによって阻害されない、方法。
第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
(a)細菌叢細菌の混合集団を、宿主改変(HM)crRNAをコードする複数のベクターと組み合わせる工程と、
(b)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてCasヌクレアーゼとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
を含み、
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更し、
工程(a)の混合集団は、第3の細菌種を含む、方法。
第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
(a)細菌叢細菌の混合集団を、宿主改変(HM)crRNAをコードする複数のベクターと組み合わせる工程と、
(b)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてCasヌクレアーゼとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
を含み、
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更し、
工程(a)の混合集団は、宿主細胞と同一種の細菌細胞の更なる亜集団を含み、前記更なる亜集団の細菌細胞は、前記標的配列を含まない、方法。
第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
(a)細菌叢細菌の混合集団を、宿主改変(HM)crRNAをコードする複数のベクターと組み合わせる工程と、
(b)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてCasヌクレアーゼとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
を含み、
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更し、
各宿主細胞は、複数の前記標的配列を含む、方法。
第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
(a)細菌叢細菌の混合集団を、宿主改変(HM)crRNAをコードする複数のベクターと組み合わせる工程と、
(b)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
宿主細胞において、Cas発現が誘導され、それによって、宿主細胞において前記発現されたCas及びHM-crRNAが組み合わされ、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてCasヌクレアーゼとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更する、方法。
第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
(a)細菌叢細菌の混合集団を、宿主改変(HM)crRNAをコードする複数のベクターと組み合わせる工程と、
(b)宿主細胞においてHM-crRNAの産生を誘導する工程と
を含み、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてCasヌクレアーゼとともに作動可能であり、HM-cRNAの産生のための遺伝子操作された核酸配列からのRNAの発現は、宿主細胞において誘導可能であり、遺伝子操作された配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
を含み、
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更する、方法。
第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
(a)細菌叢細菌の混合集団を、宿主改変(HM)crRNAをコードする複数のベクターと組み合わせる工程と、
(b)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてCasヌクレアーゼとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
を含み、
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更する、方法。
細菌宿主細胞を形質転換可能であるベクターであって、本発明の方法において使用するための、(i)宿主細胞において発現可能であるSピオゲネス(pyogenes)Cas9ヌクレオチド配列及び(ii)任意選択で、少なくとも1つの本発明のHM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列の挿入に適応可能であり、ベクターが(i)(及び任意選択で、(ii))を含む場合に、宿主細胞を形質転換可能であり、Cas(及び任意選択で、少なくとも1つのHM-crRNA(例えば、gRNA)を発現可能である、ベクター。
本発明のベクターをそれぞれ含む複数の細菌宿主細胞であって、ベクターによってコードされるCas(及び任意選択で、前記HMcrRNA)は、宿主細胞において発現される、又は発現可能であり、細菌細胞は、第1の亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団により含まれ、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団(前記複数の細菌宿主細胞)を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種である、複数の細菌宿主細胞。
宿主細菌又は古細菌細胞の標的ヌクレオチド配列を認識し、それによって、プログラムされたヌクレアーゼが、ヌクレオチド配列を改変可能であるようにプログラムされているガイド型ヌクレアーゼであって、ヌクレオチド配列は、宿主細胞におけるシグマ因子媒介性遺伝子発現カスケードにより含まれる標的遺伝子により含まれる、ガイド型ヌクレアーゼ。
(a)Casヌクレアーゼは、配列番号273のアミノ酸配列と少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号738若しくは738若しくは274のヌクレオチド配列と少なくとも70%同一であるヌクレオチド配列によってコードされるか、又は配列番号273のアミノ酸配列を含むCasのオルソログ若しくは相同体であり、Casヌクレアーゼは、配列番号138〜209から選択されるリピート配列及びCCW、CCA、CCT、CCC、CCG若しくはTCAを含む若しくはからなるPAMとともに作動可能であるか、又は
(b)Casヌクレアーゼは、配列番号261若しくは263のアミノ酸配列と少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号262若しくは264のヌクレオチド配列と少なくとも70%同一であるヌクレオチド配列によってコードされるか、又は配列番号261若しくは263のアミノ酸配列を含むCasのオルソログ若しくは相同体であり、Casヌクレアーゼは、配列番号210〜213から選択されるリピート配列及びAWG、例えば、AAG、AGG、GAG若しくはATGを含む若しくはからなるPAMとともに作動可能であるか、又は
(c)Casヌクレアーゼは、配列番号265のアミノ酸配列と少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号266のヌクレオチド配列と少なくとも70%同一であるヌクレオチド配列によってコードされるか、又は配列番号265のアミノ酸配列を含むCasのオルソログ若しくは相同体であり、Casヌクレアーゼは、配列番号215〜218から選択されるリピート配列及びNNAGAAW、NGGNG若しくはAW、例えば、AA、AT若しくはAGを含む若しくはからなるPAMとともに作動可能であるか、又は
(d)Casヌクレアーゼは、配列番号267若しくは269のアミノ酸配列と少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号268若しくは270のヌクレオチド配列と少なくとも70%同一であるヌクレオチド配列によってコードされるか、又は配列番号267若しくは269のアミノ酸配列を含むCasのオルソログ若しくは相同体であり、Casヌクレアーゼは、リピート配列配列番号214とともに作動可能である。
混合細菌集団を含む、ヒト又は非ヒト動物対象においてクロストリジウム属(Clostridium)感染を処置する方法であって、集団は、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)クロストリジウム属種の複数の宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種は、前記クロストリジウム属種とは異なり、
各宿主細胞は、
(a)CCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含む又はからなるPAMと、
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列と、
(c)宿主細胞においてCas3ヌクレアーゼとともに作動可能なCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列と、
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列と
を含み、
第1の細胞は、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列の複数のコピーを含む医薬組成物を投与する工程と、
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、それぞれの宿主細胞においてCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記それぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(g)配列番号138〜209から選択されるリピート配列(又はそれと少なくとも70%同一である配列)である、1つ又は複数のリピート配列と、
(h)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において前記宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である、スペーサー配列と
を含む核酸配列を含み、
システムは、任意選択で、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
発現されたHM-crRNAは、配列番号273のアミノ酸配列を含む、又は配列番号738若しくは274のヌクレオチド配列によってコードされるCASCADE Cas及びCas3又はそのオルソログ若しくは相同体と組み合わされ、Cas3は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞は死滅されるか、又は宿主細胞集団成長が低減され、それによって、対象における前記宿主細胞集団の割合を低減し、クロストリジウム属感染を処置する、方法。
(a)宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のための、HM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列であって、各crRNAは、それぞれの宿主細胞において発現されたCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、
(i)1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能であり、標的配列は、CCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含む又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列と
を含む遺伝子操作された核酸配列と、
(b)CASCADE Casと、
(c)Cas3又は宿主細胞においてCas3を発現するためのCas3をコードするヌクレオチド配列又はそのオルソログ若しくは相同体と、
を含み、
発現されたHM-crRNAは、宿主細胞においてCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ若しくは相同体と組み合わせることが可能であり、Cas3は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減できる、システム。
(i)1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能であり、標的配列は、CCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含む又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列と
を含む、遺伝子操作されたヌクレオチド配列。
混合細菌集団を含む、ヒト又は非ヒト動物対象において大腸菌感染を処置する方法であって、集団は、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)複数の大腸菌宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種は、大腸菌ではなく、
各宿主細胞は、
(a)AWG、例えば、AAG、AGG、GAG又はATGを含む又はからなるPAMと、
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列と、
(c)宿主細胞においてCas3ヌクレアーゼとともに作動可能なCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列と、
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列と
を含み、
第1の細胞は、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列の複数コピーを含む医薬組成物を投与する工程と、
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、それぞれの宿主細胞においてCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記それぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(g)配列番号210〜213から選択されるリピート配列である1つ又は複数のリピート配列と、
(h)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において前記宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である、スペーサー配列と
を含む核酸配列を含み、
システムは、任意選択で、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
発現されたHM-crRNAは、配列番号261若しくは263のアミノ酸配列を含む、又は配列番号262若しくは264のヌクレオチド配列によってコードされるCASCADE Cas及びCas3又はそのオルソログ若しくは相同体と組み合わされ、Cas3は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、対象における前記宿主細胞集団の割合を低減し、大腸菌感染を処置する、方法。
(a)宿主細胞におけるHM-crRNAの発現のための、前記HM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列であって、各crRNAは、それぞれの宿主細胞において発現されたCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、
(i)1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能であり、標的配列は、AWGを含む又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列と
を含む遺伝子操作された核酸配列と、
(b)CASCADE Casと、
(c)Cas3又は宿主細胞においてCas3を発現するためのCas3をコードするヌクレオチド配列又はそのオルソログ若しくは相同体と
を含み、
発現されたHM-crRNAは、宿主細胞においてCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ若しくは相同体と組み合わせることが可能であり、Cas3は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減できる、システム。
(i)配列番号210〜213及び514〜731から選択されるリピート配列である1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能であり、標的配列は、AWGを含む又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列と
を含む、遺伝子操作されたヌクレオチド配列。
混合細菌集団を含む、ヒト又は非ヒト動物対象においてストレプトコッカス属感染を処置する方法であって、集団は、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)ストレプトコッカス属種の複数の宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種は、前記ストレプトコッカス属種とは異なり、
各宿主細胞は、
(a)NNAGAAW、NGGNG又はAW、例えば、AA、AT若しくはAGを含む又はからなるPAMと、
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列と、
(c)宿主細胞においてCas3ヌクレアーゼとともに作動可能なCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列と、
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列と
を含み、
第1の細胞は、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列の複数コピーを含む医薬組成物を投与する工程と、
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、それぞれの宿主細胞において発現されたCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記それぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(g)配列番号215〜218から選択されるリピート配列である1つ又は複数のリピート配列と、
(h)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において前記宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である、スペーサー配列と
を含む核酸配列を含み、
システムは、任意選択で、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
発現されたHM-crRNAは、配列番号265のアミノ酸配列を含む、又は配列番号266のヌクレオチド配列によってコードされるCASCADE Cas及びCas3又はそのオルソログ若しくは相同体と組み合わされ、Cas3は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減させ、それによって、対象における前記宿主細胞の割合を低減し、ストレプトコッカス属感染を処置する、方法。
(a)宿主細胞におけるHM-crRNAの発現のための、前記HM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列であって、各crRNAは、それぞれの宿主細胞において発現されたCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、
(i)配列番号215〜218から選択されるリピート配列である1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能であり、標的配列は、NNAGAAW、NGGNG又はAWを含む又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列と
を含む遺伝子操作された核酸配列と、
(b)CASCADE Casと、
(c)任意選択で、配列番号265のアミノ酸配列を含むCas3又は宿主細胞においてCas3を発現するためのヌクレオチド配列(任意選択で、配列番号266を含む)又はそのオルソログ又は相同体と
を含み、
発現されたHM-crRNAは、宿主細胞においてCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ若しくは相同体と組み合わせることが可能であり、Cas3は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減できる、システム。
(i)配列番号215〜218から選択されるリピート配列である1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能であり、標的配列は、NNAGAAW、NGGNG又はAWを含む又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列と
を含む、遺伝子操作されたヌクレオチド配列。
混合細菌集団を含む、ヒト又は非ヒト動物対象においてサルモネラ属感染を処置する方法であって、集団は、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)サルモネラ属種の複数の宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種は、前記サルモネラ属種とは異なり、
各宿主細胞は、
(a)PAMと、
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列と、
(c)宿主細胞においてCas3ヌクレアーゼとともに作動可能なCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列と、
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列と
を含み、
第1の細胞は、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列の複数コピーを含む医薬組成物を投与する工程と、
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、それぞれの宿主細胞においてCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記それぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(g)配列番号214である1つ又は複数のリピート配列と、
(h)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において前記宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である、スペーサー配列と
を含む核酸配列を含み、
システムは、任意選択で、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
発現されたHM-crRNAは、配列番号267若しくは269のアミノ酸配列を含む、又は配列番号268若しくは270のヌクレオチド配列によってコードされるCASCADE Cas及びCas3又はそのオルソログ若しくは相同体と組み合わされ、Cas3は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減させ、それによって、対象における前記宿主細胞の割合を低減し、サルモネラ属感染を処置する、方法。
(a)宿主細胞におけるHM-crRNAの発現のための、前記HM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列であって、各crRNAは、それぞれの宿主細胞において発現されたCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、
(i)任意選択で、配列番号214である1つ又は複数のリピートと、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である、スペーサー配列と
を含む遺伝子操作された核酸配列と、
(b)CASCADE Casと、
(c)任意選択で、配列番号267若しくは269のアミノ酸配列を含むCas3又は宿主細胞においてCas3を発現するためのヌクレオチド配列(任意選択で、配列番号268若しくは270を含む)又はそのオルソログ若しくは相同体と
を含み、
発現されたHM-crRNAは、宿主細胞においてCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ若しくは相同体と組み合わせることが可能であり、Cas3は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減できる、システム。
(i)任意選択で、配列番号214である1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である、スペーサー配列と、
を含む、遺伝子操作されたヌクレオチド配列。
本発明は、細菌集団成長を阻害する、又は細菌の混合集団における第1及び第2の細菌の亜集団の相対比を変更するための、例えば、ヒト又は動物マイクロバイオームを変更するための、例えば、ヒトの細菌叢におけるバクテロイデス門(例えば、バクテロイデス属)、ファーミキューテス門及び/又はグラム陽性菌又は陰性菌の割合を変更するための、方法、使用、システム、アレイ、cRNA、gRNA及びベクターに関する。例えば、本明細書において記載される第1〜第3の構成を参照のこと。本発明は、例えば、宿主細菌細胞、例えば、バクテロイデス門の細胞又はファーミキューテス門の細胞の1つ又は複数の標的ヌクレオチド配列を改変することを含む。
本発明は、宿主細胞標的を伴う以下の概念を提供する:
1.細菌宿主細胞を死滅させるための、又はその成長を低減するための宿主改変(HM)CRISPR/Casシステムの使用であって、各宿主細胞について、システムは、以下の(i)〜(iv)に記載の構成要素を含み:
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも1つの核酸配列、
(ii)スペーサー配列(HM-スペーサー)及びHM-crRNAをコードするリピートを含む遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイであって、HM-crRNAが、標的配列を改変するために宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、前記Casを標的にガイドする配列を含む、遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイ、
(iii)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列、
(iv)システムの前記構成要素は、宿主細胞と、宿主細胞を形質転換し、それによって、HM-crRNAが、宿主細胞においてCasを標的にガイドして、標的配列を改変する少なくとも1つの核酸ベクターの間で分離され、
Casヌクレアーゼは、宿主細胞にとって内因性であり、標的配列は、Casによって改変され、それによって、宿主細胞を死滅させる又は宿主細胞成長を低減する、使用。
細菌の混合集団における第1及び第2の細菌の亜集団の相対比を変更するための、宿主改変(HM)CRISPR/Casシステムの使用であって、第2の細菌は、宿主細胞を含み、各宿主細胞について、システムは、以下の(i)〜(iv)に記載の構成要素を含み:
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも1つの核酸配列、
(ii)スペーサー配列(HM-スペーサー)及びHM-crRNAをコードするリピートを含む遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイであって、HM-crRNAが、標的配列を改変するために宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、前記Casを標的にガイドする配列を含む、遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイ、
(iii)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列、
(iv)システムの前記構成要素は、宿主細胞と、宿主細胞を形質転換し、それによって、HM-crRNAが、宿主細胞においてCasを標的にガイドして、標的配列を改変する少なくとも1つの核酸ベクターの間で分離され、任意選択で、Casヌクレアーゼは、宿主細胞にとって内因性であり、標的配列は、Casによって改変され、それによって、宿主細胞を死滅させる又は宿主細胞成長を低減する、使用。
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも1つの核酸配列、
(ii)スペーサー配列(HM-スペーサー)及びHM-crRNAをコードするリピートを含む遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイであって、HM-crRNAが、標的配列を改変するために宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、前記Casを標的にガイドする配列を含む、遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイ、
(iii)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列、
(iv)システムの前記構成要素は、宿主細胞と、宿主細胞を形質転換し、それによって、HM-crRNAが、宿主細胞においてCasを標的にガイドして、標的配列を改変する少なくとも1つの核酸ベクターの間で分離され、
任意選択で、Casヌクレアーゼは、宿主細胞にとって内因性であり、
標的配列は、Casによって改変され、それによって、宿主細胞を死滅させる又は宿主細胞成長を低減する、方法。
細菌の混合集団における第1及び第2の細菌の亜集団の相対比を変更するための、宿主改変(HM)CRISPR/Casシステムの使用であって、第2の細菌は、各々標的プロトスペーサー配列を含む複数の宿主細胞を含み、各宿主細胞について、システムは、上で定義した構成要素(ii)及び(iii)を含み、システムは、Casヌクレアーゼをコードする少なくとも1つの核酸配列を更に含み、前記構成要素(ii)及び前記Casをコードする配列は、宿主細胞を形質転換する少なくとも1つの核酸ベクターにより含まれ、それによって、(i)によってコードされるHM-crRNAは、宿主細胞において標的配列を改変するためにCasを標的にガイドし、
Casヌクレアーゼは、宿主細胞にとって内因性であり、標的配列は、Casによって改変され、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞成長を低減する、使用。
2.宿主細胞の標的ヌクレオチド配列を改変するための(例えば、概念1の使用のための)宿主改変(HM)CRISPR/Casシステムであって、以下の(i)〜(iv)に従う構成要素を含み:
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも1種の核酸配列、
(ii)スペーサー配列(HM-スペーサー)及びHM-crRNAをコードするリピートを含む遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイであって、HM-crRNAは、標的配列を改変するために宿主細胞において宿主標的配列とハイブリダイズして、前記Casを標的にガイドすることが可能である配列を含む、遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイ、
(iii)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現させるためのDNA配列、
(iv)システムの前記構成要素が、宿主細胞と、宿主細胞を形質転換でき、それによって、HM-crRNAが、宿主細胞においてCasを標的にガイドして、標的配列を改変する少なくとも1種の核酸ベクターの間で分離され、
任意選択で、構成要素(i)は、宿主細胞にとって内因性である、システム。
3.ベクター(単数又は複数)が、Cas(例えば、Cas9)ヌクレアーゼをコードする配列を欠く、概念2のシステム。
4.各宿主細胞が、ヒト細菌叢において見られる株又は種のものである、任意選択で、宿主細胞が、異なる株又は種の細胞と混合され、異なる細胞が、腸内細菌科又はヒトに関して(例えば、ヒト腸において)プロバイオティックである、共生している若しくは相利共生である細菌である、概念1から3のいずれか1つの使用、方法又はシステム。一例では、宿主細胞は、ファーミキューテス門(Firmicute)、例えば、ストレプトコッカス属の細胞である。
5.混合細菌集団における(例えば、ヒトにおける、例えば、ヒト細菌叢における)バクテロイデス門(例えば、バクテロイデス属)の細菌の割合の変更のための、概念1から4のいずれか1つの使用、方法又はシステム。
6.ファーミキューテス門に対するバクテロイデス門の相対比を増大するための概念5の使用、方法又はシステム。
7.前記Casヌクレアーゼが、細胞の内因性II型CRISPR/Casシステムによって提供される概念1から6のいずれか1つの使用、方法又はシステム。
8.構成要素(iii)が、宿主細胞に対して内因性である、概念1から7のいずれか1つの使用、方法又はシステム。
9.標的配列が、宿主細胞の抗生物質耐性遺伝子、病原性遺伝子又は必須遺伝子により含まれる概念1から8のいずれか1つの使用、方法又はシステム。
10.アレイが抗生物質組成物により含まれ、アレイが、抗生物質剤と組み合わせた状態にある、概念1から9のいずれか1つの使用、方法又はシステム。
11.代替としてHM-crRNA及びtracrRNAが、例えば、ベクターによって提供されるシングルガイドRNA(gRNA)により含まれる、概念1から10のいずれか1つの使用、方法又はシステム。
12.宿主細胞が、対象のHM-配列をコードする遊離末端を有するデオキシリボ核酸鎖(HM-DNA)を含む、及び/又はシステムが、HM-DNAをコードする配列を含み、HM-DNAが、HM-DNAを宿主ゲノムに(例えば、染色体若しくはエピソーム部位)へ挿入するための標的配列中の、又はその両端に位置する配列(単数若しくは複数)に対してそれぞれ相同である配列(単数若しくは複数)を含む、概念1から12のいずれか1つの使用、方法又はシステム。
13.内因性CRISPR/Casシステムを含む細菌宿主細胞を改変するための遺伝子操作された核酸ベクターであって、
(a)概念1から12のいずれか1つに記載のCRISPR/Casシステム、方法又は使用において使用するための複数の異なるcrRNA(例えば、gRNA)を発現するための核酸配列を含み、
(b)任意選択で、Casヌクレアーゼをコードする核酸配列を欠き、
第1の前記crRNAは、前記宿主細胞において第1の核酸配列とハイブリダイズ可能であり、第2の前記crRNAは、前記宿主細胞において第2の核酸配列とハイブリダイズ可能であり、前記第2の配列は、前記第1の配列とは異なり、
(c)第1の配列は、抗生物質耐性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ、第2の配列は、抗生物質耐性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ、任意選択で、両遺伝子は異なり、
(d)第1の配列は、抗生物質耐性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ、第2の配列は、必須遺伝子又は病原性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ、
(e)第1の配列は、必須遺伝子(又はそのRNA)により含まれ、第2の配列は、必須遺伝子又は病原性遺伝子(又はそのRNA により含まれ、又は
(f)第1の配列は、病原性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ、第2の配列は、必須遺伝子又は病原性遺伝子(又はそのRNA)により含まれる、
遺伝子操作された核酸ベクター。
14.ベクターによってコードされるcRNA(例えば、シングルガイドRNA)とともに作動可能である1つ又は複数のCasを含む、宿主細胞の内側の概念13のベクター。
15.HM-CRISPRアレイが、同一スペーサーの複数のコピーを含む、概念1から14のいずれか1つの使用、方法、システム又はベクター。
16.ベクターが、複数のHM-CRISPRアレイを含む、概念1から15のいずれか1つの使用、方法、システム又はベクター。
17.各ベクターが、プラスミド、コスミド、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド又はプロファージである、概念1から16のいずれか1つの使用、方法、システム又はベクター。
18.システム又はベクターが、crRNA(例えば、gRNA)をコードする核酸配列の2つ、3つ又はそれより多いコピーを含み、コピーが、宿主細胞配列(例えば、病原性、耐性又は必須遺伝子配列)を標的化するための同一スペーサー配列を含む、概念1から17のいずれか1つの使用、方法、システム又はベクター。
19.コピーが2つ又はそれより多いベクターCRISPRアレイの間で分離される、概念18の使用、方法、システム又はベクター。
20.概念1から19のいずれか1つにおいて列挙されたシステム又はベクターを含む細菌宿主細胞。
21.抗生物質剤(例えば、ベータ-ラクタム系抗生物質)と組み合わせた、概念2〜20のいずれか1つのシステム、ベクター又は細胞。
22.宿主細胞又は各宿主細胞が、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、シュードモナス属(Pseudomonas)、サルモネラ属(Salmonella)、リステリア属、大腸菌(E coli)、デスルホビブリオ属(Desulfovibrio)又はクロストリジウム属の宿主細胞である、概念1から21のいずれか1つの使用、方法、システム、ベクター又は細胞。一例では、宿主細胞又は各宿主細胞は、ファーミキューテス門の細胞、例えば、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、リステリア属又はクロストリジウム属の細胞である。
ニー数を試験コロニー数によって除することによって相違倍数を算出する。
ば、ヒト又は動物の細菌叢(腸細菌叢又は本明細書において開示される任意のその他の種類の細菌叢(micriobiota)等)により含まれる。このような方法で、宿主細胞によって媒介される又は引き起こされる疾患又は状態を処置又は予防できる。一例では、形質転換はin vitroで実施され、任意選択で、アレイ、crRNA、gRNA又は遺伝子操作されたヌクレオチド配列は、宿主細胞にエレクトロポレーションされる核酸により含まれる。一例では、核酸はRNA(例えば、gRNAのコピー)である。別の例では、核酸は、宿主細胞におけるその発現のためにcrRNA又はgRNAをコードするDNAである。
本発明の態様では、標的配列は、宿主細菌細胞に感染するファージの配列である。本発明によって達成されるようなファージゲノムの所望の改変は、ファージ死滅又はノックダウンに関するだけでなく、代わりに、宿主細胞における所望のファージ遺伝子又は調節エレメント活性化であり得る(例えば、ファージが所望のタンパク質又は宿主細胞生存力又は増殖の増大と関連しているその他の生成物を発現する場合)。或いは、改変は、例えば、ファージ標的部位に本発明に従って標的とされる誘導可能Casの使用による、誘導可能ファージ遺伝子発現調節であり得る。一実施形態では、本発明は、宿主細胞においてCasヌクレアーゼを用いて切断することによってファージ標的部位を改変することを提供する。これは、例えば、以下の様々な理由のために有用であり得る:
A.標的部位を突然変異して活性化又は不活性化するため(例えば、遺伝子ノックダウン又は抗宿主遺伝子の不活性化のため、又はファージ標的が宿主染色体中に組み込まれる場合には宿主細胞を死滅させるため)、
B.標的配列又は標的配列を含むより大きな配列を欠失するため(例えば、本発明が、ファージゲノム中の間隔のあいた部位を標的化する第1及び第2のPM-crRNAとともに使用され、各部位における切断が、切断の間のファージ核酸の欠失をもたらす場合)、
C.所望のPM-DNA配列を宿主細胞ゲノム中に挿入するため(例えば、所望のPM-DNAの相同組換え挿入のために宿主核酸における1つ又は複数のPM-crNAによってガイドされる切断を提供することによって)。
1.第1及び第2の細菌の亜集団の相対比を、前記亜集団を含む細菌の混合集団において変更する方法であって、第1の細菌は、宿主細胞(例えば、バクテロイデス門の宿主細胞)であり(第1の細菌は、任意選択で、ファージによって感染し、第2の細菌は、前記ファージによって感染しない(又はバクテロイデス門ではない))、ベクター核酸(例えば、そのPM含有トランスポゾン)を宿主細胞に導入するために1つ又は複数のステップで混合集団を、複数のベクターと組み合わせる工程と、混合集団で細菌を成長させ、前記第1及び第2の細菌の相対比が変更される工程とを含み、前記第1及び第2の細菌の相対比が変更され、
各ベクターは、細胞において標的ヌクレオチド配列(例えば、前記ファージの)を改変するために宿主細胞に導入するための遺伝子操作されたファージ改変(PM)CRISPRアレイを含み、
(a)PM-CRISPRアレイは、PM-crRNAの発現のための1つ又は複数の配列及び宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)PM-crRNAは、標的配列を改変するために宿主細胞において標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能である。
2.第1の細菌が、バクテロイデス属(例えば、テタイオタミクロン(thetaiotamicron)又はフラガリス)、アリスタイプ属(Alistipes)、アルカリフレクス属(Alkaliflexus)、パラバクテロイデス(Parabacteroides)、タンネレラ属(Tannerella)、キシラニバクター属(Xylanibacter)及び/又はプレボテラ属の細菌である態様1の方法。
3.第2の細菌が、ファーミキューテス門の細菌(例えば、第1の細菌がバクテロイデス門又はバクテロイデス属である場合)である、態様1又は2の方法。
4.第2の細菌亜集団に対する第1の細菌亜集団の比が増大される、すなわち、前記方法が実施された後に、以前よりも大きい、態様1から3のいずれか1つの方法。
5.混合集団が、その腸又は経口細菌叢を定植し、バランスを取り直すために、ヒト又は非ヒト動物へ投与するための組成物(例えば、飲料、マウスウォッシュ又は食料)により含まれ、例えば、混合集団が、in vitro又はヒト又は非ヒト動物においてin vivoである、態様4の方法。
6.第2の細菌亜集団に対する第1の細菌亜集団の比が減少される、すなわち、前記方法が実施された後に、以前よりも小さい、態様1、2又は3の方法。
7.混合集団が、ヒト消費のための飲料又は水(例えば、水路又は飲料水)によって保持される、態様6の方法。
8.各ベクターが、プラスミド、ファージ(例えば、パッケージングされたファージ)又はファージミドである、態様1から7のいずれか1つの方法。
9.各ベクターが、ファージ(例えば、パッケージングされたファージ)であり、ベクター核酸が、宿主細胞へのファージベクター核酸形質導入によって、すなわち、ファージベクターによる宿主細胞の感染によって宿主細胞に導入される、態様8の方法。一例では、ファージは、本明細書において記載されるような1つ又は複数のトランスポゾンを含む。
10.各ベクターが、プラスミドであり、ベクター核酸が、ベクターを保持する細菌から形質転換又は水平プラスミド伝達によって宿主細胞に導入される、態様8の方法。一例では、プラスミドは、本明細書において記載されるような1つ又は複数のトランスポゾンを含む。一例では、ベクターを保持する細菌は、非バクテロイデス門又は非バクテロイデス属種である。
11.前記バクテロイデス門ファージのゲノムを改変するために態様1から10のいずれか1つの方法において使用するための、遺伝子操作されたバクテロイデス門ファージ改変(PM)CRISPRアレイであって、
(a)PM-CRISPRアレイは、PM-crRNAの発現のための1つ又は複数の配列及びバクテロイデス門のファージに感染した宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)PM-crRNAは、標的配列を改変するために感染宿主細胞において、バクテロイデス門ファージゲノム標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能である
アレイ。
12.態様1〜10のいずれか1つの方法において使用するための核酸ベクター(例えば、プラスミド、ファージ又はファージミド)であって、態様11のPM-CRISPRアレイを含むベクター。
宿主細胞において宿主細菌細胞(例えば、上記のような病原性細菌細胞)のゲノム又はウイルス(例えば、ファージ)のゲノムの標的配列を改変するための遺伝子操作されたHM-CRISPRアレイを含む核酸ベクター(例えば、プラスミド、ウイルス、ファージ又はファージミド)であって、
(a)CRISPRアレイは、crRNAの発現のための1つ又は複数の配列及び宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)crRNAは、標的配列を改変するために宿主細胞において、標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能である
ベクター。
13.ヒト又は非ヒト動物消費のための細菌細胞、例えば、プロバイオティック細胞により含まれる、態様11又は12のアレイ又はベクター。
14.ベクターが、前記混合集団と組み合わせることのために使用される、又は混合集団と組合せのためのものである第3の細菌集団(例えば、本明細書において記載される担体細菌)により含まれ、それによって、ベクター核酸が、形質転換によって(例えば、第3の細菌から第1の細菌宿主細胞への水平プラスミドベクター又はトランスポゾン伝達によって)又は形質導入によって(例えば、第1の細菌宿主細胞のファージベクター感染(inefection)によって)宿主細胞に導入される、態様1から13のいずれか1つの方法、アレイ又はベクター。
15.アレイ若しくはベクター又は各アレイ若しくはベクターが、ヒト又は非ヒト動物腸共生又は相利共生細菌細胞(例えば、本明細書において記載されるような担体細菌細胞)により含まれる、態様1から14のいずれか1つの方法、アレイ又はベクター。したがって、細胞は、ヒト又は非ヒト動物と共生又は相利共生する腸内細菌種のものである。
16.ベクター又は各ベクターが、ファーミキューテス門の宿主細胞において、又はバクテロイデス門のファージに感染した宿主細胞(例えば、バクテロイデス属の細胞)において作動可能であり、任意選択で、態様15に規定されるように共生又は相利共生細菌細胞において作動可能である複製起点を含むプラスミド、ファージ又はファージミドである、態様12から15のいずれか1つの方法又はベクター。一例では、複製起点は、oriT又は本明細書において記載される任意のその他の複製起点である。
17.ベクター又は各ベクターが、(1)バクテロイデス属の細胞ではないヒト若しくは非ヒト動物共生若しくは相利共生細菌細胞と(2)バクテロイデス属の細胞である前記ファージに感染した細胞の間、又は(3)ファーミキューテス門の細胞ではないヒト若しくは非ヒト動物共生若しくは相利共生細菌細胞と(4)標的配列を含むファーミキューテス門の細胞の間で水平伝達可能である配列(例えば、本明細書において記載されるトランスポゾン)を含む、プラスミド又はファージミドである、態様12から16のいずれか1つの方法又はベクター。
18.ベクター又は各ベクターが、(1)バクテロイデス属の細胞である前記ファージに感染した細胞と、(2)ヒト又は非ヒト動物腸へのプロバイオティック投与に適している細菌細胞の間又は(3)標的配列を含むファーミキューテス門の細胞と、(4)ヒト又は非ヒト動物腸へのプロバイオティック投与に呈している細菌細胞の間で水平伝達可能であるプラスミド又はファージミド配列(例えば、本明細書において記載されるトランスポゾン)である、態様12から17のいずれか1つの方法又はベクター。
19.共生、相利共生又はプロバイオティック種が、ラクトバチルス属種(例えば、アシドフィルス((例えば、La-5、La-14又はNCFM)、ブレビ、ブルガリクス、プランタルム、ラモサス、フェルメンツム、カウカシクス、ヘルベチクス、ラクチス、レウテリ又はカゼイ例えば、カゼイシロタ)、ビフィドバクテリウム属種(例えば、ビフィダム、ブレブ、ロングム又はインファンティス)、ストレプトコッカス・サーモフィルス及びエンテロコッカス・フェシウムからなる群から選択される、態様15から18のいずれか1つの方法又はベクター。
20.改変が、(i)標的配列の切断、(ii)標的配列を含む遺伝子の転写を下方制御すること、(iii)標的配列を含む遺伝子の転写を上方制御すること又は(iv)標的で核酸配列を付加、欠失若しくは置換することである、本明細書における態様1から19のいずれか1つの方法、アレイ若しくはベクター又は任意の使用。
21.バクテロイデス門のファージが、crAssファージ、GB-124ファージ、GA-17ファージ、HB-13ファージ、H16-10ファージ、B40-8ファージ及びBフラガリスファージATCC51477-B1から選択されるバクテロイデス属のファージである、態様1から20のいずれか1つの方法、アレイ又はベクター。Nat Commun. 2014年7月24日、5:4498頁、doi: 10.1038/ncomms5498、「A highly abundant bacteriophage discovered in the unknown sequences of human faecal metagenomes」、Dutilh BEらが参照される。crAssファージ約97kbpゲノムは、公的に利用可能なメタゲノムにおいて、一緒のその他の既知ファージよりも6倍多量であり、それぞれ、ウイルス様粒子(VLP)に由来するメタゲノム及び全コミュニティーメタゲノム中のすべてのリードの最大90%及び22%を含み、公的データベース中のすべてのヒト糞便メタゲノムシーケンシングリードの1.68%に達する。新規共生プロファイリングアプローチを使用して、Dutilhらは、バクテロイデス属と関連するタンパク質相同体及びファージゲノムにコードされる独特の炭水化物結合ドメインと一致するこのファージのためのバクテロイデス属の宿主を予測した。
22.標的配列が、宿主細胞感染性、ファージ溶原性若しくは溶解性サイクル又はファージ生存力にとって必要であるファージ遺伝子、例えば、必須遺伝子又はコートタンパク質遺伝子により含まれる、本明細書における態様1から21のいずれか1つの方法、アレイ又はベクター又は任意の使用。
23.標的配列が、BACON(バクテロイデス門関連炭水化物結合)ドメインをコードする配列(例えば、宿主が、バクテロイデス属の宿主である)又はエンドリシンをコードする配列により含まれる、態様1から22のいずれか1つの方法、アレイ又はベクター。FEBS Lett. 2010年6月3日、584(11):2421〜6頁、doi:10.1016/j.febslet.2010.04.045. Epub 2010年4月21日、「Mining metagenomic data for novel domains: BACON、a new carbohydrate-binding module」、Mello Lらが参照される。ファージ構造タンパク質中のBACONドメインの存在は、粘液モデルとの提案されたバクテリオファージ接着によって説明され得る。このモデルによれば、ファージは、カプシドによって提示される炭水化物結合ドメイン(免疫グロブリン様フォールド又はBACONドメイン等)を介して腸粘液層を構成するムチン糖タンパク質と接着し、ファージが感染する細菌とのより頻繁な相互作用を促進する。
25.CRISPRアレイが、宿主細胞におけるcrRNAの発現及び産生のための配列R1-S1-R1'を含み、
(i)R1は、第1のCRISPRリピートであり、R1'は、第2のCRISPRリピートであり、R1又はR1'は、任意選択であり、
(ii)S1は、前記標的配列に対して95%以上同一であるヌクレオチド配列を含む又はからなる第1のCRISPRスペーサーである、
本明細書における態様1から24のいずれか1つの方法、アレイ若しくはベクター又は任意の使用。例えば、標的配列は、プロトスペーサーを含むか、本発明のアレイが、宿主細胞中にある場合には、Casに対して同族であるプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)にすぐ隣接するプロトスペーサー配列により含まれ、Casはまた、アレイから発現されるcrRNAに対して同族である。一実施形態では、Casは、細胞に対して内因性である。別の例では、Casは、例えば、本発明のベクターによって提供される宿主細胞に対して外因性である。
26.R1及びR1'が、宿主細胞と同一種の細胞のCRISPRアレイのリピート配列と少なくとも95%(例えば、96、97、98、99又は100%)同一である、態様25の方法、アレイ又はベクター。
27.R1及びR1'は、CRISPRアレイ(例えば、テタイオタミクロン及びフラガリス(例えば、バクテロイデス(Bacteroides fragalis)NCTC 9343から選択されるバクテロイデス属種のII-C型アレイ)のリピート配列に対して各々少なくとも95%(例えば、96、97、98、99又は100%)同一であり、宿主細胞が、リピート配列とともに機能的であるCRISPR/Casシステムを含み、例えば、前記種のバクテロイデス属の細胞である、態様25の方法、アレイ又はベクター。
28.R1及びR1'が、前記種の、例えば、前記種の前記宿主細胞のCRISPRアレイの第1の(最も5')及び第2の(第1のリピートのすぐ3'にあるリピート)リピート配列に対して、それぞれ、少なくとも95%(例えば、96、97、98、99又は100%)同一である、態様27の方法、アレイ、使用又はベクター。一例では、アレイは、II-C型アレイである。一例では、アレイ又はベクターは、R2-S2-R2'を更に含み、スペーサーS2は、スペーサーS1と同一又は異なっており(例えば、宿主細胞又はファージゲノム中の異なる標的部位を標的化するために)、R2及びR2'は、宿主細胞において機能的であり、任意選択で、R1と同一である。例えば、R1、R1'、R2及びR2'の各々は、BフラガリスCRISPRリピートである。
29.(iii)R1及びR1'の各々が、バクテロイデス属種の細胞のCRISPRアレイ(例えば、II-C型アレイ)のリピート配列に対して同一であり、種が、カッカエ、カピロサス、セルロシリチクス、コプロコラ、コプロフィルス、コプロスイス、ディスタソニス、ドレイ、エゲルチー、フェシス、フィネゴルジー、フルクス、フラガリス(例えば、フラガリスNCTC 9343)、インテスチナリス、メラニノゲニクス、ノルジー、オレイシプレヌス、オラリス、オバツス、ペクチノフィルス、プレベイウス、ステルコリス、テタイオタオミクロン、ユニフォルミス、ブルガツス及びキシラニソルベンスからなる群から選択され、(iv)宿主細胞が、リピート配列とともに機能的であるCRISPR/Casシステムを含み、前記群から選択される種のバクテロイデス属の細胞(例えば(iii)の選択された種と同一の種)である、態様25の方法、アレイ、使用又はベクター。
30.R1及びR1'が、標的配列の改変のために前記宿主バクテロイデス門又はファーミキューテス門の細胞のCRISPR/Casシステムとともに機能的である、態様25の方法、アレイ、使用又はベクター。一例では、R1、R1'、R2及びR2'は、同一細菌種、例えば、テタイオタミクロン若しくはフラガリス等のバクテロイデス属又はサーモフィルス若しくはピオゲネス等のストレプトコッカス属のII型(例えば、II-C型)CRISPR/Casシステムリピートである。
31.R1及びR1'が、バクテロイデス門 (例えば、バクテロイデス属若しくはプレボテラ属)又はファーミキューテス門(例えば、ストレプトコッカス属)の細胞のCRISPRアレイ(例えば、II-C型アレイ)のリピート配列と少なくとも95%(例えば、96、97、98、99又は100%)同一である、態様25の方法、アレイ、使用又はベクター。
32.R1及びR1'の各々が、表2の配列番号1〜5から選択される配列と少なくとも95%(例えば、96、97、98、99又は100%)同一であり、任意選択で、第1の細菌細胞が、例えば、表2における種又は株(例えば、選択された配列に対して列挙された種又は株)のバクテロイデス属の細胞である、態様25の方法、アレイ、使用又はベクター。
33.R1及びR1'の各々が、表2の配列番号6〜11から選択される配列と少なくとも95%(例えば、96、97、98、99又は100%)同一であり、任意選択で、第1の細菌細胞が、例えば、表2における種又は株(例えば、選択された配列に対して列挙された種又は株)のプレボテラ属の細胞である、態様25の方法、アレイ、使用又はベクター。
34.アレイ又は各アレイが、標的配列を改変するために前記宿主細胞においてcrRNAとともに機能する1種又は複数のCasヌクレアーゼとの組み合わせた状態にある、態様1から33のいずれか1つの方法、アレイ又はベクター。例えば、標的配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に対してすぐ隣接するプロトスペーサー配列を含み、任意選択で、PAMは、バクテロイデス門の宿主細胞により含まれるCasヌクレアーゼに対して同族である。一例では、Casは、II-C型Casヌクレアーゼである。
35.アレイ又は各アレイが、標的配列を改変するために前記宿主細胞においてcrRNAとともに機能する1種又は複数のCasヌクレアーゼをコードする核酸配列との組み合わせた状態にある、態様1から34のいずれか1つの方法、アレイ又はベクター。
36.R1及びR1'が、前記宿主細胞において標的を改変するためにII型Cas9ヌクレアーゼ(例えば、Sピオゲネス、Sサーモフィルス又はSオーレウスCas9)とともに機能性であり、任意選択で、方法、アレイ又はベクターが態様34又は35に更に従い、任意選択で、Casは前記Cas9である、態様25の方法、アレイ、使用又はベクター。
37.態様1から10又は14から36のいずれか1つの方法によって得ることができる細菌のex-vivo混合集団又は本明細書における使用。例えば、混合集団は、医学的又は栄養学的使用のための容器中にある。例えば、容器は、滅菌容器である。
38.治療的、予防的、化粧的、ヒト又は非ヒト動物体重低減(例えば、美容的低減)又は栄養学的使用のためのヒト又は非ヒト動物へ投与するための組成物であって、態様37の混合集団を含む組成物。一例では、組成物は、経口、全身、吸入的、直腸内、眼内、頬側又は膣内投与のためのものである。一例では、組成物は、ヒト又は非ヒト動物の腸又は口腔へ投与するためのものである。
39.態様37の混合集団又は態様38の組成物を含む、ヒト又は非ヒト動物消費用の食料又は飲料。
40.栄養補助食品又はプロバイオティック飲料若しくは食料である、態様39の食料又は飲料。
41.ヒト若しくは非ヒト動物における、又は飲料水におけるバクテロイデス門の感染を処置又は予防するための抗生物質組成物であって、態様11から36のいずれか1つのアレイ又はベクターを含み、任意選択で、改変が、態様21(iii)又は(iv)に記載の抗生物質組成物。
42.ヒト又は非ヒト動物において腸バクテロイデス門の割合を増大するための(例えば、肥満症、糖尿病(例えば、I型)又はGI炎症状態を処置又は予防するために)プロバイオティック組成物であって、態様11から36のいずれか1つのアレイ又はベクターを含み、任意選択で、改変が、態様21(iii)又は(iv)に記載のプロバイオティック組成物。
43.ヒト又は動物におけるファーミキューテス門に対する腸バクテロイデス属の相対割合を増大するための、例えば、肥満症、糖尿病(例えば、I型糖尿病)又はGI状態(例えば、クローン病、IBD、IBS又は潰瘍性大腸炎)を処置又は予防するための、態様38、41又は42の組成物。
44.宿主細胞において、宿主細菌細胞(例えば、上記のようなファーミキューテス門又は病原性細菌細胞)のゲノム又はウイルス(例えば、ファージ)のゲノムの標的配列を改変するための、遺伝子操作されたCRISPRアレイを含む核酸ベクター(例えば、プラスミド、ウイルス、ファージ又はファージミド)であって、
(a)CRISPRアレイは、宿主細胞におけるcrRNA(例えば、gRNAにより含まれる)の発現のための1つ又は複数の配列及び配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)crRNAは、標的配列を改変するために宿主細胞において標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能であり、
(c)アレイは、異なる種の第1及び第2の細菌細胞の間で水平伝達可能であるトランスポゾンにより含まれる
核酸ベクター。
任意選択で、Casヌクレアーゼは、宿主細胞の野生型内因性Casヌクレアーゼである。
45.アレイが、ヒト又は非ヒト動物へ投与するためのものであり、第1の細胞種が、ヒト又は動物に対して非病原性であり、第2の細胞種が、ヒト又は動物に対して病原性であり、アレイが第1の細胞により含まれる、態様44のベクター。
46.第1の細胞種が、ヒト又は動物と共生又は相利共生する種、例えば、腸細菌叢種である、態様45のベクター。
47.第1の細胞種が、ラクトバチルス属種(例えば、アシドフィルス (例えば、La-5、La-14又はNCFM)、ブレビ、ブルガリクス、プランタルム、ラモサス、フェルメンツム、カウカシクス、ヘルベチクス、ラクチス、レウテリ又はカゼイ例えば、カゼイシロタ)、ビフィドバクテリウム属種(例えば、ビフィダム、ブレブ、ロングム又はインファンティス)、ストレプトコッカス・サーモフィルス及びエンテロコッカス・フェシウムからなる群から選択される種である、態様45又は46のベクター。
48.ヒト又は動物消費のための飲料(例えば、プロバイオティックドリンク)又は食料により含まれる、態様44から47のいずれか1つのベクター。
49.標的配列を標的化するための少なくとも1つのリピート-スペーサー-リピートユニットを含み、リピートが、宿主細胞のCRISPR/Casシステムのリピートと少なくとも95%(例えば、96、97、98、99又は100%)同一であり、ベクターのリピートが、標的ヌクレオチド配列を改変するために宿主システムのCasをガイドするように宿主細胞において作動可能である、態様44から48のいずれか1つのベクター。
50.Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をコードする配列を欠く、態様49のベクター。
(a)CRISPRアレイは、crRNAの発現のための1つ又は複数の配列及び宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)crRNAは、標的配列を改変するために、宿主細胞において標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能であり、
(c)ベクターは、(i)第1の宿主細胞の第1及び第2の核酸位置の間を伝達可能であり、各位置は、染色体若しくはプラスミド上の位置であり、標的配列は、宿主細胞により含まれるか、又は(ii)第1及び第2の宿主細胞の間を伝達可能であり、標的配列は、第1及び/若しくは第2の宿主細胞により含まれる、
遺伝子操作されたCRISPR核酸ベクター。
2.MGEが、組み込み及び接合性エレメント(ICE)である、又はそれを含む、実施形態1のベクター。或いは、MGEは、可動化可能MGE(すなわち、可動化されるために、MGEによって保持されない遺伝子によってコードされる因子を使用できる)である。MGEに関連して用語「可動化可能」及び「接合性」は、当業者には容易に明らかである。
3.ICEが、トランスポゾン、例えば、接合性トランスポゾンである実施形態2のベクター。一例では、MGEは、機能的ヘルパーエレメントの存在下で可動化可能である可動化可能トランスポゾンであり、任意選択で、トランスポゾンは、前記ヘルパーエレメントと組み合わせた状態にある。
4.ベクターがプラスミドであり、任意選択で、MGEが、プラスミドにより含まれるトランスポゾンである、実施形態1から3のいずれか1つのベクター。例えば、トランスポゾンは、接合性トランスポゾンである。一例では、トランスポゾンは、可動化可能トランスポゾン(例えば、プラスミドによって、例えば、プラスミドのトランスポゾン配列の外側の遺伝子によってコードされる1つ又は複数の因子を使用して可動化可能)。任意選択で、トランスポゾンは、I型トランスポゾンである。任意選択で、トランスポゾンは、II型トランスポゾンである。
5.oriTが、第1及び第2の宿主細胞において機能的である実施形態1から4のいずれか1つのベクター。これは、例えば、第1及び第2の細胞が異なる種のものである場合に、細菌集団中の細菌全体への広がり及び伝播を促進するのに有用である。
6.第1の細胞により含まれる場合に、第1の細胞が、MGEを第2の細胞に伝達するように作動可能であるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、配列がMGEにより含まれない、実施形態5のベクター。これは、このような配列についてMGE中の空間を使用することを避けるのに有用である。例えば、これは、細胞間の伝達のためのより緻密なMGEの構築を可能にする、又は例えば、宿主細胞中のそれぞれの配列を標的化するため、若しくは第1及び第2の宿主細胞中の異なる配列を標的化するために複数のスペーサーを含むように、より大きな若しくはより多いCRISPRアレイを含めることを可能にする。
7.配列が、ベクターにより含まれない、実施形態6のベクター。これは、このような配列についてベクター又はMGE中の空間を使用することを避けるのに有用である。例えば、これは、細胞間の伝達のためのより緻密なベクター又はMGEの構築を可能にする、又は例えば、宿主細胞中のそれぞれの配列を標的化するため、若しくは第1及び第2の宿主細胞中の異なる配列を標的化するために複数のスペーサーを含むように、及び/若しくはCasタンパク質、例えば、Cas9をコードする1つ又は複数の配列を含むように、より大きな若しくはより多いCRISPRアレイを含めることを可能にする。
8.配列が、第1の細胞の接合性トランスポゾンにより含まれる、実施形態6又は7のベクター。これは、(例えば、ヒトマイクロバイオーム中の異なる細菌種の)第1及び第2の宿主細胞間の本発明のMGEの水平伝達のために、MGEの外側の因子を利用して、接合性転位を達成することを可能にするので有用である。
9.トランスポゾンが、トランスでMGEを第2の細胞に伝達するように作動可能である、実施形態8のベクター。これは、(例えば、ヒトマイクロバイオーム(micribiome)中の異なる細菌種の)第1及び第2の宿主細胞間の本発明のMGEの水平伝達のために、MGEの外側の因子を利用して、接合性転位を達成することを可能にするので有用である。例えば、本発明のMGEのoriTは、宿主細胞の接合性トランスポゾンにより含まれるoriTと同一である。これは、第1及び第2の宿主細胞(例えば、異なる種、例えば、ヒトマイクロバイオーム種の細菌細胞)間でのMGEの水平伝達を達成するために、本発明のMGEが宿主細胞によってコードされる因子とともに作動することを可能にするのに有用である。これは、MGEがより緻密であることを可能にし、上で論じられるようなCRISPRアレイ及び/又はCas遺伝子のための空間を開放する。
10.第1の細胞により含まれる場合に、MGEのoriTが、第1の細胞のICEにより含まれるoriTと同一であり、ICEが、MGEを第2の細胞に伝達するようにトランスで作動可能である、実施形態1から9のいずれか1つのベクター。
11.ベクターoriTが、バクテロイデス門(例えば、バクテロイデス目又はバクテロイデス属)又はプレボテラ属トランスポゾンのoriTである、実施形態1から10のいずれか1つのベクター。これは、第1及び/又は第2の宿主細胞が、それぞれ、バクテロイデス門(例えば、バクテロイデス目又はバクテロイデス属)又はプレボテラ属の細胞である場合に有用である。例えば、第1の細胞は、このような種の細胞であり、第2の細胞は、ファーミキューテス門の細胞であり、標的配列は、第2の細胞により含まれるが、第1の細胞により含まれず、それによって、CRISPRアレイは、第2の細胞中のCasに標的配列を切断するように指示する。一例では、標的配列は、第2の細胞の必須遺伝子又は抗生物質耐性遺伝子により含まれ(後者については、任意選択で、ベクターは、前記抗生物質と組み合わせた状態にある、又は前記抗生物質との組合せでヒト若しくは非ヒト動物に投与される)。任意選択で、トランスポゾンは、CTnDot又はCTnERLトランスポゾンであり、ベクターは、テトラサイクリンと組み合わせた状態にある、又はテトラサイクリンとの組合せでヒト若しくは非ヒト動物に投与される。
12.ベクターoriTが、CTnDot、CTnERL SXT/R391、Tn916又はTn4371ファミリートランスポゾンoriTである、実施形態1から11のいずれか1つのベクター。
13.MGEが、第1及び第2の末端リピート配列並びにリピート配列間のCRISPRアレイを含む、実施形態1から12のいずれか1つのベクター。
14.MGEが、トランスポゾンコピーを、それが第2の位置に伝達している場合には(1)第1の核酸位置に、又は(2)第2の細胞に伝達している場合には第1の細胞中に残す、実施形態1から13のいずれか1つのベクター。これは、宿主細胞を含む細菌集団におけるMGEの増殖及び維持を促進するのに有用である。代替において、MGEは、トランスポゾンコピーを、(i)それが第2の位置に伝達されている場合には第1の核酸位置に、又は(ii)それが第2の細胞に伝達している場合には第1の細胞中に残さない。
15.第1及び/又は第2の細胞により含まれる場合の(例えば、第1及び第2の細胞により含まれるベクターの第1及び第2のコピー)、実施形態1から14のいずれか1つのベクター。
16.第1及び第2の細胞が、異なる種の細胞である、実施形態15のベクター。例えば、第1の細胞は、ラクトバチルス属の細胞(例えば、本明細書において記載されるような)であり、及び/又は第2の細胞は、バクテロイデス門(Bcteroidetes)(例えば、バクテロイデス属の細胞、例えば、本明細書において記載されるような細胞)又はファーミキューテス門の細胞(例えば、本明細書において記載されるような細胞)である。一例では、例えば、GI状態若しくは糖尿病を処置若しくは予防するために、又は肥満症を処置若しくは予防するためにヒトの腸マイクロバイオームに投与するために、第1の細胞は、バクテロイデス門(Bcteroidetes)(例えば、バクテロイデス属の細胞、例えば、本明細書において記載されるような細胞)であり、第2の細胞は、ファーミキューテス門の細胞(例えば、本明細書において記載されるような細胞)である。
17.第1及び第2の細胞が、細菌又は古細菌細胞である、実施形態15又は16のベクター。
18.第1の細胞が、ヒトにおいて非病原性(例えば、共生又は相利共生細菌細胞)であり、任意選択で、第2の細胞が、ヒトにおいて病原性細胞である、実施形態16又は17のベクター。代替において、第2の細胞が、ヒトにおいて非病原性細胞である。用語「ヒトにおいて非病原性」とは、ヒトのマイクロバイオーム(例えば、腸、膣、腋窩又は口腔マイクロバイオーム)においては病原性又は実質的な病原性を伴わずに存在し得るが、ヒトのその他の環境においては病原性である特定の細菌種(例えば、バクテロイデス属種、例えば、フラガリス)等の細胞を含む。当業者ならば、第1の細胞種は、ヒト中又はヒト上で保持することができ、第2の細胞種は、ヒト中又はヒト上で低減されなければならないということを容易に理解するであろう。例えば、CRISPRアレイは、第2の細胞のゲノムを改変して、死滅させる又はヒト中又はヒト上での細胞生存力若しくは成長を低減する。例えば、標的部位は、第2の細胞により含まれ、部位は、前記Casヌクレアーゼによって切断され、それによって、標的部位を含む遺伝子を不活性化又は下方制御する。例えば、遺伝子は、第2の細胞の必須遺伝子又は抗生物質耐性遺伝子である。一例では、遺伝子は、病原性遺伝子である。
19.第2の細胞(各宿主細胞)が、(i)例えば、メチシリン、バンコマイシン耐性及びテイコプラニンから選択される抗生物質に対して耐性であるスタフィロコッカス・オーレウス細胞、(ii)例えば、セファロスポリン系剤(例えば、セフタジジム)、カルバペネム系剤(例えば、イミペネム又はメロペネム)、フルオロキノロン、アミノグリコシド系剤(例えば、ゲンタマイシン又はトブラマイシン)及びコリスチンから選択される抗生物質に対して耐性の、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeuroginosa)細胞、(iii)例えば、カルバペネムに対して耐性のクレブシエラ属(例えば、ニューモニエ(pneumoniae))の細胞、(iv)例えば、エリスロマイシン、クリンダマイシン、β-ラクタム、マクロライド、アモキシシリン、アジスロマイシン及びペニシリンから選択される抗生物質に対して耐性のストレプトコッカス属(例えば、ニューモニエ又はピオゲネス)の細胞、(v)例えば、セフトリアキソン、アジスロマイシン及びシプロフロキサシンから選択される抗生物質に対して耐性のサルモネラ属(例えば、血清型チフィ(Typhi))の細胞、(vi)例えば、シプロフロキサシン及びアジスロマイシンから選択される抗生物質に対して耐性のシゲラ属(Shigella)の細胞、(vii)例えば、イソニアジド(INH)、リファンピシン(RMP)、フルオロキノロン、アミカシン、カナマイシン及びカプレオマイシンに対する耐性から選択される抗生物質に対して耐性の結核菌(mycobacterium tuberculosis)細胞、(viii)例えば、バンコマイシンに対して耐性のエンテロコッカス属の細胞、(ix)例えば、セファロスポリン及びカルバペネムから選択される抗生物質に対して耐性の腸内細菌科細胞、(x)例えば、トリメトプリム、ニトロフラントイン(itrofurantoin)、セファレキシン及びアモキシシリンから選択される抗生物質に対して耐性の大腸菌(E coli)細胞、(xi)例えば、フルオロキノロン系抗生物質及びカルバペネムから選択される抗生物質に対して耐性のクロストリジウム属(例えば、ディフィシル(dificile))の細胞、(xii)例えば、セフィキシム(例えば、経口セファロスポリン)、セフトリアキソン(注射用セファロスポリン)、アジスロマイシン及びテトラサイクリンから選択される抗生物質に対して耐性のナイセリア・ゴノレエ(Neisseria gonnorrhoea)細胞、(xiii)例えば、ベータ-ラクタム、メロペネム及びカルバペネムから選択される抗生物質に対して耐性のアシネトバクター・バウマニー(Acinetoebacter baumannii)細胞、又は(xiv)例えば、シプロフロキサシン及びアジスロマイシンから選択される抗生物質に対して耐性のカンピロバクター属(Campylobacter)の細胞から選択される細胞である実施形態1から19のいずれか1つのベクター又は本明細書における任意の使用。このような種は、ヒトに対して病原性であり得る。
20.標的部位が、第2の細胞の抗生物質耐性遺伝子により含まれ、抗生物質が、実施形態19において列挙されたそれぞれの抗生物質である、実施形態19のベクター又は使用。
21.第1の細胞が、バクテロイデス門(例えば、バクテロイデス目又はバクテロイデス属)の細胞、;ラクトバチルス属(例えば、アシドフィルス (例えば、La-5、La-14又はNCFM)、ブレビ、ブルガリクス、プランタルム、ラモサス、フェルメンツム、カウカシクス、ヘルベチクス、ラクチス、レウテリ又はカゼイ例えば、カゼイシロタ)、ビフィドバクテリウム属種(例えば、ビフィダム、ブレブ、ロングム又はインファンティス)、ストレプトコッカス・サーモフィルス及びエンテロコッカス・フェシウム、アリスタイプ属、アルカリフレクス属、パラバクテロイデス属、タンネレラ属又はキシラニバクター属の細胞である、実施形態15〜20のいずれか1つのベクター。
22.(i)の第1及び/又は第2の核酸位置が、バクテロイデス門(例えば、バクテロイデス目又はバクテロイデス属)の細胞により含まれるか、又は(ii)の第1及び/又は第2の宿主細胞が、バクテロイデス門 (例えば、バクテロイデス目若しくはバクテロイデス属)若しくはプレボテラ属の細胞である、実施形態1から22のいずれか1つのベクター。
23.第1の細胞が、バクテロイデス門(例えば、バクテロイデス目又はバクテロイデス属)の細胞であり、第2の細胞が、ファーミキューテス門(例えば、クロストリジウム属又はスタフィロコッカス属)の細胞である、例えば、ベクターが、GI状態若しくは糖尿病を処置若しくは予防するために、又は肥満症を処置若しくは予防するためにヒトの腸マイクロバイオームに投与するためのものである、実施形態22のベクター。
24.第1の細胞(各第1の細胞)が、環境(例えば、水又は土壌環境)において環境的に許容され、任意選択で、第2の細胞(各宿主細胞)が環境において許容されない、実施形態16又は17のベクター(又は本明細書における任意の使用)。水環境は、当業者には容易に明らかであろうが、例えば、海洋又は水路(例えば、湖、運河、河川又は貯水池)環境であり得る。一例では、水環境は、ヒト消費のために意図される飲料水又は汚水である。一例では、土壌環境は、農地の土壌又は採掘現場(例えば、鉱物又は金属採掘現場)の土壌である。
25.改変された標的部位での組込みのための核酸(例えば、DNA)と組み合わせた実施形態1から24のいずれか1つのベクター。
26.組み込むための核酸は、調節エレメント又はエキソン配列、例えば、ヒト配列である、又はそれを含む、実施形態25のベクター。
27.MGEの可動化のためのトランスポサーゼと組み合わせた、実施形態1から26のいずれか1つのベクター。
28.ベクター又はMGEが、第1の宿主細胞において作動可能である毒素-抗毒素(antioxin)モジュールを含み、任意選択で、毒素-抗毒素モジュールが、第1の細胞以外の細胞において作動可能ではない、又は作動が低減された抗毒素遺伝子を含む、実施形態1から27のいずれか1つのベクター。
29.ベクター又はMGEが、第2の宿主細胞において作動可能である毒素-抗毒素(antioxin)モジュールを含み、任意選択で、毒素-抗毒素モジュールが、第2の細胞以外の細胞において作動可能ではない、又は作動が低減された抗毒素遺伝子を含む、実施形態1から28のいずれか1つのベクター。
30.ベクター又はMGEが、第1及び第2の宿主細胞において作動可能である毒素-抗毒素(antioxin)モジュールを含み、任意選択で、第1及び第2の細胞以外の細胞において作動可能ではない、又は作動が低減された抗毒素遺伝子を含む、実施形態1から29のいずれか1つのベクター。毒素-抗毒素モジュールの使用は、選択的利点、したがって、MGE保持及び広がりを付与するのに有用である。例えば、モジュールは、I型モジュール、例えば、Hok-Sokモジュールである。例えば、モジュールは、II型モジュール、例えば、HiCa-HicBモジュールである。例えば、モジュールは、tad-ata型毒素-抗毒素モジュールである。例えば、モジュールは、プラスミド中毒モジュールである。一例では、第1及び/又は第2の細胞は、バクテロイデス属の細胞であり、モジュールは、バクテロイデス属種のモジュール、例えば、Txe/YoeBファミリー中毒モジュール(例えば、http://www.uniprot.org/uniprot/F0R9D1を参照のこと)、RelE/StbEファミリー中毒モジュール(例えば、http://www.uniprot.org/uniprot/F0R9A0を参照のこと)、HigAファミリー中毒モジュール(例えば、http://www.uniprot.org/uniprot/D7J8V2又は http://www.uniprot.org/uniprot/D2ESD0を参照のこと)、RelE/StbEファミリー中毒モジュール(例えば、http://www.uniprot.org/uniprot/F0R5F4を参照のこと)。ベクター又はMGE中の毒素-抗毒素の使用は、所望の細胞(例えば、第1及び第2の及び/又は第3の細菌細胞)以外のベクターを有する細胞の破壊を可能にするのに有用であり得る。この例では、MGE又はベクターは、細菌毒素-抗毒素モジュールの毒素遺伝子及び同族抗毒素遺伝子を含み、毒素及び抗毒素遺伝子の発現は、例えば、異なるプロモーターから別個に調節される。例えば、毒素遺伝子は、第1の、第2の(及び第3の)細胞において構成的に活性であるプロモーターを含むことができ、その結果、毒素は常に産生される。抗毒素遺伝子は、第1及び/又は第2の細胞において1つ又は複数の因子(例えば、発現されたタンパク質)によって誘導可能であるが、異なる株又は種の非標的細胞ではそうではないプロモーターを含みうる。公知であるように、抗毒素は、細菌毒素/抗毒素システムにおける毒素よりも本質的に安定ではなく、したがって、ベクター又はMGEの、標的細胞ではない(例えば、第1及び/又は第2の細胞ではない)細胞への伝達は、抗毒素発現の不在下又はより低い抗毒素活性下での毒素発現につながり、したがって、非標的細胞の細胞死につながる。したがって、これは、標的細胞(第1、第2及び第3の細胞)に対して本発明のベクターを取り込み、保持する選択圧を作り出し、その結果、中に所望のCRISPRアレイ活性を有することができ、集団(腸細菌叢等)中の標的細胞にわたって伝播されうる。これはまた、非標的細胞へのベクター又はMGEの広がりを制限し、その結果、アレイの効果は、集団において制御される-この点において、非標的細胞に対してベクターを取り込まない圧力があることとなり、そうする場合には、レシピエント細胞は集団中で生存せず、それによって、MGE及びアレイを有する非標的細胞の複製を制限することとなる。
31.第1及び第2の細胞は、同一門のもの(例えば、両細菌細胞)であり、ベクターは、(d)第1の細胞及び/又は第2の細胞において複製可能又は作動可能であるが、同一門の別の細胞ではそうではない、(e)第1の細胞及び/又は第2の細胞では複製可能又は作動可能であるが、同一目の別の細胞ではそうではない、(f)第1の細胞及び/又は第2の細胞において複製可能又は作動可能であるが、同一綱の別の細胞ではそうではない、(g)第1の細胞及び/又は第2の細胞では複製可能又は作動可能であるが、同一目の別の細胞ではそうではない、(h)第1の細胞及び/又は第2の細胞では複製可能又は作動可能であるが、同一科の別の細胞ではそうではない、(i)第1の細胞及び/又は第2の細胞では複製可能又は作動可能であるが、同一属の別の細胞ではそうではない、(j)第1の細胞及び/又は第2の細胞では複製可能又は作動可能であるが、同一種の別の細胞ではそうではない、(k)第1の細胞及び/又は第2の細胞では複製可能又は作動可能であるが、同一株の別の細胞ではそうではない、実施形態1から30のいずれか1つのベクター。
32.第1のベクターが、第1の細胞により含まれ、第2のベクターが、第2の細胞により含まれ、細胞が異なる種の細胞(例えば、異なる細菌種)であり、ベクターMGEの一方又は両方が第3の細胞(例えば、細菌細胞)に伝達可能であり、第3の細胞種が、第1若しくは第2の細胞の種と同一であるか、又は第1及び第2の細胞種とは異なる種である、細胞の混合集団中の実施形態1から31のいずれか1つのベクターの第1及び第2のコピー。これは、第1の細胞が担体として作用し得るので(例えば、非病原性である場合、ヒト(huma)又は動物に投与されてもよく、その結果、ヒト又は動物に定植する、例えば、そのマイクロバイオーム)有用である。水平伝達によって、担体は、本発明のCRISPRアレイを第3の細胞に伝達し、伝播し得る(直接的に、又は第2の細胞を介して、後者はアレイのリザーバーとして作用する)。次いで、アレイは、第3の細胞において標的配列のCas改変(例えば、切断)を媒介して、例えば、第3の細胞の必須遺伝子又は抗生物質耐性遺伝子を不活性化又は下方制御することができる。
33.ベクター又はMGEが、第1、第2及び第3の宿主細胞において作動可能である毒素-抗毒素(antioxin)モジュールを含み、任意選択で、毒素-抗毒素モジュールが、第1、第2及び第3の細胞以外の細胞において作動可能ではない、又は作動が低減された(すなわち、より少ない)抗毒素遺伝子を含む、実施形態32のベクター。
34.MGEが、接合性トランスポゾンであり、oriTが、第1及び第2の宿主細胞において機能的であり、MGEが、第1及び第2の末端リピート配列及びリピート配列の間のCRISPRアレイを含み、第1及び第2の細胞が細菌細胞であり、第2の細胞が、ヒト細菌叢細胞種(例えば、病原性種)であり、標的部位が、第2の細胞により含まれるが、第1の細胞により含まれず、前記改変が、第2の細胞において前記標的を含む遺伝子又は調節配列を不活性化する、又は下方制御する、実施形態1から33のいずれか1つのベクター。
35.第1又は第2の細胞により含まれる場合の、実施形態34のベクター。
36.第1及び第2の細胞が、混合細菌細胞集団、例えば、ヒト又は非ヒト動物(例えば、イヌ、ネコ又はウマ)腸、膣、腋窩又は口腔細菌叢種の細胞の集団により含まれる、実施形態1から35のいずれか1つのベクター。上記で説明されたように、集団は、そのマイクロバイオームを定植するためにヒト又は動物へ投与するために有用である。
37.各細胞が、実施形態1から36のいずれか1つに記載のベクターを含む、実施形態22に規定されるような複数の細胞を含むex vivo組成物。或いは、組成物は、in vivo、例えば、非ヒト動物におけるものである。
38.実施形態1から36のいずれか1つのベクター又は実施形態37の組成物を含むヒト又は非ヒト動物消費用の飲料又は食料。飲料は、例えば、ヒト又は動物において肥満症又はGI状態を処置又は予防するための、ヒト又は動物による、例えば、毎日、2日に1回又は週に1回の消費のための、例えば、プロバイオティックドリンクであり得る。
39.各細胞が、実施形態1から36のいずれか1つに記載のベクターを含む、複数のバクテロイデス属の細胞を含む組成物。
40.第1の細胞の亜集団及び第2の細胞の亜集団を含む細菌細胞の混合集団であって、第1の細胞は、実施形態1から36のいずれか1つに記載のベクターを含み、ベクターは、第1及び第2の細胞亜集団間で水平伝達可能である、細菌細胞の混合集団。このような集団は、細菌が、ヒト又は動物の1つ又は複数のマイクロバイオーム(例えば、腸マイクロバイオーム)に定植するように、ヒト又は動物に投与することができる(例えば、鼻腔内に)ので有用である。特に、それらの細胞がヒト又は動物にとって非病原性である(例えば、腸マイクロバイオームにおいて非病原性)場合に、第1の(及び任意選択で、同様に第2の)細胞は、本発明のCRISPRアレイの担体として作用し得る。マイクロバイオームは、本明細書において開示される任意のその他のマイクロバイオーム又は細菌叢集団であり得る。
41.第1及び第2の細菌種の一方又は両方が、ヒト又は非ヒト動物の腸細菌叢に定植可能であり、任意選択で、第1の細菌が、ヒト又は動物と共生又は相利共生している、実施形態40の集団。第1の細菌は、ヒト又は動物に安全に投与することができ、その後、細菌叢のその他の細胞への伝達のために本発明のアレイの担体として作用し得ることが有用である。
42.混合集団が、飲料又は水(例えば、ヒト消費用の水路又は飲料水)又は土壌によって保持される、実施形態40の集団。水又は土壌における集団の提供は、環境において、又は(水について)加熱、冷却又は工業システムにおいて、又は飲料水貯蔵容器においてこのような処置をするのに有用である。
任意の実施形態の一例では、第2の細胞は、標的配列を含むコレラ(cholera)細胞であり、標的配列が改変される場合に、細胞が死滅されるか、又は細胞増殖が低減される。一例では、第2の細胞は、ヒト消費用の水(例えば、ヒト消費用に処理する前又は処理した後のこのような水)により含まれる。一例では、ベクターは、ヒトにおいてこれらを処置又は予防するためにヒトに投与するための医薬組成物により含まれる。
43.in vitroで実施形態1から36のいずれか1つに記載の複数のベクターを含む組成物。例えば、組成物は、工業用装置又は容器(例えば、例えば、食物、消費材、化粧品、個人の健康製品、石油又はオイル製造のための)において多種細菌集団と混合される。
44.そのマイクロバイオームを治療的又は予防的に定植し、バランスを取り直すために、又はヒト若しくは動物を美容的に変更するために(例えば、美容的体重減少のために)、ヒト又は非ヒト動物に投与するための、実施形態1から44のいずれか1つのベクター、組成物、食料、飲料又は集団。
45.宿主細胞において標的ヌクレオチド配列を改変する方法であって、
(1)宿主細胞を、担体細胞と組み合わせる工程であって、
(a)担体細胞は、標的を改変するためのCRISPRアレイを含むCRISPR核酸ベクターを含み、
(b)CRISPRアレイは、宿主細胞における、crRNAの発現のための1つ又は複数の配列及び配列の転写のためのプロモーターを含み、
(c)crRNAは、標的配列を改変するために、宿主細胞において標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能である
工程と、
(2)細胞を一緒に培養する工程であって、ベクターが担体細胞から宿主細胞に伝達され、それによって、crRNAが、宿主細胞において標的配列とハイブリダイズして、Casをガイドし、標的が改変される、工程と
を含む方法。
46.ベクターが、実施形態1から36のいずれか1つに従う、実施形態45の方法。
47.宿主細胞は、ヒト又は非ヒト動物マイクロバイオーム細菌種の細胞であり、任意選択で、宿主細胞は、病原性細菌種の細胞である、実施形態45又は46の方法。一例では、本明細書における任意のマイクロバイオームは、腸、膣、腋窩、頭皮、皮膚又は口腔マイクロバイオームから選択される。
48.担体細胞が、ヒト又は非ヒト動物マイクロバイオーム細菌種と共生又は相利共生する種のものである、実施形態45から47のいずれか1つの方法。一例では、担体細胞は、例えば、鼻腔内に、局所に又は経口的に投与される場合に、ヒトに対して非病原性である。
49.宿主細胞が、ヒト又は非ヒト動物の腸マイクロバイオーム細菌種のものである、実施形態45から48のいずれか1つの方法。
50.第1及び第2の細菌宿主細胞種の亜集団を含む細菌の混合集団における前記亜集団の相対比を変更する方法であって、
A:前記第1の細菌宿主細胞を提供する工程と、
B:第2の細菌宿主細胞を提供する工程であって、第2の細胞が、第1の細胞に対して異なる種又は株の細胞である工程と、
C:遺伝子操作されたCRISPRアレイを第1の細菌宿主細胞導入する工程であって、各CRISPRアレイは、前記第2の宿主細胞におけるcrRNAの発現のための1つ又は複数の配列及び配列の転写のためのプロモーターを含み、crRNAは、標的配列を改変するために宿主細胞において、前記第2の細胞により含まれる標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能である工程と、
D:第1及び第2の細菌細胞を一緒に組み合わせて、混合細菌集団を製造する工程と、
E:混合集団における細菌成長を可能にし、その結果、第1の細菌細胞から第2の細菌細胞へのCRISPRアレイの水平伝達が生じる工程であって、第2の細胞中の標的配列が、Cas改変され、それによって、前記第1及び第2の細菌の相対比が変更される、工程と
を含む方法。
51.各CRISPRアレイが、実施形態1から26のいずれか1つに従う、実施形態50の方法。
52.工程Eの混合集団の第1のサンプルを得ること、及び任意選択で、細胞の第2のサンプル中の第2の細胞の割合に対する、第1のサンプル中の第2の細胞の割合を比較することを更に含み、第2のサンプルが、工程Bにおいて第2の細胞を提供するために使用される細菌細胞の混合集団のサンプルであり、比較により、第2の細胞の割合が、工程E後に増大又は減少されていることが示される、実施形態50又は51の方法。
53.第2のサンプルが、ヒト又は動物マイクロバイオーム(例えば、腸、膣、頭皮、腋窩、皮膚又は口腔細胞)のサンプルである、実施形態52の方法。
54.ヒト又は動物マイクロバイオーム(例えば、腸、膣、頭皮、腋窩、皮膚又は口腔細胞)のサンプルが、工程Bの第2の細胞を提供するために使用される、実施形態50から53のいずれか1つの方法。
55.第1の細胞の組換え培養集団が、工程Aに使用される、実施形態50から54のいずれか1つの方法。
56.工程Eにおいて、プラスミド、ICE又はトランスポゾン水平伝達が使用され、各プラスミド、ICE又はトランスポゾンが、前記CRISPRアレイを含む、実施形態50から55のいずれか1つの方法。
57.例えば、肥満症、糖尿病IBD、GI管状態又は口腔状態を処置又は予防するために、治療的又は予防的に、ヒト又は非ヒト動物の細菌叢のバランスを取り直すための、実施形態50から56のいずれか1つの方法。糖尿病は、I型又はII型であり得る。一例では、予防は医学的である。一例では、本明細書において予防は、非医学的、例えば、美容的又は衛生目的である。例えば、細菌叢は、腋窩細菌叢であり、方法は、ヒトの体臭を防ぐ又は低減するためである。例えば、この場合には、方法は、ヒト体臭の生成及び/又は持続を媒介する宿主細菌細胞の成長又は生存力を下方制御する。
58.担体及び宿主細胞とは異なる種又は株の第3の細菌宿主細胞を提供することを含み、第3の細胞が、工程Eにおいて混合集団により含まれ、又は工程E後に前記集団と組み合わされ、第3の宿主細胞へのCRISPRアレイの水平伝達が生じる、実施形態50から57のいずれか1つの方法。
59.第3の細胞が、前記標的配列を含まない、実施形態58の方法。
このように、第3の細胞は、アレイの担体として作用することができ、標的配列を含む宿主細胞へアレイを水平伝達可能である。
60.第3の細胞が、Cas改変の標的配列を含まない、実施形態58の方法。
61.担体(及び任意選択で、同様に第3の)細胞が、実施形態21に列挙される種のもの、例えば、バクテロイデス門の細胞である、実施形態50から60のいずれか1つの方法。
62.宿主細胞が、実施形態19に列挙される種のもの又はファーミキューテス門の細胞である、実施形態50から60のいずれか1つの方法。
63.各ベクターが、プラスミド、ファージ(例えば、パッケージングされたファージ)又はファージミドである、又はそれにより含まれる、実施形態1から62のいずれか1つのベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。
64.改変が、(i)標的配列を切断すること、(ii)標的配列を含む遺伝子の転写を下方制御すること、(iii)標的配列を含む遺伝子の転写を上方制御すること又は(iv)標的で核酸配列を付加、欠失又は置換することである、実施形態1から63のいずれか1つのベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。
65.各標的配列が、宿主細胞の調節エレメント又は遺伝子により含まれる配列であり、遺伝子が、必須遺伝子、CRISPR遺伝子又は抗生物質耐性遺伝子であり、任意選択で、調節エレメントが、このような遺伝子のエレメントである、実施形態1から64のいずれか1つのベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。代替において、遺伝子は病原性遺伝子である。
66.各標的配列が、ファージゲノムにより含まれる配列であり、ファージが、宿主細胞により含まれる、実施形態1から65のいずれか1つのベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。一例では、標的配列は、宿主細胞感染性、ファージ溶原性若しくは溶解性サイクル又はファージ生存力、例えば、必須遺伝子若しくはコートタンパク質遺伝子にとって必要であるファージ遺伝子により含まれる.
67.各CRISPRアレイが、宿主細胞におけるそれぞれのcrRNAの発現及び産生のために配列R1-S1-R1'を含み、
(i)R1は、第1のCRISPRリピートであり、R1'は、第2のCRISPRリピートであり、R1又はR1'は、任意選択であり、
(ii)S1は、前記標的配列に対して95%以上同一であるヌクレオチド配列を含む又はからなる第1のCRISPRスペーサーである、
実施形態1から67のいずれか1つのベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。
68.R1及びR1'が、それぞれ、第2の宿主細胞種のCRISPRアレイの第1及び第2のリピート配列と少なくとも95%同一である、実施形態67のベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。
69.R1及びR1'が、標的配列の改変のために前記宿主細胞のCRISPR/Casシステムとともに機能的である、実施形態67又は68のベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。
70.アレイ又は各アレイが、標的配列を改変するために宿主細胞においてそれぞれのcrRNAとともに機能する1種又は複数のCasヌクレアーゼと組み合わせた状態にある、実施形態1から69のいずれか1つのベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。標的配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)にすぐ隣接するプロトスペーサー配列を含む。
71.アレイ又は各アレイが、標的配列を改変するために宿主細胞においてそれぞれのcrRNAとともに機能する1種又は複数のCasヌクレアーゼをコードする核酸配列と組み合わせた状態にある、実施形態1から70のいずれか1つのベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。
72.R1及びR1'が、前記宿主細胞において標的を改変するためにII型Cas9ヌクレアーゼ(例えば、Sピオゲネス又はSオーレウスCas9)とともに機能する、実施形態67から71のいずれか1つのベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法であって、任意選択で、実施形態70又は71に更に従い、Casが、前記Cas9である、ベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。
73.実施形態50から72のいずれか1つの方法によって得ることができる細菌のex-vivo混合集団。
74.治療的、予防的、美容的、ヒト又は非ヒト動物体重低減(例えば、美容的低減)又は栄養的使用のためにヒト又は非ヒト動物に投与するための組成物であって、実施形態73の混合集団を含む組成物。
75.実施形態73の混合集団又は実施形態74の組成を含む、ヒト又は非ヒト動物消費用の食料又は飲料。
76.栄養補助食品又はプロバイオティック飲料若しくは食料である、実施形態75の食料又は飲料。
77.ヒト若しくは非ヒト動物において、又は飲料水若しくは土壌において細菌感染を処置又は予防するための抗生物質組成物であって、実施形態1から36及び63から72のいずれか1つのベクターを含む、組成物。
78.ヒト又は非ヒト動物において腸バクテロイデス門の割合を増大するための(例えば、肥満症、糖尿病又はGI炎症性状態を処置又は予防するため)プロバイオティック組成物であって、実施形態1から36及び63から72のいずれか1つのベクターを含む、組成物。
79.例えば、肥満症、糖尿病又はGI状態を処置又は予防するために、ヒト又は動物におけるファーミキューテス門(Fermicutes)に対する腸バクテロイデス属の相対割合を増大するための実施形態74、77又は78の組成物。
80.ベクターが、アレイとともに作動可能であるCasヌクレアーゼをコードする配列を含まない、実施形態1から79のいずれか1つのベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。これは、ベクター中の空間を節約するのに有用である(例えば、宿主細胞標的化のためにより大きなアレイ又はより多くのアレイを含めることを可能にするために-これは、複数のゲノム位置を標的化して、本発明のアレイに対する耐性の進化の可能性を低減するのに有用である)。
81.MGEが、アレイとともに作動可能であるCasヌクレアーゼをコードする配列を含まない、実施形態1から80のいずれか1つのベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。これは、MGE中の空間を節約するのに有用である(例えば、宿主細胞標的化のためにより大きなアレイ又はより多くのアレイを含めることを可能にするために-これは、複数のゲノム位置を標的化して、本発明のアレイに対する耐性の進化の可能性を低減するのに有用である)。例えば、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする大きな配列を含むことを避けることが可能である。
82.アレイが、第1及び/又は第2の細胞と同一の種又は株の細胞において見られるCasエンドヌクレアーゼとともに作動可能である、実施形態80又は81のベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。一例では、アレイは、宿主細胞又は第3の細胞と同一の種又は株の細胞において見られるCasエンドヌクレアーゼとともに作動可能である。これは、ベクター又はMGE中の空間を節約するのに有用である(例えば、宿主細胞標的化のためにより大きなアレイ又はより多くのアレイを含めることを可能にするために-これは、複数のゲノム位置を標的化して、本発明のアレイに対する耐性の進化の可能性を低減するのに有用である)。
83.第1及び第2の細胞が、異なる種の細菌細胞であり、第2の細胞が、ヒト細菌叢種のものであり、第1の細胞が、前記ヒト細菌叢において非病原性である種のものであり、標的配列が、第1の細胞のゲノムにより含まれず、MGEが、第1及び第2の細胞において作動可能であるoriTを含み、MGEが、第1の細胞から第2の細胞へ水平伝達可能である、実施形態1から82のいずれか1つのベクター、組成物、食料、飲料又は集団。
担体及び宿主細胞が、異なる種の細菌細胞であり、宿主細胞が、ヒト細菌叢種のものであり、担体細胞が、前記ヒト細菌叢において非病原性である種のものであり、標的配列が、担体細胞のゲノムにより含まれず、MGEが担体及び宿主細胞において作動可能であるoriTを含み、MGEが、担体細胞から宿主細胞へ水平伝達可能である、実施形態1から83のいずれか1つの方法。
84.ベクターが、バクテリオファージにより含まれ、バクテリオファージが、第1の細胞(担体)に感染して、MGEを第1の(担体)細胞中に導入することが可能である、態様83のベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。
85.標的配列が、第2の(宿主)細胞のゲノムにより含まれる(例えば、ゲノムの必須遺伝子又は抗生物質耐性遺伝子により含まれる)、実施形態83又は84のベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。
86.第2の(宿主)細胞種が、前記ヒト細菌叢において病原性であり、標的配列が、標的配列の切断又は前記標的配列を含む遺伝子を下方制御することによって改変される、実施形態85のベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。一例では、第2の(宿主)細胞は、実施形態19の特性(i)〜(xiv)のいずれか1つに記載の細胞である。一例では、第2の(宿主)細胞は、ファーミキューテス門細胞であり、ベクターは、ヒトにおいて肥満症を処置又は予防するためのものである。
87.第2の(宿主)細胞種が、前記ヒト細菌叢において非病原性である、実施形態83、84又は85のベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。
88.第2の(宿主(hosst))細胞が、バクテロイデス門又はプレボテラ属の細胞であり、任意選択で、MGEが、前記ヒト細菌叢の第2の(宿主(hosst))細胞種からファーミキューテス門種に水平伝達可能である、実施形態83から87のいずれか1つのベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。後者は、標的配列がファーミキューテス門により含まれるが、第1の(担体)又は第2の(宿主)細胞により含まれない場合に、例えば、ヒトにおいて肥満症を処置又は予防するために有用である。
89.MGEが、前記ヒト細菌叢の第2の(宿主)細胞種から第3の細菌細胞種に水平伝達可能であり、第3の細胞種が、前記ヒト細菌叢において病原性であり、前記標的配列を含む、実施形態83から88のいずれか1つのベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。一例では、第1の(担体)及び第2の(宿主)細胞は、標的配列を含まない。
90.第3の細胞が、態様19の特性(i)〜(xiv)のいずれか1つに記載の細胞である、実施形態89のベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。
91.MGEが、アレイのリピート配列とともに作動可能であるCasエンドヌクレアーゼをコードする配列を欠き、ベクターが、MGEの外側にこのような配列(例えば、Cas9をコードする)を含む、実施形態1から90のいずれか1つのベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。
一般特性のいずれもまた、本構成に当てはまりうる。本明細書における任意のその他の構成、態様、段落、例、実施形態又は概念の特性のいずれもまた、MGEを使用する本構成と組み合わせてもよい。
したがって、本発明は、段落として番号がつけられた以下の特性を提供する;これらの段落は、列挙されるような態様のいずれにも、又は実施形態1から91のいずれにも、又は本明細書における任意のその他の構成にも当てはまる:
1.標的配列が、宿主CRISPR/Casシステムのヌクレオチド配列であり、それによって、宿主細胞において宿主CRISPR/Casシステムを改変するためにcrRNAがCasを標的にガイドする、態様44から50のいずれか1つのベクター。
2.宿主CRISPR/Casシステムが、I、II又はIII型システムであり、標的配列が、少なくとも1種、2種又は3種の更なる宿主株又は種において前記型のシステム中に保存されたヌクレオチド配列であり、前記更なる株又は種が、前記宿主とは異なる、段落1のベクター。
3.標的配列が、ストレプトコッカス属種(例えば、Sサーモフィルス又はSピオゲネスCRISPR/Casシステム配列に対して同一である、段落1又は2のベクター。
4.宿主CRISPR/Casシステムの標的配列が、
i.第1のリピートの最も5'のヌクレオチドと連続する(及び任意選択で、前記リピートの最も5'のヌクレオチドを含む、例えば、第1のリピートの5'末端に第1の3ヌクレオチドを含む)CRISPRアレイリーダー又はリーダープロモーター配列、
ii.第1のリピートのすぐ5'の最大20(例えば、3、5、7、9、10、12、15、20、30又は32)のヌクレオチドの連続ヌクレオチドの配列、
iii.第1のリピートの最も5'のヌクレオチオの最大20(例えば、3、5、7、9、10、12、15、20、30又は32)の連続ヌクレオチドの配列、
iv.第1のスペーサーリピートのすぐ3'にある最大20(例えば、3、5、7、9、10、12、15、20、30又は32)の連続ヌクレオチドの配列(及び任意選択で、配列が、第1のスペーサーの最も3'のヌクレオチドを含む、例えば、第1のリピートの3'末端に少なくとも3ヌクレオチドを含む)
を含む、段落1から3のいずれか1つのベクター。
5.アレイが、核酸ベクター(例えば、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド又はプロファージ)により含まれ、
i.crRNAが、構造R-S-R(式中、R=CRISPRリピート及びS=CRISPRスペーサー)を含むか、又はからなり、Sが、(5'から3'方向に)V-HR又はHR-V(式中、V=ベクターのDNA配列と同一の配列及びHR=前記宿主細胞CRISPRアレイのCRISPRアレイのリピートのDNA配列)を含み
ii.HRの配列が、宿主CRISPRアレイ中のVの配列とすぐ近接し、
iii.crRNAが、細胞における宿主CRISPRアレイの改変のために、宿主CRISPRアレイのスペーサーとハイブリダイズして、Casを宿主標的にガイドすることが可能である
段落1、2又は3のベクター。
例えば、Vは、ファージベクターコートタンパク質をコードする配列の配列である。この点において、Helerらは、細菌耐性の研究において、3種のCRISPR独立、バクテリオファージ耐性突然変異体が、ファージ吸着において著しい防御を示す(約50%)ことを見い出し、これは、それらがエンベロープ耐性突然変異を保持する可能性が最も高いことを示す。
6.第1のcrRNAが、ベクター中に存在する核酸とハイブリダイズしない、又は実質的にハイブリダイズしない段落5のベクター。例えば、第1のcrRNAは、ベクター中のVとハイブリダイズしない、又は宿主アレイのスペーサーとハイブリダイズするよりも強力にはハイブリダイズしない。ハイブリダイゼーション試験は、当業者には日常的なものである。例えば、ベクターDNAを単離又は合成すること及びそれをcrRNAとともにインキュベートすることによってin vitroで決定できる。例えば、PCRを使用する標準技術を使用して、ハイブリダイゼーションが起こったか否かを検出できる(例えば、宿主細胞において見られるであろうpH及び温度条件下で試験される)。
7.V=ベクターDNAの1又は最大40(例えば、最大15)の連続ヌクレオチドである、段落5又は6のベクター。標的配列中に見られるプロトスペーサー中のPAMのすぐ5'のシード配列は、crRNA対合及びCRISPR/Casシステムの切断する機能にとって重要である。このシード配列は、PAMのすぐ5'におよそ15又は12の連続ヌクレオチドを含む。
8.アレイが、ベクターにより含まれ、(5'から3'方向に)第1のリピート配列、第1のスペーサー配列及び第2のリピート配列を含み、スペーサー配列が、宿主細胞中の標的配列とハイブリダイズ可能である(例えば、それと同一である、又は90%を超える同一性を有する)配列を含み、アレイが、宿主細胞におけるリピート及びスペーサーの転写のためのプロモーターを更に含み、任意選択で、ベクターが、宿主細胞において機能的Cas及び/又はtracrRNA配列をコードするためにCasヌクレアーゼをコードする配列及び/又はtracrRNAをコードする配列を含み、tracrRNA配列が、第1又は第2のリピートと相補的である配列を含む、態様又は段落1から8のいずれか1つの方法、アレイ又はベクター。
9.CRISPRアレイが、ベクターにより含まれ、(5'から3'方向に)第1のリピート配列、第1のスペーサー配列及び第2のリピート配列を含み、スペーサー配列が、宿主細胞中の標的配列とハイブリダイズ可能である(例えば、それと同一である、又は90%を超える同一性を有する)配列を含み、アレイが、宿主細胞におけるリピート及びスペーサーの転写のためのプロモーターを更に含み、ベクターが、宿主細胞においてtracrRNA配列をコードするためにCasヌクレアーゼをコードする配列及び/又はtracrRNAをコードする配列を含まず、tracrRNA配列が、第1又は第2のリピートと相補的である配列を含み、HM-CRISPRアレイが、宿主細胞において、任意選択で、宿主tracrRNAを使用してCas(例えば、内因性宿主Casヌクレアーゼ)を宿主標的部位にガイドするために機能的である、態様又は段落1から9のいずれか1つの方法、アレイ又はベクター。
10.リピートが、宿主アレイ中のリピートに対して同一であり、本発明のCRISPRアレイが、宿主CRISPR/CasシステムのCas(例えば、Casヌクレアーゼ、例えば、Cas9)によって認識されるPAMを含まない、段落8又は9の方法、アレイ又はベクター。Cas配列を取り除く能力によって、本発明のアレイにおいて空間が開放される。
11.CRISPRアレイが、非宿主細胞Cas(例えば、宿主システムが、II若しくはIII形である、I型システムCas;宿主システムが、I若しくはIII形である、II型システムCas;又は宿主システムがI若しくはII形であるIII形システムCas)と組み合わせた状態にあり、任意選択で、宿主細胞が、非宿主Casの型と同一である型のCasを含まない又は発現しない、態様又は段落1から10のいずれか1つの方法、アレイ又はベクター。これは、CRISPRアレイが、自身中(例えば、ベクター中)の配列又は宿主中のベクターによってコードされるCasを標的化しないので、有用である。
12.CRISPRアレイが、tracrRNA配列又はtracrRNA配列をコードする配列(例えば、アレイと同一核酸上の)と組み合わせた状態にあり、任意選択で、tracrRNA配列及びHM-crRNAが、シングルガイドRNA(gRNA)により含まれる、態様又は段落1から12のいずれか1つの方法、アレイ又はベクター。
13.CRISPRアレイが、Cas又はCasをコードする配列と組み合わせた状態にあり、任意選択で、アレイが、宿主細胞ゲノムに組み込まれており、Casが宿主細胞に対して内因性である、又は外因性配列によってコードされる態様又は段落1から13のいずれか1つの方法、アレイ又はベクター。一例では、Casをコードする配列は、例えば、プラスミド又はファージ等のウイルスから宿主に導入されている外因性配列である。
14.CRISPRアレイが、プラスミド、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド又はプロファージのヌクレオチド配列により含まれる、態様又は段落1から13のいずれか1つの方法、アレイ又はベクター。ファージミドは、パッケージングされたファージである。プロファージは、細胞中の宿主染色体又はエピソームに組み込まれたファージである。
15.CRISPRアレイが、宿主細胞ゲノムに、例えば、染色体又はエピソーム核酸に組み込まれている、態様又は段落1から14のいずれか1つの方法、アレイ又はベクター。
16.例えば、細胞、例えば、微生物に感染するための、又は医学若しくは歯学において使用するための、態様又は段落1から15のいずれか1つのCRISPRアレイを含むウイルス(例えば、ビリオン、ファージ、ファージミド又はプロファージ)。
17.その第1及び第2のビリオンが、異なるアレイリーダー若しくはプロモーターを含む、及び/又は宿主細胞中の、若しくは異なる宿主株中の異なる標的配列を標的化するための、段落16に記載のビリオンの集団。
18.各アレイが態様又は段落1から17のいずれか1つに記載のCRISPRアレイの収集物であって、第1のアレイが、crRNA転写のための第1のプロモーターを含み、第2のアレイが、第1のプロモーターとは異なるcrRNA転写のための第2のプロモーターを含み、各プロモーターが、宿主プロモーターに対して同一である、又はその相同体であり、任意選択で、第1の又は両方のプロモーターが、宿主Cas(例えば、Cas1、2、9又はCsn2)プロモーター又は宿主CRISPRアレイプロモーターに対して同一である、CRISPRアレイの収集物。例えば、第1のプロモーターは、内因性Casヌクレアーゼプロモーター又は内因性Cas1若しくはCas2プロモーター又は高度に若しくは構成的に発現される、若しくは宿主細胞の必須、病原性若しくは耐性遺伝子である内因性(endogeous)遺伝子のプロモーターである。内因性プロモーターを使用することによって、宿主プロモーターを保つための宿主の進化の間の圧力となり、したがって、これは、アレイの1つ又は複数のプロモーターを標的化する宿主CRISPR/Cas防御システムの可能性を低下させる。
19.第1のアレイが、1つ又は複数のスペーサー(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50又はそれより多いスペーサー)を含み、第2のアレイが、1つより多いスペーサー(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50又はそれより多いスペーサー)を含み、第2のアレイの前記スペーサーが、第1のアレイの1つ又は複数のスペーサーに対して同一である、本発明のCRISPRアレイの収集物。これは、HM-アレイ中の多くのこのようなスペーサー(又は更に、スペーサーを複数のアレイにわたって分配すること)が、宿主細胞がスペーサーの一部を欠失しようとも一部のHM-アレイスペーサーが宿主細胞にある機会を増大することを証明するので、HM-アレイスペーサーの相同組換えによって宿主耐性を逃れるのに有用である。欠失に対する防御はまた、異なるアレイ中のスペーサーの同一コピーの両端に位置する異なるリピートを使用することによって増強される。したがって、本発明は、以下を提供する:
20.第1のアレイのスペーサー(又は前記スペーサー)は、同一である第1のリピートが両端に位置し、第2のアレイのスペーサー(又は前記スペーサー)は、同一である第2のリピートが両端に位置し、第1のリピートが、第2のリピートとは異なる、段落18又は19の収集物。
21.第1のリピートが、宿主細胞CRISPR/Casシステム中のリピートに対して同一である、段落20の収集物。
22.第1のリピートが、宿主CRISPR/Casシステム中のリピートとは異なる、段落20の収集物。
23.第1及び第2のアレイが、同一宿主細胞中に、又は同一ベクター(例えば、プラスミド、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド又はプロファージ)中に含有される、段落18から22のいずれか1つの収集物。
24.第1のアレイが、第1のベクターに含有され、第2のアレイが、第1のアレイを含有しない第2のベクター中に含有される(例えば、ベクターが、プラスミド又はビリオン(例えば、同一ウイルス種の)又はパッケージングされたファージ(例えば、同一ファージ種の)である、段落18から22のいずれか1つの収集物。
一実施形態では、本発明の方法において使用されるベクターは、段落18から24のいずれか1つのアレイにより含まれるベクターである。
25.段落1から24のいずれか1つに従う、アレイ、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、プロファージ、集団又は収集物を含む宿主細胞。
a.宿主細胞は、標的配列の転写のための第1の内因性プロモーター(第1の宿主プロモーター)を含み、
b.CRISPRアレイは、crRNAをコードする配列及びcrRNAの転写のための第1のプロモーターを含み、crRNAは、任意選択で、シングルガイドRNA(gRNA)により含まれ、標的配列を改変するために宿主細胞において宿主標的配列とハイブリダイズして、Casを標的にガイドすることが可能であり、
c.第1のプロモーターの配列は、第1の宿主プロモーターの配列とは異なる第2の内因性宿主プロモーターの配列である
本発明のCRISPRアレイ又はベクター。
1.宿主細胞の標的ヌクレオチド配列を改変するための宿主改変(HM)CRISPR/Casシステム(例えば、I、II又はIII型)であって、(i)〜(iv)に記載の構成要素を含むシステム:
(i)Casヌクレアーゼ(例えば、Cas9)をコードする少なくとも1つの核酸配列、
(ii)スペーサー配列(HM-スペーサー)及びHM-crRNAをコードするリピートを含む遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイ(例えば、上記のようなアレイ)であって、HM-crRNAが、標的配列を改変するために宿主細胞において宿主標的配列とハイブリダイズして、Casを標的にガイドすることが可能である配列を含む、遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイ、
(iii)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するためのDNA配列、
(iv)crRNAをコードする核酸配列のシステムの前記構成要素が、2、3又はそれより多いコピー(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50又はそれより多い)を含み、コピーが、宿主細胞配列(例えば、宿主病原性、耐性又は必須遺伝子配列又はベクター適応性を媒介する宿主CRISPR/Casシステム構成要素の配列)を標的化するための同一スペーサー配列を含む。
2.システムの前記構成要素が、同一スペーサーを含むcrRNAをコードする核酸配列の4、5、10、15又は20より多くの前記コピーを含む、概念1のシステム。
3.コピーが、2つ又はそれより多い核酸ベクターCRISPRアレイの間で分離される、概念1又は2のシステム。
4.第1及び第2のHMアレイを含み、第1及び第2のベクターCRISPRアレイが、同一宿主細胞中又は同一ベクター(例えば、プラスミド、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド又はプロファージ)中に含有される、概念3のシステム。
5.第1のアレイが、第1のベクター中に含有され、第2のアレイが、第1のアレイを含有しない第2のベクター中に含有される(例えば、ベクターが、プラスミド又はビリオン(例えば、同一ウイルス種の)又はファージミド(例えば、同一ファージ種の)である)、概念3又は4のシステム。
6.リピートが、宿主CRISPRアレイ中のリピートに対して同一である、概念1から5のいずれか1つのシステム。
7.リピートが、宿主CRISPRアレイ中のリピートに対して同一ではない、概念1から5のいずれか1つのシステム。
8.概念1から7のいずれか1つに記載のシステム、ベクター、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド又はプロファージを含む宿主細胞。
9.概念1から8のいずれか1つに記載のシステム、ベクター、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド又はプロファージを含む、抗菌組成物(例えば、抗生物質、例えば、医薬、殺菌剤又はマウスウォッシュ)。
この構成は、外因性配列を保持するための制限された能力を有する標的ベクター、例えば、ウイルス又はファージにおいて空間を開放するのに有利である。空間を開放することによって、より多くの標的化スペーサー又はアレイを含むことができ、これは、宿主耐性を避けるために有用である。特に、sp又はsaCas9等の嵩高いCas配列について、例えば、ベクター中に内因性Casエンドヌクレアーゼをコードするのではなく、それを利用することは有利である。更に、非宿主供給源に由来するいくつかの外因性Casを用いた場合に見られることがあるような劣性の適合性の機会はない。ウイルス、例えば、ファージゲノムサイズを低減する能力はまた、宿主細胞取り込み(宿主細胞におけるウイルスの感染及び/又は維持)を促進するために有益であり得る。いくつかの例では、利点は、ベクター(例えば、ファージ)による宿主の侵入が、侵入核酸と闘う宿主の試みにおいて、宿主Casヌクレアーゼの発現の増大を含め、宿主CRISPR/Cas活性を上方制御し得るということである。しかし、これはまた、アレイ、ベクター、システム及びこの構成の発明のその他の態様が、宿主Casによって認識される1つ又は複数のリピートを含む場合に、これらとともに内因性Casを提供するために有用である。本発明が、宿主CRISPRアレイを標的化する1つ又は複数のスペーサーを含む場合には(同様に本発明の第1の構成のとおり)、次いで、これは、宿主CRISPRアレイ自体の不活性化を促進し、次いで、自身のCasヌクレアーゼを使用して、自身のCRISPRシステムを不活性化する「自殺」宿主細胞と似ている。
1.宿主細胞の標的ヌクレオチド配列を改変するための宿主改変(HM)CRISPR/Casシステム(例えば、I、II又はIII型)であって、(i)〜(iv)に記載の構成要素を含むシステム:
(i)Casヌクレアーゼ(例えば、Cas9)をコードする少なくとも1つの核酸配列、
(ii)スペーサー配列(HM-スペーサー)及びHM-crRNAをコードするリピートを含む遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイ(例えば、上記のようなアレイ)であって、HM-crRNAが、標的配列を改変するために宿主細胞において宿主標的配列とハイブリダイズして、前記Casを標的にガイドすることが可能である配列を含む、遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイ、
(iii)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するためのDNA配列、
(iv)システムの前記構成要素が、宿主細胞と、宿主細胞を形質転換でき、それによって、HM-crRNAが、宿主細胞においてCasを標的にガイドして標的配列を改変する少なくとも1つの核酸ベクターの間で分離される。
2.構成要素の少なくとも1つが、宿主細胞に対して内因性である、例1のシステム。
3.構成要素(i)が、宿主細胞に対して内因性である、例1又は2のシステム。
4.構成要素(iii)が、宿主細胞に対して内因性である、例1から3のいずれか1つのシステム。
5.宿主細胞の標的ヌクレオチド配列を改変するための宿主改変(HM)CRISPR/Casシステム(例えば、I、II又はIII型)であって、(a)〜(e)に記載の構成要素を含むシステム:
a.Casヌクレアーゼ(例えば、Cas9)をコードする少なくとも1つの核酸配列、
b.スペーサー配列(HM-スペーサー)及びHM-crRNAをコードするリピートを含む遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイであって、HM-crRNAが、宿主細胞において宿主標的配列とハイブリダイズして、前記Casを標的にガイドすることが可能である配列を含む、遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイ、
c.任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するためのDNA配列、
d.システムの前記構成要素が、少なくとも第1と、第2の核酸ベクターの間で分離され、第1のベクターが構成要素(a)を含むが、第2のベクターは、構成要素(a)を欠き、
e.ベクターが、宿主細胞を同時に又は逐次同時形質転換でき、それによって、HM-crRNAが、宿主細胞においてCasを標的にガイドして、標的配列を改変する。
上記で提供される「分離された」の定義は、第1及び第2のベクターを含む本例に準用する。
一実施形態では、tracrRNA配列は、ベクターによって提供されないが、内因性宿主細胞CRISPR/CasシステムのtracrRNA配列であり、tracrRNAは、宿主細胞においてCasを標的にガイドするための成熟crRNAへのその後のプロセシングのために、細胞においてHM-crRNAとハイブリダイズ可能である。
6.第1のベクターが、構成要素(a)を含み、第2のベクターが、構成要素(b)及び(c)を含む、例5のシステム。
7.第1及び/又は第2のベクターが各々、1つ、2つ、3つ又はそれより多い更なる遺伝子操作されたHM-CRISPRアレイを含む、例5又は6のシステム。
8.第1及び第2のベクターのうち一方が、ファージミドであり、もう一方のベクターが、ヘルパーファージである、例5から7のいずれか1つのシステム。
9.crRNA配列及びtracrRNA配列が、例えば、ベクターによって提供されるシングルガイドRNA(gRNA)により含まれる、例1から8のいずれか1つ(例えば、例3又は6)のシステム。
10.各ベクターが、外因性核酸の挿入のための制限された能力を有する、例1から9のいずれか1つのシステム。
11.ベクター又はベクターが、ウイルス(例えば、ビリオン、パッケージングされたファージ、ファージミド又はプロファージ)である、例1から10のいずれか1つのシステム。
12.宿主細胞が、対象のHM-配列をコードする遊離末端を有するデオキシリボ核酸鎖(HM-DNA)を含む、及び/又はシステムが、HM-DNAをコードする配列を含み(例えば、ベクターに、又は宿主細胞ゲノムに、又はそのエピソームに組み込まれた)、HM-DNAが、標的配列中の、又はその両端に位置する配列(単数若しくは複数)に対してそれぞれ相同である配列(単数若しくは複数)を含む、例1から11のいずれか1つのシステム。
13.標的部位が、宿主細胞においてCasによって(例えば、前記CasヌクレアーゼがCas9である場合にCas9によって)切断され、HM-DNAが、宿主ゲノムに(例えば、染色体又はエピソーム部位に)HM-DNAを挿入するために、切断部分の5'及び3'それぞれ両端に位置する相同である第1及び第2の配列を含む、例12のシステム。
14.挿入が、相同性指定指向組換え(HDR)によってである、例13のシステム。
15.挿入が、非相同末端結合(NHEJ)によってである、例13のシステム。
16.HM-配列が、調節エレメント(例えば、内因性プロモーターと置き換わるプロモーター、例えば、誘導プロモーター)、転写阻害配列、転写増強配列、標識又は外因性タンパク質若しくはドメインをコードする配列である、又はそれをコードする、例12から15の任意の1つのシステム。
17.第1及び第2のHM-DNAを含み、第1のHM-DNAの配列が、第2のDNAの配列と相補的であり、それによって、DNAが、宿主細胞において相同組換えによって組み合わされ、宿主細胞ゲノムへの(例えば、染色体又はエピソーム部位への)挿入のために組み合わされたHM-DNAを形成することができる、例12から16のいずれか1つのシステム。
18.ベクター又はベクターが、宿主細胞に感染して、システム構成要素を含むベクター核酸を細胞に導入することが可能である、例1から17のいずれか1つのシステム。
19.前記Casヌクレアーゼがニッカーゼである、例1から18のいずれか1つのシステム。
20.細胞が細菌又は古細菌であり、前記Casヌクレアーゼが、細菌又は古細菌の内因性II型CRISPR/Casシステムによって提供される、例1から19のいずれか1つのシステム。
21.ベクター(単数又は複数)が、前記宿主細胞の内側であり、任意選択で、宿主DNAに組み込まれる、例1から20のいずれか1つのシステム。
22.ベクター(単数又は複数)が、Casヌクレアーゼ(例えば、Cas9)をコードする配列を欠く、例1から21のいずれか1つのシステム。
23.内因性CRISPR/Casシステムを含む微生物宿主細胞に感染するための、遺伝子操作された核酸ウイルスベクター(例えば、上記のようなベクター、ビリオン又はパッケージングされたファージ)であって、
(a)例1から22のいずれか1つに記載のCRISPR/Casシステムにおいて使用するための複数の異なるcrRNAを発現するための核酸配列を含み、
(b)Casヌクレアーゼ(例えば、Cas9)をコードする核酸配列を欠き、
第1の前記crRNAは、前記宿主細胞中の第1の核酸配列とハイブリダイズ可能であり、第2の前記crRNAは、前記宿主細胞中の第2の核酸配列とハイブリダイズ可能であり、前記第2の配列は、前記第1の配列とは異なり、
(c)第1の配列は、抗微生物(例えば、抗生物質)耐性遺伝子(若しくはそのRNA)により含まれ、第2の配列は、抗微生物耐性遺伝子(若しくはそのRNA)により含まれ、任意選択で、遺伝子は、異なっており、
(d)第1の配列は、抗微生物耐性遺伝子(若しくはそのRNA)により含まれ、第2の配列は、必須遺伝子若しくは病原性遺伝子(若しくはそのRNA)により含まれ、
(e)第1の配列は、必須遺伝子(若しくはそのRNA)により含まれ、第2の配列は、必須遺伝子若しくは病原性遺伝子(若しくはそのRNA)により含まれ、又は
(f)第1の配列は、病原性遺伝子(若しくはそのRNA)により含まれ、第2の配列は、必須遺伝子若しくは病原性遺伝子(若しくはそのRNA)により含まれる
ベクター。
24.内因性CRISPR/Casシステムを含む宿主細胞を形質転換するための、遺伝子操作された(宿主細胞中のベクターから直接遺伝子操作された、又は単離され、ベクターが、宿主を形質転換した遺伝子操作されたベクターに由来した)核酸ベクターであって、任意選択で、上記のようなベクターであり、
(a')例1から25のいずれか1つに記載のCRISPR/Casシステムにおいて使用するための複数の異なるcrRNAを発現するための核酸配列を含み、
(b')Casヌクレアーゼ(例えば、Cas9)をコードする核酸配列を欠き、
第1の前記crRNAは、前記宿主細胞中の第1の核酸配列とハイブリダイズ可能であり、第2の前記crRNAは、前記宿主細胞中の第2の核酸配列とハイブリダイズ可能であり、前記第2の配列は、前記第1の配列とは異なり、
第1及び/又は第2の配列は、
(c')前記宿主CRISPRアレイ中のリピートDNA又はRNA配列(例えば、リピートは、最も5'のリピート(第1のリピート)である)、
(d')tracrRNA配列又はDNA配列をコードするtracrRNA、
(e')CRISPRアレイリーダー配列、
(f')Cas遺伝子プロモーター(例えば、Cas1、Cas2又はCsn2プロモーター)、
(g')CRISPRアレイリーダープロモーター配列又は
(h')CasをコードするDNA又はRNA配列(例えば、Casは、Cas9、Cas1、Cas2又はCsn2である)であって、例えば、第1の前記crRNAは、宿主Cas1遺伝子配列(又はそのRNAの配列)を標的化可能であり、第2の前記crRNAは、宿主Cas2遺伝子配列(又はそのRNAの配列)を標的化可能である、CasをコードするDNA又はRNA配列
である、又はそれを含む宿主CRISPR/Casシステムの標的配列である
ベクター。
25.第1及び/又は第2の標的配列が、
i.第1のリピートの最も5'のヌクレオチドと連続する(及び任意選択で、前記リピートの最も5'のヌクレオチドを含む)例えば、第1のリピートの5'末端に第1の3ヌクレオチドを含む、CRISPRアレイリーダー又はリーダープロモーター配列、
ii.第1のリピートのすぐ5'の最大20(例えば、3、5、7、9、10、12、15、20、30又は32)の連続ヌクレオチドの配列、
iii.第1のリピートの最も5'のヌクレオチオの最大20(例えば、3、5、7、9、10、12、15、20、30又は32)の連続ヌクレオチドの配列、又は
iv.第1のスペーサーのすぐ3'にある(任意選択で、配列が、第1のスペーサーの最も3'のヌクレオチドを含む)、例えば、第1のリピートの3'末端に少なくとも3ヌクレオチドを含む、最大20(例えば、3、5、7、9、10、12、15、20、30又は32)の連続ヌクレオチドの配列
である、又はそれを含む、例24のベクター。
26.標的配列又は各標的配列が、配列番号1〜44からなる群から選択される配列又はその相補体により含まれる、例24又は25のベクター。
27.第1のcrRNAが、構造R-S-R(式中、R=CRISPRリピート及びS=CRISPRスペーサー)を含むか、又はからなり、Sが、(5'から3'方向に)V-HR又はHR-V(式中、V=ベクターのDNA配列と同一の配列及びHR=前記宿主細胞CRISPR/CasシステムのCRISPRアレイのリピートのDNA配列)を含み、第1のcrRNAは、細胞において宿主CRISPRアレイの改変のために、宿主CRISPRアレイのスペーサーとハイブリダイズして、CasをcrRNAの標的にガイドすることが可能である、例24から26のいずれか1つのベクター。
28.第1のcrRNAが、ベクター中に存在する核酸と実質的にハイブリダイズしない、例えば、第1のcrRNAが、ベクター中のVとハイブリダイズしない、又は宿主アレイのスペーサーとハイブリダイズするよりも強力にはハイブリダイズしない、例27のベクター。これを決定することに関する上記の考察は、この例にも当てはまる。
29.V=ベクターDNAの1又は最大40(例えば、最大15)の連続ヌクレオチドである、例27又は28のベクター。例えば、V=ベクターDNAの1、2、3、4、5、6、7 8 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39又は40の連続ヌクレオチド。
30.i.宿主CRISPR/Casシステムが、同族PAMを認識でき、
j.ベクターDNAが、プロトスペーサー配列のすぐ3'にこのようなPAMを含み、
k.V=プロトスペーサーの1又は最大40(例えば、最大15)のヌクレオチド、及び
l.HR=宿主CRISPRアレイのリピートの連続配列に対して同一の配列
である、例29のベクター。
31.宿主アレイのリピートの前記連続配列が、宿主リピートの少なくとも50%の配列である(例えば、宿主リピートの最も5'又は最も3'のヌクレオチドを含む)例30のベクター。
32.V=1〜40(例えば、最大15)の最も3'のプロトスペーサー連続ヌクレオチド及び任意選択で、リピートの前記連続配列が、宿主リピートの最も5'のヌクレオチドを含む、例30又は31のベクター。
33.V=1〜40(例えば、最大15)の最も5'のプロトスペーサー連続ヌクレオチド及び任意選択で、リピートの前記連続配列が、宿主リピートの最も3'のヌクレオチドを含む、例30又は31のベクター。
34.R=宿主CRISPR/Casシステムによって認識されるリピートである、例27から33のいずれか1つのベクター。或いは、R=宿主CRISPR/Casシステムによって認識されないリピートである。この場合には、好ましくは、ベクターは、Rと同族である、すなわち、宿主細胞においてRとともに機能可能であるCasヌクレアーゼ(及び任意選択で、tracrRNA)のヌクレオチド配列を含む。
35.第1の配列が、(c')〜(h')のいずれか1つに従い、第2の配列が、宿主必須遺伝子、病原性遺伝子又は耐性遺伝子から選択される、例24から34のいずれか1つに記載のベクター。
36.内因性CRISPR/Casシステムを含む微生物宿主細胞に感染するための例1から22のいずれか1つのシステムにおいて使用するための、遺伝子操作された核酸ウイルスベクター(例えば、ビリオン又はパッケージングされたファージ)であって、
a.宿主において第1のcrRNAを発現するための第1の核酸配列を含み、
b.第1の配列は、(5'から3'方向に)R1a-S1-R1bを含み、R1a=第1のCRISPRリピートであり、R1aは任意選択であり、R1b=第2のCRISPRリピートであり、S1=宿主配列(例えば、例23又は24において列挙される宿主配列)と相補的であるCRISPRスペーサーであり、R1a及びR1bは、宿主Casヌクレアーゼ(例えば、II型ヌクレアーゼ、例えば、Cas9)によって認識され、
c.(i)(b)のリピートを認識するCasヌクレアーゼ(例えば、Cas9)をコードする核酸配列及び/又は(ii)第1の配列によってコードされるcrRNA配列と相補的であるtracrRNA配列をコードする核酸配列を欠く
ベクター。
例えば、ベクターは、ファージにより含まれる核酸ベクターである。
37.d.宿主において第2のcrRNAを発現するための第2の核酸配列を含み、第2のcrRNAが、第1のcrRNAとは異なり、
e.第2の配列が、(5'から3'方向に)R2a-S2-R2bを含み、R2a=第1のCRISPRリピートであり、R2aは任意選択であり、R2b=第2のCRISPRリピートであり、S2=宿主配列(例えば、例23又は24において列挙される宿主配列)と相補的であるCRISPRスペーサーであり、R2a及びR2bは、宿主Casヌクレアーゼ(例えば、I又はII型ヌクレアーゼ、例えば、Cas6)によって認識される、例36のベクター。
38.(iii)(e)のリピートを認識するCas(例えば、Cas6)をコードする核酸配列及び/又は(iv)第2の配列によってコードされるcrRNA配列と相補的であるtracrRNA配列をコードする核酸配列を欠く、例37のベクター。
39.内因性CRISPR/Casシステムを含む微生物宿主細胞に共感染するための、例1から22のいずれか1つのシステムにおいて使用するための、遺伝子操作された核酸ウイルスベクター(例えば、上記のようなベクター、ビリオン又はパッケージングされたファージ)の収集物であって、第1のベクター及び第2のベクターを含み、
f.第1のベクターは、例36に従い、
g.第2のベクターは、宿主において第2のcrRNAを発現するための第2の核酸配列を含み、第2のcrRNAは、第1のcrRNAとは異なり、
h.第2の配列は、(5'から3'方向に)R2a-S2-R2bを含み、R2a=第1のCRISPRリピートであり、R2aは任意選択であり、R2b=第2のCRISPRリピートであり、S2=宿主配列と相補的であるCRISPRスペーサーであり、R2a及びR2bは、宿主Casヌクレアーゼ(例えば、I又はII型ヌクレアーゼ、例えば、Cas6)によって認識される
収集物。
例えば、第1のベクターは、第1のパッケージングされたファージミドにより含まれ、第2のベクターは、第2のパッケージングされたファージミドにより含まれる。
40.第2のベクターが、(v)(b)のリピートを認識するCas(例えば、Cas9)をコードする核酸配列及び/又は(vi)第1の配列によってコードされるcrRNA配列と相補的であるtracrRNA配列をコードする核酸配列を含む、例39の収集物。
41.第2のベクターが、(vii)(h)のリピートを認識するCas(例えば、Cas6)をコードする核酸配列及び/又は(viii)第2の配列によってコードされるcrRNA配列と相補的であるtracrRNA配列をコードする核酸配列を欠く、例39又は40の収集物。
42.第1及び第2のベクターが各々、(ix)(b)のリピートを認識するCas(例えば、Cas9)をコードする核酸配列及び(x)(h)のリピートを認識するCas(例えば、Cas6)をコードする核酸配列を欠き、任意選択で、収集物が、(b)及び(h)のリピートを認識する1つ又は複数のCasを含む宿主細胞により含まれる、例39の収集物。
43.(ix)及び/又は(x)に記載の核酸配列を含む第3のベクター(例えば、ビリオン又はファージ)を更に含む、例42の収集物。
44.各ベクターが、それぞれのパッケージングされたビリオン若しくはファージミド又はそれぞれのビリオン若しくはファージ核酸により含まれる、例39から43のいずれか1つの収集物。
45.R1a及びR1bが、同一リピート配列を含む、例36から44のいずれか1つのベクター又は収集物。
46.R2a及びR2bが、同一リピート配列を含む、例37から45のいずれか1つのベクター又は収集物。
47.(b)のリピートが、(e)のリピートを認識するCasヌクレアーゼとは異なるCasヌクレアーゼによって認識される、例37から46のいずれか1つのベクター又は収集物。
48.宿主が、異なる型(例えば、I型及びII型システム、I型及びIII型システム、II型及びIII型システム又はI、II及びIII型システム)のCRISPR/Casシステムを含む、例37から47のいずれか1つのベクター又は収集物。
49.(b)のリピートが、II型Casヌクレアーゼ、例えば、Cas9によって認識される、例36から48のいずれか1つのベクター又は収集物。
50.(e)のリピートが、I又はIII型Casヌクレアーゼ、例えば、Cas6によって認識される、例37から49のいずれか1つのベクター又は収集物。
51.ベクターが、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド又はプロファージである、例23から50のいずれか1つのベクター又は収集物。
52.ベクターによってコードされるcRNAとともに作動可能である1つ又は複数のCasを含む宿主細胞の内側の、例23から51のいずれか1つのベクター又は収集物。
53.Cas9を含む宿主細胞の内側の、例23から52のいずれか1つのベクター又は収集物。
54.HM-DNA(例えば、ベクターに組み込まれた、プラスミド上の、又は宿主細胞ゲノム若しくはそのエピソーム中の)と組み合わせたベクター又は収集物であって、HM-DNAが、例12から17のいずれか1つに列挙されるとおりである、例23から53のいずれか1つのベクター又は収集物。
55.複数の異なるcrRNAを発現するための核酸配列を含み、前記crRNAが、宿主細胞において少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50又は100のDNA配列を標的化可能である、例1から54のいずれか1つのシステム、ベクター又は収集物。
56.第1のcrRNA又は前記Casヌクレアーゼ(例えば、Cas9)ではないが、宿主ベクター適応を媒介するCasヌクレアーゼのDNA配列(又はそのRNAの配列)を標的化可能である第1のcRNAをコードする核酸配列を含み、任意選択で、第2のcrRNA又は宿主において耐性、病原性若しくは必須宿主遺伝子(又はそのRNA)の配列を標的化可能である第2のcRNAをコードする核酸配列を含む、例1から55のいずれか1つのシステム、ベクター又は収集物。
57.crRNAをコードする核酸配列の2つ、3つ又はそれより多いコピーを含み、コピーが、宿主細胞配列(例えば、病原性、耐性若しくは必須遺伝子配列又はベクター適応を媒介するが、前記Casヌクレアーゼではない宿主CRISPR/Casシステム構成要素の配列)を標的化するための同一スペーサー配列を含む、例1から56のいずれか1つのシステム、ベクター又は収集物。
58.コピーが、2つ又はそれより多いベクターCRISPRアレイ間で分離される、例57のシステム、ベクター又は収集物。
59.ベクターリピートが、宿主CRISPRアレイ中のリピート又は宿主CRISPRアレイに対して同一である(例えば、各ベクターリピートが、宿主リピートと少なくとも95%の配列同一性を有する)例1から58のいずれか1つのシステム、ベクター又は収集物。
60.ベクターリピートが、宿主CRISPRアレイ中のリピート又は宿主CRISPRアレイと同一ではない、例1から58のいずれか1つのシステム、ベクター又は収集物。
61.同一宿主細胞中に、又は同一ベクター(例えば、プラスミド又はウイルス又はビリオン又はファージ又はプロファージ又はファージミド)によって含有される第1及び第2のベクターCRISPRアレイを含む、例1から60のいずれか1つのシステム、ベクター又は収集物。
62.第1のアレイが、第1のベクター中に含有され、第2のアレイが、第1のアレイを含有しない第2のベクター中に含有される(例えば、ベクターは、プラスミド又はビリオン(例えば、同一ウイルス種の)又はファージミド(例えば、同一ファージ種の)である、例61のシステム、ベクター又は収集物。
63.例1から62のいずれか1つに記載のシステム、ベクター、収集物、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド又はプロファージを含む宿主細胞。
64.例1から62のいずれか1つに記載のシステム、ベクター、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド又はプロファージを含む抗菌組成物(例えば、抗生物質、例えば、医薬、殺菌剤又はマウスウォッシュ)。
本発明は、微生物(例えば、ファージ及び/又は細菌集団)を製造する方法であって、宿主及びウイルスを共進化を促進するように一緒にコンディショニングすること並びに、したがって、宿主のウイルス(例えば、ファージ)に対するコンディショニング、逆もまた同じを含む方法を提供する。crRNA発現又は活性の抑制可能な制御を使用して、本発明は、例えば、抗生物質耐性標的遺伝子組換えを用いて、又は用いずに、宿主におけるスペーサーによってガイドされるCas作用によって強いられるストレスを伴って、又は伴わずに、調整が生じることを可能にするように、所望のスペーサー活性がオン又はオフを切り替えられることができる制御可能な方法で、共進化を意図的に調節する。このように、細菌集団を、所望の遺伝子のファージ不活性化が引き起こされ得る状況(例えば、乳製品又は食品製造培養)において使用するために、又は細菌を死滅させる、若しくは調節するように、例えば、抗生物質耐性をノックダウンするために使用されるファージの調整において使用するために調整することができる。この構成は、本方法が、宿主とともの培養の際にアレイの抗生物質耐性遺伝子不活性化活性を意図的に抑制するので、一実施形態において、宿主の抗生物質耐性遺伝子を標的化する本発明の1つ又は複数のCRISPRアレイを保持するウイルス、例えば、ファージとともに抗生物質耐性菌宿主の培養を更に可能にする。したがって、宿主細胞の成長、培養能力を妨害する抗生物質耐性不活性化効果を伴わずに(これは、別の方法でファージ拡大を最小化する)、耐性細菌宿主集団を使用して培養で(例えば、工業的培養容器又は植物で)ファージを成長させることができ、ファージ及び宿主が共進化し、相互に調整することを可能にし、一方で、所望のファージのすべてのその他の構成要素が、培養された宿主集団に同調することを依然として可能にする。得られたファージ集団のサンプルの試験を、例えば、抗生物質耐性宿主細胞集団を使用して、ただし、宿主細胞の抗生物質耐性遺伝子のアレイ標的化について抑制解除された試験ファージを用いて実験室規模で実施できる。原核細胞及びファージ設定における遺伝子発現の天然に存在する及び合成の抑制は、当業者に周知であり、例えば、tetシステム又は光誘導システムである。
1.微生物製造方法であって、
(a)宿主細胞におけるヌクレオチド配列標的化のための宿主CRISPR/Casシステムを含む宿主細胞を提供する工程と、
(b)宿主細胞に感染可能であるウイルスを提供する工程であって
(i)ウイルスは、宿主細胞の標的ヌクレオチド配列を改変するための1つ又は複数の遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイ(例えば、上記のようなアレイ)を含み、
(ii)第1の前記HM-アレイは、標的配列を改変するために第1の宿主標的配列とハイブリダイズして、Casを宿主細胞中の標的にガイドすることが可能であるスペーサー配列(HM-スペーサー)を含む第1のHM-crRNAをコードし、任意選択で、第1の標的配列の改変は、宿主細胞成長又は生存力を低減し、
(iii)第1のHM-アレイは、第1のHM-crRNAの転写について可逆的に抑制可能であり、及び/又は第1のHM-crRNA活性が抑制可能である
工程と、
(c)ウイルスを用いて宿主細胞に感染させて、1つ又は複数のHM-CRISPRアレイを細胞中に導入する工程と、
(d)細胞における第1のHM-crRNAの転写及び/又は第1のHM-crRNA活性を抑制する工程と、
(e)感染宿主細胞を培養して、ウイルスの集団(PV1)を含む宿主細胞の集団(PH1)を製造する工程と、
(f)ウイルス集団PV1及び/又は培養宿主細胞集団を得る工程と
を含む、方法。
2.工程(e)又は(f)後にウイルス集団における第1のHM-crRNAの転写及び/又は第1のHM-crRNA活性を抑制解除する工程を更に含み、任意選択で、その後に、宿主細胞を培養する工程を更に含む、段落1の方法。
3.A.任意選択で、(a)、(f)又は段落2の更に培養された細胞の宿主細胞と同一である、宿主細胞の集団(PH2)を得る工程と、
B.Aの宿主細胞に集団PV1に由来するウイルスを感染させる工程と、
C.細胞における第1のHM-crRNAの転写及び/又は第1のHM-crRNA活性を抑制する工程と、
D.感染宿主細胞を培養して、ウイルスの集団(PV2)を含む宿主細胞の集団(PH3)を製造する工程と、
E.ウイルス集団PV2(又はそのウイルス)及び/又は培養宿主細胞集団を得る工程と
を含む、段落1又は2の方法。
4.工程(D)又は(E)後にウイルス集団における第1のHM-crRNAの転写及び/又は第1のHM-crRNA活性を抑制解除する工程を更に含み、任意選択で、その後に、宿主細胞を培養する工程を更に含む、段落3の方法。
5.更なる宿主細胞又は宿主細胞の集団(PH4)でウイルス集団PV1又はPV2の単離されたサンプルを試験する工程を含み、任意選択で、更なる細胞又は集団PH4が、(a)の細胞に対して同一であり、試験する工程が、更なる細胞又は集団PH4に前記サンプルのウイルスを感染させる工程と、任意の宿主細胞成長が生じることを可能にする期間、待機する工程と、更なる細胞又は集団PH4の所定の活性(例えば、細胞成長又は生存力)が改変されている(例えば、低減されている、低減された宿主細胞成長又は生存力*等)か、又は生じているかを決定する工程とを含み、細胞(単数又は複数)の内側のウイルスが、前記期間の間、抑制解除された第1のHM-crRNAの転写及び/又は第1のHM-crRNA活性を有する、段落1から4のいずれか1つの方法。
*これは、寒天にプレーティングされた細胞又はPH4に、サンプルのウイルスが添加される場合に、プラーク形成のための標準アッセイを使用して試験できる。
6.宿主細胞のすべてが、微生物細胞(例えば、細菌又は古細菌細胞)であり、第1の標的配列の改変が、宿主細胞成長又は生存力を低減し、前記決定する工程が、抗菌活性**が生じたことを決定する、段落5の方法。
**これは、標準プラークアッセイを使用して決定できる。
7.期間が、少なくとも1、5、10、30、60又は120分である、段落5又は6の方法。
8.(a)の細胞及び任意選択で、PH1、PH2及び/又はPH3細胞が、第1の標的配列を含まず、更なる細胞又は集団PH4細胞が、第1の標的配列を含む、段落5から7のいずれか1つの方法。
9.(a)の細胞及び任意選択で、PH1、PH2及び/又はPH3細胞が、第1の抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子を含まず、第1の標的配列が、このような遺伝子の標的配列であり、任意選択で、更なる細胞又は集団PH4細胞が、前記遺伝子を含む、段落1から8のいずれか1つの方法。
10.(a)の細胞及び任意選択で、PH1、PH2及び/又はPH3細胞が、第1の抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子を含み、第1の標的配列が、このような遺伝子の標的配列である、段落1から7のいずれか1つの方法。
11.宿主細胞のすべてが、微生物細胞(例えば、細菌又は古細菌細胞)であり、第1の標的配列の改変が、宿主細胞成長又は生存力を低減する、又は抗生物質に対する宿主細胞耐性を低減する、段落1から10のいずれか1つの方法。
12.宿主細胞のすべてが、ヒト、動物(例えば、非ヒト動物)又は植物の感染性疾患病原体である、段落1から11のいずれか1つの方法。
13.宿主細胞のすべてが、例えば、エシェリキア属(Escherichia)(例えば、大腸菌(E coli)O157:H7又はO104: H4)、シゲラ属(Shigella)(例えば、ディセンテリエ(dysenteriae))、サルモネラ属(Salmonella)(例えば、チフィ(typhi)又はエンテリカ(enterica)、例えば、血清型チフィムリウム(typhimurium)、例えば、DT104)、エルウィニア属(Erwinia)、エルシニア属(Yersinia)(例えば、ペスチス(pestis))、バチルス属(Bacillus)、ビブリオ属(Vibrio)、レジオネラ属(Legionella)(例えば、ニューモフィリア(pneumophilia))、シュードモナス属(Pseudomonas)(例えば、エルギノーサ(aeruginosa))、ナイセリア属(Neisseria)(例えば、ゴンノレア(gonnorrhoea)又はメニンギティディス(meningitidis))、ボルデテラ属(Bordetella)(例えば、パータスス(pertussus))、ヘリコバクター属(Helicobacter)(例えば、ピロリ(pylori))、リステリア属(Listeria)(例えば、モノサイトゲネス(monocytogenes))、アルゴバクテリウム属(Agrobacterium)、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)(例えば、オーレウス(aureus)、例えば、MRSA)、ストレプトコッカス属(Streptococcus)(例えば、ピオゲネス(pyogenes)又はサーモフィルス(thermophilus))、エンテロコッカス属(Enterococcus)、クロストリジウム属(Clostridium)(例えば、ディフィシル(dificile)又はボツリナム(botulinum))、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)(例えば、アミコラツム(amycolatum))、マイコバクテリウム属(Mycobacterium)(例えば、ツベルキュロシス(tuberculosis))、トレポネマ属(Treponema)、ボレリア属(Borrelia)(例えば、バーグドルフェリ(burgdorferi))、フランシセラ属(Francisella)、ブルセラ属(Brucella)、カンピロバクター属(Campylobacter)(例えば、ジェジュニ(jejuni))、クレブシエラ属(Klebsiella)(例えば、ニューモニエ(pneumoniae))、フランキア属(Frankia)、バルトネラ属(Bartonella)、リケッチア属(Rickettsia)、シュワネラ属(Shewanella)、セラチア属(Serratia)、エンテロバクター属(Enterobacter)、プロテウス属(Proteus)、プロビデンシア属(Providencia)、ブロコトリックス属(Brochothrix)、ビフィドバクテリウム属(Bifidobacterium)、ブレビバクテリウム属(Brevibacterium)、プロピオニバクテリウム属(Propionibacterium)、ラクトコッカス属(Lactococcus)、ラクトバチルス属(Lactobacillus)、ペディオコッカス属(Pediococcus)、ロイコノストック属(Leuconostoc)、ビブリオ属(例えば、コレラ(cholera)、例えば、O139又はブルニフィクス(vulnificus))、ヘモフィルス属(Haemophilus)(例えば、インフルエンザ(influenzae)、ブルセラ属(例えば、アボルツス(abortus))、フランシセラ属(Franciscella)、キサントモナス属(Xanthomonas)、エーリキア属(Erlichia)(例えば、シャフェンシス(chaffeensis))、クラミジア属(Chlamydia)(例えば、ニューモニエ)、パラクラミジア属(Parachlamydia)、エンテロコッカス属(例えば、フェカリス(faecalis)又はファセイム(faceim)、例えば、リネゾリド耐性)、オエノコッカス属(Oenococcus)及びアシネトバクター属(Acinetoebacter)(例えば、バウマニー(baumannii)、例えば、多剤耐性)の種から選択された同一種のものである、段落1から13のいずれか1つの方法。
14.宿主細胞のすべてが、例えば、メチシリン、バンコマイシン耐性及びテイコプラニンから選択される抗生物質に対して耐性のスタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)細胞である、請求項13の方法。
15.宿主細胞のすべてが、例えば、セファロスポリン系剤(例えば、セフタジジム)、カルバペネム系剤(例えば、イミペネム又はメロペネム)、フルオロキノロン、アミノグリコシド系剤(例えば、ゲンタマイシン又はトブラマイシン)及びコリスチンから選択される抗生物質に対して耐性の、シュードモナス・エルギノーサ細胞である、請求項13の方法。
16.宿主細胞のすべてが、例えば、カルバペネムに対して耐性のクレブシエラ属(例えば、ニューモニエ)の細胞である、請求項13の方法。
17.宿主細胞のすべてが、例えば、エリスロマイシン、クリンダマイシン、β-ラクタム、マクロライド、アモキシシリン、アジスロマイシン及びペニシリンから選択される抗生物質に対して耐性のストレプトコッカス属 (例えば、ニューモニエ又はピオゲネス)の細胞である、請求項13の方法。
18.宿主細胞のすべてが、例えば、セフトリアキソン、アジスロマイシン及びシプロフロキサシンから選択される抗生物質に対して耐性のサルモネラ属(例えば、血清型チフィ)の細胞である、請求項13の方法。
19.宿主細胞のすべてが、例えば、シプロフロキサシン及びアジスロマイシンから選択される抗生物質に対して耐性のシゲラ属の細胞である、請求項13の方法。
20.宿主細胞のすべてが、例えば、イソニアジド(INH)、リファンピシン(RMP)、フルオロキノロン、アミカシン、カナマイシン及びカプレオマイシンに対する耐性から選択される抗生物質に対して耐性の結核菌(mycobacterium tuberculosis)細胞である、請求項13の方法。
21.宿主細胞のすべてが、例えば、バンコマイシンに対して耐性のエンテロコッカス属の細胞である、請求項13の方法。
22.宿主細胞のすべてが、例えば、セファロスポリン及びカルバペネムから選択される抗生物質に対して耐性の腸内細菌科細胞である、請求項13の方法。
23.宿主細胞のすべてが、例えば、トリメトプリム、イトロフラントイン(itrofurantoin)、セファレキシン及びアモキシシリンから選択される抗生物質に対して耐性の大腸菌細胞である、請求項13の方法。
24.宿主細胞のすべてが、例えば、フルオロキノロン系抗生物質及びカルバペネムから選択される抗生物質に対して耐性のクロストリジウム属(例えば、ディフィシル)の細胞である、請求項13の方法。
25.宿主細胞のすべてが、例えば、セフィキシム(例えば、経口セファロスポリン)、セフトリアキソン(注射用セファロスポリン)、アジスロマイシン及びテトラサイクリンから選択される抗生物質に対して耐性のナイセリア・ゴンノレア(Neisseria gonnorrhoea)細胞である、請求項13の方法。
26.宿主細胞のすべてが、例えば、ベータ-ラクタム、メロペネム及びカルバペネムから選択される抗生物質に対して耐性のアシネトバクター・バウマニー(Acinetoebacter baumannii)細胞である、請求項13の方法。
27.宿主細胞のすべてが、例えば、シプロフロキサシン及びアジスロマイシンから選択される抗生物質に対して耐性のカンピロバクター属の細胞である、請求項13の方法。
28.宿主細胞が、ベータ(β)-ラクタマーゼを産生する、段落1から27のいずれか1つの方法。
29.宿主細胞が、段落14から27のいずれか1つに列挙される抗生物質に対して耐性である、段落1から28のいずれか1つの方法。
30.第1の標的配列が、宿主細胞に前記抗生物質に対する耐性を付与する産物をコードする遺伝子の配列である、段落29の方法。
31.第1の標的配列が、抗生物質耐性遺伝子の配列である(すなわち、宿主細胞に抗生物質に対する耐性、例えば、メチシリン耐性を付与するための)及び/又は集団PH1、集団PH2、集団PH3及び集団PH4のうち1つ、複数又はすべてが、抗生物質又は前記抗生物質(例えば、段落13から27のいずれか1つに列挙された抗生物質)に対して耐性である、段落1から30のいずれか1つの方法。
32.ウイルス集団PV1又はPV2の抑制解除されたウイルスが、抗菌活性(例えば、抗菌活性、例えば、ウイルスがファージである場合に)を有し、任意選択で、宿主細胞(単数又は複数)が、段落30に列挙される第1の標的配列を含み、第1の標的の改変が、前記抗菌活性を提供する、段落1から31のいずれか1つの方法。
33.段落5に従属する場合に、PH4の細胞が、抗生物質(例えば、段落13から27のいずれか1つに列挙された抗生物質)に対して耐性であり、(a)及びPH2の細胞が、前記抗生物質に対して耐性ではない、段落1から32のいずれか1つの方法。これは、培養すること及び拡大することを、抗生物質耐性宿主細胞を取り扱うことのリスク(例えば、これらの不適切な(inadequante)封じ込め及び薬物製造プラントからの漏れのリスク)を伴わずに比較的安全に実施できるので、薬物使用のためのウイルスの製造を補助する。それにもかかわらず、PH4に対する試験は、封じ込め実験室又は抗生物質耐性宿主株の使用のために設定されているその他の施設において実施できる。PH4に対する試験の場合には、第1のHM-crRNAは抑制解除され、その結果、本発明のHMアレイによる宿主細胞における耐性遺伝子の改変が可能となる。
34.宿主CRISPR/Casシステムが、I、II又はIII型システムであり、標的配列が、(a)の宿主細胞と同一属の少なくとも1つ、2つ又は3つの更なる宿主株又は種における前記型のシステムにおいて保存されたヌクレオチド配列である、段落1から33のいずれか1つの方法。
35.ウイルスが、ファージ又はファージミドである、段落1から34のいずれか1つの方法。
36.(b)のウイルスが、コルチコウイルス科(Corticoviridae)、シストウイルス科(Cystoviridae)、イノウイルス科(Inoviridae)、レビウイルス科(Leviviridae)、ミクロウイルス科(Microviridae)、ミオウイルス科(Myoviridae)、ポドウイルス科(Podoviridae)、シホウイルス科(Siphoviridae)又はテクティウイルス科(Tectiviridae)のウイルスである、段落35の方法。
37.(b)のウイルスが、天然に存在するファージ、例えば、(a)の細胞と同一株である細胞から誘導されたファージである、段落35又は36の方法。
38.(b)のファージが、ファージ耐性細菌を使用する選択圧によって得られた突然変異ファージである、段落35、36又は37の方法。
39.(b)において、
(iv)前記1種又は複数のHMアレイが、標的配列を改変するために第2の宿主標的配列とハイブリダイズして、Casを宿主細胞中の第2の標的にガイドすることが可能であるHMスペーサーを含む第2のHM-crRNAをコードするHMアレイを含み、第2の標的配列が、宿主CRISPR/Casシステムのヌクレオチド配列であり、それによって、第2のHM-crRNAが、Casを第2の標的にガイドして、宿主細胞において宿主CRISPR/Casシステムを改変し、第2の標的配列の改変が、宿主CRISPR/Casシステムの機能を低減又は排除し、
(v)(iv)のHMアレイが、第2の宿主標的配列とハイブリダイズ可能な第2のHM-crRNAの転写のために(a)の細胞において活性である、
段落1から38のいずれか1つの方法。
40.PH1〜4のいずれか1つ又はすべての細胞が、前記第2の標的配列を含む、段落39の方法。
41.第2の標的配列が、段落11から24のいずれか1つに列挙されるような細胞の属又は種(例えば、Sサーモフィルス又はSピオゲネス又はSオーレウス)のCRISPR/Casシステム配列に対して同一である、段落39又は40の方法。
42.第2の標的配列が、配列番号1〜44からなる群から選択される配列又はその相補体により含まれる、段落39から41のいずれか1つの方法。
43.第2の標的配列が、
A.リピートDNA又はRNA配列(例えば、リピートは、前記宿主CRISPRアレイ中の最も5'のリピート(第1のリピート)である)、
B.tracrRNA配列又はDNA配列をコードするtracrRNA、CRISPRアレイリーダー配列、
C.Cas遺伝子プロモーター(例えば、Cas1、Cas2又はCsn2プロモーター)、
D.CRISPRアレイリーダープロモーター配列又は
E.CasをコードするDNA又はRNA配列(例えば、Casは、Cas9、Cas1、Cas2又はCsn2である)
を含む、段落39から42のいずれか1つの方法。
44.第2の標的配列が、
F.第1のリピートの最も5'のヌクレオチドと連続する(及び任意選択で、前記リピートの最も5'のヌクレオチドを含む)CRISPRアレイリーダー又はリーダープロモーター配列、
G.第1のリピートのすぐ5'の最大20の連続ヌクレオチドの配列、
H.第1のリピートの最も5'のヌクレオチオの最大20の連続ヌクレオチドの配列、又は
I.第1のスペーサーリピートのすぐ3'にある(任意選択で、配列が、第1のスペーサーの最も3'のヌクレオチドを含む)最大20の連続ヌクレオチドの配列
を含む、段落39から43のいずれか1つの方法。
45.J.第2のHM-crRNAが、構造R-S-R(式中、R=CRISPRリピート及びS=CRISPRスペーサー)を含むか、又はからなり、Sが、(5'から3'方向に)V-HR又はHR-V(式中、V=(b)のウイルスのDNA配列と少なくとも95、96、97、98又は99%同一の配列及びHR=前記宿主細胞CRISPR/CasシステムのCRISPRリピートのDNA配列)を含み、
K.宿主CRISPR/Casシステムにおいて、HRの配列が、Vの配列とすぐ連続しており、
L.第2のHM-crRNAが、細胞における宿主CRISPR/Casシステムの改変(例えば、切断又は不活性化)のために、宿主CRISPR/Casシステムのスペーサーとハイブリダイズして、Casをスペーサーにガイドすることが可能である、
段落39から44のいずれか1つの方法。
46.V=ウイルスDNAの1又は最大40(例えば、最大15)の連続ヌクレオチドである、段落45の方法。
47.第2のHM-crRNAが、(b)のウイルスの核酸と実質的にハイブリダイズしない段落39から46のいずれか1つの方法。
48.a.宿主CRISPR/Casシステムが、同族PAMを認識でき、
b.(b)のウイルスの核酸が、プロトスペーサー配列のすぐ3'にこのようなPAMを含み、
c.V=プロトスペーサーの1又は最大40(例えば、最大15)のヌクレオチドであり、
d.HR=宿主CRISPR/Casシステムのリピートの連続配列に対して同一の配列である、
段落45から47のいずれか1つの方法。
49.宿主システムのリピートの前記連続配列が、宿主リピートの少なくとも50%の配列(例えば、宿主リピートの最も5'又は最も3'のヌクレオチドを含む)である、段落48の方法。
50.プロトスペーサー連続ヌクレオチドのV=1〜40(例えば、最大15)の最も3'であり、任意選択で、リピートの前記連続配列が、宿主リピートの最も5'のヌクレオチドを含む、段落45又は46の方法。
51.プロトスペーサー連続ヌクレオチドのV=1〜40(例えば、最大15)の最も5'であり、任意選択で、リピートの前記連続配列が、宿主リピートの最も3'のヌクレオチドを含む、段落48又は49の方法。
52.R=宿主CRISPR/Casシステムによって認識されるリピートである、段落45から51のいずれか1つの方法。
53.各HM-CRISPRが、(5'から3'方向に)第1のリピート配列、第1のスペーサー配列及び第2のリピート配列を含み、スペーサー配列が、宿主細胞中のそれぞれの標的配列とハイブリダイズ可能であり、アレイが、宿主細胞におけるリピート及びスペーサーの転写のためのプロモーターを更に含み、任意選択で、(b)のウイルスの核酸が、宿主細胞において機能的Cas及び/又はtracrRNA配列をコードするためにCasヌクレアーゼをコードする配列及び/又はtracrRNAをコードする配列を含み、tracrRNA配列が、第1又は第2のリピートと相補的である配列を含む、段落1から52のいずれか1つの方法。
54.各HM-CRISPRアレイが、(5'から3'方向に)第1のリピート配列、第1のスペーサー配列及び第2のリピート配列を含み、スペーサー配列が、宿主細胞中のそれぞれの標的配列とハイブリダイズ可能である配列を含み、アレイが、宿主細胞におけるリピート及びスペーサーの転写のためのプロモーターを更に含み、ベクターが、宿主細胞においてtracrRNA配列をコードするためにCasヌクレアーゼをコードする配列及び/又はtracrRNAをコードする配列を含まず、tracrRNA配列が、第1又は第2のリピートと相補的である配列を含み、HM-CRISPRアレイが、宿主細胞において、任意選択で、宿主tracrRNAを使用してCas(例えば、内因性宿主Casヌクレアーゼ)をそれぞれの宿主標的部位にガイドするために機能的である、段落1から53のいずれか1つの方法。
55.リピートが、宿主CRISPR/Casシステム中のリピートに対して同一であり、HM-CRISPRアレイ又は各HM-CRISPRアレイが、宿主CRISPR/CasシステムのCas(例えば、Casヌクレアーゼ、例えば、Cas9)によって認識されるPAMを含まない、段落53又は54の方法。
56.各HM-CRISPRアレイが、HM-スペーサーの1つより多いコピー(例えば、少なくとも2つ、3つ又は4つのコピー)を含む、段落1から55のいずれか1つの方法。
57.第2又は第3のHM-crRNA(更なるHM-crRNA)をコードし、更なるHM-crRNAが、宿主標的配列とハイブリダイズして、Casを宿主細胞中の標的にガイドすることが可能であるヌクレオチド配列を含み、任意選択で、標的配列が、宿主細胞の必須、病原性若しくは耐性遺伝子の、又は宿主細胞のCRISPR/Casシステムの必須構成要素のヌクレオチド配列である、段落1から56のいずれか1つの方法。
58.宿主細胞においてそれぞれのHM-crRNAを産生するために、HM-CRISPRアレイ又は各HM-CRISPRアレイが、宿主細胞の内因性CRISPRリピートに対して同一であるCRISPRリピート配列を含む、段落1から57のいずれか1つの方法。
59.(b)のウイルスが、(a)の宿主細胞において機能的であるCas(非宿主Cas)をコードするヌクレオチド配列を含み(例えば、非宿主Casは、I型システムCasであり、宿主システムは、II又はIII型であるか、又はII型システムCasであり、宿主システムは、I又はIII型であるか、又はIII型システムCasであり、宿主システムは、I又はII型である)、任意選択で、宿主細胞は、非宿主Casの型と同一である型のCasを含まない、又は発現しない、段落1から58のいずれか1つの方法。
60.(b)のウイルスが、tracrRNA配列をコードするヌクレオチド配列を含み、任意選択で、tracrRNA配列及び第1のHM-crRNAが、シングルガイドRNA(gRNA))により含まれる、段落1から59のいずれか1つの方法。
61.HM-crRNA又は各HM-crRNAが、それぞれのシングルガイドRNA(gRNA)により含まれる、段落1から60のいずれか1つの方法。
62.第1のHM-アレイが、第1の標的配列におけるCas切断、第1の標的配列(又は第1の標的配列を含む遺伝子)の活性下、第1の標的配列(又は第1の標的配列を含む遺伝子)のノックダウン又は第1の標的配列の突然変異を引き起こすように作動可能である、段落1から61のいずれか1つの方法。
63.任意選択で、集団が、PV1又はPV2と同一である、又はウイルスが、このような集団から得ることができる、段落1から62のいずれか1つの方法によって得ることができるウイルス、宿主細胞又はウイルス集団。
64.任意選択で、PH1、PH2、PH3若しくはPH4又は段落1から63のいずれか1つにおいて列挙される培養細胞集団と同一である、段落1から63のいずれか1つの方法によって得ることができる宿主細胞(例えば、細菌細胞)集団。
65.(b)のウイルスの核酸を含まない、又は前記第1のHM-アレイ又は前記第2のHM-アレイ(例えば、PCRによって決定されるような)を含まない、段落64の宿主細胞集団。
66.医学的又は歯科的又は眼科的使用のための(例えば、生物における感染を処置若しくは予防するための、又は生物における感染の広がりを制限するための)段落63から65のいずれか1つのウイルス、宿主細胞又は集団。
67.食物、飲料、乳製品又は美容的使用(例えば、化粧料、例えば、メーキャップにおける使用)のための、又は衛生使用(例えば、衛生品、例えば、石鹸における使用)のための、段落63から66のいずれか1つに記載のウイルス、宿主細胞又は集団を含む組成物。
68.医療における、又は歯科治療的若しくは予防的使用のための、段落63から67のいずれか1つに記載の組成物、ウイルス、宿主細胞又は集団の使用。
69.化粧品使用(例えば、化粧料、例えば、メーキャップにおける使用)における、又は衛生使用(例えば、衛生品、例えば、石鹸における使用)のための、段落63から68のいずれか1つに記載の組成物、ウイルス、宿主細胞又は集団の使用。
70.微生物宿主細胞を改変するための(例えば、細胞又は微生物細胞の培養物を死滅させる、又はその成長の低減するための)、段落63から69のいずれか1つの使用、ウイルス、宿主細胞又は集団。
71.ウイルス又は前記集団中のウイルスが、宿主細胞溶解のためにホリン及び/又はエンドリシンを発現し、任意選択で、エンドリシンが、ファージphi11、ファージTwort、ファージP68、ファージphiWMY又はファージKエンドリシン(例えば、MV-Lエンドリシン又はP-27/HPエンドリシン)である、段落1から63及び66から70のいずれか1つの方法、ウイルス又はウイルス集団。
72.ウイルス又は前記集団中のウイルスが、宿主細胞溶解のためにホリン及び/又はエンドリシンを発現しない、段落1から63及び66から70のいずれか1つの方法、ウイルス又はウイルス集団。
73.ウイルス(例えば、(b)のウイルス)又は各前記集団中のウイルスが、(a)の宿主細胞において機能的な抗菌物質、例えば、抗生物質剤、例えば、ベータ-ラクタム系抗生物質(例えば、段落13から27のいずれか1つに列挙された抗生物質)と組み合わせた状態にある、段落1から63及び66から70のいずれか1つの方法、ウイルス又はウイルス集団。
本発明は、特に、工業用又は家庭用システムにおける基質又は流体の微生物腐食(MIC)又は生物付着を制御する方法に関する。本発明はまた、本方法において使用するための処理された流体及びベクターに関する。
1.工業用又は家庭用のシステムにおける基板の微生物腐食(MIC)又は生物付着を制御する方法であって、基板の表面を、基板のMIC又は生物付着を媒介する第1の微生物種の第1の宿主細胞の集団と接触させ、
(i)集団を、細胞を形質転換又は形質導入することが可能である複数のベクターと接触させる工程であって、各ベクターは、CRISPRアレイを含み、それによってCRISPRアレイは宿主細胞に導入され、
(a)各CRISPRアレイは、crRNAの発現のための1つ又は複数のヌクレオチド配列及び宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)各crRNAは、標的配列を改変するために(例えば、標的配列を切断するために)宿主細胞において、宿主細胞の標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ、例えば、Cas9又はCpf1)をガイドすることが可能であり、標的配列は、宿主細胞生存力を媒介するための遺伝子配列である
工程と、
(ii)宿主細胞においてCasの存在下で前記cRNAを発現させ、それによって、宿主細胞において標的配列を改変し、宿主細胞生存力の低減及び前記基板のMIC又は生物付着の制御をもたらす工程と
を含む方法。
2.前記宿主細胞が、前記基質と接触している微生物バイオフィルムにより含まれる、態様1の方法。
3.前記表面及び宿主細胞が、流体、例えば、水性液(例えば、海水、淡水、貯蔵水又は飲用水)と接触している、態様1又は2の方法。
4.工業用又は家庭用システムにおいて流体の微生物生物付着を制御する方法(例えば、リザーバー又は容器において液体の細菌酸性化を制御するための)であって、流体は、前記生物付着を媒介する第1の微生物種の第1の宿主細胞の集団を含み、
(i)集団を、細胞を形質転換又は形質導入可能である複数のベクターと接触させる工程であって、各ベクターは、CRISPRアレイを含み、それによって、CRISPRアレイは宿主細胞に導入され、
(a)各CRISPRアレイは、crRNAの発現のための1つ又は複数の配列及び宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)各crRNAは、標的配列を改変するために(例えば、標的配列を切断するために)宿主細胞において、宿主細胞の標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能であり、標的配列は、宿主細胞生存力を媒介するための遺伝子配列である
工程を含み、
宿主細胞においてCasの存在下で前記cRNAの発現を可能にすること、それによって、宿主細胞において標的配列を改変すること、その結果、宿主細胞生存力の低減及び前記生物付着の制御を得ることを含む、方法。
石油化学製品回収、処理、貯蔵又は輸送システム;炭化水素回収、処理、貯蔵又は輸送システム;粗製油回収、処理、貯蔵又は輸送システム;天然ガス回収、処理、貯蔵又は輸送システム、(例えば、油井、油掘削装置、油掘削設備、油ポンピングシステム、油パイプライン、ガス掘削装置、ガス抽出設備、ガスポンピング設備、ガスパイプライン、石油タンカー、ガスタンカー、油貯蔵設備又はガス貯蔵設備);水処理又は貯蔵設備、水リザーバー(例えば、飲用水リザーバー)、エア又は水コンディショニング(例えば、冷却又は加熱)設備、例えば、クーラントチューブ、冷却器又は熱交換器;医学又は手術設備;環境(例えば、土壌、水路又は空気)処理設備;紙製造又はリサイクリング設備;発電所、例えば、火力又は原子力発電所;燃料(例えば、炭化水素燃料、例えば、石油、ディーゼル又はLPG)貯蔵設備;採鉱又は冶金、鉱物又は燃料回収システム、例えば、採鉱場又は採鉱設備;エンジニアリングシステム;船舶設備;貨物又は物品貯蔵設備(例えば、積荷容器);食品又は飲料製造、加工又は包装設備;クリーニング設備(例えば、ランドリー設備、例えば、洗浄機又は食器洗浄機);ケータリング(例えば、家庭用又は商業的ケータリング)設備;農業設備;建設(例えば、建築、公共施設インフラ又は道路建設)設備;航空設備;航空宇宙設備;輸送設備(例えば、動力車(例えば、車、大型トラック又はバン);鉄道車両;航空機(例えば、飛行機)又は海洋若しくは水路船舶(例えば、ボート又は船、潜水艦又はホバークラフト));包装設備、例えば、消費材包装設備;又は食品若しくは飲料包装設備;電子工学(例えば、コンピュータ又は携帯電話又はその電子工学構成要素);又は電子工学製造又は包装設備;歯学設備;工業用又は家庭用配管(例えば、海中パイプ)又は貯蔵容器(例えば、水タンク又は燃料タンク(例えば、ガソリンタンク、例えば、乗り物のガソリンタンク));地下設備;建築物(例えば、住居又はオフィス又は商業店舗又は工場又は発電所);道路;橋梁;農業設備;工場システム;粗製油又は天然ガス探査設備;オフィスシステム;及び家庭用システム。
5.前記流体が、水性液(例えば、海水、淡水、貯蔵水又は飲用水)である態様4の方法。
6.流体をベクターと混合すること、それによって、宿主細胞をベクターと接触させることを含む、態様3から5のいずれか1つの方法。例えば、ベクターが、液体(任意選択で、抗生物質又は殺生物剤とも)と予め混合されることもあり、次いで、混合物が表面(態様1)又は態様4の流体と接触している流体に添加される。
7.各標的配列が、宿主細胞病原性、耐性又は必須遺伝子配列、例えば、エキソン又はその調節配列である、態様1から6のいずれか1つの方法。耐性は、抗生物質耐性であり得る。一例では、宿主細胞を、宿主細胞生存力を低減するために、前記抗生物質及び前記ベクターと接触させる。
8.標的配列の改変が、宿主細胞死滅及び/又は宿主細胞成長若しくは増殖の低減をもたらす、態様1から7のいずれか1つの方法。増殖は、例えば、表面と接触している細胞拡大又は細胞分布である。
9.ベクターが、同一CRISPRアレイを含む、態様1から8のいずれか1つの方法。
10.宿主細胞が、細菌又は古細菌細胞である、態様1から9のいずれか1つの方法。代替において、第1の細胞の代わりに、藻類細胞である。
11.第1の宿主細胞が、硫酸還元菌(SRB)細胞(例えば、デスルホビブリオ属(Desulfovibrio)又はデスルホトマキュラム属(Desulfotomaculum)の細胞)である態様1から10のいずれか1つの方法。一例では、細胞が、デスルホトマキュラム・ニグリフィカン(Desulfotomaculum nigrifican)、デスルファシナム・インフェルナム(Desulfacinum infernum)、サーモデスルホバクテリウム・モビル(Thermodesulfobacterium mobile)、サーモデスルホハブダス・ノルベジクス(Thermodesulforhabdus norvegicus)、アーカエオグロブス・フルジダス(Archaeoglobus fulgidus)、デスルホミクロビウム・アプシェロナム(Desulfomicrobium apsheronum)、デスルホビブリオ・ガボネンシ(Desulfovibrio gabonensi)、デスルホビブリオ・ロングス(Desulfovibrio longus)、デスルホビブリオ・ビエトナメンシス(Desulfovibrio vietnamensis)、デスルホバクテリウム・セトニカム(Desulfobacterium cetonicum)、デスルホマキュラム・ハロフィルム(Desulphomaculum halophilum)、デスルホバクター・ビブリオホルミス(Desulfobacter vibrioformis)及びデスルホトマキュラム・サーモシステルナム(Desulfotomaculum thermocisternum)細胞からなる群から選択される。一例では、集団は、これらの細胞種のうち2種以上の混合物を含む。
12.表面又は流体が、粗製油、ガス又は石油化学製品回収、処理、貯蔵又は輸送設備により含まれる、態様11の方法。粗製油は、世界において最も重要なエネルギー供給源の1種である。粗製油が、種々の技術プロセスによって、ガソリン、油、パラフィン油、滑沢剤、アスファルト、家庭用燃料油、ワセリン及びポリマー等の消費者向け製品に精製される、精製-石油化学産業を含む多数の産業において原材料として使用される。油由来製品も、多数のその他の化学プロセスにおいて一般に使用される。代替において、流体は、前記消費者向け製品であり、表面は、このような消費者向け製品と接触している。
13.表面が、海水、水圧破砕液若しくは井戸中の液体と接触している、又は流体が海水、水圧破砕液若しくは井戸中の液体である、態様11又は12の方法。
14.方法の工程(i)が、第2の種の微生物細胞の集団(第2の宿主細胞)を提供する工程であって、第2の細胞は前記ベクターを含み、ベクターは、第2の宿主細胞から第1の宿主細胞に伝達可能である工程と、第2の宿主細胞を第1の宿主細胞を組み合わせ、それによって、ベクターが第1の宿主細胞に導入される工程とを含む、態様1から13のいずれか1つの方法。一例では、第2の細胞は、環境において(例えば、水又は土壌環境において)環境的に、工業的に、又は家庭的に許容され、第1の宿主細胞が、環境において許容されない。
15.第1の宿主細胞が、前記ベクターとの接触の前に、微生物細胞の混合物により含まれ(例えば、微生物バイオフィルムにより含まれる)、混合物が、前記第2の種の細胞を含む、態様14の方法。
16.前記第2の種が、バチルス属種又は硝酸還元菌又は硝酸還元硫化物酸化菌(NRB)である、態様14又は15の方法。
17.NRBが、カンピロバクター属種、ニトロバクター属(Nitrobacter)の種、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)の種、チオミクロスピラ属(Thiomicrospira)の種、スルフロスピリウム属(Sulfurospirillum)の種、タウエラ属(Thauera)の種、パラコッカス属(Paracoccus)の種、シュードモナス属種、ロドバクター属(Rhodobacter)の種及びデスルホビブリオ属(Desulfovibrio)の種からなる群から選択される、又は前記種のうち少なくとも2種を含む、態様16の方法。
18.NRBが、ニトロバクター・ブルガリ(Nitrobacter vulgari)、ニトロソモナス・ユーロペア(Nitrosomonas europea)、シュードモナス・スツッツゼリ(Pseudomonas stutzeri)、シュードモナス・エルギノーサ、パラコッカス・デニトリフィカン(Paracoccus denitrifican)、スルフロスピリルム・デレイアナム(Sulfurospirillum deleyianum)及びロドバクター・スファエロイデス(Rhodobacter sphaeroides)からなる群から選択される、態様17の方法。
19.前記第1の種の宿主細胞を、前記ベクターと同時に又は逐次、殺生物剤と接触させる工程を含む、態様1から18のいずれか1つの方法。一例では、宿主細胞と接触している組成物中で予め混合されたベクター及び殺生物剤が提供される。
20.殺生物剤が、テトラキスヒドロキシメチルホスホニウムスルフェート(THPS)、グルタルアルデヒド、一酸化塩素、二酸化塩素、次亜塩素酸カルシウム、次亜塩素酸カリウム、次亜塩素酸ナトリウム、ジブロモニトリロプロプリオンアミド(DBNPA)、メチレンビス(チオシアネート)(MBT)、2-(チオシアノメチルチオ)ベンゾチアゾール(TCMTB)、ブロノポール、2-ブロモ-2-ニトロ-1,3-プロパンジオール(BNPD)、トリブチルテトラデシルホスホニウムクロリド(TTPC)、タウリンアミド及びその誘導体、フェノール、第四級アンモニウム塩、塩素含有剤、キナルジニウム(quinaldinium)塩、ラクトン、有機色素、チオセミカルバゾン、キノン、カルバメート、尿素、サリチルアミド、カルバニリド、グアニド、アミジン、イミダゾリン、酢酸、安息香酸、ソルビン酸、プロピオン酸、ホウ酸、デヒドロ酢酸、亜硫酸、バニリン酸、p-ヒドロキシベンゾエートエステル、イソプロパノール、プロピレングリコール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、フェニルエチルアルコール、ホルムアルデヒド、ヨウ素及びその溶液、ポビドン-ヨウ素、ヘキサメチレンテトラミン、ノキシチオリン、1-(3-クロロアリル)-3,5,7-トリアゾ-1-アゾニアアダマンタンクロリド、タウロリジン、タウルルタム、N-(5-ニトロ-2-フルフリリデン)-l-アミノ-ヒダントイン、5-ニトロ-2-フラルデヒドセミカルバゾン、3,4,4'-トリクロロカルバニリド、3,4',5-トリブロモサリチルアニリド、3-トリフルオロメチル-4,4'-ジクロロカルバニリド、8-ヒドロキシキノリン、1-シクロプロピル-6-フルオロ-1,4-ジヒドロ-4-オキソ-7-(1-ピペラジニル)-3-キノリンカルボン酸、1,4-ジヒドロ-1-エチル-6-フルオロ-4-オキソ-7-(1-ピペラジニル)-3-キノリンカルボン酸、過酸化水素、過酢酸、ナトリウムオキシクロロセン、パラクロロメタキシレノール、2,4,4'-トリクロロ-2'-ヒドロキシジフェノール、チモール、クロルヘキシジン、塩化ベンズアルコニウム、塩化セチルピリジニウム、銀スルファジアジン、硝酸銀、臭素、オゾン、イソチアゾロン、ポリオキシエチレン(ジメチリミノ)エチレン(ジメチリミノ)エチレンジクロリド、2-(t-ブチルアミノ)-4-クロロ-6-エチルアミノ-5'-トリアジン(テルブチラジン)及びそれらの組合せからなる群から選択される、態様19の方法。一例では、殺生物剤は、テトラキスヒドロキシメチルホスホニウムスルフェート(THPS)である。一例では、殺生物剤は、第四級アンモニウム化合物である。
21.システムが、採鉱、運送、粗製油、ガス又は石油化学製品回収若しくは処理、水圧破砕、大気若しくは水加熱若しくは冷却、飲用水製造、貯蔵若しくは送達、炭化水素の輸送及び廃水処置からなる群から選択される産業運転において使用される、態様1から20のいずれか1つの方法。
22.表面が、前記選択された産業において使用される設備の表面である、又は流体が、前記選択された産業において使用される設備により含まれる流体である、態様21の方法。
23.表面が、台所、浴槽又は庭の設備の表面である、又は流体が、台所、浴槽又は庭の設備により含まれる、態様1から22のいずれか1つの方法。例えば、設備は、家庭用設定において使用される。
24.態様3に従属する場合に、流体が、容器(例えば、水タンク又はボトル)中に含有される飲用液体であり、表面が、液体と接触している容器の表面である、態様1から23のいずれか1つの方法。
25.各ベクターが、可動遺伝エレメント(MGE)を含み、MGEが、伝達の起点(oriT)及び前記CRISPRアレイを含み、MGEが、前記第1の種の宿主細胞と、前記工業用又は家庭用システム中の更なる微生物宿主細胞の間で伝達可能である、態様1から24のいずれか1つの方法。例えば、更なる細胞は、環境において(例えば、水又は土壌環境において)環境的に、工業的に、又は家庭的に許容され、第1の宿主細胞が、環境において許容されない。
26.oriTが、第1の及び更なる宿主細胞において機能的である、態様25の方法。
27.前記第1の及び更なる宿主細胞が、前記表面と接触している流体のバイオフィルムにより含まれ、又は前記細胞が、前記流体により含まれる、態様25又は26の方法。
28.前記更なる細胞が、態様16から18のいずれか1つにおいて列挙されるような種の細胞である、態様25、26又は27の方法。一例では、MGEは、更なる細胞から、第1の宿主細胞に伝達可能である、及び/又は逆もまた同じである。
29.更なる細胞が、前記第1の種の細胞である、態様25から27のいずれか1つの方法。
30.各MGEが、組み込み及び接合性エレメント(ICE)である、若しくはそれを含む、又は各ベクターが、前記第1の種の宿主細胞に感染可能であるファージであり、各MGEは、前記細胞間の伝達が可能であるファージ核酸である、態様25から29のいずれか1つの方法。
31.各ICEが、トランスポゾン、例えば、接合性トランスポゾンである、態様30の方法。
32.各ベクターが、任意選択で、態様25から31のいずれか1つに記載のMGEを含むプラスミドである、態様1から31のいずれか1つの方法。
33.第1の及び/又は更なる細胞が、MGEをその他の細胞に伝達するように作動可能なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、配列が、MGEにより含まれない、態様25から32のいずれか1つの方法。
34.配列が、ベクターにより含まれない、態様33の方法。
35.配列が、第1の細胞及び/又は更なる細胞の接合性トランスポゾンにより含まれる、態様33の方法。
36.トランスポゾンが、第1の及び更なる細胞間でMGEを伝達するようにトランスで作動可能である、態様35の方法。
37.MGEのoriTが、第1の細胞及び/又は更なる細胞のICEにより含まれるoriTと同一であり、ICEが、第1の及び更なる細胞間でMGEを伝達するようにトランスで作動可能である、態様25から36のいずれか1つの方法。
38.ベクターoriTが、SRB又はNRBトランスポゾンのoriTである、態様25から37のいずれか1つの方法。
39.各MGEが、第1及び第2の末端リピート配列並びにリピート配列間の前記CRISPRアレイを含む、態様25から38のいずれか1つの方法。
40.MGEが、CRISPRアレイコピーを(1)前記更なる宿主細胞に伝達された場合に第1の宿主細胞のゲノム中に、又は(2)第1の宿主細胞に伝達された場合に前記更なる宿主細胞中に残す、態様25から39のいずれか1つの方法。例えば、コピーは、伝達が起こる細胞のゲノム中に残されたトランスポゾン又はプロファージにより含まれる。
41.第1の及び更なる細胞が、異なる種の細菌細胞である(例えば、それぞれ、SRB及びNRB又はSRB及びバチルス属の細胞)、態様25から40のいずれか1つの方法。
42.態様30に従属する場合、MGEの可動化のためにトランスポサーゼと組み合わせた、態様25から41のいずれか1つの方法。
43.ベクター又はMGEが、前記第1の種の宿主細胞において作動可能である毒素-抗毒素(antioxin)モジュールを含み、任意選択で、毒素-抗毒素モジュールが、別の種の細胞において作動可能ではない、又は作動が低減された抗毒素遺伝子を含む、態様1から42のいずれか1つの方法。これらの実施形態は、標的配列を含む第1の宿主細胞におけるベクター/MGE(及びしたがってCRISPRアレイ)の保持に好都合に働く選択圧を作り出すのに有用である。
44.ベクター又はMGEが、前記第2の又は更なる細胞において作動可能である毒素-抗毒素モジュールを含み、任意選択で、毒素-抗毒素モジュールが、第2の又は更なる細胞以外の細胞において作動可能ではない、又は作動が低減された抗毒素遺伝子を含む、態様1から43のいずれか1つの方法。これは、第2の又は更なる細胞においてCRISPRアレイの集団を維持するのに有用である(例えば、このような細胞が第1の細胞も含むバイオフィルム中に存在する場合)が、毒素-抗毒素モジュールは、第1の宿主細胞において更なる死滅(的配列改変の作用を上回る、及び超える)を提供する。一例では、ベクター又はMGEは、第1の宿主細胞において、及び前記第2の又は更なる細胞において作動可能である毒素-抗毒素モジュールを含む。
45.毒素-抗毒素モジュールが、第1及び第2の又は更なる細胞以外の細胞において作動可能ではない、又は作動が低減されている、態様43又は44のいずれか1つの方法。したがって、第1及び第2の(又は更なる)細胞の両方においてCRISPRアレイを維持するための選択圧があり得る。普通、これは、次いで、混合集団中の細胞間でのMGE中のアレイの水平伝達のためのリザーバーを提供する(例えば、表面又は流体により含まれる集団と接触しているバイオフィルム)。
46.第1及び第2の細胞(又は第1の及び更なる細胞)が、のもの(例えば、両細菌細胞)であり、ベクターが、(A)第1の細胞及び/又は第2の(又は更なる)細胞において複製可能又は作動可能であるが、同一門の別の細胞ではそうではない、(B)第1の細胞及び/又は第2の(又は更なる)細胞では複製可能又は作動可能であるが、同一目の別の細胞ではそうではない、(C)第1の細胞及び/又は第2の(又は更なる)細胞において複製可能又は作動可能であるが、同一綱の別の細胞ではそうではない、(D)第1の細胞及び/又は第2の(又は更なる)細胞では複製可能又は作動可能であるが、同一目の別の細胞ではそうではない、(E)第1の細胞及び/又は第2の(又は更なる)細胞では複製可能又は作動可能であるが、同一科の別の細胞ではそうではない、(F)第1の細胞及び/又は第2の(又は更なる)細胞では複製可能又は作動可能であるが、同一属の別の細胞ではそうではない、又は(G)第1の細胞及び/又は第2の(又は更なる)細胞では複製可能又は作動可能であるが、同一種の別の細胞ではそうではない、態様25から45のいずれか1つの方法。
47.態様25に従属する場合に、各MGEが、接合性トランスポゾンであり、oriTが、第1の及び更なる(又は第2の)宿主細胞において機能的であり、MGEが、第1及び第2の末端リピート配列並びにリピート配列間の前記CRISPRアレイを含み、第1の及び更なる(又は第2の)細胞が細菌細胞であり、標的部位が、第1の細胞により含まれるが、更なる(又は第2の)細胞により含まれず、前記改変が、第1の細胞において前記標的を含む遺伝子又は調節配列を不活性化又は下方制御し、その結果、第1の宿主細胞生存力の低減及び前記MIC又は生物付着の制御が得られる、態様25又は態様26から46のいずれか1つの方法。
48.各CRISPRアレイが、第1の宿主細胞におけるそれぞれのcrRNAの発現及び産生のための配列R1-S1-R1'を含み、
(i)R1は、第1のCRISPRリピートであり、R1'は、第2のCRISPRリピートであり、R1又はR1'は、任意選択であり、
(ii)S1は、前記第1の宿主細胞の標的配列に対して95%以上同一であるヌクレオチド配列を含む又はからなる第1のCRISPRスペーサーである、
態様1から47のいずれか1つの方法。
49.R1及びR1'が、それぞれ、第1の宿主細胞種のCRISPRアレイの第1及び第2のリピート配列と少なくとも 95、96、97、98又は99%同一である、態様48の方法。一実施形態では、R1及びR1'の両方が存在する。
50.R1及びR1'が、標的配列の改変のために、前記第1の種の前記宿主細胞のCRISPR/Casシステムとともに機能的である、態様48又は49の方法。
51.第1の宿主細胞が、硫酸還元菌(SRB)細胞であり、R1及びR1'が、それぞれ、第1の宿主細胞種のCRISPRアレイのリピート配列(例えば、第1のリピート)と少なくとも95、96、97、98又は99%同一である、態様48から50のいずれか1つの方法。
52.R1及びR1'が、それぞれ、配列番号50~74、125〜128及び49からなる群から選択されるリピート配列と少なくとも95、96、97、98又は99%同一である、態様51の方法。表1を参照のこと。一実施形態では、R1及びR1'の両方が存在する。
53.R1及びR1'が、それぞれ、配列番号51及び125〜126、54及び127、69及び128からなる群から選択されるリピート配列と少なくとも95、96、97、98又は99%同一である、態様51の方法。配列番号51及び125〜126、54及び127、69及び128は、1種より多いSRB種で見られる。これは、本発明のCRISPRアレイを用いて1種より多いSRB種を標的化するために、例えば、SRB種が、処置されるべき工業用又は家庭用システム中に共存する場合に、例えば、基質と接触している集団又はバイオフィルムにおける、又は処置されるべき流体における共存は、特に有用である。一実施形態では、R1及びR1'の両方が存在する。
54.R1及びR1'の配列が同一である、態様48から53のいずれか1つの方法。
55.第1の宿主細胞に導入された各アレイが、その標的配列を改変するために宿主細胞においてそれぞれのcrRNAとともに機能する1種又は複数のCasヌクレアーゼ(例えば、Cas9及び/又はCfp1)と組み合わせて導入される、態様1から54のいずれか1つの方法。
一例では、任意の構成にある本明細書におけるCasは、ヌクレアーゼ 活性について非活性化され、任意選択で、標的配列アクチベーター又はデプレッサーを含む。本明細書におけるCas9は、例えば、Sピオゲネス又はSオーレウスCas9である。
56.第1の宿主細胞に導入された各アレイが、標的配列を改変するために宿主細胞においてそれぞれのcrRNAとともに機能する1種又は複数のCasヌクレアーゼ(例えば、Cas9及び/又はCfp1)をコードする核酸配列と組み合わせて導入される、態様1から55のいずれか1つの方法。
57.R1及びR1'が、前記第1の宿主細胞において標的配列を改変するためにII型Cas9ヌクレアーゼとともに機能性であり、任意選択で、方法が態様55又は56に更に従い、Casが前記Cas9である、態様48から56のいずれか1つの方法。
58.前記ベクター又はMGEのすべて又は一部が、それぞれのアレイとともに作動可能であるCasヌクレアーゼをコードする配列を含まない、態様1から57のいずれか1つの方法。
59.前記それぞれのアレイが各々、第1の種の細胞において見られるCasエンドヌクレアーゼとともに作動可能である、態様58の方法。
60.態様25に従属する場合に、各MGEが、アレイのリピート配列とともに作動可能であるCasエンドヌクレアーゼをコードする配列を欠き、それぞれのベクターが、MGEの外側のこのような配列(例えば、Cfp1のCas9をコードする)を含む、態様25又は態様26から59のいずれか1つの方法。
61.粗製油、ガス又は石油化学製品回収、処理、貯蔵又は輸送設備(例えば、粗製油タンカー、油掘削装置又は石油掘削設備) により含まれる基質の微生物腐食(MIC)又は生物付着を制御する方法であって、基質の表面を、第1の宿主細胞の集団と接触させ、第1の宿主細胞は、基質のMIC又は生物付着を媒介する第1の種の硫黄-又は硫酸-還元菌(SRB)、細胞外高分子物質産生菌(EPSB)、酸産生菌(APB)、硫黄-又は硫酸-酸化菌(SOB)、鉄酸化菌(IOB)、マンガン酸化菌(MOB)、アンモニア産生菌(AmPB)又は酢酸産生菌(AcPB)であり、表面及び細胞集団を、海水、淡水、水圧破砕液又は井戸(例えば、油又は天然ガス井)中の液体から選択される液体と接触させる方法であり、
(i)液体を、第1の宿主細胞を形質転換又は形質導入することが可能である複数のベクターと混合することによって、細胞集団をベクターと接触させる工程であって、各ベクターは、CRISPRアレイを含み、それによってCRISPRアレイが宿主細胞中に導入され、
(a)各CRISPRアレイは、crRNAの発現のための1つ又は複数の配列及び宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)各crRNAは、標的配列を改変するために(例えば、標的配列を切断するために)宿主細胞において、宿主細胞の標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ、例えば、Cas9又はCfp1)をガイドすることが可能であり、標的配列は、宿主細胞生存力を媒介するための遺伝子配列であり、
(c)(a)の各配列は、第1の宿主細胞におけるそれぞれのcrRNAの発現及び産生のための配列R1-S1-R1'を含み、R1は、第1のCRISPRリピートであり、R1'は、第2のCRISPRリピートであり、R1又はR1'は、任意選択であり、S1は、前記第1の宿主細胞の標的配列に対して70、75、80、85、90又は95%以上同一であるヌクレオチド配列を含む又はからなる第1のCRISPRスペーサーである
工程と、
(ii)宿主細胞においてCasの存在下で前記cRNAを発現させ、それによって、宿主細胞において標的配列を改変し、宿主細胞生存力の低減及び前記基質のMIC又は生物付着の制御をもたらす工程とを含む方法。一実施形態では、R1及びR1'の両方が存在する。
62.態様1に従属する場合に、態様1又は態様1から61のいずれか1つに従う、態様61の方法。
63.各ベクターが、第1の宿主細胞に感染可能であるファージである、又は前記CRISPRアレイを含むMGE(例えば、トランスポゾン)を含むベクターであり、MGEが、第1の宿主細胞に伝達可能である、態様61又は62の方法。
64.第1の細胞が、硫酸還元菌(SRB)細胞、例えば、デスルホビブリオ属(Desulfovibrio)又はデスルホトマキュラム属(Desulfotomaculum)の細胞である、態様61、62又は63の方法。
65.R1及びR1'が、それぞれ、第1の宿主細胞種のCRISPRアレイのリピート配列(例えば、第1のリピート)と少なくとも95、96、97、98又は99%同一であり、ベクターアレイが、第1の種の細胞において見られるCasエンドヌクレアーゼとともに作動可能である、態様64の方法。一例では、R1及びR1'は、同一配列である。
66.R1及びR1'が、それぞれ、配列番号50〜74、125〜128及び49からなる群から選択されるリピート配列と少なくとも95、96、97、98又は99%同一である、態様65の方法。一例では、R1及びR1'は、同一配列である。
67.R1及びR1'が、それぞれ、配列番号51及び125~126、54及び127、69及び128からなる群から選択されるリピート配列と少なくとも95、96、97、98又は99%同一である、態様66の方法。表1を参照のこと。これは、本発明のCRISPRアレイを用いて1種より多いSRBを標的化するために、例えば、SRB種が、処置されるべき工業用又は家庭用システム中に共存する場合に、例えば、基質と接触している集団又はバイオフィルムにおける、又は処置されるべき流体における共存は、特に有用である。一例では、R1及びR1'は、同一配列である。
68.前記複数のベクターが、更なるベクターを含み、更なるベクターが各々、前記集団により含まれる更なる宿主細胞を標的化するための1種又は複数のCRISPRアレイを含み、更なる宿主細胞種が、第1の宿主細胞種とは異なり、工程(i)において、前記集団の更なる細胞を、更なる細胞を形質転換又は形質導入可能である複数の前記更なるベクターと接触させ、各ベクターが、CRISPRアレイを含み、それによって、CRISPRアレイが、更なる宿主細胞に導入され、
(a)各CRISPRアレイが、crRNAの発現のための1つ又は複数の配列及び宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)各crRNAが、標的配列を改変するために(例えば、標的配列を切断するために)宿主細胞において、前記更なる宿主細胞の標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能であり、標的配列が、宿主細胞生存力を媒介するための遺伝子配列であり、
工程(ii)が、前記更なる宿主細胞においてCasの存在下で前記cRNAを発現させ、それによって、更なる宿主細胞において標的配列を改変する、態様1から67のいずれか1つの方法。
69.更なる宿主細胞が、前記基質又は流体のMIC又は生物付着を媒介し、工程(ii)が、更なる宿主細胞生存力の低減及び前記基質又は流体のMIC又は生物付着の制御をもたらす、態様68の方法。
70.船又はボートのバラスト水において細菌生物付着を制御する方法であって、水は、前記生物付着を媒介する第1の微生物種の第1の宿主細胞の集団を含み、
(i)集団を、細胞を形質転換又は形質導入することが可能である複数のベクターと接触させる工程であって、各ベクターは、CRISPRアレイを含み、それによってCRISPRアレイは、宿主細胞に導入され、
(a)各CRISPRアレイは、crRNAの発現のための1つ又は複数の配列及び宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)各crRNAは、標的配列を改変するために(例えば、標的配列を切断するために)宿主細胞において、宿主細胞の標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能であり、標的配列は、宿主細胞生存力を媒介するための遺伝子配列である
工程と、
(ii)宿主細胞においてCasの存在下で前記cRNAを発現させ、それによって、宿主細胞において標的配列を改変し、宿主細胞生存力の低減及び前記生物付着の制御をもたらす工程と
を含む、方法。
71.第1の宿主細胞が、ビブリオ・コレラ(Vibrio cholerae)、大腸菌又はエンテロコッカス属(Enterococci)の種の細胞である、態様70の方法。
72.工程(i)が、例えば、船又はボートの船体においてバラスト水をベクターと混合することを含む、態様70又は71の方法。
73.船又はボートが、海洋乗り物であり、水が海水である、態様70から72のいずれか1つの方法。
74.船又はボートの代わりに、バラスト水が、容器又は海上での掘削プラットフォーム、例えば、油プラットフォーム又は油掘削装置により含まれる、態様70から72のいずれか1つの方法。一例では、船、ボート、容器、プラットフォーム又は掘削装置が、海上で(すなわち、その位置に非一時的に)固定されている。
75.船又はボートからバラスト水を排出する方法であって、排出されたバラスト水が、態様70から74のいずれか1つの方法によって処置された水を含む、方法。
76.水が、水域、例えば、海、大洋又は水路(例えば、川、運河、湖又は貯水池)中に、又は容器中に排出される、態様75の方法。
77.バラスト水が、態様70から76のいずれか1つの方法によって得られる、又は得ることができる、CRISPRアレイを含むバラスト海水。
78.態様77のバラスト海水を含む船、ボート、容器又は掘削装置。
79.第1の細胞が、硫酸還元菌(SRB)細胞、例えば、デスルホビブリオ属(Desulfovibrio)又はデスルホトマキュラム属(Desulfotomaculum)の細胞であり、各ベクターが、SRBを標的化するための1つ又は複数のCRISPRアレイを含み、各アレイが、態様61の(a)〜(c)に規定されるとおりである、態様61から69のいずれか1つの方法において使用するためのベクター。
80.R1及びR1'が、態様65から67のいずれか1つに従う、態様79のベクター。
81.第1の細胞が、コレラ (例えば、ビブリオ、例えば、O1又はO139)、大腸菌又はエンテロコッカス属種の細胞であり、ベクターは、細胞を標的化するための1つ又は複数のCRISPRアレイを含み、各アレイが、態様70の(a)及び(b)に規定されるとおりである、態様70から76のいずれか1つの方法において使用するためのベクター。
82.前記細胞に感染可能なバクテリオファージである、態様79から81のいずれか1つのベクター。
83.前記細胞に伝達可能なトランスポゾン又はMGEである、態様79から81のいずれか1つのベクター。
84.各ベクターが、態様82又は83に従い、任意選択で、前記細胞の生存力を低減可能である殺生物剤又は抗生物質と組み合わた状態にある、複数のベクター。
・バイオフィルムの形成に好都合に働くEPSの生成、
・金属の腐食に作用する酵素アリール炭化水素ヒドロキシラーゼ(AHH)の放出による石油製品の分解の微生物(例えば、細菌)促進、
・腐食プロセスを増大する硫酸の生成、及び
・硫黄の酸化。
・表面が金属表面である、表面での水酸化鉄の堆積による生体内鉱質形成の細菌促進、
・EPSの生成、
・表面が金属表面である、酵素アリール炭化水素ヒドロキシラーゼ(AHH)の放出によるシステムにおける石油製品の分解の細菌促進、
・硫酸の生成、及び
・硫黄の酸化。
細菌と関連する腐食及び/又は生物付着を低減するための本発明によって想定される特定の適用例がある。以下に記載する適用は、本発明の概念を制限しようとするものではなく、単に、細菌によって誘導される腐食を制御するために、又は環境汚染を低減するために本発明を使用できる方法の例示である。
・立方メートルあたりの最小寸法が50マイクロメートル以上の10より少ない生存生物、
・ミリリットルあたりの最小寸法が50マイクロメートル未満及び10マイクロメートル以上の10より少ない生存生物。
・100ミリリットルあたり1コロニー形成単位(cfu)未満、又は1グラム(湿重量)の動物プランクトンサンプルあたり1cfu未満の毒性原性ビブリオ・コレラエ菌(O1及びO139)、
・100ミリリットルあたり250cfu未満の大腸菌(Escherichia coli)
・100ミリリットルあたり100cfu未満の腸のエンテロコッカス属。
船又はボートのバラスト水において細菌生物付着を制御する方法であって、水は、前記生物付着を媒介する第1の微生物種(コレラ菌、大腸菌又はエンテロコッカス属種等)の第1の宿主細胞の集団を含み、
(i)集団を、細胞を形質転換又は形質導入することが可能である複数のベクターと接触させる工程であって、各ベクターは、CRISPRアレイを含み、それによってCRISPRアレイは、宿主細胞に導入され、
(a)各CRISPRアレイは、crRNAの発現のための1つ又は複数の配列及び宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)各crRNAは、標的配列を改変するために(例えば、標的配列を切断するために)宿主細胞において、宿主細胞の標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能であり、標的配列は、宿主細胞生存力を媒介するための遺伝子配列である
工程と、
(ii)宿主細胞においてCasの存在下で前記cRNAを発現させ、それによって、宿主細胞において標的配列を改変し、宿主細胞生存力の低減及び前記生物付着の制御をもたらす工程と
を含む、方法。
85.細菌宿主細胞に導入するためのCRISPRアレイを含むベクターであって、細菌は、水系伝染可能であり、
(a)CRISPRアレイは、crRNAの発現のための配列及び前記宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)crRNAは、標的配列を改変するために(例えば、標的配列を切断するために)宿主細胞において、宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能であり、標的配列は、宿主細胞生存力を媒介するためのヌクレオチド配列(例えば、遺伝子又は調節配列)であり、
(c)(a)の配列は、crRNAの発現及び産生のための配列R1-S1-R1'を含み、R1は、第1のCRISPRリピートであり、R1'は、第2のCRISPRリピートであり、R1又はR1'は、任意選択であり、S1は、宿主細胞標的配列に対して80%以上同一である(例えば、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100%同一である)ヌクレオチド配列を含む又はからなる第1のCRISPRスペーサーである、
ベクター。
86.細胞が、ビブリオ・コレラエ、エンテロコッカス属又は大腸菌の細胞である、態様85のベクター。
87.ベクターが、前記Casを発現可能であるヌクレオチド配列を欠く、態様85又は86のベクター。
一例では、したがって、ベクターは、Casヌクレアーゼをコードしない。代替において、ベクターは、前記Casをコードする。
88.標的配列が、17〜45の連続ヌクレオチド、例えば、18、19、20又は21の連続ヌクレオチドのプロトスペーサー配列である、態様85、86又は87のベクター。
一例では、各スペーサー(S1)は、17〜45の連続ヌクレオチド、例えば、18、19、20、21、30、31、32又は33の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列である。VコレラエPLEのプロトスペーサー配列は、例えば、32の連続ヌクレオチドであり、これを標的化するベクターは、例えば、32のヌクレオチドPLE配列に対して100%又は少なくとも80、90若しくは95%同一である32の連続ヌクレオチドのスペーサー配列を有する。ベクターが、複数のスペーサーを含む場合には、スペーサーは、異なるスペーサーの混合物であり得る、又は同一スペーサーであり得る。例えば、アレイは、複数のスペーサーを含み、スペーサーのサブセットは同一である。同一スペーサーは、例えば、宿主細胞の病原性因子をコードする遺伝子のプロトスペーサー配列に対して相同であり得る。複数のスペーサーを使用することは、ひとたびベクターが細胞の内側にあると、宿主が1つ又は複数のスペーサーを切断する場合には有利であり得る-未切断スペーサーが依然としてcrRNAを形成し、標的配列に進むことができる。ベクター中又はアレイ中の異なるスペーサーの混合物を使用することは、侵入ベクターに対する宿主の適応のリスクを最小にし、それによって、耐性を最小にするのに有利である。
89.標的配列が、病原性、耐性又は必須遺伝子配列である、態様85から88のいずれか1つのベクター。一例では、標的配列は、PICI様エレメント(PLE)、例えば、V.コレラエPLE、例えば、PLE1の配列である。
90.標的配列が病原性アイランド配列であり、任意選択で、宿主細胞が、ビブリオ・コレラエ細胞であり、標的配列がTCP、CTX又はVPI配列である、態様85~89のいずれか1つのベクター。一例では(例えば、宿主が、ビブリオ属である)病原性アイランドは、TCP(毒素共調節線毛)又はCTX(コレラ毒素)である。ビブリオ属病原性アイランド(VPI)は、毒素共調節線毛(TCP)の生成に主に関与する遺伝子を含有する。それは、2つの反復領域(att様部位)が両側に位置する大きな遺伝子エレメント(約40kb)であり、構造でファージゲノムと類似する。VPIは、いくつかのその他の遺伝子とともに、2つの遺伝子群、TCPクラスター及びACFクラスターを含有する。acfクラスターは、4種の遺伝子:acfABCDからなる。tcpクラスターは、15種の遺伝子:tcpABCDEFHIJPQRST及び調節遺伝子toxTからなる。
91.宿主細胞が、ビブリオ・コレラエであり、標的配列が、CTXφ遺伝子配列である、態様85から90のいずれか1つベクター。コレラ毒素の遺伝子は、CTXphi(CTXφ)、V.コレラエゲノムに挿入されたテンペレートバクテリオファージによって保持される。CTXφは、あるV.コレラエ株から別のものにコレラ毒素遺伝子遺伝子を伝染させることができる、1つの水平遺伝子導入の形態。毒素共調節線毛の遺伝子は、VPI病原性アイランド(VPI)によってコードされる。
92.宿主細胞が、ビブリオ・コレラエであり、標的配列が、ctxB、tcpA、ctxA、tcpB、wbet、hlyA、hapR、rstR、mshA又はtcpP配列である態様85から90のいずれか1つのベクター。
93.標的配列が、17〜45の連続ヌクレオチド(例えば、18、19、20又は21の連続ヌクレオチド)であり、グラム陽性菌のファージ誘導性染色体アイランド(PICI)、例えば、スタフィロコッカス・オーレウス病原性アイランド(SaPI)の配列と少なくとも80%(例えば、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100%同一)同一である、態様85~92のいずれか1つのベクター。ICP1ファージ(aka ICP1関連ファージ)スペーサー配列の例は、以下に提供されている。これらのスペーサー配列は、Vコレラエ中の標的配列(プロトスペーサー配列)に対して相同である。
94.宿主細胞が、ビブリオ・コレラエであり、crRNAが、ビブリオ・コレラエの細胞中のプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の5、4又は3つのヌクレオチド内の標的配列とハイブリダイズ可能であり、PAMがGAである、態様85から93のいずれか1つのベクター。
95.宿主細胞が、ビブリオ・コレラエであり、細胞が、エルトール(El Tor)O1又はO139ビブリオ・コレラエ細胞である、態様85~94のいずれか1つのベクター。一例では、V.コレラエは、血清型O1エルトール(El Tor)N16961、エルトール(El Tor)生物型18又はエルトール(El Tor)株MJ-1236である。一例では、宿主細胞は、大腸菌O157:H7細胞である。
96.ベクターが、前記宿主細胞に感染可能であるバクテリオファージである、態様85から95のいずれか1つのベクター。一例では、宿主細胞は、大腸菌であり、ファージは、λ又はT4ファージである。一例では、宿主細胞は、エンテロコッカス属の細胞であり、ファージは、エンテロコッカス属ファージIME-EF1、phiEF24C、φEf1又はEFDG1である(Appl Environ Microbiol. 2015年4月;81(8):2696〜705頁 doi:10.1128/AEM.00096-15. Epub 2015年2月6日、「Targetting Enterococcus faecalis biofilms with phage therapy」、Khalifa Lらを参照のこと)。
97.宿主細胞が、ビブリオ・コレラエであり、ベクターが、ビブリオ・コレラエの細胞に感染可能であるバクテリオファージである、態様96のベクター。
98.バクテリオファージが、CTXφ、ICPIファージ及びミオウイルスから選択され、例えば、ファージが、ICP1_2003_A、ICP1_2004_A、ICP1_2005_A、ICP1_2006_E又はICP1_20011_A、任意選択で、遺伝子操作された、天然に存在しないファージである、態様97のベクター。
99.ベクターが、ICE、例えば、トランスポゾンである、又はそれを含む態様85から98のいずれか1つのベクター。ICEは、本明細書において記載されるICEの特性のいずれも含み得る。
100.トランスポゾンが、第1から第2の前記宿主細胞に伝達可能である接合性トランスポゾンである、態様99のベクター。
101.トランスポゾンが、CRISPRアレイのコピーを第1の細胞に残す態様99又は100のベクター。
102.各アレイが、それぞれの可動遺伝エレメント(MGE)により含まれ、MGEが、宿主細胞において作動可能である伝達の起点(oriT)を含む、態様85から101のいずれか1つのベクター。MGEは、本明細書において記載される任意のMGEに従うものであり得る。
103.ベクターが、遺伝子操作されたベクターである、態様85から102のいずれか1つのベクター。
104.態様85から103のいずれか1つに記載の複数のベクターを含む水又は食品処置組成物。
一例では、水は、バラスト水、海水、汽水、淡水、飲料水、水路水(例えば、入り江 水)又は工業用水である。一例では、水は、ヒトGI管流体中の水である。
一例では、宿主細胞は、甲殻類、魚類、イネ又は穀物により含まれる。一例では、組成物は、食品を処置するためのものであり、宿主細胞は、大腸菌O157:H7細胞である。一例では、標的配列は、大腸菌 (例えば、O157:H7)宿主細胞において志賀毒素をコードする配列である。これまでに記載された水系種の代替において、宿主細胞は、サルモネラ属又はリステリア属の細胞である。
105.ヒトにおけるビブリオ・コレラエ感染の処置又は予防のための医薬であって、態様85から103のいずれか1つに記載の複数のベクターを含む、医薬。代替において、本発明は、ヒトにおける大腸菌感染の処置又は予防のための医薬であって、本発明の複数のベクターを含む医薬を提供する。代替において、本発明は、ヒトにおけるエンテロコッカス属感染の処置又は予防のための医薬であって、本発明の複数のベクターを含む医薬を提供する。
106.抗宿主細胞抗生物質又は抗宿主細胞殺生物剤を更に含む、態様104又は105の組成物又は医薬。
本発明のこれらの態様は、例えば、細胞において、又はin vitroでCas活性を調節するために有用である。本発明は、Casをコードする遺伝子を標的化して、Cas活性を制限することを含み、これは、Casの一次的な調節にとって有利である。本発明はまた、細胞のゲノムを改変する場合に、例えば、オフターゲットCas切断の機会を低減するために、Cas活性のストリンジェンシーの増大が望まれる設定において有用であり得る。適用は、例えば、細胞又は細胞を含む組織若しくは生物の遺伝子療法又は標的遺伝子組換えのために、例えば、オフターゲット効果が最小化されなければならない、又は避けられなければならないヒト、動物又は植物細胞の改変においてである。例えば、ヒトにおいて遺伝子療法のために、又は疾患若しくは状態の処置若しくは予防のために患者に投与されるべきヒト細胞(例えば、iPS細胞)において所望の変化を作製するためにCas改変を使用する場合に、極めて高いストリンジェンシーが必要とされる。本開示は、これらの適用を本発明の方法及び製品の一部として提供する。
1.第1のCasをコードする発現可能な遺伝子を改変する方法であって、
(a)ガイドRNA(gRNA1)をCas遺伝子と前記遺伝子から発現される第1のCasの存在下で組み合わせる工程と、
(b)gRNA1を前記Cas遺伝子の配列(例えば、そのプロモーター又は第1のCasをコードするDNA配列)とハイブリダイズさせて、第1のCasを遺伝子にガイドし、それによって、CasがCas遺伝子を改変する工程と
を含む、方法。
2.Casがヌクレアーゼであり、Cas遺伝子が切断される、条項1の方法。
3.Cas遺伝子が、突然変異され、下方制御され、又は不活性化される、条項1又は2の方法。
4.第1のCasがCas9である、条項1から3のいずれか1つの方法。
5.gRNA1が、単一ガイドRNAである、条項1から4のいずれか1つの方法。
6.方法が宿主細胞において実施される、条項1から5のいずれか1つの方法。
7.細胞が、原核細胞、例えば、細菌又は古細菌細胞(例えば、大腸菌細胞)である、条項6の方法。
8.リコンビニアリング法である、条項6の方法。
9.細胞が、ヒト又は非ヒト動物病原体種又は株(例えば、Sオーレウス)のものである、条項6、7又は8の方法。
10.細胞が、ヒトマイクロバイオーム種、例えば、ヒト腸イクロバイオーム種の細胞である、条項6から9のいずれか1つの方法。
11.Cas遺伝子が、宿主CRISPR/Casシステムにより含まれる、条項6から10のいずれか1つの方法。
12.細胞が、真核細胞(例えば、ヒト、非ヒト動物、酵母又は植物細胞)である、条項6の方法。
13.非ヒト胚、非ヒト接合体、非ヒト生殖細胞又はヒト若しくは動物(例えば、方法は、美容的方法である)において実施され、任意選択で、手術又は療法又は診断によるヒト又は動物身体の処置のための方法ではない、条項12の方法。
14.Cas遺伝子が、工程(a)において細胞に導入されている核酸により含まれる、条項6から13のいずれか1つの方法。
15.核酸ベクターによる形質転換又は宿主細胞における核酸ベクターの維持に対する、宿主細胞抵抗性の発生を低減するための、条項6から14のいずれか1つの方法。
16.ヒト若しくは動物の医学療法、予防若しくは診断のための(例えば、ヒト若しくは動物、方法がヒト若しくは動物細胞において実施される場合にはヒト又は動物細胞の遺伝子療法のための、又は方法が細菌細胞において実施される場合にはヒト若しくは動物における細菌感染を処置若しくは予防するための)、条項1から15のいずれか1つの方法又は核酸又はその細胞生成物。
17. in vitroで実施される、条項1から6のいずれか1つの方法。
18.in vivoで実施され、任意選択で、ヒト胚で実施されず、任意選択で、手術又は療法又は診断によるヒト又は動物身体の処置のためではない、条項1から16のいずれか1つの方法。
19.工程(a)においてCas遺伝子と組み合わされている第1の核酸からの転写によってgRNA1が産生される条項1から18のいずれか1つの方法。
20.細胞において実施され、工程(a)においてgRNA1をコードする第1の核酸が、細胞に導入され、又は工程(a)においてcrRNAをコードする第1の核酸が、細胞に導入され、crRNAが、細胞においてtracrRNAとともにgRNA1を形成する、条項19の方法。
21.Cas遺伝子が、第1のCasによって改変される、標的部位(CS-t)を含む標的核酸と組み合わされ、
I.Cas遺伝子が、第1のCasに対して同族である第1のプロトスペーサー(PS1)隣接PAM(P1)を含み、PS1が、第1のCasによって第1の部位(CS1)で改変され(例えば、切断され)、
II.gRNA1が、第1のCasをガイドするためにPS1と相補的である配列を含み、工程(b)においてPS1がCS1で改変され、
III.標的核酸が、プロトスペーサー配列(PS-t)隣接するPAM(P-t)を含み、P-tが第1のCasに対して同族であり、
IV.工程(b)の前又はその間に、ガイドRNA(gRNA-t)を、標的核酸及び前記遺伝子から発現された第1のCasを組合せることを含み、gRNA-tが、PS-tとハイブリダイズし、第1のCasをガイドして、CS-tを改変し、
V.任意選択で、改変された標的核酸を単離又はシーケンシングすることを含む、
条項19又は20の方法。
22.gRNA-tが、工程IVにおいてCasと組み合わされている核酸(例えば、前記第1の核酸)からの転写によって生成される、任意の条項21の方法。
23.細胞において実施され、核酸がcrRNAをコードし、crRNAが、細胞においてtracrRNAとともにgRNA-tを形成する、条項22の方法。
24.gRNA1の生成が、gRNA-tの生成後に開始され、それによって、PS1が改変される(例えば、切断される)前に標的核酸のコピーにおいてPS-tが改変され(例えば、切断される)て、第1のCas発現を下方制御又は不活性化する、条項21から23のいずれか1つの方法。
25.切断された標的核酸を、更なる核酸と組み合わせる工程を更に含み、それによって核酸間の相同組換えが起こり、
(i)標的核酸のヌクレオチド配列が、欠失され、
(ii)更なる核酸のヌクレオチド配列が、欠失され、
(iii)標的核酸のヌクレオチド配列が、更なる核酸に挿入され、及び/又は
(iv)更なる核酸のヌクレオチド配列が、標的核酸に挿入される、
条項1から24のいずれか1つの方法。
26.(i)が起こり、それによって、標的核酸のヌクレオチド配列又は調節エレメントを不活性化する、条項25の方法。
27.(i)が起こり、それによって、標的核酸のヌクレオチド配列又は調節エレメントを活性化する、条項25の方法。
28.(ii)が起こり、それによって、更なる核酸のヌクレオチド配列又は調節エレメントを不活性化する、条項25、26又は27の方法。
29.(ii)が起こり、それによって、更なる核酸のヌクレオチド配列又は調節エレメントを活性化する、条項25、26又は27の方法。
30.(iii)が起こり、任意選択で、挿入される配列を更なる核酸の調節エレメントと機能的な関係に置き、及び/又は新規マーカー配列を作り出す、条項25から29のいずれか1つの方法。
31.(iv)が起こり、任意選択で、挿入される配列を標的核酸の調節エレメントと機能的な関係に置き、及び/又は新規マーカー配列を作り出す、条項25から30のいずれか1つの方法。
32.新規マーカー配列又はその発現産物を検出して、相同組換えが起こったことを調べる工程を更に含む、条項30又は31の方法。
33.標的核酸産物、更なる核酸産物及び/又は第1のベクター産物を単離又はシーケンシングする工程を更に含む、条項21から32のいずれか1つの方法。
34.第1のベクターが、条項35から55のいずれか1つにおいて規定されるようなものである、条項1から33のいずれか1つの方法。
35.例えば、項1の方法において使用するための、第1の(例えば、単離された)核酸ベクター又はベクターの組合せであって、
(a)第1のベクター又は前記組合せのベクターは、第1の部位(CS1)でPS1を改変するための第1のCasをガイドするために所定のプロトスペーサー配列(PS1)と相補的であるガイドRNA(gRNA1、例えば、単一gRNA)をコードする発現可能なヌクレオチド配列を含み、PS1は、第1のCasに対して同族であるPAM(P1)に隣接するか、又は発現可能な配列は、tracrRNAとともにgRNA1を形成するcrRNAをコードし、
(b)PS1及びP1は、発現可能な第1のCasをコードする遺伝子の配列であり、PS1は、第1のCasによってCS1で改変されることが可能である
第1の核酸ベクター又はベクターの組合せ。
36.第1のCasが、ヌクレアーゼであり、CS1が、ヌクレアーゼによって切断されることが可能である、条項35のベクター又は組合せ。
37.第1のCasがCas9である、条項35又は36のベクター又は組合せ。
38.gRNA1が、単一ガイドRNAである、条項35から37のいずれか1つのベクター又は組合せ。
39.ヌクレオチド配列が、gRNA1を生成するために原核細胞(例えば、細菌又は古細菌細胞)において発現可能である、条項35から38のいずれか1つのベクター又は組合せ。
40.条項39のベクター又は組合せを含むリコンビニアリングキット(例えば、細胞は、リコンビニアリング許容大腸菌細胞である)。
41.ヌクレオチド配列が、gRNA1を生成するために真核細胞(例えば、ヒト、動物、植物又は酵母細胞)において発現可能である、条項35から38のいずれか1つのベクター又は組合せ。
42.第1のベクター又は前記組合せのベクター(例えば、第2のベクター)が、第1のCasをガイドしてPS-tを改変(例えば、切断する)ために、標的核酸の所定のプロトスペーサー配列(PS-t)と相補的であるガイドRNA(gRNA-t、例えば、単一gRNA)をコードする発現可能な ヌクレオチド配列を含む、又は発現可能な配列が、tracrRNAとともにgRNA-tを形成するcrRNAをコードし、標的核酸が、PS-t隣接PAM(P-t)を含み、P-tが、PS-tを改変するために第1のCasに対して同族である、条項35から41のいずれか1つのベクター又は組合せ。
43.更に、前記標的核酸と組み合わせた、条項42のベクター又は組合せ。
44.前記標的核酸が、細胞の染色体又はエピソーム核酸である、条項43のベクター又は組合せ。
45.細胞が、ヒト又は非ヒト動物病原体種又は株(例えば、Sオーレウス)の細胞ある、条項44のベクター又は組合せ。
46.細胞が、ヒトマイクロバイオーム種、例えば、ヒト腸マイクロバイオーム種の細胞である、条項45又は45のベクター又は組合せ。
47.PS-tが、細胞(例えば、原核細胞)の必須遺伝子、病原性遺伝子又は抗生物質耐性遺伝子配列により含まれる、条項44から46のいずれか1つのベクター又は組合せ。
48.第1のCasが、PS-tを改変する(例えば、切断する)場合に、遺伝子が下方制御される、又は不活性化される、条項47のベクター又は組合せ。
49.第1のCasが、PS-tを改変する場合に、遺伝子が上方制御される、又は活性化される、条項47のベクター又は組合せ。
50.第1のCas(例えば、第1のベクターにより含まれる)をコードする前記遺伝子と組み合わせた、条項35から49のいずれか1つのベクター又は組合せ。
51.細胞が、第1のCasをコードする前記遺伝子を含むCRISPR/Casシステムを含む、条項35から50のいずれか1つのベクター又は組合せ。
52.ヒト又は非ヒト動物において疾患又は状態を処置、予防又は診断するための、例えば、ヒト若しくは動物、方法がヒト若しくは動物細胞において実施される場合にはヒト又は動物細胞の遺伝子療法のための、又は方法が細菌細胞において実施される場合にはヒト若しくは動物における細菌感染を処置若しくは予防するための、条項35から51のいずれか1つのベクター又は組合せ。
53.条項35から52のいずれかに記載の第1のベクター又は組合せを含む、食料、食品成分又は前駆体成分、飲料、水(例えば、ヒト消費のために意図される)、産業用又は環境様物質(例えば、油、石油製品、土壌若しくは水路若しくは貯水池又は油、石油製品、土壌、水、食料、食料成分若しくは前駆体を回収若しくは処理するための設備又は前駆体の飲料若しくは飲料成分)。
54.条項35から52のいずれかに記載の第1のベクター又は組合せを含む抗生物質(例えば、抗細菌又は抗古細菌)組成物。
55.ヒト又は動物において疾患又は状態(例えば、細菌感染又は肥満症)を処置又は予防するための医薬であって、条項35から52のいずれかに記載の第1のベクター又は組合せを含む医薬。
一例では、ベクター、組合せ、医薬又は抗生物質が、医学デバイス又は医学容器(例えば、シリンジ、吸入器又はIVバッグ)により含まれる。
以下の特性は、本発明の任意の構成(例えば、その態様、実施形態、概念、条項又は例のいずれかにおける)に適用する。
1.本発明の任意の態様によるアレイ、遺伝子操作された配列、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、プロファージ、集団又は集合物を含む、抗菌組成物(例えば、抗生物質、例えば、医薬、消毒薬又は口腔洗浄薬)。
2.医療又は歯科又は眼科使用のため(例えば、生物における感染を処置若しくは予防又は生物における感染の広がりを制限するため)の、条項1の組成物。
3.化粧用の使用(例えば、化粧製品、例えば、メーキャップにおける使用)のため、又は衛生使用(例えば、衛生製品、例えば、石鹸における使用)のための、本発明によるアレイ、遺伝子操作された配列、システム、集合物、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、プロファージを含む組成物、組成物、集団、集合物、使用又は方法。
4.歯科治療又は予防的使用のための医薬における、条項1〜35のいずれか1つに記載のアレイ、遺伝子操作された配列、集合物、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、プロファージ、集団又は集合物を含む組成物の使用。
5.化粧用の使用(例えば、化粧製品、例えば、メーキャップにおける使用)における、又は衛生使用(例えば、衛生製品、例えば、石鹸における使用)のための、本発明によるアレイ、遺伝子操作された配列、集合物、システム、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、プロファージを含む組成物、組成物、集団、集合物、使用又は方法の使用。
6.宿主細胞の標的ヌクレオチド配列を改変する能力がある(HM)CRISPR/Cas9システム(例えば、I、II又はIII型)を改変している宿主における本発明によるアレイ、遺伝子操作された配列、システム、集合物、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、プロファージ、組成物、集団又は集合物の使用であって、アレイ、遺伝子操作された配列、システム、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、プロファージ、集団又は集合物は本発明による、使用。
7.アレイ、遺伝子操作された配列、システム、集合物、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、プロファージ、集団又は集合物が、宿主細胞内にない、条項4、5又は6の使用。
8.アレイ、遺伝子操作された配列、集合物、システム、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、プロファージ、集団又は集合物が、宿主細胞(例えば、微生物、細菌又は古細菌細胞)内である、条項5又は6の使用。
9.微生物細胞を改変するため(例えば、細胞の成長若しくは微生物細胞の培養を死滅させる又は低減させるため)の、条項4〜6のいずれか1つの使用。
10.宿主細胞(例えば、微生物細菌又は古細菌)における標的ヌクレオチド配列を改変する方法であって、本発明によるアレイ、遺伝子操作された配列、システム、集合物、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、集団又は集合物を用いて宿主細胞を形質転換し、これにより、標的ヌクレオチド配列が、改変されたCasである工程を含み、宿主標的配列が、細胞の宿主CRISPR/Casシステムのヌクレオチド配列である、方法。
11.核酸ベクターによる形質転換に対する宿主細胞抵抗性又は宿主細胞における核酸ベクターの維持の発生を低減する方法であって、宿主細胞が、標的ヌクレオチド配列を含み、本発明によるアレイ、遺伝子操作された配列、集合物、システム、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、集団又は集合物を用いて宿主細胞を形質転換し、これにより、標的ヌクレオチド配列が、改変された(例えば、切断された、変異誘発された又はノックダウンされた)Casである、工程を含む、方法。
12.ベクターが、宿主細胞に感染する能力があるウイルスであり、形質転換工程が、ベクターを用いて宿主細胞を感染させる工程を含む、条項11の方法。
13.宿主細胞が、細菌又は古細菌細胞であり、ベクターが、ファージ又はファージミドである、条項11又は12の方法。
14.宿主標的配列が、ベクター配列スペーサーの宿主CRISPR/Casにより介在される取得に必須である、条項11〜13のいずれか1つの方法。
15.少なくとも成分(ii)が、宿主細胞溶解のためのエンドリシンを発現する能力があるウイルス(例えば、ファージ)において含有され、任意選択で、エンドリシンが、ファージphi11、ファージTwort、ファージP68、ファージphiWMY又はファージKエンドリシン(例えば、MV-Lエンドリシン又はP-27/HPエンドリシン)である、いずれかの先行する条項のアレイ、遺伝子操作された配列、システム、ベクター、細胞、集合物、組成物、使用又は方法。
16.宿主細胞溶解のためのエンドリシンとの組合せにおける、例えば、MV-Lエンドリシン若しくはP-27/HPエンドリシン又はその機能的相同体との組合せにおける、条項15のアレイ、遺伝子操作された配列、システム、ベクター、集合物、細胞、組成物、使用又は方法。
17.抗微生物、例えば、抗生物質剤、例えば、ベータ-ラクタム抗生物質との組合せにおける、いずれかの先行する条項のアレイ、遺伝子操作された配列、システム、ベクター、集合物、細胞、組成物、使用又は方法。
18.宿主細胞が、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、シュードモナス属(Pseudomonas)、サルモネラ属、リステリア属、大腸菌、デスルホビブリオ属(Desulfovibrio)又はクロストリジウム属の宿主細胞である、いずれかの先行する条項のアレイ、遺伝子操作された配列、システム、ベクター、集合物、細胞、組成物、使用又は方法。
19.宿主細胞が、スタフィロコッカス属(例えば、Sアウレウス)の宿主細胞であり、少なくとも成分(ii)が、I、II又はIII型スタフィロコッカス属のファージ(例えば、パッケージされたファージ)、任意選択で、カウドウイルス又はミオウイルス科ファージにおいて含有される、いずれかの先行する条項のアレイ、遺伝子操作された配列、システム、ベクター、集合物、細胞、組成物、使用又は方法。
20.宿主細胞が、ベータ-ラクタム抗生物質抵抗性ストレプトコッカス・アウレウス(Streptococcus aureus)、メチシリン抵抗性ストレプトコッカス・アウレウス(Streptococcus aureus)(MRSA)、バンコマイシン抵抗性ストレプトコッカス・アウレウス(Streptococcus aureus)又はテイコプラニン抵抗性ストレプトコッカス・アウレウスであり、任意選択で、標的配列が、それぞれ、宿主ベータ-ラクタム抗生物質抵抗性遺伝子、メチシリン抵抗性遺伝子、バンコマイシン抵抗性遺伝子又はテイコプラニン抵抗性遺伝子の配列である、いずれかの先行する条項のアレイ、遺伝子操作された配列、システム、ベクター、細胞、集合物、組成物、使用又は方法。
プラスミドは、バクテロイデス種において高度に共通し、株の20〜50%においてみられる。多くのプラスミドは、oriT及びトランス活性化可動遺伝子を有し、それらが結合により移行されることを可能にする。従って、一例では、ベクターは、oriT及び/又は可動遺伝子を含むプラスミドであり、例えば、第1又は第2の細菌は、バクテロイデスである。一例では、遺伝子操作された配列は、このようなベクターにより含まれる。
もしれない。これに対処するために、本発明は、本発明のベクター、遺伝子操作された配列又はトランスポゾンを有する細菌の担体集団を提供し、担体細菌は、このようなベクター、配列又はトランスポゾンと適合可能であり、これにより、ベクター、配列又はトランスポゾンは、担体及びレシピエント細菌が混合されるとき、腸細菌叢におけるレシピエント宿主細菌細胞(例えば、バクテロイデス)への水平方向の移行を可能にする。一例では、担体細菌は、ヒト又は非ヒト動物の食物摂取のための飲料(例えば、本明細書において記載されるもののような、プロバイオティクスドリンク)又は食料により含まれ、これにより、担体細菌は、ヒト又は動物により(例えば、口腔において又は腸において)により保有されるレシピエント細菌と混合することができる。実施形態において、ベクター、配列又はトランスポゾンは、本発明のCRISPRアレイを含み、アレイは、例えば、配列を切断して、標的配列を含む遺伝子を不活性化することにより、レシピエント細胞により含まれるヌクレオチド配列を標的にして、標的配列を改変する。代替において、ベクター、配列又はトランスポゾンは、第1のレシピエント細菌と異なる種である、細菌の第2のレシピエント集団への水平方向の移行(例えば、接合トランスポゾン移行)を可能にし、ヌクレオチド配列標的部位は、第2のレシピエント細菌により含まれるが、第1のレシピエント細菌により含まれず、これにより、標的部位は、第2のレシピエント細菌(宿主細胞)におけるCasにより改変される。
抗生物質抵抗性は、世界中の問題である。抗生物質抵抗性の新たな形態は、国境を越え、容易に国家間で広がり得る。抵抗性の多くの形態は、顕著な速度で広がる。世界の保健の指導者は、抗生物質抵抗性微生物を、世界中の全ての国における人々にとって「壊滅的な脅威を引き起こす」「悪夢の細菌」と記載した。米国において毎年、少なくとも200万人の人々が、その感染を処置するよう設計された抗生物質の1つ又は複数に抵抗性である細菌の重篤な感染を得る。これらの抗生物質抵抗性感染の直接的な結果として、少なくとも23,000人の人々が毎年死亡する。抗生物質抵抗性感染に合併した他の状態で、より多くが死亡する。加えて、ほぼ250,000人の人々が、毎年、クロストリジウム・ディフィシル(Cディフィシル)感染のため病院でのケアを必要とする。これらの感染の大部分において、抗生物質の使用は、病気を導く主要な関与因子である。米国において毎年、Cディフィシル感染で、少なくとも14,000人の人々が死亡する。これらの感染の多くは、予防することができる。抗生物質抵抗性感染は、既に大いに悩まされた米国及び他の医療制度に、相当かつ回避できるコストを加算する。多くの場合において、抗生物質抵抗性感染は、抗生物質を用いて容易に処置可能である感染と比較して、延長した及び/又は高価な処置を要求し、病院滞在を拡大し、追加の医師の訪問及び健康ケアを必要とし、よりひどい障害及び死をもたらす。米国経済に対する抗生物質抵抗性の総経済コストを計算するのは困難である。概算は変動するが、過度の直接的なヘルスケアコストにおいて200億ドルもの高い範囲にあり、1年毎に350億ドルもの高さの生産性を失うため社会に対する追加のコストを伴う(2008ドル)。抗生物質の使用は、世界中で抗生物質抵抗性を導く1つの最も重要な要因である。抗生物質は、ヒト医薬において使用される最も一般的に処方される薬物である。しかしながら、人々に処方される全抗生物質の最大50%は、必要とされず、最適には、処方されることが有効ではない。抗生物質をまた、食用動物において一般的に使用して、疾患を予防し、制御し、処置し、食物を生み出す動物の成長を促進する。成長を促進するための抗生物質の使用は、必須ではなく、実施を廃止すべきである。米国食品医薬品局(FDA)の近年の指導は、この目標に向けた筋道
を記載する。食用動物において使用される薬物の量を、ヒトにおいて使用される量と直接比較することは困難であるが、より多くの抗生物質が、食物の産生において使用されるという証拠が存在する。
1.任意選択で、宿主細胞は、スタフィロコッカス・アウレウス細胞、例えば、メチシリン、バンコマイシン、リネゾリド、ダプトマイシン、キヌプリスチン、ダルホプリスチン及びテイコプラニンから選択される抗生物質に抵抗性のスタフィロコッカス・アウレウス細胞であり、宿主標的部位(又は標的部位の1つ又は複数)は、前記抗生物質に対する宿主抵抗性を付与する遺伝子により含まれる。
2.任意選択で、宿主細胞は、シュードモナス・エルギノーサ細胞、例えば、セファロスポリン(例えば、セフタジジム)、カルバペネム(例えば、イミペネム又はメロペネム)、フルオロキノロン、アミノグリコシド(例えば、ゲンタマイシン又はトブラマイシン)から選択される抗生物質に対して抵抗性のシュードモナス・エルギノーサ細胞であり、コリスチン及び宿主標的部位(又は標的部位の1つ又は複数)は、前記抗生物質に対する宿主抵抗性を付与する遺伝子により含まれる。
3.任意選択で、宿主細胞は、クレブシエラ属 (例えば、ニューモニエ)細胞、例えば、カルバペネムに対して抵抗性のクレブシエラ属細胞であり、宿主標的部位(又は標的部位の1つ又は複数)は、前記抗生物質に対する宿主抵抗性を付与する遺伝子により含まれる。
4.任意選択で、宿主細胞は、ストレプトコッカス属(Streptoccocus)(例えば、サーモフィルス、ニューモニエ又はピオゲネス)細胞、例えば、エリスロマイシン、クリンダマイシン、ベータ-ラクタム、マクロライド、アモキシシリン、アジスロマイシン及びペニシリンから選択される抗生物質に対して抵抗性のストレプトコッカス属細胞であり、宿主標的部位(又は標的部位の1つ又は複数)は、前記抗生物質に対する宿主抵抗性を付与する遺伝子により含まれる。
5.任意選択で、宿主細胞は、サルモネラ(例えば、血清型チフィ)細胞、例えば、セフトリアキソン、アジスロマイシン及びシプロフロキサシンから選択される抗生物質に対して抵抗性のサルモネラ細胞であり、宿主標的部位(又は標的部位の1つ又は複数)は、前記抗生物質に対する宿主抵抗性を付与する遺伝子により含まれる。
6.任意選択で、宿主細胞は、シゲラ属(Shigella)細胞、例えば、シプロフロキサシン及びアジスロマイシンから選択される抗生物質に対して抵抗性のシゲラ属細胞であり、宿主標的部位(又は標的部位の1つ又は複数)は、前記抗生物質に対する宿主抵抗性を付与する遺伝子により含まれる。
7.任意選択で、宿主細胞は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(mycobacterium tuberculosis)細胞、例えば、イソニアジド(INH)、リファンピシン(RMP)、フルオロキノロン、アミカシン、カナマイシン及びカプレオマイシン及びアジスロマイシンから選択される抗生物質に抵抗性のマイコバクテリウム・ツベルクローシス細胞であり、宿主標的部位(又は標的部位の1つ又は複数)は、前記抗生物質に対する宿主抵抗性を付与する遺伝子により含まれる。
8.任意選択で、宿主細胞は、エンテロコッカス属の細胞、例えば、バンコマイシンに対して抵抗性のエンテロコッカス属の細胞であり、宿主標的部位(又は標的部位の1つ又は複数)は、前記抗生物質に対する宿主抵抗性を付与する遺伝子により含まれる。
9.任意選択で、宿主細胞は、腸内細菌科細胞、例えば、セファロスポリン及びカルバペネムから選択される抗生物質に対して抵抗性の腸内細菌科細胞であり、宿主標的部位(又は標的部位の1つ又は複数)は、前記抗生物質に対する宿主抵抗性を付与する遺伝子により含まれる。
10.任意選択で、宿主細胞は、大腸菌細胞、例えば、トリメトプリム、イトロフラントイン、セファレキシン及びアモキシシリンから選択される抗生物質に対して抵抗性の大腸菌細胞であり、宿主標的部位(又は標的部位の1つ又は複数)は、前記抗生物質に対する宿主抵抗性を付与する遺伝子により含まれる。
11.任意選択で、宿主細胞は、クロストリジウム属(例えば、ディフィシル)細胞、例えば、フルオロキノロン抗生物質及びカルバペネムから選択される抗生物質に対して抵抗性のクロストリジウム属細胞であり、宿主標的部位(又は標的部位の1つ又は複数)は、前記抗生物質に対する宿主抵抗性を付与する遺伝子により含まれる。
12.任意選択で、宿主細胞は、ナイセリア・ゴノレエ(Neisseria gonnorrhoea)細胞、例えば、セフィキシム(例えば、経口セファロスポリン)、セフトリアキソン(注射可能なセファロスポリン)、アジスロマイシン及びテトラサイクリンから選択される抗生物質に対して抵抗性のナイセリア・ゴノレエ細胞であり、宿主標的部位(又は標的部位の1つ又は複数)は、前記抗生物質に対する宿主抵抗性を付与する遺伝子により含まれる。
13.任意選択で、宿主細胞は、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetoebacter baumannii)細胞、例えば、ベータ-ラクタム、メロペネム及びカルバペネムから選択された抗生物質に対して抵抗性のアシネトバクター・バウマンニ細胞であり、宿主標的部位(又は標的部位の1つ又は複数)は、前記抗生物質に対する宿主抵抗性を付与する遺伝子により含まれる。
14.任意選択で、宿主細胞は、カンピロバクター属の細胞、例えば、シプロフロキサシン及びアジスロマイシンから選択される抗生物質に対して抵抗性のカンピロバクター属の細胞であり、宿主標的部位(又は標的部位の1つ又は複数)は、前記抗生物質に対する宿主抵抗性を付与する遺伝子により含まれる。
15.任意選択で、宿主細胞は、ベータ(β)-ラクタマーゼを産生する。
16.任意選択で、宿主細胞は、例1〜14のいずれか1つにおいて列挙された抗生物質に対して抵抗性である細菌宿主細胞である。
一例では、組成物(例えば、抗生物質と組み合わせたHM組成物又は遺伝子操作された配列)は、以下のいずれかである。一例では、組成物は、医療、眼科、歯科又は医薬組成物(例えば、抗宿主ワクチンにより含まれる)である。一例では、組成物は、抗菌組成物、例えば、抗生物質又は抗ウイルス薬、例えば、医薬、消毒薬又は口腔洗浄薬である。一例では、組成物は、化粧用組成物(例えば、顔又は身体のメーキャップ組成物)である。一例では、組成物は、除草剤である。一例では、組成物は、農薬である(例えば、宿主がバチルス属(Bacillus)(例えば、チューリンゲンシス(thuringiensis))宿主であるとき)。一例では、組成物は、飲料(例えば、ビール、ワイン又はアルコール飲料)添加物である。一例では、組成物は、食品添加物である(例えば、宿主が、大腸菌、サルモネラ、リステリア属又はクロストリジウム属(例えば、ボツリヌム)宿主であるとき)。一例では、組成物は、水添加物である。一例では、組成物は、水生動物環境(例えば、魚のタンクにおける)のための添加剤である。一例では、組成物は、油又は石油化学工業組成物であるか、又はこのような組成物において含まれる(例えば、宿主が、硫黄還元細菌、例えば、デスルホビブリオ属宿主であるとき)。一例では、組成物は、油又は石油化学製品の添加剤である。一例では、組成物は、化学添加剤である。一例では、組成物は、消毒薬(例えば、ヒト又は動物使用のため、例えば、外科手術又は医療使用のため、又は赤ちゃんの授乳のための装置を無菌化するための)である。一例では、組成物は、ヒト又は動物使用のための個人用衛生組成物である。一例では、組成物は、環境での使用のため、例えば、土壌処理又は環境の汚染除去(例えば、宿主が、硫黄還元細菌、例えば、デスルホビブリオ属宿主であるとき、例えば、汚水から、又は油、石油化学製品若しくは化学物質から)のための組成物である。一例では、組成物は、植物の成長刺激因子である。一例では、組成物は、油、石油化学製品、金属又は鉱物抽出における使用のための組成物である。一例では、組成物は、織物の処理又は添加剤である。一例では、組成物は、動物の皮、皮革又はスウェード処理又は添加剤である。一例では、組成物は、色素添加剤である。一例では、組成物は、飲料(例えば、ビール又はワイン)醸造又は発
酵添加物である(例えば、宿主が、ラクトバチルス属宿主であるとき)。一例では、組成物は、紙添加剤である。一例では、組成物は、色素添加剤である。一例では、組成物は、接着剤添加剤である。一例では、組成物は、抗ヒト又は動物又は植物寄生組成物である。一例では、組成物は、空気添加剤(例えば、宿主が、レジオネラ属宿主であるとき、例えば、エアコンディショニング装置における空気又はそれにより産生される空気のための)である。一例では、組成物は、抗凍結添加剤である(例えば、宿主が、レジオネラ属宿主である場合)。一例では、組成物は、目薬又は眼科用組成物(例えば、コンタクトレンズ液)である。一例では、組成物は、乳製品により含まれる(例えば、組成物は、牛乳又は乳製品にあるか、又はそれであり、例えば、宿主は、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、ラクトコッカス属又はリステリア属宿主である)。一例では、組成物は、家庭用又は産業用洗浄製品であるか、又はそれにより含まれる(例えば、宿主が、大腸菌、サルモネラ、リステリア属又はクロストリジウム属(例えば、ボツリヌム)宿主である場合)。一例では、組成物は、燃料により含まれる。一例では、組成物は、溶媒(例えば、水以外)により含まれる。一例では、組成物は、ベーキング添加物(例えば、食品のベーキング添加物)である。一例では、組成物は、実験室用試薬(例えば、バイオテクノロジー又は組換えDNA若しくはRNAテクノロジーにおける使用のための)である。一例では、組成物は、織物浸漬剤により含まれる。一例では、組成物は、ビタミン合成プロセスにおける使用のためである。一例では、組成物は、抗作物又は植物妨害組成物である(例えば、宿主が、腐生細菌であるとき)。一例では、組成物は、抗腐食化合物、例えば、金属腐食を予防するか、又は低減するための抗腐食化合物である(例えば、宿主が、硫黄還元細菌、例えば、デスルホビブリオ属宿主であるとき、例えば、油抽出、処置若しくは汚染要件;金属抽出、処理又は汚染装置;又は鉱物抽出、処理又は汚染装置である腐食の低減又は予防における使用のための)。一例では、組成物は、農業用又は農場用組成物であるか、又はこのような組成物において含まれる。一例では、組成物は、貯蔵牧草添加物である。本発明は、この段落における使用のため又はこの段落において記載される任意の適用における使用のための本明細書において記載されるHM-CRISPRアレイ、HM-CRISPR/Casシステム、HM-crRNA、HM-スペーサー、HM-DNA、HM-Cas、HM-組成物又はgRNAasを提供し、例えば、宿主細胞は、微生物細胞又は細菌若しくは古細菌細胞である。本発明は、この段落において記載される任意の適用方法を提供し、方法は、本発明のHM-CRISPRアレイ、HM-CRISPR/Casシステム、HM-crRNA、HM-スペーサー、HM-DNA、HM-Cas、gRNA又はHM-組成物を宿主細胞(例えば、微生物、細菌又は古細菌細胞)と合わせる工程を含む。実施形態において、宿主細胞は、ヒト(若しくはヒト胚)又は動物に存在しない。
(参考文献)
Wall, J. D.、B. J. Rapp-Giles、及びM. Rousset、1993年、「Characterization of a small plasmid from Desulfovibrio desulfuricans and its use for shuttle vector construction」、J. Bacteriol.、175:4121〜4128頁;
Seyedirashti Sら;J Gen Microbiol.、1992年7月;138(7):1393〜7頁、「Molecular characterization of two bacteriophages isolated from Desulfovibrio vulgaris NCIMB 8303 (Hildenborough)」;
Driggers及びSchmidt、J. gen. Virol.、(1970年)、6、421〜427頁、「Induction of Defective and Temperate Bacteriophages in Caulobacter」。
1.細菌の混合集団における第1及び第2の細菌の亜集団の相対比の変更のための宿主改変(HM)CRISPR/Casシステムの使用であって、第2の細菌が宿主細胞を含み、
各宿主細胞について、システムが、(i)〜(iv)に記載の構成要素を含み、
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも1つの核酸配列、
(ii)宿主細胞標的配列、並びに宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、前記Casを宿主細胞における標的にガイドして、標的配列を改変する配列を含むHM-crRNAをコードするスペーサー配列(HM-スペーサー)及びリピートを含む遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイ、
(iii)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列、
(iv)システムの前記成分が、宿主細胞と宿主細胞を形質転換する少なくとも1つの核酸ベクター間で分離され、これにより、HM-crRNAが、Casを標的にガイドして、宿主細胞における宿主CRISPR/Casシステムを改変し、
標的配列が、Casにより改変され、これにより、宿主細胞が死滅されるか、又は宿主細胞成長が阻害される、使用。
2.細菌宿主細胞の標的ヌクレオチド配列を改変するための、概念1の使用のための宿主改変(HM)CRISPR/Casシステムであって、システムが、(i)〜(iv)に記載の構成要素を含み、
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも1つの核酸配列、
(ii)宿主細胞標的配列、並びに宿主標的配列にハイブリダイズして、前記Casを宿主細胞における標的にガイドして、標的配列を改変する能力がある配列を含むHM-crRNAをコードするスペーサー配列(HM-スペーサー)及びリピートを含む遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイ、
(iii)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するためのDNA配列、
(iv)システムの前記成分が、宿主細胞と宿主細胞を形質転換することができる少なくとも1つの核酸ベクター間で分離され、これにより、HM-crRNAが、Casを標的にガイドして、宿主細胞における宿主CRISPR/Casシステムを改変する、宿主改変(HM)CRISPR/Casシステム。
3.ベクター又は複数のベクターが、Cas(例えば、Cas9)ヌクレアーゼをコードする配列を欠く、概念2のシステム。
4.各宿主細胞が、ヒト細菌叢においてみられる株又は種のものである、いずれかの先行する概念の使用又はシステム。
5.(a)混合細菌集団におけるバクテロイデス門の細菌の部分の変更;(b)混合細菌集団におけるファーミキューテス門亜集団(宿主細胞)の比率の低減;(c)混合集団における第1のファーミキューテス門種(宿主細胞)の比率の低減であって、混合集団が、成長が前記cRNAにより阻害されない第2のファーミキューテス門種を含む、低減;(d)混合細菌集団における第1のグラム陽性細菌種(宿主細胞)の比率の低減であって、混合集団が、成長が前記cRNAにより阻害されない第2のグラム陽性細菌種を含む、低減;(e)混合細菌集団における細菌種(宿主細胞)の比率の低減であって、混合集団が、成長が前記cRNAにより阻害されない異なる細菌種を含み、第1の種が、他の種の16sリボソームRNAをコードするDNA配列に対して少なくとも80、82、83、84、85、90又は95%同一である16sリボソームRNAをコードするDNA配列を含む、低減;(f)混合細菌集団における第1の細菌ヒト腸細菌叢種(宿主細胞、例えば、ファーミキューテス門)の比率の低減であって、混合集団が異なる細菌種を含み、異なる種が、成長が前記cRNAにより阻害されないヒト腸プロバイオティック種である、低減;又は(g)混合細菌集団における細菌ヒト腸細菌叢種((宿主細胞、例えば、ファーミキューテス門)の比率の低減であって、混合集団が異なる細菌種を含み、異なる種が、成長が前記cRNAにより阻害されないヒト腸共生種である、低減のための、概念1又は4の使用。
6.(a)混合細菌集団におけるバクテロイデス門の細菌の部分の変更;(b)混合細菌集団におけるファーミキューテス門亜集団(宿主細胞)の比率の低減;(c)混合集団における第1のファーミキューテス門種(宿主細胞)の比率の低減であって、混合集団が、成長が前記cRNAにより阻害されない第2のファーミキューテス門種を含む、低減;(d)混合細菌集団における第1のグラム陽性細菌種(宿主細胞)の比率の低減であって、混合集団が、成長が前記cRNAにより阻害されない第2のグラム陽性細菌種を含む、低減;(e)混合細菌集団における細菌種(宿主細胞)の比率の低減であって、混合集団が、成長が前記cRNAにより阻害されない異なる細菌種を含み、第1の種が、他の種の16sリボソームRNAをコードするDNA配列に対して少なくとも80、82、83、84、85、90又は95%同一である16sリボソームRNAをコードするDNA配列を含む、低減;(f)混合細菌集団における第1の細菌ヒト腸細菌叢種(宿主細胞、例えば、ファーミキューテス門)の比率の低減であって、混合集団が異なる細菌種を含み、異なる種が、成長が前記cRNAにより阻害されないヒト腸プロバイオティック種である、低減;又は(g)混合細菌集団における細菌ヒト腸細菌叢種(宿主細胞、例えば、ファーミキューテス門)の比率の低減であって、混合集団が異なる細菌種を含み、異なる種が、成長が前記cRNAにより阻害されないヒト腸共生種である、低減のための、概念2又は3の使用であって、(a)〜(g)が、ヒト又は動物対象において、(i)比率が低減されない前記細菌種による細菌叢感染;又は(ii)比率が低減される前記細菌種による疾患若しくは状態を処置又は予防するためである、概念2又は3の使用。
7.バクテロイデス門対ファーミキューテス門の相対比を増大させるための、概念5又は6の使用又はシステム。
8.前記Casヌクレアーゼが、細胞の内因性II型CRISPR/Casシステムによりもたらされる、任意の先行する概念の使用又はシステム。
9.構成要素(i)が、宿主細胞にとって内因性である、任意の先行する概念の使用又はシステム。
10.標的配列が、抗生物質抵抗性遺伝子、病原性遺伝子又は宿主細胞の必須遺伝子により含まれる、任意の先行する概念の使用又はシステム。
11.標的配列が宿主染色体配列である、任意の先行する概念の使用又はシステム。
12.或いは、HM-crRNA及びtracrRNAが、シングルガイドRNA(gRNA)、例えば、ベクターによりもたらされるシングルガイドRNA(gRNA)により含まれる、任意の先行する概念の使用又はシステム。
13.宿主細胞が、対象となるHm-配列をコードするフリーな末端を有するデオキシリボ核酸鎖(HM-DNA)を含み、及び/又はシステムが、HM-DNAをコードする配列を含み、HM-DNAが、HM-DNAを宿主ゲノムに(例えば、染色体又はエピソーム部位に)挿入するための標的配列において又はそれに隣接する配列又は複数の配列に相同である配列又は複数の配列を含む、任意の先行する概念の使用又はシステム。
14.内因性CRISPR/Casシステムを含む細菌宿主細胞を改変するための、概念1の使用のための遺伝子操作された核酸ベクターであって、ベクターが、
(a)CRISPR/Casシステムにおける使用のため又は任意の先行する概念に記載の使用のための、複数の異なるcrRNA(例えば、gRNAにより含まれる)を発現する核酸配列を含み;
(b)任意選択で、Casヌクレアーゼをコードする核酸配列を欠き、
前記crRNAの第1のものが、前記宿主細胞における第1の核酸配列にハイブリダイズする能力があり、前記crRNAの第2のものが、前記宿主細胞における第2の核酸配列にハイブリダイズする能力があり、前記第2の配列が、前記第1の配列と異なり;
(c)第1の配列が、抗生物質抵抗性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ、第2の配列が、抗生物質抵抗性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ;任意選択で、遺伝子が異なり;
(d)第1の配列が、抗生物質抵抗性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ、第2の配列が、必須又は病原性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ;
(e)第1の配列が、必須伝子(又はそのRNA)により含まれ、第2の配列が、必須又は病原性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ;又は
(f)第1の配列が、病原性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ、第2の配列が、必須又は病原性遺伝子(又はそのRNA)により含まれる、遺伝子操作された核酸ベクター。
15.ベクターによりコードされるcRNA(例えば、シングルガイドRNA)とともに作動可能である1つ又は複数のCas含む宿主細胞内部の、概念14のベクター。
16.HM-CRISPRアレイが、同じスペーサーの複数のコピーを含む、任意の先行する概念の使用、システム又はベクター。
17.ベクターが、複数のHM-CRISPRアレイを含む、任意の先行する概念の使用、システム又はベクター。
18.各ベクターが、ウイルス又はファージである、任意の先行する概念の使用、システム又はベクター。
19.システム又はベクターが、crRNA(例えば、gRNA)をコードする核酸配列の2、3つ以上のコピーを含み、コピーが、宿主細胞配列(例えば、病原性、抵抗性又は必須遺伝子配列)を標的にするための同じスペーサー配列を含む、任意の先行する概念の使用、システム又はベクター。
20.コピーが、2つ以上のベクターCRISPRアレイの間の分離される、概念19の使用、システム又はベクター。
21.任意の先行する概念において列挙されるシステム又はベクターを含む、細菌宿主細胞。
22.アレイが、抗生物質剤と組み合わせた状態にあり;又は使用が、宿主細胞を第1の抗生物質に曝露することを含み、標的配列が、前記第1の抗生物質に対する抵抗性についての抗生物質抵抗性遺伝子により含まれる、任意の先行する概念の使用、システム、ベクター又は細胞。
23.宿主細胞が、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、シュードモナス、サルモネラ属、リステリア属、大腸菌、デスルホビブリオ属、又はクロストリジウム属宿主細胞である、任意の先行する概念の使用、システム、ベクター又は細胞。
24.各ベクターが、概念14又は15に記載のものである、概念1〜13又は16〜23のいずれか1つの使用、システム又は細胞。
25.宿主細胞集団成長が、前記HM-アレイ又は前記gRNAをコードするヌクレオチド配列を用いて形質転換されていない前記宿主細胞の集団の成長と比較して少なくとも5分の1低減される、任意の先行する概念の使用、システム、ベクター又は細胞。
26.表面上での宿主細胞集団成長が阻害される、任意の先行する概念の使用、システム、ベクター又は細胞。一例では、集団は、ヒト組織表面(例えば、腸組織表面、例えば、インビボ又はエクスビボでの)と接触している。
27.第1の細菌が、ヒト(例えば、ヒト腸における)とプロバイオティック、共生又は相利共生である、任意の先行する概念の使用、システム、ベクター又は細胞。
28.第1及び第2の細菌が、共にファーミキューテス門であり、異なる種又は株の細菌であり;又は第1の細菌が、腸内細菌科であり、第2の細菌が、ファーミキューテス門である、任意の先行する概念の使用、システム、ベクター又は細胞。
29.宿主細胞が、細菌細胞の代わりに、古細菌細胞であるか、又は各集団が、細菌集団の代わりに、古細菌集団である、任意の先行する概念の使用、システム、ベクター又は細胞。
30.宿主細胞が、流体、表面、装置、容器、河川、水、飲料、食料又は化粧品により又はそれ上に含まれる、産業又はエクスビボ医療用流体、表面、装置又は容器を処理するための;又は河川、水、飲料、食料又は化粧品を処理するための、概念1、4、5、7〜13、16〜20及び22〜29のいずれか1つの使用。
31.HM-cRNA又はgRNAが、隣接のNNAGAAW又はNGGNGプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)である宿主細胞標的プロトスペーサー配列にハイブリダイズする能力がある配列を含む、任意の先行する概念の使用、システム、ベクター又は細胞。
32.1.4kbより大きい外来DNA配列を含む、任意の先行する概念に記載の核酸ベクター、又は使用、システム又は細胞における使用のためのベクターであって、外来DNAが、CRISPR/Casシステムの1つ又は複数の構成要素をコードし、宿主細胞においてHM-crRNA又はgRNAを発現するための遺伝子操作されたアレイを含み、外来配列が、cRNA又はgRNAと同族であるCasヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を欠き;少なくとも2つの異なるcRNA又はgRNAが、外来DNAにより(例えば、少なくとも2つのHM-CRISPRアレイにより)コードされる、ベクター。
33.ベクターが、宿主細胞を形質転換する能力があるウイルスベクターである、概念32のベクター。
34.cRNA又はgRNAが、宿主細胞においてそれぞれの標的プロトスペーサー配列にハイブリダイズする能力があり、各プロトスペーサー配列が、抗生物質抵抗性又は必須宿主遺伝子により含まれる、概念32又は33のベクター。
35.宿主細胞が、ヒト細菌叢種の細胞である、概念32〜34のいずれか1つのベクター。
1.集団の成長を阻害するための細菌宿主細胞集団の野生型内因性Casヌクレアーゼ活性の使用であって、集団が、複数の宿主細胞を含み、各宿主細胞が、野生型Casヌクレアーゼ活性を有する内因性CRISPR/Casシステムを有し、使用が、集団の宿主細胞を形質転換することを含み、各形質転換された宿主細胞が、宿主細胞における宿主改変(HM)cRNA又はガイドRNA(gRNA)をもたらすための遺伝子操作されたヌクレオチド配列を用いて形質転換され、HM-cRNA又はgRNAが、内因性Casをガイドするための宿主細胞標的プロトスペーサー配列を標的にハイブリダイズする能力がある配列を含み、cRNA又はgRNAが、前記野生型ヌクレアーゼ活性を有する宿主細胞の内因性Casヌクレアーゼと同族であり、宿主細胞の前記形質転換後、集団の成長が阻害される。
宿主細胞は、同じ種又は株のものであってもよい。
2.宿主細胞集団成長の阻害が、前記遺伝子操作されたヌクレオチド配列を用いて形質転換されていない前記宿主細胞の集団の成長と比較して、少なくとも5分の1の成長における低減である、実施形態1の使用。
3.表面上での集団成長が、阻害される、実施形態1の使用。
4.表面上での集団成長が、阻害される、実施形態2の使用。
5.前記阻害が、各宿主細胞のための、前記宿主細胞の死滅又は成長の低減のためのHM-CRISPR/Casシステムの使用を含み、システムが、(i)〜(iv)に記載の構成要素を含み、
(i)前記Casヌクレアーゼをコードする少なくとも1つの核酸配列、
(ii)前記HM-crRNAをコードするスペーサー配列(HM-スペーサー)及びリピートを含む、遺伝子操作された宿主改変HM-CRISPRアレイ、
(iii)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列、
(iv)システムの前記成分が、宿主細胞と宿主細胞を形質転換する少なくとも1つの核酸ベクター間で分離され、これにより、HM-crRNAが、前記Casを標的にガイドして、標的配列を改変し、
標的配列が、宿主細胞においてCasにより改変され、これにより、宿主細胞が死滅されるか、又は宿主細胞成長が阻害される、実施形態1の使用。
6.細菌の混合集団における第1及び第2の細菌の亜集団の相対比の変更のための、任意の先行する実施形態の使用であって、第2の細菌が宿主細胞を含む、使用。
7.宿主細胞が、ヒト細菌叢においてみられる株又は種のものである、実施形態6の使用。
8.宿主細胞が、異なる株又は種の細胞と混合され、異なる細胞が、ヒト(例えば、ヒト腸において)とプロバイオティック、共生又は相利共生である腸内細菌科又は細菌である、実施形態6又は7の使用。
9.任意選択で、集団におけるバクテロイデス門対1つ以上又は全てのファーミキューテス門種(例えば、対ストレプトコッカス属)の相対比を増大するための、バクテロイデス門細菌及び他の細菌を含む混合細菌集団におけるバクテロイデス門細菌の比率の変更のための、いずれかの先行する実施形態の使用。
10.混合集団における第1の細菌対第2の細菌の相対比を変更するための、任意の先行する実施形態の使用であって、第1及び第2の細菌が、共にファーミキューテス門であり、異なる種又は株の細菌であり、第2の細菌が、宿主細胞を含む、使用。一例では、使用は、第1の細菌の第2の細菌に対する比率を増大させる。
11.遺伝子操作されたヌクレオチド配列が、外来Casヌクレアーゼをコードする配列と組み合わせた状態にない、実施形態1の使用。
12.ベクター又は複数のベクターが、Casヌクレアーゼをコードする配列を欠く、実施形態5の使用。
13.各宿主細胞が、ヒト細菌叢においてみられる株又は種のものである、実施形態1の使用。
14.各宿主細胞が、ヒト細菌叢においてみられる株又は種のものである、実施形態6の使用。
15.各宿主細胞が、異なる株又は種の細胞と混合され、異なる細胞が、ヒト(例えば、ヒト腸において)とプロバイオティック、共生又は相利共生である腸内細菌科又は細菌である、実施形態13の使用。
16.使用が、バクテロイデス門細菌及び他の細菌を含む混合細菌集団におけるバクテロイデス門細菌の比率を変更し、任意選択で、使用が、集団におけるバクテロイデス門対1つ以上又は全てのファーミキューテス門種(例えば、ストレプトコッカス属)の相対比を変更する、実施形態1の使用。
17.第1及び第2の細菌が、共にファーミキューテス門であり、使用が、混合集団における第1対第2の細菌の相対比を変更する、実施形態1の使用。一例では、使用は、第1の細菌の第2の細菌に対する比率を増大させる。
18.前記Casヌクレアーゼが、宿主細胞内因性II型CRISPR/Casシステムによりもたらされ、及び/又はHM-cRNA又はgRNAが、隣接5'-NNAGAAW-3'プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)である宿主細胞標的プロトスペーサー配列にハイブリダイズする能力がある配列を含む、実施形態1の使用。
19.前記Casヌクレアーゼが、宿主細胞内因性II型CRISPR/Casシステムによりもたらされる、実施形態5の使用。
20.構成要素(ii)が、宿主細胞にとって内因性である、実施形態5の使用。
21.各形質転換された宿主細胞が、細胞内の前記HM-crRNAの産生において構成要素(ii)とともに作動可能である内因性RNaseIIIを含む、実施形態5の使用。
22.標的配列が、抗生物質抵抗性遺伝子、病原性遺伝子又は宿主細胞の必須遺伝子により含まれる、実施形態1の使用。
23.遺伝子操作されたヌクレオチド配列が、抗生物質剤と組み合わせた状態にある、実施形態1の使用。
24.HM-crRNA及びtracrRNAが、シングルガイドRNA(gRNA)により含まれる、実施形態5の使用。
25.形質転換された宿主細胞各々が、対象となるHm-配列をコードするフリーな末端を有するデオキシリボ核酸鎖(HM-DNA)を含み、HM-DNAが、HM-DNAを宿主ゲノムに挿入するための、標的配列において又は隣接する配列又は複数の配列にそれぞれ、相同である配列又は複数の配列を含み、HM-DNA配列が、宿主細胞ゲノムに挿入される、実施形態1の使用。
26.宿主細胞プロトスペーサー標的配列にハイブリダイズするための、宿主細胞において、複数の異なるcrRNA(又はgRNA)を発現させることを含み、前記crRNA(又はgRNA)の第1のものが、第1のプロトスペーサー核酸配列にハイブリダイズする能力があり、前記crRNA(又はgRNA)の第2のものが、第2のプロトスペーサー核酸配列にハイブリダイズする能力があり、前記第2の配列が、前記第1の配列と異なり、
(a)第1の配列が、抗生物質抵抗性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ、第2の配列が、抗生物質抵抗性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ;任意選択で、遺伝子が異なり;
(b)第1の配列が、抗生物質抵抗性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ、第2の配列が、必須又は病原性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ;
(c)第1の配列が、必須伝子(又はそのRNA)により含まれ、第2の配列が、必須又は病原性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ;又は
(d)第1の配列が、病原性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ、第2の配列が、必須又は病原性遺伝子(又はそのRNA)により含まれる、
実施形態1の使用。
27.宿主細胞が、ヒト又は動物対象により含まれる混合細菌集団により含まれ、使用が、(i)対象において、混合集団により含まれる前記宿主細胞により感染を処置するか;(ii)前記宿主細胞により媒介される状態又は疾患の対象におけるリスクを処理するか、又は低減するか;(iii)前記宿主細胞により引き起こされるか、又は媒介される体の匂いを低減するか;又は(iv)ヒトの個人用衛生処置である、実施形態6の使用。
28.使用が、ヒト又は動物対象における前記宿主細胞による感染を処置するか、又はリスクを低減し、宿主細胞各々が、前記標的プロトスペーサー配列を含む抗生物質抵抗性遺伝子(第1の抗生物質に対する抵抗性について)を含み、使用が、遺伝子操作されたヌクレオチド配列及び第1の抗生物質を対象に投与することを含み、感染が、対象において低減されるか、又は予防される、実施形態1の使用。
29.各遺伝子操作されたヌクレオチド配列が、抗生物質抵抗性遺伝子を更に含み、HM-crRNA又はgRNAが、抗生物質抵抗性遺伝子を標的にせず、使用が、集団を前記抗生物質及び複数の前記遺伝子操作された配列に曝露し、これにより、宿主細胞におけるHM-crRNA又はgRNAをコードする配列の維持を促進することを含む、実施形態1の使用。
30.宿主細胞が、グラム陽性細胞又はストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属、シュードモナス、サルモネラ、リステリア属、大腸菌、デスルホビブリオ属、Vコレラエ又はクロストリジウム属細胞である、実施形態1の使用。
31.産業用又は医療用流体、表面、装置又は容器を処理するため;又は河川、水、飲料、食料又は化粧品を処理するための、実施形態1の使用であって、宿主細胞が、流体、表面、装置、容器、河川、水、飲料、食料又は化粧品により又は上に含まれ、宿主細胞集団の成長は、前記処理を行うことにより、阻害される、使用。
代替において、任意の実施形態は、任意の先行する実施形態に従属する。
態様:混合集団における担体と宿主細胞間の水平方向の移行
1.担体細菌を含む混合細菌集団を産生する方法であって、集団が、それぞれ、第1及び第2の細菌の第1及び第2の亜集団を含み、亜集団が、互いに異なる第1及び第2の種の細菌であり、第2の細菌が、複数の宿主細胞を含み、担体細菌が、各々が、宿主細胞における宿主細胞改変(HM)cRNA又はガイドRNA(gRNA)をもたらすための遺伝子操作されたヌクレオチド配列を含む第1の細菌細胞であり、HM-cRNA又はgRNAが、第1のCasヌクレアーゼを標的にガイドして、標的を改変するため、宿主細胞標的プロトスペーサー配列にハイブリダイズする能力がある配列を含み、担体細菌が、標的配列を含まず、
a.各々が前記遺伝子操作されたヌクレオチド配列を含む、複数の核酸を用意する工程;
b.前記複数の核酸を、それぞれ、第1及び第2の細菌種の第1及び第2の亜集団を含む第1の混合集団と合わせる工程、第2の亜集団が宿主細胞を含み;
c.核酸が、宿主細胞の存在下で前記第1の亜集団の細胞を形質転換することを可能にし、これにより、前記担体細胞及び前記宿主細胞を含む第2の混合集団を産生する工程、担体細胞により含まれる前記遺伝子操作されたヌクレオチド配列が、宿主細胞に水平方向で移行して、形質転換された宿主細胞における前記HM-cRNA又はgRNAの産生のため宿主細胞を形質転換する能力がある、
を含む、方法。
2.第2の混合集団を得る工程を更に含む、態様1の方法。
3.複数の担体細胞を第2の混合集団から単離する工程を更に含む、態様1の方法。
4.形質転換された宿主細胞において前記HM-cRNA又はgRNAを産生する工程を更に含み、前記HM-crRNA又はgRNA配列が、前記形質転換された宿主細胞における標的プロトスペーサー配列にハイブリダイズし、第1のCasヌクレアーゼを標的にガイドし、これにより、第1のCasヌクレアーゼを用いて標的を改変する、態様1の方法。
5.前記標的改変を含む宿主細胞を得る工程を更に含む(例えば、宿主細胞が、前記第1の細菌種を含む混合集団により含まれる)、態様4の方法。
6.cRNA又はgRNAが、宿主細胞の内因性Casヌクレアーゼと同族であり、ヌクレアーゼが、前記第1のCasヌクレアーゼである、態様1の方法。
7.cRNA又はgRNAが、担体細胞の内因性Casヌクレアーゼと同族であり、ヌクレアーゼが、前記第1のCasヌクレアーゼである、態様1の方法。
8.ヌクレアーゼが、野生型ヌクレアーゼ活性を有する、態様7の方法。
9.第1のCasヌクレアーゼがCas9である、態様1、6、7又は8の方法。
10.Cas9が、ストレプトコッカス属Cas9である、態様9の方法。
11.各遺伝子操作されたヌクレオチド配列が、それぞれの核酸ベクターにより含まれ、ベクターが、担体と宿主細胞の間の水平方向の移行の能力がある、態様1の方法。
12.各遺伝子操作された配列が、それぞれの可動遺伝要素、例えば、トランスポゾン又はプラスミドにより含まれる、態様1又は11の方法。
13.宿主細胞の前記形質転換後に、宿主細胞亜集団の成長が阻害される、態様1の方法。
14.宿主細胞集団成長の阻害が、前記遺伝子操作されたヌクレオチド配列を用いて形質転換されていない前記宿主細胞の集団の成長と比較して、少なくとも5分の1である、態様13の方法。
15.表面上での宿主細胞集団成長が、阻害される、態様13又は14の方法。
1.細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、混合集団が、それぞれ、第1及び第2の細菌叢種の第1及び第2の細菌亜集団を含み、種は異なり、第2の細菌亜集団が、宿主細胞集団を含み、細菌叢細菌の混合集団を、宿主改変(HM)crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列の複数のコピーと合わせる工程、及び宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程を含み、各遺伝子操作された核酸配列が、HM-CRISPR/Casシステムを形成するようそれぞれの宿主細胞におけるCasヌクレアーゼとともに作動可能であり、遺伝子操作された配列が、スペーサー及びHM-crRNAをコードするリピート配列を含み、HM-crRNAが、宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、Casヌクレアーゼを宿主細胞における標的配列にガイドする能力がある配列を含み、任意選択で、HM-システムが、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、これにより、HM-crRNAが、宿主細胞における宿主標的配列のCas改変をガイドし、これにより、宿主細胞が死滅されるか、又は宿主細胞集団成長が低減され、これにより、前記宿主細胞集団の比率を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変化させる、方法。
2.標的ヌクレオチド配列の改変のため、宿主細胞の内因性Casヌクレアーゼを使用する工程を含む、段落1の方法。
3.前記Cas改変を受けていない宿主細胞の対照集団の成長と比較して、少なくとも5分の1宿主細胞集団の成長を低減する工程を含む、段落1又は2の方法。
4.表面上での宿主細胞集団成長を阻害する工程を含む、段落1、2又は3の方法。
5.第1の種が、宿主細胞種の16sリボソームRNAをコードするDNA配列に少なくとも80%同一である16sリボソームRNAをコードするDNA配列を有し、混合集団における第1の細菌の成長が、前記HM-システムにより阻害されない、段落1、2、3、又は4の方法。
6.第1の種が、ヒト腸共生種及び/又はヒト腸プロバイオティック種である、段落1〜5のいずれかの方法。
7.第1の種が、バクテロイデス門(例えば、バクテロイデス)であり、任意選択で、宿主細胞が、グラム陽性細菌細胞である、段落1〜6のいずれかの方法。
8.宿主細胞が、ファーミキューテス門の細胞である、段落1〜7のいずれかの方法。
9.宿主細胞が、ファーミキューテス門の細胞である、段落1〜8のいずれかの方法。
10.宿主細胞が、ファーミキューテス門の細胞である、段落1〜9のいずれかの方法。
11.各宿主細胞について、システムが、(i)〜(iv)に記載の構成要素:(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも1つの核酸配列;(ii)宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、前記Casを宿主細胞における標的にガイドして、標的配列を改変する配列を含むHM-crRNAをコードするスペーサー配列及びリピートを含む遺伝子操作されたHM-CRISPRアレイ;(iii)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列;(iv)システムの前記成分が、宿主細胞と宿主細胞を形質転換する少なくとも1つの核酸ベクターの間で分離され、これにより、HM-crRNAが、Casを標的にガイドして、宿主細胞における宿主標的配列を改変し;及び標的配列が、Casにより改変され、これにより、宿主細胞が死滅するか、又は宿主細胞成長が低減されることを含み、方法が、(iv)のベクターを宿主細胞に導入する工程、及び宿主細胞における前記HM-crRNAを発現させ、HM-cRNAが、宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的にガイドして、標的配列を改変することを可能にする工程を含み、これにより、宿主細胞が死滅するか、又は宿主細胞成長が低減され、これにより、細菌の混合集団における前記亜集団の相対比が変更される、段落1〜10のいずれかの方法。
12.構成要素(i)が、各宿主細胞にとって内因性である、段落11の方法。
13.各ベクターが、ウイルス又はファージである、段落12の方法。
14.各標的配列が、隣接NNAGAAW又はNGGNGプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)である、段落11の方法。
15.或いは、HM-crRNA及びtracrRNAが、シングルガイドRNA(gRNA)により含まれ、前記gRNAを宿主細胞に導入する工程又は宿主細胞におけるgRNAを発現させる工程を含む、段落1〜14のいずれかの方法。
16.第1及び第2の種の各々が、それぞれファーミキューテス門の種であり、第1の細菌の成長が、HM-システムにより阻害されない、段落1〜15のいずれかの方法。
17.第1及び第2の種の各々が、それぞれグラム陽性種であり、第1の細菌の成長が、HM-システムにより阻害されない、段落1〜16のいずれかの方法。
18.ヒト又は動物対象の宿主細胞感染を処置するための、段落1〜17のいずれか1つの方法であって、宿主細胞を第1の抗生物質に曝露する工程を含み、標的配列が、各々、前記第1の抗生物質に対する抵抗性についての抗生物質抵抗性遺伝子により含まれ、宿主細胞感染が、対象において処置される、方法。
19.ヒト又は動物対象における疾患又は状態を処置するか、又はリスクを低減するための、段落1〜18のいずれか1つの方法であって、疾患又は状態が、前記第2の細菌種により媒介され、第1の細菌が、ヒトとプロバイオティック、共生又は相利共生であり(例えば、ヒト腸において)、第1の細菌細胞が、前記標的配列を含まず、前記Casによる標的配列改変が、行われ、宿主細胞の成長が、前記対象において阻害されるが、第1の細胞の成長は、阻害されず、疾患又は状態が処置されるか、又は疾患又は状態のリスクが、前記対象において低減される、方法。
20.産業用又は医療用流体、表面、装置若しくは容器を処理するため;又は河川、水、飲料、食料又は化粧品を処理するための、段落1〜19のいずれか1つの方法であって、前記宿主細胞が、流体、表面、装置、容器、河川、水、飲料、食料又は化粧品により含まれるか、又はそれ上にあり、宿主細胞成長が阻害され、これにより、前記処置を行う、方法。
21.各宿主細胞が、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、シュードモナス属、サルモネラ、リステリア属、大腸菌、デスルホビブリオ属、ビブリオ属又はクロストリジウム属の細胞である、段落1〜20のいずれか1つの方法。
22.各標的配列が、抗生物質抵抗性遺伝子、病原性遺伝子又は宿主細胞の必須遺伝子により含まれる、段落1〜21のいずれか1つの方法。
23.混合集団におけるバクテロイデスの比率を増大させるための、段落7の方法であって、前記増大が生じる、方法。
24.Bテタイオタオミクロン及び/又はフラジリスの比率が、増大される、段落23の方法。
25.混合集団により含まれるバクテロイデス門対ファーミキューテス門又はグラム陽性宿主細胞の相対比が、増大される、段落7の方法。
26.Bテタイオタオミクロン及び/又はフラジリスの比率が、増大される、段落25の方法。
27.ヒト又は動物における共生又は相利共生バクテロイデス門を好ましくするための、段落1〜24のいずれかの方法。
28.態様1の産物を含む細菌培養物を産生する工程、及び培養物をヒト又は動物に投与し、これにより、前記ヒト又は動物における共生又は相利共生バクテロイデス門を好ましくする工程を含む、段落27の方法。
29.ヒト又は動物における腸バクテロイデス(例えば、Bテタイオタオミクロン(thetaiotamicron))によるパネート細胞刺激のための、段落1の方法であって、混合集団が、バクテロイデス第1の細菌を含む腸内細菌を含み、態様1の産物が、前記ヒト又は動物において産生されるか、又はヒト又は動物に投与され、これにより、パネート細胞が刺激される、方法。
30.ヒト又は動物において腸バクテロイデス(例えば、Bフラジリス)に対する免疫応答を発生させるための、態様1の方法であって、混合集団が、バクテロイデス第1の細菌を含む腸内細菌を含み、態様1の産物が、前記ヒト又は動物において産生されるか、又はヒト又は動物に投与され、これにより、前記免疫応答が発生する、方法。
本発明はまた、異なる種及び株の混合微生物集団における1回目の成功した宿主細胞標的化及び内因性又は外来(ベクターによりコードされるCas)の使用のための確立である、以下の実施例6において例示される、以下の条項1以降に関する。
1.第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
a. 細菌叢細菌の混合集団を、Casヌクレアーゼをコードする複数のベクター及び宿主改変(HM)crRNAと組み合わせる工程と、
b. 宿主細胞においてベクターによってコードされるCas及びHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてベクターによってコードされるCasとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casヌクレアーゼを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
を含み、
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更する、方法。
2.第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
a. 細菌叢細菌の混合集団を、宿主改変(HM)crRNAをコードする複数のベクターと組み合わせる工程と、
b. 宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてCasヌクレアーゼとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
を含み、
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更し、
宿主細胞集団成長を少なくとも5、10-、100、1000、10000、100000又は1000000倍低減する、方法。
3.第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
a. 細菌叢細菌の混合集団を、宿主改変(HM)crRNAをコードする複数のベクターと組み合わせる工程と、
b. 宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてCasヌクレアーゼとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
を含み、
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更し、
表面での宿主細胞集団成長を阻害する、方法。
4.第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
a. 細菌叢細菌の混合集団を、宿主改変(HM)crRNAをコードする複数のベクターと組み合わせる工程と、
b. 宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてCasヌクレアーゼとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
を含み、
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更し、
第1の種は、宿主細胞種の16sリボソームRNAをコードするDNA配列と少なくとも80%同一である16sリボソームRNAをコードするDNA配列を有し、混合集団中の第1の細菌の成長は、前記HMシステムによって阻害されない、方法。
5.第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
a. 細菌叢細菌の混合集団を、宿主改変(HM)crRNAをコードする複数のベクターと組み合わせる工程と、
b. 宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてCasヌクレアーゼとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
を含み、
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更し、
工程(a)の混合集団は、第3の細菌種を含む、方法。
6.第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
a. 細菌叢細菌の混合集団を、宿主改変(HM)crRNAをコードする複数のベクターと組み合わせる工程と、
b. 宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてCasヌクレアーゼとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
を含み、
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更し、
工程(a)の混合集団は、宿主細胞と同一種の細菌細胞の更なる亜集団を含み、前記更なる亜集団の細菌細胞は、前記標的配列を含まない、方法。
前記さらなる亜集団の細胞は、前記HM-CRISPR/Casシステムの存在下で死滅されないか、又は宿主細胞集団成長が、前記システムの存在下で低減される。
7.第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
a. 細菌叢細菌の混合集団を、宿主改変(HM)crRNAをコードする複数のベクターと組み合わせる工程と、
b. 宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてCasヌクレアーゼとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
を含み、
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更し、
各宿主細胞は、複数の前記標的配列を含む、方法。
8.第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
a. 細菌叢細菌の混合集団を、宿主改変(HM)crRNAをコードする複数のベクターと組み合わせる工程と、
b. 宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
宿主細胞において、Cas発現が誘導され、それによって、宿主細胞において前記発現されたCas及びHM-crRNAが組み合わされ、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてCasヌクレアーゼとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更する、方法。
9.第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
a. 細菌叢細菌の混合集団を、宿主改変(HM)crRNAをコードする複数のベクターと組み合わせる工程と、
b. 宿主細胞においてHM-crRNAの産生を誘導する工程と
を含み、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてCasヌクレアーゼとともに作動可能であり、HM-cRNAの産生のための遺伝子操作された核酸配列からのRNAの発現は、宿主細胞において誘導可能であり、遺伝子操作された配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
を含み、
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更する、方法。
10.第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
a. 細菌叢細菌の混合集団を、宿主改変(HM)crRNAをコードする複数のベクターと組み合わせる工程と、
b. 宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてCasヌクレアーゼとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
を含み、
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更する、方法。
11.Casが、ベクターによりコードされる、条項2〜10のいずれか1つの方法。
12.Casが、宿主細胞ゲノムによりコードされる、条項2〜10のいずれか1つの方法。
13.宿主細胞集団成長を少なくとも5分の1低減する、いずれかの先行する条項の方法。
14.表面上の宿主細胞集団成長を阻害する、いずれかの先行する条項の方法。
15.第1の種が、宿主細胞種の16sリボソームRNAをコードするDNA配列と少なくとも80%同一である16sリボソームRNAをコードするDNA配列を、混合集団における第1の細菌の成長が、前記HM-システムにより阻害されない、いずれかの先行する条項の方法。
16.第1の種が、グラム陰性種であり、任意選択で、第2の種が、グラム陰性種である、条項15の方法。
17.第1の種が、グラム陽性種であり、第2の種が、グラム陰性種である、条項1〜15のいずれか1つの方法。
18.工程(a)の混合集団が、第3の種を含み、第3の種が、グラム陰性種である、いずれかの先行する条項の方法。
19. 工程(a)の混合集団が、第3の細菌種を含む、いずれかの先行する条項の方法。
20.第3の種が、グラム陽性種である、条項19の方法。
21.第1及び第2の種が、グラム陰性種である、条項20の方法。
22.工程(a)の混合集団が、宿主細胞と同じ種の細菌細胞のさらなる亜集団を含み、前記さらなる亜集団の細菌細胞が、前記標的配列を含まない、いずれかの先行する条項の方法。
23.ベクターが、HM-crRNA配列を含むシングルガイドRNA(HM-gRNA)を発現する、いずれかの先行する条項の方法。
24.方法が、宿主細胞におけるHM-cRNAの産生において内因性宿主細胞RNaseIII及び/又は内因性宿主細胞tracrRNAを使用する工程を含む、条項1〜22のいずれか1つの方法。
25.各宿主細胞が、複数の前記標的配列(例えば、リボソームRNAをコードする配列、例えば、16s rRNAをコードする配列)を含む、いずれかの先行する条項の方法。
26.各宿主細胞が、前記標的配列の少なくとも2、3、4、5、6又は7つのコピーを含む、条項25の方法。
27.前記標的配列が、前記第2の種の細菌において保存される、いずれかの先行する条項の方法。
例えば、標的配列は、前記第2の種の細菌の株において保存され、任意選択で、前記第2の種の細菌の第2の株において保存されない。
28.前記標的配列は、必須遺伝子により含まれ、及び/又は宿主細胞におけるタンパク質発現のため要求される、いずれかの先行する条項の方法。
29.宿主細胞が、前記第2の種の第1の株のものであり、前記遺伝子標的配列が、前記株に存在するが、標的配列が、異なる株のものである第2の種の細菌に存在しない、いずれかの先行する条項の方法。
30.工程(a)の混合集団が、前記異なる株の細菌の亜集団を含む、条項29の方法。
例えば、標的配列は、前記第2の種の細菌の株において保存され、任意選択で、前記第2の種の細菌の第2の株において保存されない。
31.第1の種は、グラム陰性種であり、工程(a)の混合集団は、第3の種の細菌の亜集団を含み、第3の種は、グラム陽性種である、条項30の方法。
32.第1の種が、グラム陽性種であり、工程(a)の混合集団が、第3の種の細菌の亜集団を含み、第3の種が、グラム陰性種である、条項30の方法。
33.第2の種が、グラム陰性種である、条項30、31又は32の方法。
34.第2の種が、腸内細菌科種である、いずれかの先行する条項の方法。
35.第2の種が、大腸菌である、いずれかの先行する条項の方法。
36.第2の種が、ヒト又は動物腸細菌叢種である、いずれかの先行する条項の方法。
37.各種が、環境上の種、又はヒト若しくは動物(例えば、腸)細菌叢種であり、及び/又は宿主細胞が、ヒト細菌叢種の細胞である、いずれかの先行する条項の方法。
38.Cas発現が、宿主細胞において誘導可能である、いずれかの先行する条項の方法。
39.Cas発現が、宿主細胞において誘導される、いずれかの先行する条項の方法。
40.HM-cRNA発現が、宿主細胞において誘導可能である、いずれかの先行する条項の方法。
41.HM-crRNA発現が、宿主細胞において誘導される、いずれかの先行する条項の方法。
42.細菌宿主細胞を形質転換する能力があるベクターであって、ベクターが、宿主細胞において発現可能である(i)SピオゲネスCas9ヌクレオチド配列、(ii)任意選択で、いずれかの先行する条項の方法における使用のための、いずれかの先行する条項において定義された少なくとも1つのHM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列の挿入物を収容する能力があり、ベクターが、(i)(及び任意選択で、(ii))を含むとき、ベクターが、宿主細胞を形質転換し、Cas(及び任意選択で、少なくとも1つのHM-crRNA(例えば、gRNA)を発現する能力がある、ベクター。
43.発現されるCasが、Cas9である、条項42のベクター。
代替において、発現されるCasは、Cas3、例えば、大腸菌Cas3である。発現されるCasは、Casを宿主細胞における1つ又は複数の標的配列に標的化するよう、宿主細胞において発現されるHM-crRNAと作動可能である。
44.ヒト又は動物における疾患又は状態を処置又は予防するためであるか、又はヒト又は動物における疾患又は状態を処置又は予防する、いずれかの先行する条項の方法又はベクター。
45.項42から44のいずれか1つのベクターをそれぞれ含む複数の細菌宿主細胞であって、ベクターによってコードされるCas(及び任意選択で、前記HMcrRNA)は、宿主細胞において発現される、又は発現可能であり、細菌細胞は、第1の亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団により含まれ、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団(前記複数の細菌宿主細胞)を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種である、複数の細菌宿主細胞。
46.ヒト又は動物における疾患又は状態を処置又は予防するための、条項45の複数の細胞。
47.第1の細菌叢種が、ヒト腸共生種及び/又はヒト腸プロバイオティック種である、いずれかの先行する条項の方法、ベクター又は複数の細胞。
48.第1の細菌叢種が、バクテロイデス門(例えば、バクテロイデス)であり、任意選択で、宿主細胞が、グラム陽性細菌細胞である、いずれかの先行する条項の方法、ベクター又は複数の細胞。
49.宿主細胞集団が、ファーミキューテス門細胞からなる、いずれかの先行する条項の方法、ベクター又は複数の細胞。
50.各宿主細胞について、システムが、(i)〜(iv)に記載の構成要素を含み、
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも1つの核酸配列;
(ii)宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、前記Casを宿主細胞における標的にガイドして、標的配列を改変する配列を含むHM-crRNAをコードするスペーサー配列及びリピートを含む遺伝子操作されたHM-CRISPRアレイ;
(iii)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列;
(iv)システムの前記成分が、宿主細胞と宿主細胞を形質転換する少なくとも1つの核酸ベクターの間の分離であり、これにより、HM-crRNAが、Casを標的にガイドして、宿主細胞における宿主標的配列を改変する、いずれかの先行する条項の方法、ベクター又は複数の細胞であって、
標的配列が、Casにより改変され、これにより、宿主細胞が死滅するか、又は宿主細胞成長が低減され;
(iv)のベクターを宿主細胞に導入する工程及び宿主細胞における前記HM-crRNAを発現させて、HM-cRNAが、宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的にガイドして、標的配列を改変する工程を含み、これにより、宿主細胞が死滅するか、又は宿主細胞成長が、低減され、これにより、細菌の混合集団における前記亜集団の相対比を変更する、方法、ベクター又は複数の細胞。
51.各ベクターが、ウイルス又はファージであり、いずれかの先行する条項の方法、ベクター又は複数の細胞。
52.各標的配列が、隣接NNAGAAW又はNGGNGプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)である、いずれかの先行する条項の方法、ベクター又は複数の細胞。
53.第1及び第2の種の各々が、それぞれのファーミキューテス門種であり、第1の細菌の成長が、HM-システムにより阻害されない、いずれかの先行する条項の方法、ベクター又は複数の細胞。
54.第1及び第2の種の各々が、それぞれのグラム陽性種であり、第1の細菌の成長が、HM-システムにより阻害されない、いずれかの先行する条項の方法、ベクター又は複数の細胞。
55.ヒト又は動物対象の宿主細胞感染を処置するための、いずれかの先行する条項の方法、ベクター又は複数の細胞であって、宿主細胞を第1の抗生物質に曝露する工程を含み、標的配列が、各々、前記第1の抗生物質に対する抵抗性についての抗生物質抵抗性遺伝子により含まれ、宿主細胞感染が、対象において処置される、方法、ベクター又は複数の細胞。
56.ヒト又は動物対象における疾患又は状態を処置するための、又はリスクを低減するための、いずれかの先行する条項の方法、ベクター又は複数の細胞であって、疾患又は状態が、前記第2の細菌種により媒介され、第1の細菌種が、ヒトとプロバイオティック、共生又は相利共生であり(例えば、ヒト腸において)、第1の細菌種細胞が、前記標的配列を含まず、前記Casによる標的配列改変が、行われ、宿主細胞の成長が、前記対象において阻害されるが、第1の細菌種細胞の成長が、阻害されず、疾患又は状態が、処置されるか、又は前記対象における疾患又は状態の成長が、低減される、方法、ベクター又は複数の細胞。
57.産業用又は医療用流体、表面、装置若しくは容器を処理するため;又は河川、水、飲料、食料又は化粧品を処理するための、いずれかの先行する条項の方法、ベクター又は複数の細胞であって、前記宿主細胞が、流体、表面、装置、容器、河川、水、飲料、食料又は化粧品により含まれる、宿主細胞成長が阻害され、これにより、前記処置を行う、方法、ベクター又は複数の細胞。
58.各宿主細胞が、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、シュードモナス属、サルモネラ属、リステリア属、大腸菌、デスルホビブリオ属、ビブリオ属又はクロストリジウム属の細胞である、いずれかの先行する条項の方法、ベクター又は複数の細胞。
59.各標的配列が、抗生物質抵抗性遺伝子、病原性遺伝子又は宿主細胞の必須遺伝子により含まれる、いずれかの先行する条項の方法、ベクター又は複数の細胞。
60.前記増大が行われる、混合集団におけるバクテロイデスの比率を増大させるための、いずれかの先行する条項の方法、ベクター又は複数の細胞。
61.Bテタイオタオミクロン及び/又はBフラジリス(fragilis)の比率が、増大される、いずれかの先行する条項の方法、ベクター又は複数の細胞。
62.混合集団により含まれるバクテロイデス門対ファーミキューテス門若しくはグラム陽性宿主細胞の相対比が、増大される、いずれかの先行する条項の方法、ベクター又は複数の細胞。
63.ヒト又は動物における共生又は相利共生バクテロイデス門を好ましくするための、いずれかの先行する条項の方法、ベクター又は複数の細胞。
64.条項1の産物を含む細菌培養物を産生する工程、及び培養物をヒト又は動物に投与し、これにより、前記ヒト又は動物における共生又は相利共生バクテロイデス門を好ましくする工程を含む、いずれかの先行する条項の方法。
例えば、方法が、態様1の産物を含む細菌培養物を産生する工程、及び培養物をヒト又は動物に投与し、これにより、前記ヒト又は動物における共生又は相利共生バクテロイデス門を好ましくする工程を含む。
65.ヒト又は動物における腸バクテロイデス(例えば、Bテタイオタオミクロン)によるパネート細胞刺激のための、いずれかの先行する条項の方法、ベクター又は複数の細胞であって、第1の細菌種が、バクテロイデス種であり、方法が、前記ヒト又は動物における前記変更された比率を含む混合集団を産生する工程、及び前記変更された比率を含む前記混合集団をヒト又は動物に投与し、これにより、パネート細胞が刺激される工程を含む、方法、ベクター又は複数の細胞。
66.ヒト又は動物における腸バクテロイデス(例えば、Bフラジリス)に対する免疫応答を発生させるための、いずれかの先行する条項の方法、ベクター又は複数の細胞であって、第1の細菌種が、バクテロイデス種であり、方法が、前記ヒト又は動物において産生される前記変更された比率を含む混合集団を産生する工程、及び前記変更された比率を含む前記混合集団をヒト又は動物に投与し、これにより、前記免疫応答が発生する工程を含む、方法、ベクター又は複数の細胞。
本発明のさらなる構成は、以下を提供する。
宿主細菌又は古細菌細胞の標的ヌクレオチド配列を認識するようプログラムされるガイド型ヌクレアーゼであって、これにより、プログラムされたヌクレアーゼは、ヌクレオチド配列を改変する能力があり、任意選択で、ヌクレオチド配列が、宿主細胞におけるシグマ因子により媒介される遺伝子発現カスケードにより含まれる標的遺伝子により含まれる。
ヌクレアーゼは、宿主細胞における宿主改変(HM)-CRISPR/Casシステムの一部として作動可能であるCasヌクレアーゼであり、システムが、(i)〜(iv)に記載の構成要素を含み、
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも1つの核酸配列、
(ii)(a)HM-crRNAをコードするスペーサー配列及び1つ又は複数のリピート配列を含む遺伝子操作された核酸配列であって、スペーサーが、宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、前記Casヌクレアーゼを宿主細胞における標的にガイドして、標的配列を改変する配列を含み;又は(b)宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、前記Casヌクレアーゼを宿主細胞における標的にガイドして、標的配列を改変する配列を含むガイドRNA(例えば、シングルガイドRNA)をコードする遺伝子操作されたヌクレオチド配列、
(iii)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列、
(iv)構成要素(ii)が、宿主細胞を形質転換し、これにより、HM-crRNA又はガイドRNAが、Casを標的にガイドして、宿主細胞における宿主標的配列を改変する能力がある核酸ベクターにより含まれ、
標的配列が、Casヌクレアーゼにより改変され、これにより、宿主細胞が死滅するか、又は宿主細胞成長が低減される。
ヌクレアーゼは、Casヌクレアーゼであり、
(a)Casヌクレアーゼは、配列番号273又は275〜286のアミノ酸配列と少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号738又は274のヌクレオチド配列に少なくとも70%同一であるヌクレオチド配列によりコードされるか、又は配列番号273のアミノ酸配列を含むCasのオルソログ又は相同体であり、Casヌクレアーゼが、配列番号138〜209又は290〜513から選択されるリピート配列及びCCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含むか、又はからなるPAMとともに作動可能である;又は
(b)Casヌクレアーゼが、配列番号261又は263又は287〜289から選択されるアミノ酸配列に少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号262又は264のヌクレオチド配列と少なくとも70%同一であるヌクレオチド配列によりコードされるか、又は配列番号261又は263のアミノ酸配列を含むCasのオルソログ又は相同体であり、Casヌクレアーゼが、配列番号210〜213及び514〜731から選択されるリピート配列及びAWG、例えば、AAG、AGG、GAG又はATGを含むか、又はからなるPAMとともに作動可能である;又は
(c)Casヌクレアーゼが、配列番号265のアミノ酸配列に少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号266のヌクレオチド配列に少なくとも70%同一であるヌクレオチド配列によりコードされるか、又は配列番号265のアミノ酸配列を含むCasのオルソログ又は相同体であり、Casヌクレアーゼが、配列番号215〜218から選択されるリピート配列及びNNAGAAW、NGGNG又はAW、例えば、AA、AT若しくはAGを含むか、又はからなるPAMとともに作動可能である;又は
(d)Casヌクレアーゼが、配列番号267又は269のアミノ酸配列に少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号268又は270のヌクレオチド配列と少なくとも70%同一であるヌクレオチド配列によりコードされるか、又は配列番号267又は269のアミノ酸配列を含むCasのオルソログ又は相同体であり、Casヌクレアーゼが、リピート配列の配列番号214とともに作動可能である。
1.宿主細菌又は古細菌細胞の標的ヌクレオチド配列を認識するようプログラムされるガイド型ヌクレアーゼであって、これにより、プログラムされたヌクレアーゼは、ヌクレオチド配列を改変する能力があり、任意選択で、ヌクレオチド配列が、宿主細胞におけるシグマ因子により媒介される遺伝子発現カスケードにより含まれる標的遺伝子により含まれる。
一例では、ヌクレアーゼは、RNA(例えば、crRNA)により人工的にプログラムされる。
シグマ因子は、プロモーターの認識及び開口、並びにRNA合成における開始工程を含む、転写開始において重要な役割を果たす細菌RNAポリメラーゼ(RNAP)の複数のドメインサブユニットである。
2.ヌクレオチド配列が、転写が、宿主細胞種又は株におけるシグマ因子により直接的又は間接的に調節される遺伝子により含まれる、記載1のヌクレアーゼ。
3.ヌクレオチド配列が、宿主細胞種又は株におけるシグマ因子の転写を直接的又は間接的に調節する産物をコードする遺伝子により含まれる、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
4.ヌクレオチド配列が、前記カスケードのシグマ因子をコードする遺伝子により含まれる、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
5.標的遺伝子の転写が、
(a)σE;
(b)σF;
(c)σG;
(d)σH;
(e)σK;
(f)Spo0A;
(g)SpoIIID;
(h)SpoVT;又は
(i)SpoIIR
により宿主細胞種の細胞において調節される、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
6.シグマ因子が、σE;σF;σG;σH;又はσKである、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
7.シグマ因子が、Cディフィシル又はBスブチリスσE;σF;σG;σH;若しくはσK、その相同体又はオルソログである、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
実施形態において、相同体、オルソログ又は均等物は、選択された遺伝子と同じ機能を有するか、又は選択された遺伝子によりコードされる産物と同じ機能を有する産物をコードする。
8.シグマ因子が、配列番号223、225、227、239及び243から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80、85、90、95、96、97、98又は99%同一(若しくは100%同一)であるアミノ酸配列を含む、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
任意選択で、細胞は、Cディフィシル細胞である。
9.ヌクレオチド配列が、
(a)σE;
(b)σF;
(c)σG;
(d)σH;
(e)σK;
(f)Spo0A;
(g)SpoIIID;
(h)SpoVT;又は
(i)SpoIIR
をコードする遺伝子により含まれる、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
10.標的ヌクレオチド配列が、表12〜17及び23において列挙される遺伝子から選択される遺伝子、又はその相同体、オルソログ又は機能的な均等物により含まれる、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
任意選択で、宿主細胞は、Cディフィシルではない種のものである。
実施形態において、相同体、オルソログ又は均等物は、選択された遺伝子と同じ機能を有するか、又は選択された遺伝子によりコードされる産物と同じ機能を有する産物をコードする。
相同体:共通の祖先DNA又はタンパク質配列からの継承による、第2の遺伝子、ヌクレオチド又はタンパク質配列に関連する遺伝子、ヌクレオチド又はタンパク質配列。用語、相同体は、遺伝子複製現象により分けられる遺伝子間の関連又は遺伝子複製現象により分けられる遺伝子間の関係に適用し得る。
オルソログ:オルソログは、種分化により、共通の先祖遺伝子、ヌクレオチド又はタンパク質配列から進化した異なる種における遺伝子、ヌクレオチド又はタンパク質配列である。通常、オルソログは、進化の経過において同じ機能を保持する。
11.標的ヌクレオチド配列が、配列番号220、222、224、226、228、229、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、259及び260から選択される配列と少なくとも80、85、90、95、96、97、98又は99%同一(若しくは100%同一)であるヌクレオチド配列により含まれる、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
12.標的配列が、配列番号219、221、223、225、227、230、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255及び257から選択される配列と少なくとも80、85、90、95、96、97、98又は99%同一(若しくは100%同一)であるアミノ酸配列をコードする、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
13.標的配列が、spo0A、spoIIID、sigK、sigF、sigH、Spo0A-Pホスファターゼ、spoIIE、spoIIAA、spoIIAB、spoIIGA、sigE、spoIIR、sigG、SpoIIIA、spoIID、SpoIIQ、SpoIVB又はCtpB遺伝子により含まれる、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
14.宿主細胞が、Cディフィシル細胞であり、標的配列が、CディフィシルutxA、毒素A又はCディフィシル毒素B遺伝子により含まれる、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
15.宿主細胞が、Cディフィシル細胞であり、標的配列が、Cディフィシルcdu2、cdu1、tcdD、tcdB、tcdE、tcdA、tcdC、cdd1、cdd2、cdd3又はcdd4遺伝子により含まれるヌクレオチド配列により含まれる、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
16.標的配列が、ステージI、II、III、IV又はVの胞子形成遺伝子により含まれるか、又は胞子コートタンパク質をコードする、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
17.ヌクレアーゼが、さらなるプログラム化ヌクレアーゼと組み合わせた状態にあり、さらなるヌクレアーゼが、宿主細胞のさらなる標的ヌクレオチド配列を認識するようプログラムされ、これにより、さらなるプログラム化ヌクレアーゼが、さらなるヌクレオチド配列を改変する能力があり、任意選択で、さらなるヌクレオチド配列が、宿主細胞における前記シグマ因子により媒介される遺伝子発現カスケードにより含まれる標的遺伝子により含まれる、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
一例では、ヌクレアーゼは、同じタイプのヌクレアーゼ、例えば、Cas3又は9のコピーである。一例では、ヌクレアーゼは、宿主細胞にとって内因性である(例えば、内因性I型CディフィシルCasヌクレアーゼ)。
18.さらなる標的配列が、記載9〜16のいずれか1つにおいて列挙される遺伝子又は配列により含まれる、記載17のヌクレアーゼ。
19.その又は各ヌクレアーゼが、宿主細胞の内因性Casである、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
任意選択で、Casヌクレアーゼ、ベクター又はシステムは、宿主細胞により含まれる。
20.その又は各ヌクレアーゼが、宿主細胞に感染するか、又は形質転換する能力がある核酸ベクター(例えば、バクテリオファージ、ファスミド又は接合プラスミド)により含まれるCasである、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
21.その又は各ヌクレアーゼが、配列番号220、222、224、226、228、229、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、259及び260から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%同一(若しくは100%同一)であるヌクレオチド配列によりコードされるCasから選択されるCasである、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
22.その又は各ヌクレアーゼが、配列番号219、221、223、225、227、230、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255及び257から選択されるアミノ酸配列に少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%同一(若しくは100%同一)であるアミノ酸配列を含むCasから選択されるCasである、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
23.その又は各ヌクレアーゼが、配列番号138〜218から選択される(例えば、配列番号138〜209から選択される)リピート配列と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%同一(若しくは100%同一)であるリピート配列とともに作動可能であるCasであり、任意選択で、宿主細胞が、Cディフィシル細胞である、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
24.宿主細胞が、胞子形成する細菌種の細胞である、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
25.カスケードが、宿主細胞種において胞子形成を調節する、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
26.宿主細胞が、ファーミキューテス門、クロストリジウム目、クロストリジウム属、ペプトストレプトコッカス目、クロストリディオイデス目又はバチルス属の種、例えば、表18において列挙されるCディフィシル株のものである、いずれかの先行する記載(例えば、記載24又は25)のヌクレアーゼ。
実施形態において、株は、630、ATCC43255、CD3、R20291、CD69、CD002、CF5及びM120から選択される。一例では、株は、Cディフィシル630である。
27.前記改変が、宿主細胞により含まれる染色体又はエピソーム配列を切断する、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
染色体又はエピソーム配列が、標的配列を含む。
28.前記改変が、宿主細胞を死滅させるか、又は細胞の成長又は増殖を低減する、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
29.ヌクレアーゼが、インビトロのものである、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
30.ヌクレアーゼが、任意選択で、遺伝子操作されたcrRNA又はガイドRNA(例えば、シングルgRNA)を用いてプログラムされるCasヌクレアーゼ(例えば、Cas3若しくは9、又はcpf1)である、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
31.ヌクレアーゼが、ヌクレアーゼをコードする核酸ベクター(例えば、バクテリオファージ又はファスミド)及び任意選択で、ヌクレアーゼをプログラムするための、1つ又は複数のRNAと組み合わせた状態にある、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
32.ヌクレアーゼが、I型Cas3であり、前記ベクターが、1つ又は複数のCASCADE Cas(例えば、CasA、B、C、D及びE並びに/又はCas1若しくはCas2)をコードするか、又は前記ベクターが、前記CASCADE Casをコードする第2のベクターと組み合わせた状態にあり、前記Cas3が、標的配列を改変するための前記CASCADE Casとともに作動可能である、記載31のヌクレアーゼ。
33.ヌクレアーゼが、I型Cas3であり、宿主細胞において1つ又は複数のCASCADE Cas(例えば、CasA、B、C、D及びE並びに/又はCas1若しくはCas2)と組み合わせた状態にあり、CASCADE Casの1つ又は複数が、宿主細胞の内因性ヌクレオチド配列によりコードされ、前記Cas3が、標的配列を改変するための前記CASCADE Casとともに作動可能である、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
34.ヌクレアーゼが、I型Cas(例えば、I-B、-C又は-E型Cas、例えば、Cas3)である、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
任意選択で、ヌクレアーゼが、CASCADE Casである。
35.Casヌクレアーゼ(及び任意選択で、CASCADE Cas)が、大腸菌、Cディフィシル、サルモネラ エンテリカ又はSサーモフィルスのCas3である、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
36.ヌクレアーゼが、宿主細胞における宿主改変(HM)-CRISPR/Casシステムの一部として作動可能であるCasヌクレアーゼであり、システムが、(i)〜(iv)に記載の構成要素を含み、
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも1つの核酸配列、
(ii)(a)HM-crRNAをコードするスペーサー配列及び1つ又は複数のリピート配列を含む遺伝子操作された核酸配列であって、スペーサーが、宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、前記Casヌクレアーゼを宿主細胞における標的にガイドして、標的配列を改変する配列を含み;又は(b)宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、前記Casヌクレアーゼを宿主細胞における標的にガイドして、標的配列を改変する配列を含むガイドRNA(例えば、シングルガイドRNA)をコードする遺伝子操作されたヌクレオチド配列、
(iii)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列、
(iv)構成要素(ii)が、宿主細胞を形質転換し、これにより、HM-crRNA又はガイドRNAが、Casを標的にガイドして、宿主細胞における宿主標的配列を改変する能力がある核酸ベクターにより含まれ、
標的配列が、Casヌクレアーゼにより改変され、これにより、宿主細胞が死滅するか、又は宿主細胞成長が低減される、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
或いは、Casヌクレアーゼは、宿主細胞における標的配列の転写又はそれからの転写を表すためのdCasである。
任意選択で、方法は、(iv)のベクターを宿主細胞に導入する工程及び宿主細胞における前記HM-crRNAを発現させて、HM-cRNAが、宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的にガイドして、標的配列を改変する工程を含み、これにより、宿主細胞が死滅するか、又は宿主細胞成長が、低減され、これにより、細菌の混合集団における前記亜集団の相対比を変更する。
37.(iv)の前記ベクターとの組合せにおける、記載36のヌクレアーゼ。
38.成分(i)が、(iv)のベクターにより、又は異なるベクターにより含まれる、記載37のヌクレアーゼ。
39.ヌクレアーゼが、宿主細胞の内因性核酸配列によりコードされる、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
この例において、宿主細胞は、内因性ヌクレアーゼ活性を含む。
40.記載36〜39のいずれか1つにおいて定義される、宿主改変システム。
41.ヌクレアーゼが、Casヌクレアーゼであり、宿主が、前記Casヌクレアーゼ又はその相同体若しくはオルソログをコードする内因性ヌクレオチド配列を含み、前記Casヌクレアーゼが、宿主細胞において作動可能である、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ又はシステム。
42.ヌクレアーゼが、Casヌクレアーゼであり、
(a)Casヌクレアーゼが、配列番号273のアミノ酸配列と少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号738又は274のヌクレオチド配列と少なくとも70%同一であるヌクレオチド配列によりコードされるか、又は配列番号273のアミノ酸配列を含むCasのオルソログ又は相同体であり、Casヌクレアーゼが、配列番号138〜209から選択されるリピート配列及びCCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含むか、又はからなるPAMとともに作動可能である;又は
(b)Casヌクレアーゼが、配列番号261又は263のアミノ酸配列と少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号262又は264のヌクレオチド配列と少なくとも70%同一であるヌクレオチド配列によりコードされるか、又は配列番号261又は263のアミノ酸配列を含むCasのオルソログ又は相同体であり、Casヌクレアーゼが、配列番号210〜213から選択されるリピート配列及びAWG、例えば、AAG、AGG、GAG又はATGを含むか、又はからなるPAMとともに作動可能である;又は
(c)Casヌクレアーゼが、配列番号265のアミノ酸配列に少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号266のヌクレオチド配列に少なくとも70%同一であるヌクレオチド配列によりコードされるか、又は配列番号265のアミノ酸配列を含むCasのオルソログ又は相同体であり、Casヌクレアーゼが、配列番号215〜218から選択されるリピート配列及びNNAGAAW、NGGNG又はAW、例えば、AA、AT若しくはAGを含むか、又はからなるPAMとともに作動可能である;又は
(d)Casヌクレアーゼが、配列番号267又は269のアミノ酸配列に少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号268又は270のヌクレオチド配列と少なくとも70%同一であるヌクレオチド配列によりコードされるか、又は配列番号267又は269のアミノ酸配列を含むCasのオルソログ又は相同体であり、Casヌクレアーゼが、リピート配列の配列番号214とともに作動可能である
いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ又はシステム。
43.ヌクレアーゼが、Casヌクレアーゼであり、Casが、
(a)配列番号を含むリピート及びCCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含むか、又はからなるPAM;
(b)配列番号を含むリピート及びAWG、例えば、AAG、AGG、GAG又はATGを含むか、又はからなるPAM;又は
(c)配列番号を含むリピート及びNNAGAAW、NGGNG又はAW、例えば、AA、AT又はAGを含むか、又はからなるPAM
とともに作動可能である、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ又はシステム。
本明細書におけるヌクレオチド配列は、5'から3'方向で書かれる。
任意選択で、システムは、抑制されたCasを含み、
(a)Casが、配列番号58、60、66及び68から選択されるアミノ酸配列、又は選択された配列と少なくとも80%同一であるか、又は配列番号49〜52から選択される配列及びAWG、例えば、AAG、AGG、GAG又はATGを含むか、又はからなるPAMを含むリピートとともに作動可能であるそのオルソログ又は相同体であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、宿主細胞が、大腸菌細胞である;又は
(b)Casが、配列番号56、64、70及び72から選択されるアミノ酸配列、又は選択された配列と少なくとも80%同一であるか、又は配列番号53を含むリピートとともに作動可能であるそのオルソログ又は相同体であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、宿主細胞が、Sエンテリカである;又は
(c)Casが、配列番号62から選択されるアミノ酸配列、又は選択された配列と少なくとも80%同一であるか、又はNNAGAAW、NGGNG又はAW、例えば、AA、AT又はAG含むか、又はからなるPAMとともに作動可能でありオルソログ又は相同体であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、宿主細胞が、Sサーモフィラスの細胞である。
任意選択で、システムは、抑制されたCasを含み、Casは、
(a)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌細胞である、配列番号49〜52から選択される配列及びAWG、例えば、AAG、AGG、GAG又はATGを含むか、又はからなるPAMを含むリピート;
(b)宿主細胞が、Sエンテリカである、配列番号53を含むリピート;又は
(c)任意選択で、宿主細胞が、Sサーモフィラスの細胞である、NNAGAAW、NGGNG又はAW、例えば、AA、AT又はAGを含むか、又はからなるPAM、
とともに作動可能である。
任意選択で、システムは、抑制されたCasを含み、Casは、
(a)任意選択で、Casヌクレアーゼが、配列番号58、60、66及び68から選択されるアミノ酸配列、又は選択された配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、宿主細胞が、大腸菌細胞である、AWG、例えば、AAG、AGG、GAG又はATGを含むか、又はからなるPAM;又は
(b)任意選択で、Casヌクレアーゼが、配列番号62から選択されるアミノ酸配列、又は選択された配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、宿主細胞が、Sサーモフィラスの細胞である、NNAGAAW、NGGNG又はAW、例えば、AA、AT又はAGを含むか、又はからなるPAM
とともに作動可能である。
任意選択で、プロトスペーサーは、宿主細胞のゲノムにおける前記PAMのすぐ3'にある少なくとも5、6、7、8、9又は10個の隣接するヌクレオチドの配列を含む。
任意選択で、プロトスペーサーは、宿主細胞のゲノムにおける前記PAMのすぐ5'にある少なくとも5、6、7、8、9又は10個の隣接するヌクレオチドの配列を含む。
44.ヌクレアーゼが、Casヌクレアーゼであり、Casが、
(a)CCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含むか、又はからなるPAM、任意選択で、Casヌクレアーゼが、I-B型Casであり、及び/又は配列番号273のアミノ酸配列を含むか、又はそのオルソログ又は相同体である;
(b)AWG、例えば、AAG、AGG、GAG又はATGを含むか、又はからなるPAM、任意選択で、Casヌクレアーゼが、配列番号261又は263のアミノ酸配列を含むか、又はそのオルソログ又は相同体である;
(c)NNAGAAW、NGGNG又はAW、例えば、AA、AT又はAGを含むか、又はからなるPAM、任意選択で、Casヌクレアーゼが、I-B型Casであり、及び/又は配列番号266のアミノ酸配列を含むか、又はそのオルソログ又は相同体である
とともに作動可能である、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ又はシステム。
45.
(a)記載42(a)、43(a)又は44(a)、宿主細胞が、Cディフィシルの細胞であり、任意選択で、細胞が、配列番号138〜209から選択されるリピート配列及び各標的配列の5'のCCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含むか、又はからなるPAMを含む;
(b)記載42(b)、43(b)又は44(b)、宿主細胞が、大腸菌細胞である;
(c)記載42(c)、43(c)又は44(c)、宿主細胞が、Sサーモフィルスの細胞である;又は
(d)記載42(d)、宿主細胞が、Sエンテリカの細胞である
に記載のヌクレアーゼ又はシステム。
任意選択で、Casは、I-B型Casであるか、又はシステムは、I-B型システムである。
46.標的ヌクレオチド配列が、前記PAMのすぐ3'にある少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65又は70個の隣接するヌクレオチドの配列を含み、前記PAMが、宿主細胞の染色体又はエピソームにより含まれるか、又は配列番号220、222、224、226、228、229、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、259及び260から選択される配列により含まれる、記載42〜45のいずれか1つに記載のヌクレアーゼ又はシステム。
本明細書において開示される任意のヌクレオチド配列に関して、本発明はまた、本明細書において開示されるPAMのすぐ3'又は5'にある隣接する5、10、15、20、30、40又は50個のヌクレオチドを含むか、又はからなる標的ヌクレオチド配列を提供し、PAMが、参照配列により含まれる。全てのこのような標的配列は、あたかも本明細書において別々に記載されるかのように、本説明において含まれるか、又は本明細書において開示される参照配列の隣接のヌクレオチド配列の全て又は一部により含まれる。
47.ヌクレアーゼが、Casヌクレアーゼであり、
(A)
(a)宿主細胞が、任意選択で、Cディフィシル細胞であり;
(b)Casが、記載42(a)、43(a)又は44(a)において列挙される通りであり;
(c)Casが、記載42(a)又は43(a)において列挙されるリピートとともに作動可能であり;
(d)標的ヌクレオチド配列が、記載42(a)、43(a)又は44(a)において列挙されるPAMのすぐ3'にある少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65又は70個の隣接するヌクレオチドの配列を含む;又は
(B)
(e)宿主細胞が、任意選択で、大腸菌細胞であり;
(f)Casが、記載42(b)、43(b)又は44(b)において列挙される通りであり;
(g)Casが、記載42(b)又は43(b)において列挙されるリピートとともに作動可能であり;
(h)標的ヌクレオチド配列が、記載42(b)、43(b)又は44(b)において列挙されるPAMのすぐ3'にある少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65又は70個の隣接するヌクレオチドの配列を含む;又は
(C)
(i)宿主細胞が、任意選択で、Sサーモフィルスの細胞であり;
(j)Casが、記載42(c)、43(c)又は44(c)において列挙される通りであり;
(k)Casが、記載42(c)又は43(c)において列挙されるリピートとともに作動可能であり;
(l)標的ヌクレオチド配列が、記載42(c)、43(c)又は44(c)において列挙されるPAMのすぐ3'にある少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65又は70個の隣接するヌクレオチドの配列を含む
いずれかの先行する記載に記載のヌクレアーゼ又はシステム。
48.ヌクレアーゼが、TALEN、メガヌクレアーゼ又はジンクフィンガーヌクレアーゼである、いずれかの先行する記載1〜29及び31に記載のヌクレアーゼ又はシステム。
49.記載40〜47のいずれか1つに記載のシステムにおける使用のための、遺伝子操作されたヌクレオチド配列を含むベクター、核酸又はHM-CRISPRアレイ、遺伝子操作されたヌクレオチド配列が、記載36(ii)において定義される通りであり、及び/又はいずれかの先行する記載に記載のヌクレアーゼをコードするベクター、核酸又はHM-CRISPRアレイ。
50.ベクターが、バクテリオファージ、ファスミド又はプラスミド(例えば、接合プラスミド)である、記載49のベクター。
51.ヒト又は動物対象における疾患又は状態を処置又は予防するための医薬であって、疾患又は状態を処置又は予防するために対象に投与するための、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ、システム、ベクター、核酸又はアレイを含む、医薬。
52.対象のCディフィシル感染を処置するための、記載51の医薬であって、宿主細胞が、Cディフィシル宿主細胞、例えば、表18における株から選択される株である、医薬。
53.細胞の標的配列を認識及び改変するようにヌクレアーゼをガイドするために、宿主細菌又は古細菌細胞において記載1〜39及び41〜48のいずれか1つのヌクレアーゼと組み合わせることが可能である核酸配列(例えば、RNA、crRNA又はシングルgRNA配列)をコードする又は含む核酸分子。
54.ヌクレアーゼが、Casであり、核酸が、RNA、crRNA又はシングルgRNAをコードするか、又はそれであり、任意選択で含み、RNA、crRNA又はシングルRNAが、配列番号138〜218から選択される(例えば、配列番号138〜209から選択される)リピート配列と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%同一(若しくは100%同一)である1つ又は2つのリピート配列各々を含み、任意選択で、宿主細胞が、Cディフィシルの細胞である、記載34の核酸。
55.記載53又は54において列挙される核酸又は核酸配列を含む、核酸ベクター(例えば、バクテリオファージ、ウイルス、ファスミド、プラスミド又は接合プラスミド)。
56.ヒト又は動物対象における疾患又は状態を処置又は予防するための、記載53〜55のいずれか1つに記載の核酸又はベクター。
57.混合細菌又は古細菌の集団により含まれる複数の宿主細胞を改変する方法であって、集団が、(i)第1の種又は株の細菌又は古細菌細胞の第1の亜集団、及び(ii)前記複数の宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の細胞が、前記混合集団の第1の細胞ではない、宿主細胞を改変する能力を有する標的配列及びヌクレアーゼを含まず、方法が、混合集団を、記載1〜39及び41〜56のいずれか1つのヌクレアーゼ、ベクター、核酸、アレイ又は医薬と組み合わせ、これにより、記載40〜48のいずれか1つのシステムを形成する工程を含み、これにより、ヌクレアーゼが、宿主細胞により含まれる標的配列を改変し、これにより、宿主細胞を改変するか、又は死滅させる、方法。
一例では、本発明は、混合集団を含むヒト又は非ヒト動物(antimal)における疾患又は状態を処置又は予防するためであり、疾患又は状態は、前記宿主細胞種又は株の細菌により媒介されるか、又は引き起こされる。
58.宿主細胞が、記載42〜45のいずれか1つにおいて定義されるPAMを含み、標的ヌクレオチド配列が、前記PAMのすぐ3'にある少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65又は70個の隣接するヌクレオチドの配列を含み、前記PAMが、宿主細胞の染色体又はエピソームにより含まれ、標的配列が、配列番号220、222、224、226、228、229、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、259及び260から選択される配列により含まれる、記載57の方法。
59.産業又はエクスビボ医療用流体、表面、装置若しくは容器を処理するため;又は河川、水、飲料、食料又は化粧品を処理するための、記載57又は58の方法であって、宿主細胞が、流体、表面、装置、容器、河川、水、飲料、食料又は化粧品により含まれるか、又はそれ上にある、方法。
任意選択で、細胞は、表25の種から選択される種の細胞から選択される。
1.混合細菌集団を含む、ヒト又は非ヒト動物対象においてクロストリジウム属感染を処置する方法であって、集団は、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)クロストリジウム属種の複数の宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種は、前記クロストリジウム属種とは異なり、
各宿主細胞は、
(a)CCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含む又はからなるPAMと、
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列と、
(c)宿主細胞においてCas3ヌクレアーゼとともに作動可能なCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列と、
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列と
を含み、
第1の細胞は、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列の複数のコピーを含む医薬組成物を投与する工程と、
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、それぞれの宿主細胞においてCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記それぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(g)配列番号138〜209から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列と、
(h)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において前記宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である、スペーサー配列と
を含む核酸配列を含み、
システムは、任意選択で、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
発現されたHM-crRNAは、配列番号273のアミノ酸配列を含む、又は配列番号738若しくは274のヌクレオチド配列によってコードされるCASCADE Cas及びCas3又はそのオルソログ若しくは相同体と組み合わされ、Cas3は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞は死滅されるか、又は宿主細胞集団成長が低減され、それによって、対象における前記宿主細胞集団の割合を低減し、クロストリジウム属感染を処置する、方法。
2.標的ヌクレオチド配列が、配列番号220、222、224、226、228、229、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、259及び260から選択される配列により含まれる、段落1の方法。
3.標的ヌクレオチド配列が、宿主細胞におけるシグマ因子により媒介される遺伝子発現カスケードにより含まれる遺伝子により含まれる、段落1又は2の方法。
4.標的ヌクレオチド配列が、その転写が宿主細胞種においてシグマ因子により直接的又は間接的に調節される遺伝子により含まれる、いずれかの先行する段落の方法。
5.標的遺伝子の転写が、
(a)σE;
(b)σF;
(c)σG;
(d)σH;
(e)σK;
(f)Spo0A;
(g)SpoIIID;
(h)SpoVT;又は
(i)SpoIIR
により、宿主細胞の細胞において調節される、いずれかの先行する段落の方法。
6.標的ヌクレオチド配列が、宿主細胞種においてシグマ因子の転写を直接的又は間接的に調節する産物をコードする遺伝子により含まれる、いずれかの先行する段落の方法。
7.シグマ因子が、σE;σF;σG;σH;又はσKである、段落3〜6のいずれか1つの方法。
8.シグマ因子が、配列番号223、225、227、239及び243から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む、段落3〜7のいずれか1つの方法。
9.標的ヌクレオチド配列が、表12〜17及び23において列挙される遺伝子から選択される遺伝子、又はその相同体、オルソログ又は機能的な均等物により含まれる、いずれかの先行する段落の方法。
10.標的配列が、ステージI、II、III、IV又はVの胞子形成遺伝子により含まれるか、又は胞子コートタンパク質をコードする、いずれかの先行する段落の方法。
11.PAM及び標的配列が、宿主細胞の染色体配列である、いずれかの先行する段落の方法。
12.PAM及び標的配列が、宿主細胞のエピソーム配列である、段落1〜10のいずれか1つの方法。
13.Cas3及び/又はCASCADE Casが、宿主細胞の内因性Casである、いずれかの先行する段落の方法。
14.工程(e)が、対象に前記Cas3及び/又はCASCADE Casをコードする核酸を投与する工程を含む、いずれかの先行する段落の方法。
15.工程(e)が、対象に、前記遺伝子操作された配列を含む複数の核酸ベクターを投与する工程を含み、ベクターが、ウイルス、バクテリオファージ、ファスミド又はプラスミド(例えば、接合プラスミド)である、いずれかの先行する段落の方法。
16.工程(e)が、対象に前記遺伝子操作された配列を含む複数の担体細菌細胞を投与する工程を含み、任意選択で、担体細菌細胞が、ラクトバチルス属細胞である、いずれかの先行する段落の方法。
17.担体細胞が、Lロイテリ細胞である、段落16の方法。
18.ヒト又は非ヒト動物対象における大腸菌感染を処置する方法であって、対象が、混合細菌集団を含み、集団が、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)複数の大腸菌宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種が、大腸菌でなく、
各宿主細胞が、
(a)AWG、例えば、AAG、AGG、GAG又はATGを含むか、又はからなるPAM;
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列;
(c)宿主細胞におけるCas3ヌクレアーゼと作動可能なCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列;
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列
を含み;
第1の細胞が、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする複数のコピーの遺伝子操作された核酸配列を含む医薬組成物を投与する工程;及び
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程
を含み;
各HM-crRNAが、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によりコードされ、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記それぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasが、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列が、
(g)配列番号210〜213から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(h)前記宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力がある前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列
を含む核酸配列を含み;
システムが、任意選択で、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み;
発現されたHM-crRNAが、配列番号261又は263のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号262又は264のヌクレオチド配列又はそのオルソログ若しくは相同体によりコードされる、CASCADE Cas及びCas3と組み合わされ、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が死滅されるか、又は宿主細胞集団成長が低減され、これにより、対象における前記宿主細胞集団の比率が低減されるか、又は大腸菌感染が処置される、方法。
19.Cas3及び/又はCASCADE Casが、宿主細胞の内因性Casである、段落18の方法。
20.工程(e)が、対象に前記Cas3及び/又はCASCADE Casをコードする核酸を投与する工程を含む、段落18又は19の方法。
21.標的ヌクレオチド配列が、宿主細胞におけるシグマ因子により媒介される遺伝子発現カスケードにより含まれる遺伝子により含まれる、段落18、19又は20の方法。
22.標的ヌクレオチド配列が、その転写が宿主細胞種においてシグマ因子により直接的又は間接的に調節される遺伝子により含まれる、段落18〜21のいずれか1つの方法。
23.標的ヌクレオチド配列が、宿主細胞種においてシグマ因子の転写を直接的又は間接的に調節する産物をコードする遺伝子により含まれる、段落18〜23のいずれか1つの方法。
24.シグマ因子が、σE;σF;σG;σH;又はσKである、段落18〜23のいずれか1つの方法。
25.標的ヌクレオチド配列が、表12〜17及び23において列挙される遺伝子から選択される遺伝子、又はその相同体、オルソログ又は機能的な均等物により含まれる、段落18〜24のいずれか1つの方法。
26.PAM及び標的配列が、宿主細胞の染色体配列である、段落18〜25のいずれか1つの方法。
27.PAM及び標的配列が、宿主細胞のエピソーム配列である、段落18〜25のいずれか1つの方法。
28.工程(e)が、対象に、前記遺伝子操作された配列を含む複数の核酸ベクターを投与する工程を含み、ベクターが、ウイルス、バクテリオファージ、ファスミド又はプラスミド(例えば、接合プラスミド)である、段落18〜27のいずれか1つの方法。
29.工程(e)が、対象に前記遺伝子操作された配列を含む複数の担体細菌細胞を投与する工程を含み、任意選択で、担体細菌細胞が、ラクトバチルス属細胞である、段落18〜28のいずれか1つの方法。
30.担体細胞が、Lロイテリ細胞である、段落29の方法。
31.ヒト又は非ヒト動物対象におけるストレプトコッカス属感染を処置する方法であって、対象が、混合細菌集団を含み、集団が、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)複数のストレプトコッカス属種の宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種は、前記ストレプトコッカス属種と異なり、
各宿主細胞が、
(a)NNAGAAW、NGGNG又はAW、例えば、AA、AT若しくはAGを含む又はからなるPAM;
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列;
(c)宿主細胞におけるCas3ヌクレアーゼと作動可能なCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列;
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列;
を含み、
第1の細胞が、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする複数のコピーの遺伝子操作された核酸配列を含む医薬組成物を投与する工程;及び
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程
を含み、
各HM-crRNAが、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、それぞれの宿主細胞において発現されたCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記それぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasが、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列が、
(g)配列番号215〜218から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び、
(h)前記宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力がある前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列
を含む核酸配列を含み;
システムが、任意選択で、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み;
発現されたHM-crRNAは、配列番号265のアミノ酸配列を含む、又は配列番号266のヌクレオチド配列によってコードされる、CASCADE Cas及びCas3又はそのオルソログ若しくは相同体と組み合わされ、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が死滅されるか、又は宿主細胞集団成長が低減され、これにより、対象における前記宿主細胞の比率が低減されるか、又はストレプトコッカス属感染が処置される、方法。
32.Cas3及び/又はCASCADE Casが、宿主細胞の内因性Casである、段落31の方法。
33.工程(e)が、対象に前記Cas3及び/又はCASCADE Casをコードする核酸を投与する工程を含む、段落31又は32の方法。
34.標的ヌクレオチド配列が、宿主細胞におけるシグマ因子により媒介される遺伝子発現カスケードにより含まれる遺伝子により含まれる、段落31、32又は33の方法。
35.標的ヌクレオチド配列が、その転写が宿主細胞種においてシグマ因子により直接的又は間接的に調節される遺伝子により含まれる、段落31〜34のいずれか1つの方法。
36.標的ヌクレオチド配列が、宿主細胞種においてシグマ因子の転写を直接的又は間接的に調節する産物をコードする遺伝子により含まれる、段落31〜35のいずれか1つの方法。
37.シグマ因子が、σE;σF;σG;σH;又はσKである、段落35又は36の方法。
38.標的ヌクレオチド配列が、表12〜17及び23において列挙される遺伝子から選択される遺伝子、又はその相同体、オルソログ又は機能的な均等物により含まれる、段落31〜37のいずれか1つの方法。
39.PAM及び標的配列が、宿主細胞の染色体配列である、段落31〜38のいずれか1つの方法。
40.PAM及び標的配列が、宿主細胞のエピソーム配列である、段落31〜38のいずれか1つの方法。
41.工程(e)が、対象に、前記遺伝子操作された配列を含む複数の核酸ベクターを投与する工程を含み、ベクターが、ウイルス、バクテリオファージ、ファスミド又はプラスミド(例えば、接合プラスミド)である、段落31〜40のいずれか1つの方法。
42.工程(e)が、対象に前記遺伝子操作された配列を含む複数の担体細菌細胞を投与する工程を含み、任意選択で、担体細菌細胞が、ラクトバチルス属細胞である、段落31〜41のいずれか1つの方法。
43.担体細胞が、Lロイテリ細胞である、段落42の方法。
44.ヒト又は非ヒト動物対象におけるサルモネラ属感染を処置する方法であって、対象が、混合細菌集団を含み、集団が、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)複数のサルモネラ属種の宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種が、前記サルモネラ属種は異なり、
各宿主細胞が、
(a)PAM;
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列;
(c)宿主細胞においてCas3ヌクレアーゼとともに作動可能なCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列;
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列;
を含み、
第1の細胞は、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする複数のコピーの遺伝子操作された核酸配列を含む医薬組成物を投与する工程;及び
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み;
各HM-crRNAが、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記それぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列が、
(g)配列番号214である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(h)前記宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力がある前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列
を含む核酸配列を含み;
システムが、任意選択で、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み;
発現されたHM-crRNAは、配列番号267若しくは269のアミノ酸配列を含む、又は配列番号268若しくは270のヌクレオチド配列によってコードされるCASCADE Cas及びCas3又はそのオルソログ若しくは相同体と組み合わされ、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が死滅されるか、又は宿主細胞集団成長が低減され、これにより、対象における前記宿主細胞の比率が低減されるか、又はサルモネラ属感染が処置される、方法。
45.Cas3及び/又はCASCADE Casが、宿主細胞の内因性Casである、段落44の方法。
46.工程(e)が、対象に前記Cas3及び/又はCASCADE Casをコードする核酸を投与する工程を含む、段落44又は45の方法。
47.標的ヌクレオチド配列が、宿主細胞におけるシグマ因子により媒介される遺伝子発現カスケードにより含まれる遺伝子により含まれる、段落44、45又は46の方法。
48.標的ヌクレオチド配列が、その転写が宿主細胞種においてシグマ因子により直接的又は間接的に調節される遺伝子により含まれる、段落44〜47のいずれか1つの方法。
49.標的ヌクレオチド配列が、宿主細胞種においてシグマ因子の転写を直接的又は間接的に調節する産物をコードする遺伝子により含まれる、段落44〜48のいずれか1つの方法。
50.シグマ因子が、σE;σF;σG;σH;又はσKである、段落48又は49の方法。
51.標的ヌクレオチド配列が、表12〜17及び23において列挙される遺伝子から選択される遺伝子、又はその相同体、オルソログ又は機能的な均等物により含まれる、段落44〜50のいずれか1つの方法。
52.PAM及び標的配列が、宿主細胞の染色体配列である、段落44〜51のいずれか1つの方法。
53.PAM及び標的配列が、宿主細胞のエピソーム配列である、段落44〜51のいずれか1つの方法。
54.工程(e)が、対象に、前記遺伝子操作された配列を含む複数の核酸ベクターを投与する工程を含み、ベクターが、ウイルス、バクテリオファージ、ファスミド又はプラスミド(例えば、接合プラスミド)である、段落44〜53のいずれか1つの方法。
55.工程(e)が、対象に前記遺伝子操作された配列を含む複数の担体細菌細胞を投与する工程を含み、任意選択で、担体細菌細胞が、ラクトバチルス属細胞である、段落44〜54のいずれか1つの方法。
56.担体細胞が、Lロイテリ細胞である、段落55の方法。
57.宿主細胞を死滅させるため、又は宿主細胞の成長を低減するための、HM-CRISPR/Casシステムであって、宿主細胞が、クロストリジウム属細胞(例えば、段落1〜17のいずれか1つにおいて定義される)であり、
(a)宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)配列番号138〜209から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列が、宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力があり、標的配列が、CCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含むか、又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列
を含み;
(b)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列;
(c)CASCADE Cas;及び
(d)宿主細胞におけるCas3を発現するための、配列番号273のアミノ酸配列、又は配列番号738又は274を含むヌクレオチド配列を含むCas3、又はそのオルソログ又は相同体
を含み;
発現されたHM-crRNAが、宿主細胞におけるCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ又は相同体と組み合わせる能力があり、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が、死滅され得るか、又は宿主細胞集団成長が低減され得る
システム。
58.段落57のシステムにおける使用のための遺伝子操作されたヌクレオチド配列であって、遺伝子操作された配列が、宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードし、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、Cas3が、配列番号273のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号738又は274を含むヌクレオチド配列によりコードされ、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)配列番号138〜209から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列が、宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力があり、標的配列が、CCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含むか、又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列
を含む、ヌクレオチド配列。
任意選択で、本明細書における遺伝子操作されたヌクレオチド配列は、DNA配列である。任意選択で、本明細書における遺伝子操作されたヌクレオチド配列は、RNA配列である。
59.宿主細胞を死滅させるため、又は宿主細胞の成長を低減するための、HM-CRISPR/Casシステムであって、宿主細胞が、大腸菌細胞(例えば、段落18〜30のいずれか1つにおいて定義される)であり、
(a)宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)配列番号210〜213から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列が、宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力があり、標的配列が、AWG、例えば、AAG、AGG、GAG又はATGを含むか、又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列
を含み;
(b)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列;
(c)CASCADE Cas;及び
(d)宿主細胞におけるCas3を発現するための、配列番号261又は263のアミノ酸配列、又は配列番号262又は264を含むヌクレオチド配列を含むCas3、又はそのオルソログ又は相同体
を含み;
発現されたHM-crRNAが、宿主細胞におけるCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ又は相同体と組み合わせる能力があり、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が、死滅され得るか、又は宿主細胞集団成長が低減され得る
システム。
60.段落59のシステムにおける使用のための遺伝子操作されたヌクレオチド配列であって、遺伝子操作された配列が、宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードし、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、Cas3が、配列番号261又は263のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号262又は264を含むヌクレオチド配列によりコードされ、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)配列番号210〜213から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列が、宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力があり、標的配列が、AWG、例えば、AAG、AGG、GAG又はATGを含むか、又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列
を含む、ヌクレオチド配列。
61.宿主細胞を死滅させるため、又は宿主細胞の成長を低減するための、HM-CRISPR/Casシステムであって、宿主細胞が、ストレプトコッカス属細胞(例えば、段落31〜43のいずれか1つにおいて定義される)であり、
(a)宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)配列番号215〜218から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列が、宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力があり、標的配列が、NNAGAAW、NGGNG又はAW、例えば、AA、AT若しくはAGを含むか、又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列
を含み;
(b)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列;
(c)CASCADE Cas;及び
(d)宿主細胞におけるCas3を発現するための、配列番号265のアミノ酸配列、又は配列番号266を含むヌクレオチド配列を含むCas3、又はそのオルソログ又は相同体
を含み;
発現されたHM-crRNAが、宿主細胞におけるCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ又は相同体と組み合わせる能力があり、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が、死滅され得るか、又は宿主細胞集団成長が低減され得る
システム。
62.段落61のシステムにおける使用のための遺伝子操作されたヌクレオチド配列であって、遺伝子操作された配列が、宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードし、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、Cas3が、配列番号265のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号266を含むヌクレオチド配列によりコードされ、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)配列番号215〜218から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列が、宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力があり、標的配列が、NNAGAAW、NGGNG又はAW、例えば、AA、AT若しくはAGを含むか、又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列
を含む、ヌクレオチド配列。
63.宿主細胞を死滅させるため、又は宿主細胞の成長を低減させるための、HM-CRISPR/Casシステムであって、宿主細胞が、サルモネラ細胞(例えば、段落44〜56のいずれか1つにおいて定義される)であり、
(a)宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列が、
(iii)配列番号214である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(iV)宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力がある前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列
(b)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列;
(c)CASCADE Cas;及び
(d)宿主細胞においてCas3を発現するための、配列番号267又は269のアミノ酸配列、又は配列番号268又は270を含むヌクレオチド配列を含むCas3、又はそのオルソログ又は相同体
を含み;
発現されたHM-crRNAが、宿主細胞におけるCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ又は相同体と組み合わせる能力があり、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が、死滅され得るか、又は宿主細胞集団成長が低減され得る
システム。
64.段落63のシステムにおける使用のための遺伝子操作されたヌクレオチド配列であって、遺伝子操作された配列が、宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードし、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、Cas3が、配列番号267又は269のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号268又は270を含むヌクレオチド配列によりコードされ、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)配列番号214である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(ii)宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力がある前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列
を含む、遺伝子操作されたヌクレオチド配列。
65.各crRNAが、シングルガイドRNA(シングルgRNA)により含まれ、シングルgRNAが、tracrRNA配列を含む、段落57〜64のいずれか1つのシステム又は遺伝子操作された配列。
66.遺伝子操作された配列が、核酸ベクター、例えば、ウイルス、ファージ、ファスミド、プラスミド又は接合プラスミドにより含まれる、段落57〜65のいずれか1つのシステム又は遺伝子操作された配列。
67.遺伝子操作された配列のコピーが、複数の担体細菌により含まれ、任意選択で、担体細菌細胞が、ラクトバチルス属の細胞である、段落57〜66のいずれか1つのシステム又は遺伝子操作された配列。
68.担体細胞が、Lロイテリ細胞である、段落67のシステム又は遺伝子操作された配列。
69.対象における前記宿主細胞の感染を処置又は予防するため、ヒト又は動物対象に投与するための、段落67又は68において定義される複数の担体細菌細胞であって、発現されたHM-crRNAが、宿主細胞におけるCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ又は相同体と組み合わせる能力があり、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が、死滅され得るか、又は宿主細胞集団成長が、低減され得、これにより、対象における前記宿主細胞の比率を低減し、対象における宿主細胞感染を処置する、担体細菌細胞。
70.ヒト又は動物対象において前記宿主細胞の感染を処置又は予防するための、段落57〜68のいずれか1つのシステム又は遺伝子操作された配列であって、発現されたHM-crRNAが、宿主細胞におけるCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ又は相同体と組み合わせる能力があり、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が、死滅され得るか、又は宿主細胞集団成長が、低減され得、これにより、対象における前記宿主細胞の比率を低減し、対象における宿主細胞感染を処置する、システム又は遺伝子操作された配列。
71.段落57〜70のいずれか1つの遺伝子操作された配列又は複数の細菌細胞及び薬学的に許容される希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物
1.宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞の成長を低減するための宿主改変(HM)-CRISPR/Casシステムであって、宿主細胞は、クロストリジウム属細胞であり
(a)宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のための、HM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列であって、各crRNAは、それぞれの宿主細胞において発現されたCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、
(iii)1つ又は複数のリピート配列と、
(iv)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能であり、標的配列は、CCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含む又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列と
を含む遺伝子操作された核酸配列と、
(b)CASCADE Casと、
(c)Cas3又は宿主細胞においてCas3を発現するためのCas3をコードするヌクレオチド配列又はそのオルソログ若しくは相同体と、
を含み、
発現されたHM-crRNAは、宿主細胞においてCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ若しくは相同体と組み合わせることが可能であり、Cas3は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減できる、システム。
宿主細胞を死滅させるため、又は宿主細胞の成長を低減するための、宿主改変(HM)-CRISPR/Casシステムが提供され、
宿主細胞が、クロストリジウム属細胞であり、
(a)宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)配列番号138〜209及び290〜513から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列が、宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力があり、標的配列が、CCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含むか、又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列
を含み;
(b)CASCADE Cas;及び
(c)宿主細胞においてCas3又はそのオルソログ又は相同体を発現させるための、配列番号273及び275〜286から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号738又は274を含むヌクレオチド配列を含むCas3
を含み;
発現されたHM-crRNAが、宿主細胞におけるCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ又は相同体と組み合わせる能力があり、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が、死滅され得るか、又は宿主細胞集団成長が低減され得る
システム。
2.条項1のシステムにおける使用のための遺伝子操作されたヌクレオチド配列であって、遺伝子操作された配列が、宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードし、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)1つ又は複数のリピート配列;及び
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列が、宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力があり、標的配列が、CCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含むか、又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列
を含む、遺伝子操作されたヌクレオチド配列。
条項1のシステムにおける使用のための遺伝子操作されたヌクレオチド配列であって、遺伝子操作された配列が、宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードし、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、Cas3が、配列番号273及び275〜286から選択されるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号738又は274を含むヌクレオチド配列によりコードされ、
(i)配列番号138〜209及び290〜513から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列が、宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力があり、標的配列が、CCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含むか、又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列
を含む、遺伝子操作されたヌクレオチド配列。
3.Cas3が、配列番号273及び275〜286から選択されるアミノ酸配列又は前記選択された配列と少なくとも70%同一である配列を含む、いずれかの先行する条項のシステム又は遺伝子操作された配列。
4.(i)のリピート配列が、配列番号138〜209及び290〜513から選択されるリピート配列;又は前記選択された配列に少なくとも70%同一である配列である、いずれかの先行する条項のシステム又は遺伝子操作された配列。
5.リピート配列が、
(a)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルR20291株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号138〜146又は496〜513;又は
(b)任意選択で、宿主細胞が、Cディフィシル630株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号147〜158、290〜306又は370〜384;又は
(c)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルATCC45233株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号159〜166;又は
(d)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルBi-9株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号167〜175;又は
(e)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルM120株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号176〜181又は470〜476;又は
(f)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCF5株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号182〜187;又は
(g)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCD002株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号188〜194;又は
(h)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCD3株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号195〜201;又は
(i)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCD69株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号202〜209;又は
(j)任意選択で、宿主細胞が、Cディフィシル2007855株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号351〜369;又は
(k)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルBI1株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号385〜419;又は
(l)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルBI9株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号420〜434;又は
(m)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCD196株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号435〜452;又は
(n)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルBI9株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号420〜434;又は
(o)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCF5株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号453〜468;又は
(p)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルM68株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号477〜495
から選択されるリピート配列である、条項4のシステム又は遺伝子操作された配列。
6.標的ヌクレオチド配列が、配列番号220、222、224、226、228、229、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、259及び260から選択される配列により含まれる、いずれかの先行する条項のシステム又は遺伝子操作された配列。
7.標的ヌクレオチド配列が、宿主細胞におけるシグマ因子により媒介される遺伝子発現カスケードにより含まれる遺伝子により含まれる、条項1〜5のいずれかの1つのシステム又は遺伝子操作された配列
5.標的遺伝子の転写が、
(a)σE;
(b)σF;
(c)σG;
(d)σH;
(e)σK;
(f)Spo0A;
(g)SpoIIID;
(h)SpoVT;又は
(i)SpoIIR
により、宿主細胞種の細胞において調節される、いずれかの先行する条項のシステム又は遺伝子操作された配列。
9.標的ヌクレオチド配列が、宿主細胞種においてシグマ因子の転写を直接的又は間接的に調節する産物をコードする遺伝子により含まれる、いずれかの先行する条項のシステム又は遺伝子操作された配列。
10.標的ヌクレオチド配列が、表12〜17及び23において列挙される遺伝子から選択される遺伝子、又はその相同体、オルソログ又は機能的な均等物により含まれる、いずれかの先行する条項のシステム又は遺伝子操作された配列。
11.標的配列が、ステージI、II、III、IV又はVの胞子形成遺伝子により含まれるか、又は胞子コートタンパク質をコードする、いずれかの先行する条項のシステム又は遺伝子操作された配列。
12.宿主細胞を死滅させるための、又は宿主細胞の成長を低減するためのHM-CRISPR/Casシステムであって、宿主細胞は、大腸菌細胞であり、
(a)宿主細胞におけるHM-crRNAの発現のための、前記HM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列であって、各crRNAは、それぞれの宿主細胞において発現されたCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、
(iii)1つ又は複数のリピートと、
(iv)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能であり、標的配列は、AWGを含む又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列と
を含む遺伝子操作された核酸配列と、
(b)CASCADE Casと、
(c)Cas3又は宿主細胞においてCas3を発現するためのCas3をコードするヌクレオチド配列又はそのオルソログ若しくは相同体と
を含み、
発現されたHM-crRNAは、宿主細胞においてCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ若しくは相同体と組み合わせることが可能であり、Cas3は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減できる、システム。
宿主細胞を死滅させるため、又は宿主細胞の成長を低減させるための、HM-CRISPR/Casシステムであって、宿主細胞が、大腸菌であり、
(a)宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)配列番号210〜213及び514〜731から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列が、宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力があり、標的配列が、AWGを含むか、又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列
を含む、ヌクレオチド配列;
(b)CASCADE Cas;及び
(c)宿主細胞においてCas3又はそのオルソログ又は相同体を発現させるための、配列番号261、263及び287〜286から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号262又は264を含むヌクレオチド配列を含むCas3
を含み;
発現されたHM-crRNAが、宿主細胞におけるCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ又は相同体と組み合わせる能力があり、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が、死滅され得るか、又は宿主細胞集団成長が低減され得る
システム。
13.条項12のシステムにおける使用のための遺伝子操作されたヌクレオチド配列であって、遺伝子操作された配列が、宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードし、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、Cas3が、配列番号261、263及び287〜289のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号262又は264を含むヌクレオチド配列によりコードされ、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)任意選択で、配列番号210〜213及び514〜731から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列が、宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力があり、標的配列が、AWGを含むか、又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列
を含む、遺伝子操作されたヌクレオチド配列。
条項12のシステムにおける使用のための遺伝子操作されたヌクレオチド配列であって、遺伝子操作された配列が、宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードし、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、Cas3が、配列番号261、263及び287〜289から選択されるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号262又は264を含むヌクレオチド配列によりコードされ、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)配列番号210〜213及び514〜731から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列が、宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力があり、標的配列が、AWGを含むか、又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列
を含む、遺伝子操作されたヌクレオチド配列。
14.Cas3が、配列番号261、263及び287〜286から選択されるアミノ酸配列又は前記選択された配列と少なくとも70%同一である配列を含む、条項12のシステム又は条項13の遺伝子操作された配列。
15.リピート配列が、配列番号210〜213及び514〜731から選択されるリピート配列、又は前記選択された配列に少なくとも70%同一である配列である、条項12〜14のいずれか1つのシステム又は遺伝子操作された配列。
16.リピート配列が、
(a)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌K12株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号210〜212又は691〜695;又は
(b)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌O157:H7株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号213、677又は678;又は
(c)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌042株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号514〜518;又は
(d)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌1303株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号519〜521;又は
(e)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌536株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号522〜527;又は
(f)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌55989株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号528又は529;又は
(g)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌ACN001株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号530〜532;又は
(h)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌APEC株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号533〜545;又は
(i)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌APEC IMT5155株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号533〜537;又は
(j)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌APEC O1株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号538〜542;又は
(k)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌APEC O78株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号543〜545;又は
(l)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌B株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号546〜560;又は
(m)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌B REL606株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号556〜560;又は
(n)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌BL21株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号561〜574;又は
(o)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌BW25113株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号575〜578;又は
(p)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌BW2592株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号579〜582;又は
(q)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌C(例えば、ATTC8739)株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号583〜588;又は
(r)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌DH1株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号589〜597;又は
(s)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌E24377A株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号598〜600;又は
(t)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌ECC-1470株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号601〜603;又は
(u)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌ED1a株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号604〜608;又は
(v)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌ER2796株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号609〜612;又は
(w)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌ETEC(例えば、H10407)株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号613〜618;又は
(x)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌LF82株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号644〜667;又は
(y)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌LY180株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号668〜670;又は
(z)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌O104:H4株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号671〜673;又は
(aa)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌O111:H(例えば、1128)株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号674〜676;又は
(bb)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌P12b株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号679〜684;又は
(cc)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌PCN033株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号685;又は
(dd)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌PCN061株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号686〜689;又は
(ee)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌SECEC SMS-3-5株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号690;又は
(ff)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌K12 MC4100株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号691〜695;又は
(gg)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌UM146株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号696〜699;又は
(hh)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌UMN026株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号700〜707;又は
(ii)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌UMNF18株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号708〜711;又は
(jj)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌UMNK88株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号712〜715;又は
(kk)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌UT189株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号716〜720;又は
(ll)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌VR50株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号721〜723;又は
(mm)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌W株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号724〜729;又は
(nn)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌Xuzhou21株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号730又は731
から選択されるリピート配列である、条項15のシステム又は遺伝子操作された配列。
17.PAMが、AAG、AGG、GAG又はATGを含むか又はからなる、条項12〜16のいずれか1つのシステム又は遺伝子操作された配列。
18.宿主細胞を死滅させるための、又は宿主細胞の成長を低減するためのHM-CRISPR/Casシステムであって、宿主細胞は、ストレプトコッカス属細胞であり、
(a)宿主細胞におけるHM-crRNAの発現のための、前記HM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列であって、各crRNAは、それぞれの宿主細胞において発現されたCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、
(i)配列番号215〜218から選択されるリピート配列である1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能であり、標的配列は、NNAGAAW、NGGNG又はAWを含む又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列と
を含む遺伝子操作された核酸配列と、
(b)CASCADE Casと、
(c)任意選択で、配列番号265のアミノ酸配列を含むCas3又は宿主細胞においてCas3を発現するためのヌクレオチド配列(任意選択で、配列番号266を含む)又はそのオルソログ又は相同体と
を含み、
発現されたHM-crRNAは、宿主細胞においてCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ若しくは相同体と組み合わせることが可能であり、Cas3は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減できる、システム。
宿主細胞を死滅させるため、又は宿主細胞の成長を低減させるための、HM-CRISPR/Casシステムであって、宿主細胞が、ストレプトコッカス属の細胞であり、
(a)宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列が、
(iii)配列番号215〜218から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(iv)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列が、宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力があり、標的配列が、NNAGAAW、NGGNG又はAWを含むか、又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列;
(b)CASCADE Cas;及び
(c)宿主細胞におけるCas3を発現するための、配列番号265のアミノ酸配列、又は配列番号266を含むヌクレオチド配列を含むCas3、又はそのオルソログ又は相同体
を含み;
発現されたHM-crRNAが、宿主細胞におけるCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ又は相同体と組み合わせる能力があり、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が、死滅され得るか、又は宿主細胞集団成長が低減され得る
システムが提供される。
19.条項18のシステムにおける使用のための遺伝子操作されたヌクレオチド配列であって、遺伝子操作された配列が、宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードし、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、Cas3が、任意選択で、配列番号265のアミノ酸配列を含むか、又は任意選択で、配列番号266を含むヌクレオチド配列によりコードされ、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)任意選択で、配列番号215〜218から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列が、宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力があり、標的配列が、NNAGAAW、NGGNG又はAWを含むか、又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列
を含む、遺伝子操作されたヌクレオチド配列。
条項18のシステムにおける使用のための遺伝子操作されたヌクレオチド配列であって、遺伝子操作された配列が、宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードし、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、Cas3が、配列番号265のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号266を含むヌクレオチド配列によりコードされ、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)配列番号215〜218から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列が、宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力があり、標的配列が、NNAGAAW、NGGNG又はAWを含むか、又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列
を含む、遺伝子操作されたヌクレオチド配列。
20.PAMが、AA、AT又はAGを含むか又はからなる、条項18のシステム又は条項19の遺伝子操作された配列。
21.宿主細胞を死滅させるための、又は宿主細胞の成長を低減するためのHM-CRISPR/Casシステムであって、宿主細胞は、サルモネラ属細胞であり、
(a)宿主細胞におけるHM-crRNAの発現のための、前記HM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列であって、各crRNAは、それぞれの宿主細胞において発現されたCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、
(iii)任意選択で、配列番号214である1つ又は複数のリピートと、
(iv)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である、スペーサー配列と
を含む遺伝子操作された核酸配列と、
(b)CASCADE Casと、
(c)任意選択で、配列番号267若しくは269のアミノ酸配列を含むCas3又は宿主細胞においてCas3を発現するためのヌクレオチド配列(任意選択で、配列番号268若しくは270を含む)又はそのオルソログ若しくは相同体と
を含み、
発現されたHM-crRNAは、宿主細胞においてCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ若しくは相同体と組み合わせることが可能であり、Cas3は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減できる、システム。
宿主細胞を死滅させるため、又は宿主細胞の成長を低減させるための、HM-CRISPR/Casシステムであって、宿主細胞が、サルモネラ細胞であり、
(a)宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)配列番号214である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(ii)宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力がある前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列;
(b)CASCADE Cas;及び
(c)宿主細胞においてCas3を発現するための、配列番号267又は269のアミノ酸配列、又は配列番号268又は270を含むヌクレオチド配列を含むCas3、又はそのオルソログ又は相同体
を含み;
発現されたHM-crRNAが、宿主細胞におけるCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ又は相同体と組み合わせる能力があり、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が、死滅され得るか、又は宿主細胞集団成長が低減され得る
システム。
22.条項21のシステムにおける使用のための遺伝子操作されたヌクレオチド配列であって、遺伝子操作された配列が、宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードし、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、Cas3が、配列番号267又は269のアミノ酸配列を任意選択で含むか、又は配列番号268又は270を任意選択で含むヌクレオチド配列によりコードされ、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)任意選択で、配列番号214である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(ii)宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力がある前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列
を含む、遺伝子操作されたヌクレオチド配列。
条項21のシステムにおける使用のための遺伝子操作されたヌクレオチド配列であって、遺伝子操作された配列が、宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードし、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、Cas3が、配列番号267又は269のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号268又は270を含むヌクレオチド配列によりコードされ、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)配列番号214である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(ii)宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力がある前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列
を含む、遺伝子操作されたヌクレオチド配列。
23.Cas3及び/又はCASCADE Casが、宿主細胞の内因性Casである、いずれかの先行する条項のシステム又は遺伝子操作された配列。
24.遺伝子操作された配列が、核酸ベクター、任意選択で、ウイルス、ファージ、ファスミド、プラスミド又は接合プラスミドにより含まれる、いずれかの先行する条項のシステム又は遺伝子操作された配列。
25.遺伝子操作された配列のコピーが、複数のキャリア細菌により含まれ、任意選択で、担体細菌細胞が、ラクトバチルス属の細胞である、いずれかの先行する条項のシステム又は遺伝子操作された配列。
26.ヒト又は動物対象において前記宿主細胞の感染を処置又は予防するための、システム又は遺伝子操作された配列であって、発現されたHM-crRNAが、宿主細胞におけるCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ又は相同体と組み合わせる能力があり、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が、死滅され得るか、又は宿主細胞集団成長が、低減され得、これにより、対象における前記宿主細胞の比率を低減し、対象における宿主細胞感染を処置する、いずれかの先行する条項のシステム又は遺伝子操作された配列。
27.いずれかの先行する条項のシステム又は遺伝子操作された配列及び薬学的に許容される希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物。
28.ヒト又は非ヒト動物対象におけるクロストリジウム属感染を処置する方法であって、対象が、混合細菌集団を含み、集団が、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)クロストリジウム属種の複数の宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種が、前記クロストリジウム属種と異なり、
各宿主細胞が、
(a)CCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含むか、又はからなるPAM;
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列;
(c)宿主細胞におけるCas3ヌクレアーゼと作動可能なCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列;
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列
を含み;
第1の細胞が、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする複数のコピーの遺伝子操作された核酸配列を含む医薬組成物を投与する工程;及び
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程
を含み;
各HM-crRNAが、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によりコードされ、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記それぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasが、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列が、
(g)任意選択で、配列番号138〜209及び290〜513から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(h)前記宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力がある前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列
を含む核酸配列を含み;
発現されたHM-crRNAが、任意選択で、配列番号273及び275〜286のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号738又は274のヌクレオチド配列又はそのオルソログ若しくは相同体によりコードされる、CASCADE Cas及びCas3と組み合わされ、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が死滅されるか、又は宿主細胞集団成長が低減され、これにより、対象における前記宿主細胞集団の比率が低減されるか、又はクロストリジウム属感染が処置される、方法。
ヒト又は非ヒト動物対象における大腸菌感染を処置する方法であって、対象が、混合細菌集団を含み、集団が、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)複数のクロストリジウム属種の宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種が、前記クロストリジウム属種と異なり、
各宿主細胞が、
(a)CCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含むか、又はからなるPAM;
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列;
(c)宿主細胞におけるCas3ヌクレアーゼと作動可能なCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列;
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列
を含み;
第1の細胞が、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする複数のコピーの遺伝子操作された核酸配列を含む医薬組成物を投与する工程;及び
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程
を含み;
各HM-crRNAが、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によりコードされ、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記それぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasが、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列が、
(g)配列番号138〜209及び290〜513から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(h)前記宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力がある前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列
を含む核酸配列を含み;
発現されたHM-crRNAが、配列番号273及び275〜286のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号738又は274のヌクレオチド配列又はそのオルソログ若しくは相同体によりコードされる、CASCADE Cas及びCas3と組み合わされ、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が死滅されるか、又は宿主細胞集団成長が低減され、これにより、対象における前記宿主細胞集団の比率が低減されるか、又はクロストリジウム属感染が処置される、方法。
29.ヒト又は非ヒト動物対象における大腸菌感染を処置する方法であって、対象が、混合細菌集団を含み、集団が、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)複数の大腸菌宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種が、大腸菌でなく、
各宿主細胞が、
(a)AWG、例えば、AAG、AGG、GAG又はATGを含むか、又はからなるPAM;
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列;
(c)宿主細胞におけるCas3ヌクレアーゼと作動可能なCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列;
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列
を含み;
第1の細胞が、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする複数のコピーの遺伝子操作された核酸配列を含む医薬組成物を投与する工程;及び
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程
を含み;
各HM-crRNAが、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によりコードされ、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記それぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasが、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列が、
(g)任意選択で、配列番号210〜213及び514〜731から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(h)前記宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力がある前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列
を含む核酸配列を含み;
発現されたHM-crRNAが、任意選択で、配列番号261、263及び287〜286のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号262又は264のヌクレオチド配列又はそのオルソログ若しくは相同体によりコードされる、CASCADE Cas及びCas3と組み合わされ、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が死滅されるか、又は宿主細胞集団成長が低減され、これにより、対象における前記宿主細胞集団の比率が低減されるか、又は大腸菌感染が処置される、方法。
ヒト又は非ヒト動物対象における大腸菌感染を処置する方法であって、対象が、混合細菌集団を含み、集団が、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)複数の大腸菌宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種が、大腸菌でなく、
各宿主細胞が、
(a)AWG、例えば、AAG、AGG、GAG又はATGを含むか、又はからなるPAM;
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列;
(c)宿主細胞におけるCas3ヌクレアーゼと作動可能なCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列;
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列
を含み;
第1の細胞が、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする複数のコピーの遺伝子操作された核酸配列を含む医薬組成物を投与する工程;及び
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程
を含み;
各HM-crRNAが、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によりコードされ、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記それぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasが、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列が、
(g)配列番号210〜213及び514〜731から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(h)前記宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力がある前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列
を含む核酸配列を含み;
発現されたHM-crRNAが、配列番号261、263及び287〜289のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号262又は264のヌクレオチド配列又はそのオルソログ若しくは相同体によりコードされる、CASCADE Cas及びCas3と組み合わされ、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が死滅されるか、又は宿主細胞集団成長が低減され、これにより、対象における前記宿主細胞集団の比率が低減されるか、又は大腸菌感染が処置される、方法。
30.ヒト又は非ヒト動物対象におけるストレプトコッカス属感染を処置する方法であって、対象が、混合細菌集団を含み、集団が、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)ストレプトコッカス属種の複数の宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種が、前記ストレプトコッカス属種と異なり、
各宿主細胞が、
(a)NNAGAAW、NGGNG又はAW、例えば、AA、AT又はAGを含むか、又はからなるPAM;
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列;
(c)宿主細胞におけるCas3ヌクレアーゼと作動可能なCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列;
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列
を含み;
第1の細胞が、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする複数のコピーの遺伝子操作された核酸配列を含む医薬組成物を投与する工程;及び
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程
を含み;
各HM-crRNAが、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によりコードされ、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記それぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasが、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列が、
(g)任意選択で、配列番号215〜218から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(h)前記宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力がある前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列
を含む核酸配列を含み;
発現されたHM-crRNAが、任意選択で、配列番号265のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号266のヌクレオチド配列又はそのオルソログ若しくは相同体によりコードされる、CASCADE Cas及びCas3と組み合わされ、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が死滅されるか、又は宿主細胞集団成長が低減され、これにより、対象における前記宿主細胞集団の比率が低減されるか、又はストレプトコッカス属感染が処置される、方法。
ヒト又は非ヒト動物対象におけるストレプトコッカス属感染を処置する方法であって、対象が、混合細菌集団を含み、集団が、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)複数のストレプトコッカス属種の宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種が、前記ストレプトコッカス属種と異なり、
各宿主細胞が、
(a)NNAGAAW、NGGNG又はAW、例えば、AA、AT又はAGを含むか、又はからなるPAM;
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列;
(c)宿主細胞におけるCas3ヌクレアーゼと作動可能なCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列;
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列
を含み;
第1の細胞が、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする複数のコピーの遺伝子操作された核酸配列を含む医薬組成物を投与する工程;及び
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程
を含み;
各HM-crRNAが、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によりコードされ、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記それぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasが、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列が、
(g)配列番号215〜218から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(h)前記宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力がある前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列
を含む核酸配列を含み;
発現されたHM-crRNAが、配列番号265のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号266のヌクレオチド配列又はそのオルソログ若しくは相同体によりコードされる、CASCADE Cas及びCas3と組み合わされ、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が死滅されるか、又は宿主細胞集団成長が低減され、これにより、対象における前記宿主細胞集団の比率が低減されるか、又はストレプトコッカス属感染が処置される、方法。
31.ヒト又は非ヒト動物対象におけるサルモネラ属感染を処置する方法であって、対象が、混合細菌集団を含み、集団が、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)サルモネラ属種の複数の宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種が、前記サルモネラ属種と異なり、
各宿主細胞が、
(a)PAM;
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列;
(c)宿主細胞におけるCas3ヌクレアーゼと作動可能なCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列;
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列
を含み;
第1の細胞が、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする複数のコピーの遺伝子操作された核酸配列を含む医薬組成物を投与する工程;及び
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程
を含み;
各HM-crRNAが、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によりコードされ、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記それぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasが、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列が、
(g)任意選択で、配列番号214である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(h)前記宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力がある前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列
を含む核酸配列を含み;
発現されたHM-crRNAが、任意選択で、配列番号267又は269のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号268又は270のヌクレオチド配列又はそのオルソログ若しくは相同体によりコードされる、CASCADE Cas及びCas3と組み合わされ、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が死滅されるか、又は宿主細胞集団成長が低減され、これにより、対象における前記宿主細胞集団の比率が低減されるか、又はサルモネラ属感染が処置される、方法。
ヒト又は非ヒト動物対象におけるサルモネラ属感染を処置する方法であって、対象が、混合細菌集団を含み、集団が、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)複数のサルモネラ属種の宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種が、前記サルモネラ属種と異なり、
各宿主細胞が、
(a)PAM;
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列;
(c)宿主細胞におけるCas3ヌクレアーゼと作動可能なCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列;
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列
を含み;
第1の細胞が、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする複数のコピーの遺伝子操作された核酸配列を含む医薬組成物を投与する工程;及び
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程
を含み;
各HM-crRNAが、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によりコードされ、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記それぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasが、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列が、
(g)配列番号214である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(h)前記宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力がある前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列
を含む核酸配列を含み;
発現されたHM-crRNAが、配列番号267又は269のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号268又は270のヌクレオチド配列又はそのオルソログ若しくは相同体によりコードされる、CASCADE Cas及びCas3と組み合わされ、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が死滅されるか、又は宿主細胞集団成長が低減され、これにより、対象における前記宿主細胞集団の比率が低減されるか、又はサルモネラ属感染が処置される、方法。
32.ヌクレアーゼが、Casであり、宿主細菌又は古細菌細胞の標的ヌクレオチド配列を認識するようプログラムされ、これにより、プログラムされるヌクレアーゼが、ヌクレオチド配列を改変する能力があり、ヌクレオチド配列が、宿主細胞におけるシグマ因子により媒介される遺伝子発現カスケードにより含まれる標的遺伝子により含まれる、条項1、3〜14〜18、20、21及び23〜26のいずれか1つのシステムにおける使用のためのガイド型ヌクレアーゼ。
33.ヌクレオチド配列が、前記カスケードのシグマ因子をコードする遺伝子により含まれる、条項32のヌクレアーゼ。
34.標的遺伝子の転写が、
(a)σE;
(b)σF;
(c)σG;
(d)σH;
(e)σK;
(f)Spo0A;
(g)SpoIIID;
(h)SpoVT;又は
(i)SpoIIR
により、宿主細胞種の細胞において調節される、条項32のヌクレアーゼ。
35.ヌクレオチド配列が、
(a)σE;
(b)σF;
(c)σG;
(d)σH;
(e)σK;
(f)Spo0A;
(g)SpoIIID;
(h)SpoVT;又は
(i)SpoIIR
をコードする遺伝子により含まれる、条項32のヌクレアーゼ。
36.標的ヌクレオチド配列が、表12〜表17及び表23に列挙される遺伝子から選択される遺伝子又はその相同体、オルソログ又は機能的同等物により含まれる、項32に記載のヌクレアーゼ。
37.標的ヌクレオチド配列が、配列番号220、222、224、226、228、229、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、259及び260から選択される配列と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列により含まれる、項32に記載のヌクレアーゼ。
38.標的配列が、配列番号219、221、223、225、227、230、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255及び257から選択される配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列をコードする、項32に記載のヌクレアーゼ。
39.標的配列が、spo0A、spoIIID、sigK、sigF、sigH、Spo0A-Pホスファターゼ、spoIIE、spoIIAA、spoIIAB、spoIIGA、sigE、spoIIR、sigG、SpoIIIA、spoIID、SpoIIQ、SpoIVB又はCtpB遺伝子により含まれる、項32に記載のヌクレアーゼ。
40.宿主細胞が、Cディフィシル細胞であり、標的配列が、CディフィシルutxA、毒素A又はCディフィシル毒素B遺伝子により含まれる、項32に記載のヌクレアーゼ。
41.宿主細胞が、Cディフィシル細胞であり、標的配列が、Cディフィシルcdu2、cdu1、tcdD、tcdB、tcdE、tcdA、tcdC、cdd1、cdd2、cdd3又はcdd4遺伝子により含まれるヌクレオチド配列により含まれる、項32に記載のヌクレアーゼ。
42.標的配列が、ステージI、II、III、IV若しくはV胞子形成遺伝子により含まれる、又は胞子コートタンパク質をコードする、項32に記載のヌクレアーゼ。
43.条項32〜42のいずれか1つのヌクレアーゼをコードする、宿主細胞に感染するか、又は形質転換する能力がある核酸ベクター(任意選択で、バクテリオファージ、ファスミド又は接合プラスミド)。
44.ヌクレアーゼ又はベクターが、ヌクレアーゼをプログラムするための1つ又は複数のcrRNA又はガイドRNA(gRNA)と組み合わせた状態にあるか、又はこのようなcrRNA又はgRNAをコードする核酸と組み合わせた状態にある、条項32〜42のいずれか1つのヌクレアーゼ又は条項43のベクター。
45.ヌクレアーゼが、Cas3であり、Cas又はベクターが、1つ又は複数のCASCADE Cas(任意選択で、CasA、B、C、D及びE;又はCas1若しくはCas2)をコードする核酸と組み合わせた状態にあり、前記Cas3が、宿主細胞の標的配列を改変するための前記CASCADE Casとともに作動可能である、条項32〜42のいずれか1つのヌクレアーゼ又は条項43のベクター。
46.Casヌクレアーゼが、大腸菌、Cディフィシル、サルモネラ エンテリカ又はSサーモフィルスCas3である、条項26〜39のいずれか1つのヌクレアーゼ又はベクター。
47.Cas3が、配列番号273及び275〜286、261、263、287-289、265、267及び269から選択されるアミノ酸配列、又は前記選択される配列に少なくとも70%同一である配列を含む、条項46のヌクレアーゼ又はベクター。
48.細胞の標的配列を認識及び改変するようにヌクレアーゼをガイドするために、宿主細菌細胞において条項32〜36、42及び44〜47のいずれか1つのヌクレアーゼと組み合わせることが可能であるcrRNA又はシングルgRNAをコードする又は含む核酸分子。
49.crRNA又はシングルgRNAが、配列番号138〜209及び290〜513から選択されたリピート配列と少なくとも70、80、85、90、95、96、97、98、又は99%同一(若しくは100%同一)である配列により含まれる配列を含み、任意選択で、宿主細胞が、Cディフィシル細胞である、条項48の核酸。
50.条項48又は49の核酸を含む、宿主細胞に感染するか、又は形質転換する能力がある核酸ベクター(任意選択で、バクテリオファージ、ファスミド又は接合プラスミド)。
51.ヒト又は動物対象における疾患又は状態を処置又は予防するための医薬であって、宿主細胞により媒介される疾患又は状態を処置又は予防するために対象に投与するための、条項1〜27及び32〜50のいずれか1つのシステム、配列、ベクター、ヌクレアーゼ又は核酸を含む、医薬。
52.宿主細胞が、Cディフィシル宿主細胞であり、任意選択で、表18及び19における株並びに表24における配列番号275〜286について挙げられる株から選択されるCディフィシル株のものである、対象のCディフィシル感染を処置するための、条項51の医薬。
任意選択で、本発明の方法、アレイ、配列又は他の構成における代替において、リピート配列(例えば、アレイ又は遺伝子操作された核酸により含まれるリピート)は、配列番号138〜209及び290〜513から選択されるリピート配列である。
任意選択で、本発明の方法、アレイ、配列又は他の構成における代替において、リピート配列は、
(a)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルR20291株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号138〜146及び496〜513;又は
(b)任意選択で、宿主細胞が、Cディフィシル630株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号147〜158、290〜306及び370〜384;又は
(c)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルATCC45233株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号159〜166;又は
(d)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルBi-9株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号167〜175;又は
(e)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルM120株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号176〜181及び470〜476;又は
(f)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCF5株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号182〜187;又は
(g)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCD002株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号188〜194;又は
(h)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCD3株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号195〜201;又は
(i)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCD69株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号202〜209;又は
(j)任意選択で、宿主細胞が、Cディフィシル2007855株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号351〜369;又は
(k)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルBI1株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号385〜419;又は
(l)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルBI9株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号420〜434;又は
(m)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCD196株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号435〜452;又は
(n)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルBI9株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号420〜434;又は
(o)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCF5株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号453〜468;又は
(p)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルM68株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号477〜495
から選択されるリピート配列である。
任意選択で、本発明の方法、アレイ、配列又は他の構成における代替において、リピート配列は、配列番号210〜213及び514〜731から選択されるリピート配列である。
任意選択で、本発明の方法、アレイ、配列又は他の構成における代替において、リピート配列は、
(a)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌K12株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号210〜212及び691〜695;又は
(b)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌O157:H7株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号213、677及び678;又は
(c)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌042株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号514〜518;又は
(d)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌1303株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号519〜521;又は
(e)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌536株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号522〜527;又は
(f)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌55989株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号528又は529;又は
(g)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌ACN001株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号530〜532;又は
(h)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌APEC株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号533〜545;又は
(i)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌APEC IMT5155株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号533〜537;又は
(j)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌APEC O1株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号538〜542;又は
(k)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌APEC O78株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号543〜545;又は
(l)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌B株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号546〜560;又は
(m)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌B REL606株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号556〜560;又は
(n)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌BL21株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号561〜574;又は
(o)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌BW25113株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号575〜578;又は
(p)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌BW2592株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号579〜582;又は
(q)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌C(例えば、ATTC8739)株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号583〜588;又は
(r)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌DH1株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号589〜597;又は
(s)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌E24377A株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号598〜600;又は
(t)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌ECC-1470株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号601〜603;又は
(u)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌ED1a株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号604〜608;又は
(v)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌ER2796株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号609〜612;又は
(w)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌ETEC(例えば、H10407)株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号613〜618;又は
(x)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌LF82株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号644〜667;又は
(y)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌LY180株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号668〜670;又は
(z)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌O104:H4株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号671〜673;又は
(aa)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌O111:H(例えば、1128)株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号674〜676;又は
(bb)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌P12b株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号679〜684;又は
(cc)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌PCN033株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号685;又は
(dd)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌PCN061株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号686〜689;又は
(ee)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌SECEC SMS-3-5株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号690;又は
(ff)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌K12 MC4100株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号691〜695;又は
(gg)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌UM146株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号696〜699;又は
(hh)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌UMN026株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号700〜707;又は
(ii)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌UMNF18株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号708〜711;又は
(jj)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌UMNK88株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号712〜715;又は
(kk)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌UT189株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号716〜720;又は
(ll)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌VR50株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号721〜723;又は
(mm)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌W株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号724〜729;又は
(nn)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌Xuzhou21株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号730又は731
から選択されるリピート配列である。
・志賀毒素産生大腸菌(STEC)(STECは、ベロ毒素産生大腸菌(VTEC)としても言及され得る);
・腸管出血性大腸菌(EHEC)(この病原系は、食物由来の大流行と関連してニュースにおいて最も一般的に聞かれるものである);
・腸内毒素原性大腸菌(ETEC);
・腸管病原性大腸菌(EPEC);
・腸管凝集性大腸菌(EAEC);
・腸管侵入性大腸菌(EIEC);及び
・分散接着性大腸菌(DAEC)
から選択される。
油、金属及び鉱物産業
実施形態において、宿主細胞は、坑道又はフィールド;金属鉱山又はフィールド;油のフィールド又は油若しくは石油化学製品に存在する(例えば、宿主が、嫌気性硫黄還元細菌、例えば、デスルホビブリオ属の細菌であるとき、これらのいずれかについて)。一例では、この組成物は、酸化剤(例えば、次亜塩素酸ナトリウム)、四級アンモニウム化合物又はイソチアゾロンを含むか、又は次亜塩素酸ナトリウム、四級アンモニウム化合物又はイソチアゾロンと同時又は連続して投与される。デスルホビブリオ属の細菌宿主を改変するために本発明において使用するための適当なベクターの例は、バクテリオファージである。以下の参考文献は、デスルホビブリオ属に感染するファージを単離する適当な方法を記載する。本発明におけるベクターとしての使用については、参考文献のいずれかが記載するバクテリオファージを使用してもよい。或いは、ベクターは、ナノ粒子により提供される。
(i)Seyedirashti Sら、J Gen Microbiol.、1991年7月;137(7):1545〜9頁、「Induction and partial purification of bacteriophages from Desulfovibrio vulgaris (Hildenborough) and Desulfovibrio desulfuricans ATCC 13541」;
(ii)Seyedirashti Sら、J Gen Microbiol.、1992年7月;138(7):1393〜7頁、「Molecular characterization of two bacteriophages isolated from Desulfovibrio vulgaris NCIMB 8303 (Hildenborough)」;
(iii)*Walker CBら;Environ Microbiol.、2006年11月;8(11):1950〜9頁、「Recovery of temperate Desulfovibrio vulgaris bacteriophage using a novel host strain」;
(iv)Mirandaら、Corrosion Science 48、(2006年)、2417〜2431頁、「Biocorrosion of carbon steel alloys by an hydrogenotrophic sulfate-reducing bacterium Desulfovibrio capillatus isolated from a Mexican oil field separator」;
(v)Eydalら、The ISME Journal、(2009年)、3、1139〜1147頁;doi:10.1038/ismej.2009.66;2009年6月11日にオンラインで公開、「Bacteriophage lytic to Desulfovibrio aespoeensis isolated from deep groundwater」;
(vi)Walker CBら;Environ Microbiol.、2009年9月;11(9):2244〜52頁、doi: 10.1111/j.1462-2920.2009.01946.x、「Contribution of mobile genetic elements to Desulfovibrio vulgaris genome plasticity」。
*[本文献に記載される配列は、受託番号DQ826728-DQ826732の下GenBankに寄託され、参照により本明細書に取り込まれる]
本発明の代替の適用は、水又は汚水処理のための、本明細書に記載するHM-CRISPRアレイ、HM-CRISPR/Casシステム、HM-crRNA、HM-スペーサー、HM-DNA、HM-Cas又はHM-組成物を提供し、例えば、宿主が、硫黄還元細菌、例えば、デスルホビブリオ属の細菌である。
本発明の代替の適用は、ヒト又は動物における細菌感染を処置、予防又は低減する(例えば、その広がり若しくは拡大を低減する)ための本明細書において記載されるHM-CRISPRアレイ、HM-CRISPR/Casシステム、HM-crRNA、HM-スペーサー、HM-DNA、HM-Cas又はHM-組成物を提供する。
第1の例において、感染は、ヒトにおいてMRSA宿主細胞により引き起こされる。宿主細胞は、スタフィロコッカス・アウレウス宿主細胞であり、本発明のHM-アレイは、I、II又はIII型スタフィロコッカス属のパッケージされたファージ(カウドウイルス目又はミオウイルス科ファージ)の集団に含有される。ファージ集団は、メチシリン若しくはバンコマイシンと共に、又はなしで、MRSA感染患者に投与される。1回の試験において、ファージHM-アレイは、宿主細胞における、(i)内因性SアウレウスCRISPRアレイのリーダープロモーターの3'にある20個のヌクレオチドの領域及び(ii)メチシリン抵抗性遺伝子を標的にする。バンコマイシンが投与されるとき、通常より少ない用量が、患者に投与される。宿主細胞感染が、ノックダウンされ、ファージ医薬に対する抵抗性が、確立されないか、又は通常より少ない速度又は重症度で確立されることが予想される。他の試験において、設計は、これらの試験におけるファージがまた、必須のSアウレウス遺伝子ftsZを標的にすることを除き、同一である(Liangら、Int J Infect Dis. 2015年1月;30:1〜6頁、doi: 10.1016/j.ijid.2014.09.015.、Epub 2014年11月5日、「Inhibiting the growth of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in vitro with antisense peptide nucleic acid conjugates targeting the ftsZ gene」)。
さらなる試験は、上記の試験を繰り返すが、ファージKエンドリシンを、メチシリンに加えて又は代わりに投与した。
(参考文献)
1.Jiang Wら、Nucleic Acids Res.、2013年11月;41(20):e188. doi: 10.1093/nar/gkt780. Epub、2013年9月2日、「Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum and rice」;
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混合腸細菌叢試料におけるクロストリジウム・ディフィシル細菌のノックダウンを参照にして記載する、本実施例に従い、細菌の比率の変更を行う。試料は、バクテロイデス及びメトロニダゾール(MTZ)抵抗性Cディフィシル株630亜集団を含有する。エクスビボ混合集団を、本発明に従い、CRISPRアレイを含有するよう遺伝子操作した担体細菌(ラクトバチルス・アシドフィルスLa-14及び/又はLa-5)の集団と組み合わせる。
5'-ATTTACATACCACTTAGTTAATATAAAAC-3'(配列番号118)
を有する。
5'-GTTTTATATTAACTAAGTGGTATGTAAAT-3'(配列番号119)。
世界保健機関(WHO)コレラファクトシート第107号(2015年7月にアップデート)を参照のこと。コレラは、細菌ビブリオ・コレラエが混入した食物又は水の摂取により引き起こされる急性下痢性感染である。研究者は、毎年、およそ1400〜4300万のケースが存在し、コレラが原因で、世界中で毎年28000〜142000人が死亡していると推定している。2時間〜5日間という短いインキュベーション期間は、潜在的な爆発的なパターンの大流行の引き金を引く要因である。コレラは、極端に病原性のある疾患である。これは、小児と成人の両方に影響し、数時間以内に殺傷し得る。Vコレラエに感染した人の約80%は、症状を発症しないが、細菌は、感染の1〜10日後に彼らの顔面に存在し、環境に戻り、他の人々を感染させる可能性がある。症状を発症する人のうち、80%が、軽度又は中度の症状を有し、一方、およそ20%が、重篤な脱水症状を伴った急性水様性下痢を発症する。処置しないままなら、これが死を導き得る。
GUUAGCAGCCGCAUAGGCUGCUUAAAUA[配列番号75]。
実施形態において、細胞は、ビブリオ(例えば、コレラ)細胞であり、標的配列は、ace、cep、ctxA、ctxB、orfU、zot、rstA、rstB、rstR、acfA、acfB、acfC、tagE、aldA、int、tagA、tagD、tcpA、tcpB、tcpC、tcpD、tcpE、tcpF、tcpH、tcpI、tcpJ、tcpP、tcpQ、tcpR、tcpS、tcpT又はtoxT配列である。
1.材料及び方法
1.1.株
以下の株を、本実施例並びに実施例7及び8のコースにおいて使用した:大腸菌MG1655、大腸菌TOP10、ストレプトコッカス・サーモフィルスLMD-9(ATCC BAA-491、Manassas、Virginia)、ストレプトコッカス・サーモフィルスDSM20617(T)(DSMZ社、Braunschweig、Germany)、ラクトコッカス・ラクチスMG1363及びストレプトコッカス・ミュータンス・クラーク1924DSM20523(DSMZ社、Braunschweig、Germany)。
全ての株を、TH培地上37℃において20時間成長させた。Sサーモフィルス用の選択培地は、3gl-1の2-フェニルエタノール(PEA)を添加したTH培地であった。PEAを培地に加え、121℃にて15分間、15psiにおいてオートクレーブにかけた。1.5%(wt/vol)寒天を対応する培地に加えることにより、寒天プレートを調製した。選択又はプラスミド維持が必要なとき、30μgml-1カナマイシンを、サーモフィルス株及び大腸菌の両方のために使用し、500μgml-1を、Sミュータンスのため使用した。
全てのサブクローニング手法において、大腸菌(One Shot(登録商標)ThermoFischer社 TOP10 Chemically Competent cells)を使用した。Phusionポリメラーゼを使用して、PCRを行った。全てのPCR産物を、製造元のプロトコールに従い、Macherey-NagelによるNucleospin Gel及びPCR Clean-upを用いて精製した。精製したフラグメントを、総容量34μlの1μl酵素を含む1×FD緩衝液中の制限酵素DpnIを用いて切断した。切断した反応物を、製造元のプロトコールに従い、Macherey-NagelによるNucleospin Gel及びPCR Clean-upを用いて再度精製した。製造元のプロトコール(New England Biolabs社)に従い、10μl反応物において、Gibsonアセンブリーを行った。
1.4.1エレクトロコンピテント大腸菌細胞及び形質転換
市販のエレクトロコンピテント細胞(One Shot(登録商標)ThermoFischer社 TOP10 Chemically Competent E. coli)を、クローニング及び実験のため使用した。エレクトロポレーションを、Electro Cell Manipulator(BTX Harvard Apparatus ECM630)を使用して、標準設定:1800V、25μF及び200Ωを使用して行った。パルス後、LB-SOC培地1mlを加え、細胞を37℃にて1時間インキュベーションした。形質転換した細胞を、50μgml-1カナマイシンを含有するLB寒天において播種した。
エレクトロポレーションプロトコールを、Somkuti及びSteinberg、1988年から改変した。40mM DL-スレオニン(T8375 Sigma-Aldrich社)を添加したTHブロスにおけるストレプトコッカス・サーモフィルスの一晩培養物を、同じ培地5mlにおいて100倍希釈し、OD6000.3〜0.5(およそ接種後2.5時間)まで成長させた。10,000×gにおいて10分間、4℃での遠心分離により、細胞を収集し、氷冷洗浄緩衝液(0.5Mスクロース+10%グリセロール)5mlを用いて3回洗浄した。細胞を洗浄した後、エレクトロポレーション緩衝液(0.5Mスクロース、10%グリセロール及び1mM MgCl2)中OD60015〜30に懸濁した。エレクトロポレーション緩衝液における細胞を、使用(1時間以内)まで4℃で維持するか、又はエッペンドルフ中のアリコート50μlを、液体窒素中において凍結し、後の使用のため-80℃において保存した。
精製したプラスミドDNA1μlを、細胞懸濁液50μlに加え、エレクトロポレーションを、予め冷却した2mmギャップのエレクトロポレーションキュベットにおいて行った。エレクトロポレーション設定は、Electro Cell Manipulator(BTX Harvard Apparatus ECM630)を使用して、2500V、25μF及び200Ωであった。電気パルス直後、THブロス1mlを、細胞に加え、懸濁液を、氷上で10分間維持し、続いて、細胞を、3時間、37℃でインキュベーションした。抵抗性遺伝子の発現のための時間を置いた後、細胞を、30μgml-1カナマイシンを含有するTH寒天プレートに播種した。構築物に依存して、コロニーは、37℃でのインキュベーションの12〜48時間、目に見えた。
本研究において使用した全てのプラスミドは、ストレプトコッカス・クレモリス由来の潜在性プラスミドpWV01からもたらされた広範な宿主範囲の発現ベクター(Bryksin及びMatsumura、2010年)であるpBAV1K-T5に基づき、Gibsonの方法を使用した他のフラグメントとの構築のためのオーバーハングを含有するものを使用して、骨格を増幅した。
ストレプトコッカス・サーモフィルスは、4種の異なるCRISPRシステム(Sapranauskasら、2011年)を有し、本研究のため、II型CRISPR1(ST1-CRISPR)システムを選択した。標的配列の設計は、LMD-9の入手可能なゲノム配列(GenBank:CP000419.1)に基づく。ST1-CRISPRアレイを、CRISPRアレイリピート及びスペーサーのみをキシロース誘導可能なプロモーター(Xieら、2013年)の下に、続いて、対応するtracrRNAを連鎖球菌種のための強力な恒常的プロモーターの下に(Sorgら、2014年)含有するよう設計した(図2、配列番号)。
一晩定常フェーズの培養物を、対応する抗生物質を含むTHブロスに1:100希釈した。中期指数基の細胞を、異なる濃度のD-(+)-キシロース(0、0.001、0.01、0.1、0.5及び1%wt/vol)とインキュベーションし、細胞培養物を培地において直接測定して、細胞懸濁液又は懸濁緩衝液(PBS緩衝液)上での培地の自己蛍光の程度を評価した。細胞培養物の20μlの試料を、平底を有する96ウェルプレート上、PBS緩衝液において1/10希釈した。細胞懸濁液又は培地の蛍光を、プレートリーダー上で読み取った。励起波長558nm及び発光波長612nmを使用して、mCherry蛍光を測定した。再懸濁した細胞の吸光度を、OD600nmにおいて測定した。最低、3種の独立した生物学的複製を、各実験について行った。
SサーモフィルスのDNAポリメラーゼIII及びtetAを標的化するCRISPRアレイを含有するプラスミドを含む、SサーモフィルスLMD-9及び大腸菌TOP10の両方を、プラスミド維持のため30μgml-1カナマイシンを添加した培養物3mlにおいて一晩成長させた。翌日、96ウェルの深いウェルプレートに、30μgml-1カナマイシンを添加した、新鮮TH培地中の一晩培養物の1/100の500μlを接種した。中期指数期の細胞培養物を、1%キシロースを用いて誘導した。Sサーモフィルス及び大腸菌単独に対する死滅効果を試験した。試験した各株及び条件について、陰性対照を、キシロースなしで維持した。細胞をOD約0.5まで成長させ、次に、96ウェルレプリケーター(Mettler Toledo Liquidator(商標)96)を使用して、TH培地に10倍連続希釈して、滴容量5μLを、1gl-1PEAを添加したTH寒天上プレートにスポットした。プレートを、24時間、37℃にてインキュベーションし、コロニー形成単位(CFU)を、三連の測定値から計算した。
2.1成長条件及び選択培地
本発明者らは、本発明者らが同時培養実験のため使用することを計画した全ての株について成長を支持する細菌の株及び培養プロトコールを提示する。本発明者らは、THブロス中37℃での大腸菌との類似の成長を支持することができる、Sサーモフィルス株LMD-9を使用した(図3)。
ストレプトコッカス属の種のための誘導システムは、異種性キシロース誘導カセット(Xyl-S)を作製することにより、バチルス・メガテリウムのキシロースオペロン(図5)に基づき、既に開発されている。xylR及びxylAプロモーターを、それぞれ、gyrA及びldhプロモーターを恒常的に発現するSミュータンスで置き換えた。ストレプトコッカス属の種のためのこの発現カセットは、異なる種間の選択性及び発現レベルにおける相違を示すが、システムを、Sサーモフィルスにおいて試験していない(Xieら、2013年)。したがって、本発明者らは、Sサーモフィルスにおいてキシロース誘導カセットを検証するためにまず提示した。
CRISPRアレイにおけるゲノム標的化スペーサーが、SサーモフィルスLMD-9において死を引き起こし得るかどうかを決定するために、本発明者らは、設計したCRISPRアレイを、既に構築した2つのキシロース誘導可能なシステム(pBAV1KT5-XylR-mCherry-Pldha+XylA及びpBAV1KT5-XylR-mCherry-PxylA)に挿入した。これらのプラスミドにおいて、本発明者らは、mCherryを、CRISPRアレイを含有するgBlockで置き換えた(図7)。Pldha+XylAプロモーターを含むバリアントは、より強力であると予想され、PxylAより高い基礎活性を有する(Xieら、2013年)。
本発明者らが、大腸菌においてプラスミドを構築した後、プラスミドをSサーモフィルスに形質転換した。これにより、本発明者らが、特定の細菌種の細胞死を引き起こすかどうかを決定することを可能にする。興味深いことに、強力なPldh+XylAハイブリッドプロモーターを含有するプラスミドに曝露したSサーモフィルスにおける細菌宿主集団サイズ(細菌を成長させ、寒天プレート上のコロニーをカウントすることにより示す)は、弱い通常のPxylAプロモーターを含有するプラスミドに曝露したSサーモフィルスと比較して10分の1であり(図8;強力なアレイ発現を含む52個のコロニー対弱いアレイ発現を含む556個のコロニー、10.7倍の差)、2種の株は、エレクトロコンピテントSサーモフィルス細胞の同じバッチを使用して並行して形質転換した。これは、本発明者らに、Sサーモフィルス遺伝子を標的化するCRISPRアレイを有するプラスミドが、内因性Casヌクレアーゼ及びRNaseIIIを使用して、細胞を死滅させ、これにより、集団成長を10分の1に阻害することができることを示唆する。
この研究において、本発明者らは、内因性Cas9システムを使用して、Sサーモフィルスを特異的に死滅させるためのCRISPRアレイを設計することを提示する。死滅シグナルに渡る対照を得るために、本発明者らは、Sサーモフィルスにおいて適用し得る誘導可能なシステムを適用しようと努めた。Bメガテリウム由来のキシロース誘導可能なXylRシステムを、Sミュータンス(Xie、2013年)においては既に適用したが、Sサーモフィルスにおいては適用していない。本研究において、本発明者らは、Sサーモフィルスにおいて設計したXylR-mCherry-Pldhaを使用してxylR誘導システムの機能性を示した。本発明者らは、0.1%wt/volが、SサーモフィルスにおいてXylRシステムを完全に誘導するのに十分であることを見いだした(図6)。
実施例6は、ストレプトコッカス・サーモフィルスLMD-9の特定の成長阻害を示した。ここで、本発明者らは、成長阻害が、第2の株:ストレプトコッカス・サーモフィルスDSM20617においても得られ得ることを示す。したがって、実施例6において記載した方法を、後者の株に適用した(SサーモフィルスDSM20617についての選択培地が、2.5gl-1の2-フェニルエタノール(PEA)を添加したTH培地であることを除く)。
次に、本発明者らは、3種の混合集団における特定の細菌種の選択的成長阻害を示した。本発明者らは、ヒト及び動物の腸細菌叢においてみられる種を選択した(SサーモフィルスDSM20617(T)、ラクトバチルス・ラクチス及び大腸菌)。本発明者らは、2つのグラム陽性種(Sサーモフィルス及びLラクチス)を含めて、これが、前者の種の選択的死滅についての能力に影響を与えるかどうかを観察して、更に、これは、Sサーモフィルスと系統的に関連する種である(2つの種間の高い16sリボソームRNA配列同一性により示す)ので、Lラクチスを選択する困難さを増大させる(細菌叢における状況をより密接に模倣する)。Sサーモフィルス及びLラクチスは、共にファーミキューテス門である。更に、細菌叢を模倣するために、ヒト共生腸種(大腸菌)を含めた。
実施例6において提示した方法は、株を使用した(選択培地が、2.5gl-1の2-フェニルエタノール(PEA)を添加したTH培地であることを除く)。
0.5Mスクロース及び1%グリシンを添加したTH培地におけるLラクチスの一晩培養物を、同じ培地5mlにおいて100倍希釈し、OD6000.2〜0.7(接種後およそ2時間)まで30℃にて成長させた。7000×gにおいて5分間、4℃にて細胞を収集し、氷冷洗浄緩衝液(0.5Mスクロース+10%グリセロール)5mlを用いて3回洗浄した。細胞を洗浄した後、エレクトロポレーション緩衝液(0.5Mスクロース、10%グリセロール及び1mM MgCl2)中OD60015〜30に懸濁した。エレクトロポレーション緩衝液における細胞を、使用(1時間以内)まで4℃で維持するか、又はエッペンドルフ中のアリコート50μlを、液体窒素中において凍結し、後の使用のため-80℃において保存した。
1.2CRISPRアレイの活性化:混合体実験
SサーモフィルスDSM20617、LラクチスMG1363及び大腸菌TOP10を、SサーモフィルスのDNAポリメラーゼIII及びtetAを標的化するCRISPRアレイを含有するプラスミドを用いて遺伝子形質転換した。形質転換後、全ての細胞を、単独及び共同培養において3時間37℃において成長させて、これにより、プラスミドにおいてコードされる抗生物質抵抗性を発生させるための回復を可能にした。本発明者らは、CRISPRによりコードされる成長阻害の読み取り値としての形質転換効率を使用することを決定した。したがって、細胞を回復させた後、培養物を、TH培地、PEAを添加したTH及び全てカナマイシンを添加したマッコンキー寒天に播種し、1%キシロースにより誘導した。
2.0Lラクチス、大腸菌及びSサーモフィルス間の系統学的相違
Sサーモフィルス及びLラクチスの16SrrNAをコードするDNA配列における計算した配列類似性を、83.3%と決定した。以下の16S配列を使用した:大腸菌:AB030918.1、Sサーモフィルス:AY188354.1、Lラクチス:AB030918。以下のパラメーター:-gapopen10.0、-gapextend0.5、-endopen10.0、-endextend0.5、-aformat3対、-snucleotide1、-snucleotide2を含む指針(http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html)を用いて、配列を整列させた。図11は、Sサーモフィルス、Lラクチス及び大腸菌由来の16S配列の最尤系統樹を示す。
Sサーモフィルス及びLラクチスは、多くの発酵食品及びヨーグルトに一般に使用される。これらの株は、宿主との密接な関連を形作る腸微生物であることが一般に知られおり、Sサーモフィルス及びLラクチスが系統的に密接に関連するという、これらの生物の16SリボソームRNA領域の従前の特徴決定が示されている(Ludwigら、1995年)ので、本発明者らはこれらの株を選択する。並行して、本発明者らはまた、大腸菌はまた、腸微生物コミュニティーにおいて一般に見られるので、本発明者らの混合集団の同時培養実験のためこの生物の成長を評価した。本発明者らは、本発明者らが同時培養実験のため使用することを計画した全ての株について成長を支援する細菌の株及び培養プロトコールを提示する。本発明者らは、全ての株が、37℃でのTHブロスにおける成長を支援することが可能であることを見いだした(図3)。
本発明者らは、CRISPRアレイを含有するプラスミドを用いてSサーモフィルス、Lラクチス及び大腸菌を形質転換し、等しい量で合わせた全ての細菌種の混合体においてそれらを培養し、それにより、本発明者らが、Sサーモフィルスにおいて細胞死を特異的に引き起こし得るかを決定することを可能にした。本発明者らは、全ての種を、pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PXylA又はpBAV1KT5-XylR-CRISPR-Pldha+XylAプラスミドを用いて形質転換した。
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実施例8において、本発明者らは、驚くべきことに、異なる種の混合した混合体における選択的集団成長阻害について、宿主細菌における内因性Casヌクレアーゼ活性を利用する可能性を確立した。次に、本発明者らは、異なる種の混合した混合体における選択的集団成長阻害について、ベクターがコードするCas活性を使用する代わりの可能性を調査した。本発明者らは、3種の異なる種、及び標的細菌の代わりの株を更に含む混合集団における特定の細菌種の選択的成長阻害を示した。本発明者らは、驚くべきことに、予め決定した標的種のまさに標的株の選択的成長阻害を示す。更に、代替の株を、ベクターがコードするCRISPR/Casシステムは標的にせず、ヒト又は動物の腸細菌叢エレメントを模倣した混合した細菌の混合体におけるこのようなベクターが生じたシステムのすばらしい特異性を確立するのが望ましい。
1.材料及び方法
1.1.プラスミド及び株
表7及び8を参照。別段示さない限り、全ての株を、トッドヘヴィットブロス(TH)(T1438 Sigma-Aldrich)において、好気性条件で37℃にて培養した。株を、25%グリセロール中-80℃にて保存した。
自己標的化sgRNA-Cas9複合体は、それぞれ、テオフィリンリボスイッチ及びAraC/PBAD発現系によりしっかり調節された。Cas9のしっかりした調節は、大腸菌において安定的に行うのに望ましい。プラスミドは、大腸菌のK-12株を標的化するシングルガイドRNA(sgRNA)を含むストレプトコッカス・ピオゲネス由来の外来Cas9を含有していた。したがって、K-12由来の株TOP10は、システムが活性化されたとき、2本鎖自己切断及び続く死に影響されやすかった。Nissleの様な大腸菌の株は、同じ標的配列を有し、したがって、それらは、sgRNA-Cas9活性により影響されなかった。実施例9において使用した配列を示す、以下の表9〜11を参照のこと。本発明者らは、シングルgRNA設計を使用して、死滅化を促進するための複数の場所での宿主細胞ゲノムを切断する機会を増大させた、標的細胞において保存され、複数のコピー(7つのコピー)で提示される標的配列(リボソームRNAをコードする配列)を選択する。
図13は、spCas9及びリボソームRNAサブユニット16sを標的にする自己標的化sgRNAの発現を制御する制御因子を示す。
1.2.鑑別成長培地
全ての株を、TH培地上37℃において20時間成長させた。Bスブチリス用の選択培地は、5gl-1の2-フェニルエタノール(PEA)を添加したTH培地であった。PEAを培地に加え、121℃にて15分間、15psiにおいてオートクレーブにかけた。1.5%(wt/vol)寒天を対応する培地に加えることにより、寒天プレートを調製した。
1.3.クローニング
全てのサブクローニング手法において、大腸菌(One Shot(登録商標)ThermoFischer社 TOP10 Chemically Competent cells)を使用した。Phusion(商標)ポリメラーゼを使用して、PCRを行った。全てのPCR産物を、製造元のプロトコールに従い、Macherey-Nagel(商標)によるNucleospin(商標)Gel及びPCR Clean-upを用いて精製した。精製したフラグメントを、総容量34μlの1μl酵素を含む1×FD緩衝液中の制限酵素DpnIを用いて切断した。切断した反応物を、製造元のプロトコールに従い、Macherey-NagelによるNucleospin Gel及びPCR Clean-upを用いて再度精製した。製造元のプロトコール(New England Biolabs社)に従い、10μl反応物において、Gibsonアセンブリーを行った。
製造元の指示に従い、Qiagenキットを使用して、プラスミドDNAを調製した。グラム陽性株のための改変は、細胞溶解を促進するための0.5%グリシン及びリゾチームを添加した培地での細菌の成長を含んでいた。
1.4.形質転換
1.4.1エレクトロコンピテント大腸菌細胞及び形質転換
市販のエレクトロコンピテント細胞(One Shot(登録商標)ThermoFischer社 TOP10 electrompetent E. coli)を、クローニング及び実験のため使用した。エレクトロポレーションを、Electro Cell Manipulator(BTX Harvard Apparatus ECM630)を使用して、標準設定:1800V、25μF及び200Ωを使用して行った。パルス後、LB-SOC培地1mlを加え、細胞を37℃にて1時間インキュベーションした。形質転換した細胞を、対応する抗生物質を含有するLB寒天において播種した。
1.5.大腸菌及び混合体実験におけるsgRNA-Cas9の活性化
K-12由来の株のリボソームRNAをコードする配列を標的化するsgRNAを含有するプラスミドを含む大腸菌TOP10とNissleの両方、及び他の細菌を、一晩、THブロス3mlにおいて成長させた。翌日、細胞を、OD約0.5まで成長させ、次に、96ウェルレプリケーター(Mettler Toledo Liquidator(商標)96)を使用して、TH培地に10倍連続希釈して、液滴4μLを、TH寒天、インデューサー(1%アラビノース及び2mMテオフィリン)を含むTH寒天、2.5gl-1PEAを添加したTH寒天及び1%マルトースを添加したマッコンキー寒天にスポットした。プレートを、20時間、37℃にてインキュベーションし、コロニー形成単位(CFU)を、三連の測定値から計算した。
2.結果
2.1外来CRISPR-Cas9システムを使用した大腸菌の株の特異的標的化
本発明者らは、まず、システムが、大腸菌TOP10とNissleの両方において死滅化システムを導入することにより、2つの大腸菌の株間で区別できるかを試験した。
2.1混合培養物における外来CRISPR-Cas9システムを使用した大腸菌の標的化
両方の大腸菌の株、Bスブチリス、Lラクチスについて二連で、及び混合培養物について三連で、一晩培養物の連続希釈を行った。全ての株を、37℃にて20時間、インデューサーを含む選択プレート、及び含まない選択プレートにおいて成長させた。システムの導入は、他の細菌を未変性のままにしながら、K-12由来株を標的化するsgRNA-Cas9を活性化する。
異なる細菌を混合培養から区別することは、異なる種の細胞数を決定し、種の特異的な除去を決定するために重要である。マッコンキー寒天は、大腸菌を選択的に成長させ、PEA寒天は、グラム陰性(大腸菌)からグラム陽性(Bスブチリス)の単離のため使用される選択培地である。加えて、本発明者らは、異なる濃度のPEAが、他のグラム陽性のものの成長を部分的に阻害することを見いだした。2.5gl-1のPEAが、L大腸菌及びLラクチスの成長を制限しながら、Bスブチリスを選択的に成長させることを証明した。
図14は、誘導可能な、外来のベクターから生じたCRISPR-Casシステムによる大腸株の特異的標的化を示す。sgRNAは、K-12由来大腸株の大腸菌TOP10のゲノムを標的にし、一方、試験した他の株は影響されなかった。
図15は、この研究において使用した個々の細菌種の連続希釈液及びCRISPR-Cas9システムの誘導なしでのTH寒天における混合培養物を用いたスポットアッセイを示す。
図16は、異なる選択培地上での希釈液103のスポットアッセイを示す。2.5gl-1PEAを含むTHは、Bスブチリス(subtilis)単独の選択培地である。マルトースを添加したマッコンキーは、グラム陰性及び腸内桿菌を選択的に単離し、マルトース発酵に基づきそれらを鑑別するように設計された細菌用選択及び鑑別培地である。したがって、TOP10ΔmalK変異体は、プレート上で白色のコロニーを生じ、一方、Nissleは、ピンク色のコロニーを生じる;Aは、大腸菌(E coli)ΔmalK、Bは、大腸菌Nissleであり、Cは、Bスブチリス(subtilis)であり、Dは、Lラクチス(L lactis)であり、Eは、混合培養物であり;マッコンキー-/B及びEでの画像は、ピンク色を出現し;マッコンキー+/B及びEでの画像は、ピンク色を出現する。図17は、異なる培地及び選択プレート上でのこの研究において使用した細菌の選択的成長を示す。本発明者らは、混合集団における標的大腸菌の株(図17におけるx軸上の「大腸菌」)を明らかに選択的に死滅する一方、他の関連する株(「大腸菌-Nissle」)を同様に死滅しないことを観察することができる。混合集団における標的株の死滅化は、本実験において1000倍であった。
[1]Zhang, X. Z.、及びZhang, Y. H. P.、(2011年)、Simple, fast and high-efficiency transformation system for directed evolution of cellulase in Bacillus subtilis、Microbial Biotechnology、4(1)、98〜105頁、http://doi.org/10.1111/j.1751-7915.2010.00230.x。
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本実施例は、宿主にとって内因性であるCas3及びリピート配列を使用したクロストリジウム・ディフィシルの迅速かつ高精度の死滅化についての例を提供する。
クロストリジウム・ディフィシル (Cディフィシル)は、健常個体の腸に無症候性コロニー形成し得る胞子形成ヒト日和見病原体である。院内下痢症のような、罹患しているCディフィシルと関連する疾患の2つの主なリスク因子は、年齢及び抗生物質処置であり、致死的な結果を有し得る。本発明者らの研究の対象であるCディフィシル630Δermは、十分に特徴付けられた株であり、変異体検体の作製のため広く使用されている。
研究目的
目的1:結合によるCGVのデリバリー
Cディフィシルを特異的に標的化し、死滅するためのアレイを含有するCRISPRによりガイドされるベクター(CGV)を設計し、構築した。アレイを欠く同じCGVを構築して、接合効率についての対照として使用した。両方のCGVを、担体株大腸菌CA434に形質転換し、プラスミドを対象のCディフィシル630Δermの本発明者らの株に接合するためのドナー株として使用した。
レシピエント標的株CディフィシルにおけるデリバリーされたCRISPRアレイの転写の際、内因性Cas3をガイドして、それ自体のDNAを切断し、これにより、細菌の死を導いた。
設計したCGVを使用した接合完了体Cディフィシル細胞の効率的な死滅の達成
材料及び方法
細菌の株及び成長条件
大腸菌の株CA434を、Chain Biotech社から取得した。それを、栄養素豊富な培地(2×YT)にて培養し、一晩、37℃及び250rpmにて成長させた。CGVを維持するために要求されるとき、培地に12,5μg/mLチアンフェニコールを添加した。
大腸菌CA434の担体細胞を、本発明者らのCGV(対照ベクターpMTL84151-FJ797649及びCRISPRベクターpMTL84151-cdCRISPR1)のいずれかのエレクトロポレーションにより得た。それを行うために、大腸菌CA434の一晩培養物を、選択せずに新鮮な2×YT培地に1:100希釈し、OD600約0.5まで成長させた。次に、標準的な手法(Sharanら、2009年)によりそれらをエレクトロコンピテントにした。エレクトロコンピテント細胞を、プラスミドpMTL84151-FJ797649又はpMTL84151-cdCRISPR1のいずれかを用いて、形質転換し、2×YTにおいて1時間37℃にて振盪(250rpm)しながら回復させた。最終的に、それらを、形質転換体の選択のための12.5μg/mLチアンフェニコールを添加したLB寒天上に播種した。形質転換体を、Cディフィシルとの接合のため、12.5μg/mLチアンフェニコールを添加した液体2×YTにおいて、37℃及び250rpmにて成長させた。ドナー細胞1mlを、4000×gにて2分間遠心分離し、上清を取り除き、PBS400μlを用いて注意深く洗浄した。第2の遠心分離サイクル後、ペレットを、BHI非選択的プレートにおけるCディフィシルとの接合のため嫌気チャンバーに移した。改変したプロトコール(Des Purdyら、2002年)に従い、接合のため、Cディフィシルを調製した。Cディフィシル630Δermを、選択的BHIS+CCプレートにおいて一晩インキュベーションし、それから、掻爬物を、一晩、非選択的BHI1mlにおいて接種し、接合のため、一晩インキュベーションした。その培養物200μlを使用して、ペレット化したドナー細胞を再懸濁し、混合培養物を、非選択的BHIプレートの上部に20μlのスポットで播種した。接合物を24時間インキュベーションして、接合を可能にした。インキュベーション後、プレート全体を、無菌の接種ループを用いて徹底的に掻把し、BHIに再懸濁し、連続希釈液を、ドナー大腸菌の成長を妨げるためのBHI+CCプレート上及び接合完了体のさらなる選択のためチアンフェニコールを添加したBHI+CC上に播種した。48時間後に、シングルコロニーをカウントした。
対照CGVを有するCディフィシル接合完了体を選択する、BHI+CC+チアンフェニコールプレートの複製物は、1回の接合実験当たり約600〜750CFUを生じる一定数のコロニーを示した。CディフィシルのCRISPRアレイを含むCGVを有する大腸菌CA434との接合のため、プレートは何もなく、コロニーを観察しなかった。これは、CRISPRアレイを受け取った接合完了体Cディフィシル630Δerm細胞の100%の死滅に変える(図18:接合完了体Cディフィシル630Δermの死滅を参照)。
この実験の結果は、本発明者らが、所望のCRISPRアレイを含有するCGVを、大腸菌担体細菌からCディフィシル630Δermに首尾よく接合できたことを示す。本発明者らはまた、非常に効率的なCRISPR死滅のためCディフィシル内因性Cas3機構を首尾よく利用し得る。
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TABLE 1:本発明における使用のためのSRBのリピート配列
例えば、システムが、粗製油、天然のガス若しくは水回収、処理又は保存装置であるとき、R1及びR1'の各々が、これらのリピートコンセンサス配列から選択することができる。
下線=VコレラエPLE内の配列と100%同一性を有するCRISPRスペーサー
(a)Cディフィシルを標的化するpMTL84151-cdCRISPR1における設計スペーサーの概要
一例では、本発明の1つ又は複数のスペーサーは、この配列表におけるそれぞれの配列を標的にする。配列番号1〜44は、II型CRISPR/Casシステム配列、例えば、ストレプトコッカス属の配列である。
Claims (52)
- 宿主細胞を死滅させるための、又は宿主細胞の成長を低減するための宿主改変(HM)-CRISPR/Casシステムであって、宿主細胞は、クロストリジウム属細胞であり、
(a)宿主細胞におけるHM-crRNAの発現のための、前記HM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列であって、各crRNAは、それぞれの宿主細胞においてCas3及びCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casとともに作動可能であり、
(i)1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能であり、標的配列は、CCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含む又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列と
を含む遺伝子操作された核酸配列と、
(b)CASCADE Casと、
(c)Cas3又は宿主細胞においてCas3を発現するためのCas3をコードするヌクレオチド配列又はそのオルソログ若しくは相同体と
を含み、
発現されたHM-crRNAは、宿主細胞においてCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ若しくは相同体と組み合わせることが可能であり、Cas3、オルソログ又は相同体は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減できる、システム。 - 遺伝子操作された配列が、宿主細胞におけるHM-crRNAの発現のために前記HM-crRNAをコードし、各crRNAが、それぞれの宿主細胞においてCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列が、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能であり、標的配列が、CCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含む又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列と
を含む、請求項1に記載のシステムにおいて使用するための遺伝子操作されたヌクレオチド配列。 - Cas3が、配列番号275〜286及び273から選択されるアミノ酸配列又は前記選択された配列と少なくとも70%同一である配列を含む、請求項1又は2に記載のシステム又は遺伝子操作された配列。
- (i)のリピート配列が、配列番号290〜513及び138〜209から選択されるリピート配列又は前記選択された配列と少なくとも70%同一である配列である、請求項1から3のいずれか一項に記載のシステム又は遺伝子操作された配列。
- リピート配列が、
(a)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルR20291株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号138〜146及び496〜513、
(b)任意選択で、宿主細胞が、Cディフィシル630株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号147〜158、290〜306及び370〜384、
(c)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルATCC45233株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号159〜166、
(d)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルBi-9株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号167〜175;
(e)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルM120株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号176〜181及び470〜476;
(f)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCF5株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号182〜187;
(g)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCD002株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号188〜194;
(h)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCD3株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号195〜201;
(i)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCD69株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号202〜209;
(j)任意選択で、宿主細胞が、Cディフィシル2007855株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号351〜369;
(k)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルBI1株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号385〜419;
(l)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルBI9株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号420〜434;又は
(m)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCD196株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号435〜452;
(n)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルBI9株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号420〜434;
(o)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCF5株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号453〜468;又は
(p)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルM68株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号477〜495
から選択されるリピート配列である、請求項4に記載のシステム又は遺伝子操作された配列。 - 標的ヌクレオチド配列が、配列番号220、222、224、226、228、229、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、259及び260から選択される配列により含まれる、請求項1から5のいずれか一項に記載のシステム又は遺伝子操作された配列。
- 標的ヌクレオチド配列が、宿主細胞におけるシグマ因子媒介性遺伝子発現カスケードにより含まれる遺伝子により含まれる、請求項1から5のいずれか一項に記載のシステム又は遺伝子操作された配列。
- 標的配列の転写が、宿主細胞種の細胞において、
(a)σE、
(b)σF、
(c)σG、
(d)σH、
(e)σK、
(f)Spo0A、
(g)SpoIIID、
(h)SpoVT、又は
(i)SpoIIR
によって制御される、請求項1から7のいずれか一項に記載のシステム又は遺伝子操作された配列。 - 標的ヌクレオチド配列が、宿主細胞種においてシグマ因子の転写を直接的又は間接的に制御する産物をコードする遺伝子により含まれる、請求項1から8のいずれか一項に記載のシステム又は遺伝子操作された配列。
- 標的ヌクレオチド配列が、表12〜17及び23に列挙される遺伝子から選択される遺伝子又はその相同体、オルソログ又は機能的同等物により含まれる、請求項1から9のいずれか一項に記載のシステム又は遺伝子操作された配列。
- 標的配列が、ステージI、II、III、IV若しくはV胞子形成遺伝子により含まれる、又は胞子コートタンパク質をコードする、請求項1から10のいずれか一項に記載のシステム又は遺伝子操作された配列。
- 宿主細胞を死滅させるための、又は宿主細胞の成長を低減するためのHM-CRISPR/Casシステムであって、宿主細胞は、大腸菌細胞であり、
(a)宿主細胞におけるHM-crRNAの発現のための、前記HM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列であって、各crRNAは、それぞれの宿主細胞においてCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、
(i)1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能であり、標的配列は、AWGを含む又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列と
を含む遺伝子操作された核酸配列と、
(b)CASCADE Casと、
(c)Cas3又は宿主細胞においてCas3を発現するためのCas3をコードするヌクレオチド配列又はそのオルソログ若しくは相同体と
を含み、
発現されたHM-crRNAは、宿主細胞においてCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ若しくは相同体と組み合わせることが可能であり、Cas3、オルソログ又は相同体は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減できる、システム。 - 遺伝子操作された配列が、宿主細胞におけるHM-crRNAの発現のために前記HM-crRNAをコードし、各crRNAが、それぞれの宿主細胞においてCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列が、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能であり、標的配列が、AWGを含む又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列と
を含む、請求項12に記載のシステムにおいて使用するための遺伝子操作されたヌクレオチド配列。 - Cas3が、配列番号287〜289、261及び263から選択されるアミノ酸配列又は前記選択された配列と少なくとも70%同一である配列を含む、請求項12に記載のシステム又は請求項13に記載の遺伝子操作された配列。
- リピート配列が、配列番号514〜731及び210〜213から選択されるリピート配列又は前記選択された配列と少なくとも70%同一である配列である、請求項12から14のいずれか一項に記載のシステム又は遺伝子操作された配列。
- リピート配列が、
(a)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌K12株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号210〜212及び691〜695、
(b)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌O157:H7株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号213、677及び678、
(c)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌042株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号514〜518、
(d)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌1303株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号519〜521;
(e)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌536株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号522〜527;
(f)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌55989株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号528又は529;
(g)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌ACN001株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号530〜532;
(h)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌APEC株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、;配列番号533〜545
(i)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌APEC IMT5155株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号533〜537;
(j)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌APEC O1株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号538〜542;
(k)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌APEC O78株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号543〜545;
(l)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌B株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号546〜560;
(m)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌B REL606株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号556〜560;
(n)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌BL21株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号561〜574;
(o)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌BW25113株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号575〜578;
(p)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌BW2592株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号579〜582;
(q)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌C(例えば、ATTC8739)株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号583〜588;
(r)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌DH1株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号589〜597;
(s)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌E24377A株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号598〜600;
(t)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌ECC-1470株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号601〜603;
(u)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌ED1a株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号604〜608;
(v)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌ER2796株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号609〜612;
(w)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌ETEC(例えば、H10407)株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号613〜618;
(x)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌LF82株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号644〜667;
(y)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌LY180株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号668〜670;
(z)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌O104:H4株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号671〜673;
(aa)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌O111:H(例えば、1128)株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号674〜676;
(bb)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌P12b株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号679〜684;
(cc)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌PCN033株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号685;
(dd)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌PCN061株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号686〜689;
(ee)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌SECEC SMS-3-5株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号690;
(ff)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌K12 MC4100株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号691〜695;
(gg)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌UM146株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号696〜699;
(hh)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌UMN026株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号700〜707;
(ii)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌UMNF18株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号708〜711;
(jj)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌UMNK88株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号712〜715;
(kk)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌UT189株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号716〜720;
(ll)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌VR50株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号721〜723;
(mm)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌W株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号724〜729;又は
(nn)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌Xuzhou21株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号730若しくは731
から選択されるリピート配列である、請求項15に記載のシステム又は遺伝子操作された配列。 - PAMが、AAG、AGG、GAG又はATGを含む又はからなる、請求項12から16のいずれか一項に記載のシステム又は遺伝子操作された配列。
- 宿主細胞を死滅させるための、又は宿主細胞の成長を低減するためのHM-CRISPR/Casシステムであって、宿主細胞は、ストレプトコッカス属細胞であり、
(a)宿主細胞におけるHM-crRNAの発現のための、前記HM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列であって、各crRNAは、それぞれの宿主細胞においてCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、
(i)任意選択で、配列番号215〜218から選択されるリピート配列である1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能であり、標的配列は、NNAGAAW、NGGNG又はAWを含む又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列と
を含む遺伝子操作された核酸配列と、
(b)CASCADE Casと、
(c)Cas3(任意選択で、配列番号265のアミノ酸配列を含む)又は宿主細胞においてCas3を発現するためのヌクレオチド配列(任意選択で、配列番号266を含む)又はそのオルソログ又は相同体と
を含み、
発現されたHM-crRNAは、宿主細胞においてCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ若しくは相同体と組み合わせることが可能であり、Cas3、オルソログ又は相同体は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減できる、システム。 - 遺伝子操作された配列が、宿主細胞におけるHM-crRNAの発現のために前記HM-crRNAをコードし、各crRNAが、それぞれの宿主細胞においてCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、Cas3が、任意選択で、配列番号265のアミノ酸配列を含むか、又は任意選択で、配列番号266を含むヌクレオチド配列によってコードされ、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)任意選択で、配列番号215〜218から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列が、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能であり、標的配列が、NNAGAAW、NGGNG又はAWを含む又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列と
を含む、請求項18に記載のシステムにおいて使用するための遺伝子操作されたヌクレオチド配列。 - PAMが、AA、AT又はAGを含む又はからなる、請求項18に記載のシステム又は請求項19に記載の遺伝子操作された配列。
- 宿主細胞を死滅させるための、又は宿主細胞の成長を低減するためのHM-CRISPR/Casシステムであって、宿主細胞は、サルモネラ属細胞であり、
(a)宿主細胞におけるHM-crRNAの発現のための、前記HM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列であって、各crRNAは、それぞれの宿主細胞においてCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、
(i)任意選択で、配列番号214である1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である、スペーサー配列と
を含む遺伝子操作された核酸配列と、
(b)CASCADE Casと、
(c)任意選択で、配列番号267若しくは269のアミノ酸配列を含むCas3又は宿主細胞においてCas3を発現するためのヌクレオチド配列(任意選択で、配列番号268又は270を含む)又はそのオルソログ若しくは相同体と
を含み、
発現されたHM-crRNAは、宿主細胞においてCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ若しくは相同体と組み合わせることが可能であり、Cas3、オルソログ又は相同体は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減できる、システム。 - 遺伝子操作された配列が、宿主細胞におけるHM-crRNAの発現のために前記HM-crRNAをコードし、各crRNAが、それぞれの宿主細胞においてCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、Cas3が、任意選択で、配列番号267若しくは269のアミノ酸配列を含むか、又は任意選択で、配列番号268若しくは270を含むヌクレオチド配列によってコードされ、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)任意選択で、配列番号214である1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列が、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である、スペーサー配列と
を含む、請求項21に記載のシステムにおいて使用するための遺伝子操作されたヌクレオチド配列。 - Cas3及び/又はCASCADE Casが、宿主細胞の内因性Casである、請求項1から22のいずれか一項に記載のシステム又は遺伝子操作された配列。
- 遺伝子操作された配列が、核酸ベクター、任意選択で、ウイルス、ファージ、ファスミド、プラスミド又は接合性プラスミドにより含まれる、請求項1から23のいずれか一項に記載のシステム又は遺伝子操作された配列。
- 遺伝子操作された配列のコピーが、複数の担体細菌により含まれ、任意選択で、担体細菌細胞が、ラクトバチルス属細胞である、請求項1から24のいずれか一項に記載のシステム又は遺伝子操作された配列。
- 発現されたHM-crRNAが、宿主細胞においてCASCADE Cas及びCas3又はその前記オルソログ又は相同体を組み合わせることが可能であり、Cas3が、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減でき、それによって、対象における前記宿主細胞の割合を低減し、対象における宿主細胞感染を処置する、ヒト又は動物対象における前記宿主細胞の感染を処置又は予防するための請求項1から25のいずれか一項に記載のシステム又は遺伝子操作された配列。
- 請求項1から26のいずれか一項に記載のシステム又は遺伝子操作された配列及び薬学的に許容される希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物。
- 混合細菌集団を含む、ヒト又は非ヒト動物対象においてクロストリジウム属感染を処置する方法であって、集団は、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)クロストリジウム属種の複数の宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種は、前記クロストリジウム属種とは異なり、
各宿主細胞は、
(a)CCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含む又はからなるPAMと、
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列と、
(c)宿主細胞においてCas3ヌクレアーゼとともに作動可能なCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列と、
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列と
を含み、
第1の細胞は、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、方法は、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列の複数コピーを含む医薬組成物を投与する工程と、
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程とを含み、
各HM-crRNAは、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、それぞれの宿主細胞においてCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記それぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)任意選択で、配列番号138〜209及び290〜513から選択されるリピート配列である1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において前記宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である、スペーサー配列と
を含む核酸配列を含み、
発現されたHM-crRNAは、任意選択で、配列番号273及び275〜286から選択されるアミノ酸配列を含む、又は配列番号274のヌクレオチド配列によってコードされるCASCADE Cas及びCas3又はそのオルソログ若しくは相同体と組み合わされ、Cas3は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減させ、それによって、対象における前記宿主細胞の割合を低減し、クロストリジウム属感染を処置する、方法。 - 混合細菌集団を含む、ヒト又は非ヒト動物対象において大腸菌感染を処置する方法であって、集団は、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)複数の大腸菌宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種は、大腸菌ではなく、
各宿主細胞は、
(a)AWGを含む又はからなるPAMと、
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列と、
(c)宿主細胞においてCas3ヌクレアーゼとともに作動可能なCASCADE Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列と、
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列と
を含み、
第1の細胞は、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、方法は、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列の複数コピーを含む医薬組成物を投与する工程と、
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程とを含み、
各HM-crRNAは、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、それぞれの宿主細胞においてCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記それぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)任意選択で、配列番号210〜213及び514〜731から選択されるリピート配列である1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において前記宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である、スペーサー配列と
を含む核酸配列を含み、
発現されたHM-crRNAは、任意選択で、配列番号261、263及び287〜289から選択されるアミノ酸配列を含む、又は配列番号262若しくは264のヌクレオチド配列によってコードされるCASCADE Cas及びCas3又はそのオルソログ若しくは相同体と組み合わされ、Cas3は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減させ、それによって、対象における前記宿主細胞の割合を低減し、大腸菌感染を処置する、方法。 - 混合細菌集団を含む、ヒト又は非ヒト動物対象においてストレプトコッカス属感染を処置する方法であって、集団は、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)ストレプトコッカス属種の複数の宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種は、前記ストレプトコッカス属種とは異なり、
各宿主細胞は、
(a)NNAGAAW、NGGNG又はAWを含む又はからなるPAMと、
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列と、
(c)宿主細胞においてCas3ヌクレアーゼとともに作動可能なCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列と、
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列と
を含み、
第1の細胞は、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、方法は、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列の複数コピーを含む医薬組成物を投与する工程と、
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程とを含み、
各HM-crRNAは、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、それぞれの宿主細胞においてCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記それぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)任意選択で、配列番号215〜218から選択されるリピート配列である1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において前記宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である、スペーサー配列と
を含む核酸配列を含み、
発現されたHM-crRNAは、任意選択で、配列番号265のアミノ酸配列を含む、又は配列番号266のヌクレオチド配列によってコードされるCASCADE Cas及びCas3又はそのオルソログ若しくは相同体と組み合わされ、Cas3は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減させ、それによって、対象における前記宿主細胞の割合を低減し、ストレプトコッカス属感染を処置する、方法。 - 混合細菌集団を含む、ヒト又は非ヒト動物対象においてサルモネラ属感染を処置する方法であって、集団は、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)サルモネラ属種の複数の宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種は、前記サルモネラ属種とは異なり、
各宿主細胞は、
(a)PAMと、
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列と、
(c)宿主細胞においてCas3ヌクレアーゼとともに作動可能なCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列と、
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列と
を含み、
第1の細胞は、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、方法は、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列の複数コピーを含む医薬組成物を投与する工程と、
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程とを含み、
各HM-crRNAは、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、それぞれの宿主細胞においてCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記のそれぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)任意選択で、配列番号214である1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において前記宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である、スペーサー配列と
を含む核酸配列を含み、
発現されたHM-crRNAは、任意選択で、配列番号267若しくは269のアミノ酸配列を含む、又は配列番号268若しくは270のヌクレオチド配列によってコードされるCASCADE Cas及びCas3又はそのオルソログ若しくは相同体と組み合わされ、Cas3は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減させ、それによって、対象における前記宿主細胞の割合を低減し、サルモネラ属感染を処置する、方法。 - Casであり、宿主細菌又は古細菌細胞の標的ヌクレオチド配列を認識するようにプログラムされ、それによって、プログラムされたヌクレアーゼが、ヌクレオチド配列を改変可能であり、ヌクレオチド配列が、宿主細胞におけるシグマ因子媒介性遺伝子発現カスケードにより含まれる標的遺伝子により含まれる、請求項1、3から12、14から18、20、21及び23から26のいずれか一項に記載のシステムにおいて使用するためのガイド型ヌクレアーゼ。
- ヌクレオチド配列が、前記カスケードのシグマ因子をコードする遺伝子により含まれる、請求項32に記載のヌクレアーゼ。
- (a)σE、
(b)σF、
(c)σG、
(d)σH、
(e)σK、
(f)Spo0A、
(g)SpoIIID、
(h)SpoVT又は
(i)SpoIIR
によって、宿主細胞種の細胞において標的遺伝子の転写が制御される、請求項32に記載のヌクレアーゼ。 - ヌクレオチド配列が、
(a)σE、
(b)σF、
(c)σG、
(d)σH、
(e)σK、
(f)Spo0A、
(g)SpoIIID、
(h)SpoVT又は
(i)SpoIIR
をコードする遺伝子により含まれる、請求項32に記載のヌクレアーゼ。 - 標的ヌクレオチド配列が、表12〜17及び23に列挙される遺伝子から選択される遺伝子又はその相同体、オルソログ又は機能的同等物により含まれる、請求項32に記載のヌクレアーゼ。
- 標的ヌクレオチド配列が、配列番号220、222、224、226、228、229、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、259及び260から選択される配列と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列により含まれる、請求項32に記載のヌクレアーゼ。
- 標的配列が、配列番号219、221、223、225、227、230、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255及び257から選択される配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列をコードする、請求項32に記載のヌクレアーゼ。
- 標的配列が、spo0A、spoIIID、sigK、sigF、sigH、Spo0A-Pホスファターゼ、spoIIE、spoIIAA、spoIIAB、spoIIGA、sigE、spoIIR、sigG、SpoIIIA、spoIID、SpoIIQ、SpoIVB又はCtpB遺伝子により含まれる、請求項32に記載のヌクレアーゼ。
- 宿主細胞が、Cディフィシル細胞であり、標的配列が、CディフィシルutxA、毒素A又はCディフィシル毒素B遺伝子により含まれる、請求項32に記載のヌクレアーゼ。
- 宿主細胞が、Cディフィシル細胞であり、標的配列が、Cディフィシルcdu2、cdu1、tcdD、tcdB、tcdE、tcdA、tcdC、cdd1、cdd2、cdd3又はcdd4遺伝子により含まれるヌクレオチド配列により含まれる、請求項32に記載のヌクレアーゼ。
- 標的配列が、ステージI、II、III、IV若しくはV胞子形成遺伝子により含まれる、又は胞子コートタンパク質をコードする、請求項32に記載のヌクレアーゼ。
- 宿主細胞に感染又は形質転換可能である核酸ベクター(任意選択で、バクテリオファージ、ファスミド又は接合性プラスミド)であって、請求項32から42のいずれか一項に記載のヌクレアーゼをコードするベクター。
- ヌクレアーゼをプログラミングするための1種若しくは複数のcrRNA若しくはガイドRNA(gRNA)と組み合わせた状態にあり、又はこのようなcrRNA若しくはgRNAをコードする核酸と組み合わせた状態にある、請求項32から42のいずれか一項に記載のヌクレアーゼ又は請求項43に記載のベクター。
- ヌクレアーゼがCas3であり、Cas又はベクターが、1種又は複数のCASCADE Cas(任意選択で、CasA、B、C、D及びE又はCas1若しくはCas2)をコードする核酸と組み合わせた状態にあり、前記Cas3が、宿主細胞の標的配列を改変するために前記CASCADE Casとともに作動可能である、請求項32から42のいずれか一項に記載のヌクレアーゼ又は請求項43に記載のベクター。
- Casヌクレアーゼが、大腸菌、Cディフィシル、サルモネラ・エンテリカ又はSサーモフィルスCas3である、請求項32から45のいずれか一項に記載のヌクレアーゼ又はベクター。
- Cas3が、配列番号273及び275〜286、261、263、287〜289、265、267及び269から選択されるアミノ酸配列又は前記選択された配列と少なくとも70%同一である配列を含む、請求項46に記載のヌクレアーゼ又はベクター。
- 細胞の標的配列を認識及び改変するようにヌクレアーゼをガイドするために、宿主細菌細胞において請求項32から42及び44から47のいずれか一項に記載のヌクレアーゼと組み合わせることが可能であるcrRNA又はシングルgRNAをコードする又は含む核酸分子。
- crRNA又はシングルgRNAが、配列番号138〜209及び290〜513から選択されるリピート配列と少なくとも70%同一である配列により含まれる配列を含み、任意選択で、宿主細胞が、Cディフィシル細胞である、請求項48に記載の核酸。
- 宿主細胞を感染又は形質転換可能である核酸ベクター(任意選択で、バクテリオファージ、ファスミド又は接合性プラスミド)であって、請求項48又は49に記載の核酸を含む、核酸ベクター。
- ヒト又は動物対象において疾患又は状態を処置又は予防するための医薬であって、宿主細胞によって媒介される疾患又は状態を処置又は予防するために対象に投与するための、請求項1から27及び32から50のいずれか一項に記載のシステム、配列、ベクター、ヌクレアーゼ又は核酸を含む医薬。
- 宿主細胞が、任意選択で、表18及び19中の株並びに表24中の配列番号275〜286について列挙された株から選択されるCディフィシル株のCディフィシル宿主細胞である、対象のCディフィシル感染を処置するための、請求項51に記載の医薬。
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