ES2844174T3

ES2844174T3 - Métodos, células y organismos

Info

Publication number: ES2844174T3
Application number: ES18174860T
Authority: ES
Inventors: Allan Bradley; Hanif Ali; E-Chiang Lee
Original assignee: Kymab Ltd
Current assignee: Kymab Ltd
Priority date: 2013-09-18
Filing date: 2014-09-18
Publication date: 2021-07-21
Anticipated expiration: 2034-09-18
Also published as: WO2015040402A1; US20170275611A1; EP2877571B1; DE202014010413U1; US20150079680A1; TW201542816A; ES2681622T3; EP2877571A1; EP3418379A3; US11920128B2; US20160257948A1; US20160257974A1; EP3418379B1; EP3842528A1; US20160177340A1; CN105637087A; EP3418379A2; US20190338274A1; US20160207983A1; EP3988649A1

Abstract

Un método de producción de una célula de mamífero o un organismo mamífero no humano transgénico, comprendiendo el método: (a) llevar a cabo un método de (i) inactivación génica de una secuencia nucleotídica diana por deleción de una secuencia nucleotídica que es de al menos 20 kb en el genoma de una primera célula; y/o (ii) activación génica de una secuencia nucleotídica de inserción que es de al menos 20 kb en el genoma de una primera célula; en el que la célula o progenie de la misma puede desarrollarse en un organismo o célula no humana; en el que el método comprende: (Ia) usar la escisión de ácido nucleico para crear una primera y segunda roturas en una hebra de ácido nucleico, creando así extremos de corte 5' y 3' y una secuencia nucleotídica entre los extremos, en el que la escisión se lleva a cabo combinando en una célula la hebra de ácido nucleico, una endonucleasa Cas9, un ARNcr y un ARNtracr para orientar la endonucleasa; (Ib) usar la recombinación homóloga para eliminar la secuencia nucleotídica, en el que la recombinación homóloga se lleva a cabo: (A) entre un ácido nucleico entrante que comprende un primer y segundo brazos de homología, en el que los brazos de homología son sustancialmente homólogos respectivamente de una secuencia que se extiende en dirección 5' desde el extremo 5' y una secuencia que se extiende en dirección 3' desde el extremo 3'; o (B) entre un ácido nucleico entrante que comprende una secuencia nucleotídica de inserción flanqueada por el primer y segundo brazos de homología, en el que los brazos de homología son sustancialmente homólogos respectivamente de una secuencia que se extiende en dirección 5' desde el extremo 5' y una secuencia que se extiende en dirección 3' desde el extremo 3', en el que la secuencia nucleotídica de inserción se inserta entre los extremos 5' y 3'; y/o (IIa) usar la escisión de ácido nucleico para crear extremos de corte 5' y 3' en una sola hebra de ácido nucleico, en el que la escisión se lleva a cabo combinando en una célula la hebra de ácido nucleico, una endonucleasa Cas9, un ARNcr y un ARNtracr para orientar la endonucleasa; (IIb) usar la recombinación homóloga para insertar una secuencia nucleotídica entre los extremos, en el que la secuencia de inserción comprende un elemento regulador o codifica toda o parte de una proteína, en el que la recombinación homóloga se lleva a cabo entre un ácido nucleico entrante que comprende una secuencia nucleotídica de inserción flanqueada por el primer y segundo brazos de homología, en el que los brazos de homología son sustancialmente homólogos respectivamente de una secuencia que se extiende en dirección 5' desde el extremo 5' y una secuencia que se extiende en dirección 3' desde el extremo 3', en el que la secuencia nucleotídica de inserción se inserta entre los extremos 5' y 3; (b) desarrollar la célula o progenie hasta un organismo no humano o una célula no humana.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos, células y organismos

Los inventores han ideado un enfoque para introducir una o más inserciones y/o deleciones deseadas de tamaños conocidos en una o más localizaciones predefinidas en un ácido nucleico (p.ej., en un genoma de célula u organismo). Desarrollaron técnicas para hacer esto de forma secuencial o bien insertando un fragmento de ADN discreto de tamaño definido en el genoma precisamente en una localización predefinida o bien llevando a cabo una deleción discreta de un tamaño definido en una localización precisa. La técnica está basada en la observación de que las roturas de ADN monocatenario se reparan preferencialmente mediante la ruta de HDR, y esto reduce las opciones de indeles (p.ej. producidas por NHEJ) en la presente invención y divulgación y por tanto es más eficaz que las técnicas de la técnica anterior.

Los inventores han ideado también nuevas técnicas denominadas recombinación dirigida por homología mediada por endonucleasa secuencial (sEHDR) y recombinación dirigida por homología mediada por Cas secuencial (sCHDR).

Antecedentes

Se ha mostrado que ciertas cepas bacterianas y arqueales contienen sistemas de defensa inmunitaria adaptativos altamente evolucionados, los sistemas CRISPR/Cas, que experimentan continuamente reprogramación para dirigir la degradación de secuencias complementarias presentes en el ADN vírico o plasmídico invasor. Se incorporan fragmentos cortos de ADN extraño, llamados espaciadores, al genoma entre las repeticiones de CRISPR y sirven como “memoria” de exposiciones pasadas. Se usan entonces los espaciadores de CRISPR para reconocer y silenciar elementos genéticos exógenos de manera análoga a la iARN en organismos eucarióticos.

El sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR) que incluye la proteína asociada a CRISPR (Cas) se ha reconstituido in vitro por una serie de grupos de investigación, permitiendo la escisión del ADN de casi cualquier molde de ADN sin el problema potencial de buscar el cortador enzimático de restricción correcto. El sistema CRISPR/Cas ofrece también una escisión de extremo romo que crea un ADNbc o, usando versiones mutadas de Cas, una escisión específica monocatenaria selectiva (véase Cong et al., Wang et al. y Mali et al. citados a continuación).

Mediante estudios in vitro que usan el sistema CRISPR/Cas de Streptococcus pyogenes de tipo II, se ha mostrado que los únicos componentes requeridos para una modificación de ADN o genoma diana mediada por CRISPR/Cas eficaz son una nucleasa Cas (p.ej., una nucleasa Cas9), ARN de CRISPR (ARNcr) y ARNcr transactivador (ARNtracr). El mecanismo de tipo silvestre de escisión de ADN mediada por CRISPR/Cas ocurre a través de varias etapas. La transcripción de la matriz de CRISPR, que contiene fragmentos pequeños (20-30 pares de bases) del ADN encontrado (o diana), hasta pre-ARNcr, que experimenta maduración mediante hibridación con ARNtracr a través de repeticiones directas de pre-ARNcr. La hibridación de pre-ARNcr y ARNtracr, conocidos como ARN guía (ARNg o ARNsg), se asocia con la nucleasa Cas formando un complejo de ribonucleoproteína que media la conversión de pre-ARNcr en ARNcr maduro. El dúplex de ARNcr:ARNtracr maduro dirige a Cas9 a la diana de ADN consistente en el protoespaciador y el motivo adyacente al protoespaciador necesario (motivo adyacente al protoespaciador de CRISPR/cas; PAM) a través de la formación de heterodúplex entre la región espaciadora del ARNcr y el ADN protoespaciador en el genoma diana. La nucleasa Cas9 media la escisión del ADN diana en dirección 5’ de PAM creando una rotura bicatenaria en el protoespaciador o una muesca específica de hebra usando una nucleasa Cas9 mutada, con lo que muta un motivo de escisión específico de hebra de ADN (por ejemplo, la nicasa Cas9 contiene una sustitución D10A) (Cong et al.).

Cabe señalar que se han aislado diferentes cepas de Streptococcus que usan secuencias de PAM que son diferentes de la usada por Cas9 de Streptococcus pyogenes. Esta última requiere una secuencia PAM NGG. Los sistemas CRISPR/Cas (por ejemplo, la endorribonucleasa Csy4 en Pseudomonas aeroginosa (véase Shah et al.) se han descrito en otras especies procarióticas que reconocen una secuencia de PAM diferente (p.ej., CCN, TCN, TTC, AWG, CC, NNAGNN, NGG, NGGNG). Cabe destacar que la Csy4 (también conocida como Cas6f) no tiene homología de secuencia con Cas9, pero la escisión de ADN ocurre mediante un mecanismo similar que implica el ensamblaje de un complejo de Cas-proteína-ARNcr que facilita el reconocimiento de ADN diana que conduce a una escisión de ADN específica (Haurwitz et al.).

El sistema CRISPR/Cas de tipo II reconstituido in vitro se ha adaptado y aplicado a una serie de diferentes ajustes. Estos incluyen crear una alteración génica selectiva en un gen individual o múltiples en citoblastos embrionarios y también una alteración génica individual o múltiples usando un enfoque de una etapa que usa cigotos para generar mutaciones bialélicas en ratones. La velocidad, exactitud y eficacia a las que podría aplicarse este sistema a la edición genómica, además de su capacidad multiplexadora, hacen a este sistema enormemente superior a sus tecnologías de edición genómica predecesoras, a saber nucleasas de dedo de cinc (ZFN), nucleasas efectoras de tipo activador de transcripción (TALEN) y meganucleasas domésticas genomanipuladas (Gaj et al. y Pérez-Pinera et al.). Estas se han usado exitosamente en diversos hospedadores eucarióticos, pero todas padecen importantes limitaciones: en particular mutagénesis fuera de diana que conduce a toxicidad relacionada con nucleasa, y también el tiempo y coste de desarrollar tales proteínas genomanipuladas. El sistema CRISPR/Cas por otro lado es un sistema de edición genómica superior mediante el que pueden introducirse mutaciones con facilidad relativa, simplemente diseñando un ARN de guía individual complementario de la secuencia protoespaciadora en el ADN diana.

La rotura de ADNbc inducida por una endonucleasa, tal como Cas9, se repara posteriormente mediante el mecanismo de unión de extremos no homólogos (NHEJ), con lo que la reparación de ADN posterior en la unión del punto de rotura se desarrolla con inserciones o deleciones (indeles) diferentes e impredecibles de tamaño variable. Esto es altamente indeseable cuando se requiere una edición de ácido nucleico o genoma precisa. Sin embargo, puede generarse una mutación precisa predefinida usando reparación dirigida por homología (HDR), p.ej. con la inclusión de un oligo donante o fragmento de ADN donante. Se ha mostrado que este enfoque con la nucleasa Cas9 genera mutaciones predefinidas precisas, pero la eficacia a la que esto ocurre en ambos alelos es baja y se observa mutación en una de las hebras de la diana de ADNbc (Wang et al.).

El sistema CRISPR/Cas tiene por lo tanto algunas limitaciones en su forma actual. Aunque puede ser posible modificar una secuencia deseada en una hebra de ADNbc, la secuencia en la otra hebra está a menudo mutada mediante NHEJ indeseable.

Compendio

La invención es como se presenta en las reivindicaciones.

Una primera configuración proporciona:

Un método de recombinación de ácido nucleico, comprendiendo el método proporcionar ADNbc que comprende una primera y segunda hebras y

(a) usar escisión de ácido nucleico para crear extremos de corte 5' y 3' en la primera hebra;

(b) usar recombinación homóloga para insertar una secuencia nucleotídica entre los extremos, produciendo así una primera hebra modificada; produciendo así ADN en el que la primera hebra se ha modificado por dicha recombinación, pero la segunda hebra no se ha modificado; y

(c) opcionalmente replicar la primera hebra modificada para producir un ADNbc de progenie en el que cada hebra del mismo comprende una copia de la secuencia nucleotídica insertada; y aislar el ADNbc de progenie.

Una segunda configuración proporciona:

Un método de recombinación de ácido nucleico, comprendiendo el método

(a) usar escisión de ácido nucleico para crear extremos de corte 5' y 3' en una hebra individual de ácido nucleico;

(b) usar recombinación homóloga para insertar una secuencia nucleotídica entre los extremos, en el que la secuencia de inserto comprende un elemento regulador o codifica toda o parte de una proteína; y

(c) opcionalmente obtener la hebra de ácido nucleico modificada en la etapa (b) o una hebra de ácido nucleico de progenie que comprende la secuencia nucleotídica insertada.

Una tercera configuración proporciona:

Un método de recombinación de ácido nucleico, comprendiendo el método

(a) usar escisión de ácido nucleico para crear una primera y segunda roturas en una hebra de ácido nucleico, creando así extremos de corte 5’ y 3’ y una secuencia nucleotídica entre los extremos;

(b) usar recombinación homóloga para eliminar la secuencia nucleotídica; y

(c) obtener opcionalmente la hebra de ácido nucleico modificada en la etapa (b) o una hebra de ácido nucleico de progenie que comprende la deleción.

Una cuarta configuración proporciona:

(a) usar escisión de ácido nucleico mediada por endonucleasa Cas para crear un extremo de corte en la primera hebra en 3’ del motivo PAM;

(b) usar escisión de ácido nucleico mediada por endonucleasa Cas para crear un corte en la segunda hebra en una posición que corresponde a una posición en 3’ del extremo de corte de la hebra de la parte (a), cuyo corte está en 3’ del motivo PAM;

(c) proporcionar un primer ARNg que hibrida con una secuencia en 5’ del motivo PAM en la hebra de la parte (a) ;

(d) proporcionar un segundo ARNg que hibrida con una secuencia en 5’ del motivo PAM en la hebra de la parte (b) ,

en el que las hebras de ácido nucleico de la parte (a) y la parte (b) se reparan produciendo una deleción de ácido nucleico entre los cortes.

En aspectos de las configuraciones de la presente memoria, se proporciona un método de recombinación dirigida por homología mediada por endonucleasa secuencial (sEHDR) que comprende llevar a cabo el método de cualquier configuración anterior una primera vez y llevar a cabo el método de cualquier configuración anterior una segunda vez. De este modo, la divulgación posibilita llevar a cabo modificaciones de ácido nucleico en serie, p.ej. modificaciones genómicas, que pueden comprender deleciones o inserciones de secuencia precisas o combinaciones de estas dos o más veces. Por ejemplo, es posible usar este aspecto de la divulgación para “recorrer” ácidos nucleicos (p.ej., cromosomas en células) para hacer deleciones o inserciones de secuencia nucleotídica relativamente grandes y precisas. En una realización, se usan una o más endonucleasas Cas (p.ej., Cas9 y/o Cys4) en un método de recombinación dirigida por homología mediada por Cas secuencial (sCHDR). Breve descripción de las figuras

Figura 1A. Inserción de ADN precisa en una localización predefinida (KI): El ARNg diseñado frente a una localización predefinida puede inducir muesca de ADN usando nicasa Cas9 D10A en 5' de la secuencia de PAM (mostrada como un recuadro negro sólido). Como alternativa, puede usarse ARNg junto con nucleasa de tipo silvestre Cas9 para inducir roturas de ADN bicatenario en 5' de la secuencia de PAM. La adición de un oligo donante o un fragmento de ADN donante (monocatenario o bicatenario) con homología alrededor de la región del punto de rotura que contenga cualquier forma de alteraciones de ADN, incluyendo adición de ADN endógeno o exógeno, puede insertarse precisamente en la unión del punto de rotura donde se repara el ADN por HDR.

Figura 1B. Inserción de ADN precisa en una localización predefinida (KI): Esta figura muestra una descripción más detallada de los mecanismos descritos en la Figura 1A. El ARNsg diseñado frente a una localización predefinida puede inducir muesca de ADN usando nicasa Cas9 D10A en 5' de la secuencia de PAM (mostrada como un recuadro negro sólido). Como alternativa, puede usarse ARNsg junto con nucleasa de tipo silvestre Cas9 para inducir roturas de ADN bicatenario en 5’ de la secuencia de PAM. La adición de un oligo donante o un fragmento de ADN donante (monocatenario o bicatenario) con brazos de homología (HA) alrededor de la región del punto de rotura que contenga cualquier forma de alteraciones de ADN, incluyendo la adición de ADN endógeno o exógeno, puede insertarse precisamente en la unión de punto de rotura donde se repara el ADN por HDR.

Figura 2A. Deleción de ADN precisa (KO): Los ARNg de orientación flanqueantes de la región de interés pueden inducir dos muescas de ADN usando nicasa Cas9 D10A en localizaciones predefinidas que contienen las secuencias de PAM deseadas (mostradas como recuadros negros sólidos). Como alternativa, pueden usarse ARNg con nucleasa de tipo silvestre Cas9 para inducir dos DSB que flanquean la región de interés. La adición de un oligo donante o un fragmento de ADN donante (monocatenario o bicatenario) con homología con la región en 5’ de PAM 1 y en 3’ de la secuencia PAM 2 guiará la reparación de ADN de manera precisa por HDR. La reparación de ADN por HDR reducirá el riesgo de formación de indeles en las uniones de punto de rotura y evitará la reparación de ADN mediante NHEJ, y al hacer esto, eliminará la región flanqueada por la secuencia de PAM y llevará a cabo la reparación de ADN de manera predeterminada y predefinida.

Figura 2B. Deleción de ADN precisa (KO): Esta figura muestra una descripción más detallada del mecanismo descrito en la Figura 2A. Los ARNsg de orientación flanqueantes de la región de interés pueden inducir dos muescas de ADN usando nicasa Cas9 D10A en localizaciones predefinidas que contienen las secuencias de PAM deseadas (mostradas como recuadros negros sólidos). Nota: los PAM pueden localizarse en hebras de ADN opuestas a diferencia del ejemplo representado en la figura, en que ambos PAM están en la misma hebra de ADN. Como alternativa, pueden usarse ARNsg con nucleasa de tipo silvestre Cas9 para inducir dos DSB flanqueantes de la región de interés. La adición de un oligo donante o un fragmento de ADN donante (monocatenario o bicatenario) con homología con la región en 5’ de PAM 1 y en 3’ de la secuencia PAM 2 guiará la reparación de ADN de manera precisa por HDR. La reparación por HDR reducirá el riesgo de formación de indeles en las uniones de punto de rotura y evitará la reparación de ADN mediante NHEJ y, al hacer esto, eliminará la región flanqueada por la secuencia de PAM y llevará a cabo la reparación de ADN de manera predeterminada y predefinida.

Figura 3A: Deleción e inserción de ADN precisas (KO ^ KI): Los ARNg de orientación flanqueantes de la región de interés pueden inducir dos muescas de ADN usando nicasa Cas9 D10A en localizaciones predefinidas que contienen las secuencias de PAM deseadas (mostradas como recuadros negros sólidos). Como alternativa, pueden usarse ARNg con nucleasa de tipo silvestre Cas9 para inducir dos DSB que flanquean la región de interés. La adición de un oligo donante o un fragmento de ADN donante (monocatenario o bicatenario) con homología con la región en 5’ de PAM 1 y en 3’ de PAM 2 con inclusión de ADN endógeno o exógeno guiará la reparación de ADN de manera precisa por HDR con la deleción concomitante de la región flanqueada por DSB o muesca y la inserción del ADN de interés.

Figura 3B: Deleción e inserción de ADN precisas (KO ^ KI): Esta figura muestra una descripción más detallada del mecanismo descrito en la Figura 3A. Los ARNg de orientación flanqueantes de la región de interés pueden inducir dos muescas de ADN usando nicasa Cas9 D10A en localizaciones predefinidas que contienen las secuencias de PAM deseadas (mostradas como recuadros negros sólidos). Como alternativa, pueden usarse ARNsg con nucleasa de tipo silvestre Cas9 para inducir dos DSB flanqueantes de la región de interés. La adición de un oligo donante o un fragmento de ADN donante (monocatenario o bicatenario) con homología con la región en 5’ de PAM 1 y en 3’ de PAM 2 con inclusión de ADN endógeno o exógeno adicional (inserto de ADN) guiará la reparación de ADN de manera precisa por HDR con la deleción concomitante de la región flanqueada por DSB o muesca y la inserción del ADN interés. Nota: De nuevo, los PAM pueden localizarse en hebras de ADN opuestas a diferencia del ejemplo representado en la figura, en que ambos PAM están en la misma hebra de ADN.

Figura 4A: Reciclado de PAM para edición genómica secuencial (deleciones): Los ARNg de orientación flanqueantes de la región de interés pueden inducir dos muescas de ADN usando nicasa Cas9 D10A en localizaciones predefinidas que contienen las secuencias de PAM deseadas (mostradas como recuadros negros sólidos). Como alternativa, pueden usarse ARNg con nucleasa de tipo silvestre Cas9 para inducir dos DSB flanqueantes de la región de interés. La adición de un oligo donante o un fragmento de ADN donante (monocatenario o bicatenario) con homología con la región en 5’ de PAM 2 y en 3’ de PAM 3 guiará la reparación de ADN de manera precisa por HDR y, al hacer esto, eliminará la región entre PAM 2 y PAM 3. Esta deleción retendrá PAM 3 y por tanto actuará como sitio para llevar a cabo otra ronda de edición genómica mediada por CRISPR/Cas. Puede usarse otro sitio de PAM (p.ej. PAM 1) junto con la secuencia de PAM 3 para llevar a cabo otra ronda de deleción como se describe anteriormente. Usando este enfoque de reciclado de PAM, pueden ejecutarse muchas rondas de deleciones en forma de deleción por etapas, en que PAM 3 se recicla después de cada ronda. Este enfoque puede usarse también para la adición por etapas de a Dn endógeno o exógeno.

Figura 4B: Reciclado de PAM para edición genómica secuencial (deleciones): Esta figura muestra una descripción más detallada del mecanismo descrito en la Figura 4B. Los ARNg de orientación flanqueantes de la región de interés pueden inducir dos muescas de ADN usando nicasa Cas9 D10A en localizaciones predefinidas que contienen las secuencias de PAM deseadas. Como alternativa, pueden usarse ARNsg con nucleasa de tipo silvestre Cas9 para inducir dos DSB flanqueantes de la región de interés. La adición de un oligo donante o un fragmento de ADN donante (monocatenario o bicatenario) con homología con la región en 5’ de PAM 1 (recuadro de PAM claro) y en 3’ de PAM 2 (recuadro de PAM negro) guiará la reparación de ADN de manera precisa por HDR y, al hacer esto, eliminará la región entre PAM 1 y PAM 2. La secuencia de PAM junto con el ARNg único puede incluirse en el ADN de intrusión y orientarse de vuelta al sitio de edición. Así, la secuencia PAM 1 puede reciclarse por ejemplo y por tanto actúa como sitio para llevar a cabo otra ronda de edición genómica mediada por CRISPR/Cas. Puede usarse otro sitio de PAM (p.ej., PAM 3, recuadro de PAM gris) junto con la secuencia PAM 1 reciclada para llevar a cabo otra ronda de edición (concretamente inserción) como se describe anteriormente. Usando este enfoque de reciclado de PAM, pueden ejecutarse muchas rondas de edición genómica de forma por etapas, en que PAM 1 se recicla después de cada ronda. Este enfoque puede usarse también para la adición por etapas de ADN endógeno o exógeno.

Figura 5A: Inserción de Lox mediada por CRISPR/Cas para facilitar el RMCE: Los ARNg de orientación flanqueantes de la región de interés pueden inducir dos muescas de ADN usando nicasa Cas9 D10A en localizaciones predefinidas que contienen las secuencias de PAM deseadas (mostradas como recuadros negros sólidos). Como alternativa, pueden usarse ARNg con nucleasa de tipo silvestre Cas9 para inducir dos DSB flanqueantes de la región de interés. La adición de dos oligos donantes o fragmentos de ADN donantes (monocatenarios o bicatenarios) con homología con las regiones 5’ y 3’ de cada secuencia de PAM en que el ADN donante contiene secuencias de reconocimiento de recombinasa (RRS), tales como loxP y lox5171, guiará la reparación de ADN de manera precisa por HDR con la inclusión de estas RRS. Las RRS introducidas pueden usarse como plataforma de aterrizaje para insertar cualquier ADN de interés con alta eficacia y precisamente usando intercambio de módulos mediado por recombinasa (RMCE). El sitio PAM 2 retenido puede reciclarse para otra ronda de edición genómica mediada por CRISPR/Cas para deleción o inserción de ADN de interés. Nota: el ADN de interés insertado podría contener un marcador de selección tal como PGK-Puro flanqueado por LTR PiggyBac para permitir la selección inicial y, tras integración exitosa en el ADN de interés, el marcador de selección puede retirarse convenientemente expresando la transposasa hyperPbase.

Figura 5B: Inserción de Lox mediada por CRISPR/Cas para facilitar el RMCE: Esta figura muestra una descripción más detallada del mecanismo descrito en la Figura 5A. Los ARNsg de orientación flanqueantes de la región de interés pueden inducir dos muescas de ADN usando nicasa Cas9 D10A en localizaciones predefinidas que contienen las secuencias de PAM deseada (mostradas como recuadros negros sólidos). Como alternativa, pueden usarse ARNsg con nucleasa de tipo silvestre Cas9 para inducir dos DSB flanqueantes de la región de interés. La adición de dos oligos donantes o fragmentos de ADN donantes (monocatenarios o bicatenarios) con homología con regiones en 5’ y 3’ de cada secuencia de PAM en que el ADN donante contiene secuencias de reconocimiento de recombinasa (RRS), tales como loxP y lox5171, guiará la reparación de ADN de manera precisa por HDR con la inclusión de estas RRS. Nota: la orientación de los sitios lox puede realizarse secuencialmente o en conjunto en un proceso de una etapa. Las RRS introducidas pueden usarse como plataforma de aterrizaje para la inserción de cualquier ADN de interés con alta eficacia y precisamente usando el intercambio de módulos mediado por recombinasa (RMCE). Como se detalla en la Figura 4, la secuencia de PAM puede reciclarse para otra ronda de edición genómica mediada por CRISPR/Cas para deleción o inserción de ADN de interés. Como opción, el ADN de interés insertado podría contener un marcador de selección tal como PGK-Puro flanqueado por LTR PiggyBac para permitir la selección inicial y, tras integración exitosa en el ADN de interés, el marcador de selección puede retirarse convenientemente expresando la transposasa hyperPbase.

Figuras 6A y 6B: Modificación genómica para producir Cas9 escindióle por transposón y ARNg

Figura 6C: Expresión de Cas9 de copia individual: Puede orientarse inicialmente una plataforma de aterrizaje a cualquier locus de elección en citoblastos embrionarios de ratón o cualquier otra estirpe celular eucariótica. La plataforma de aterrizaje contendrá típicamente LTR 5' y 3' PiggyBac, marcador de selección tal como neo, por ejemplo floxeado y un promotor sin gen tal como PGK en la configuración general mostrada. Se realiza la orientación por recombinación homóloga y se seleccionan los clones en G418. La siguiente etapa implicará RCME para insertar Cas9 ligada por una secuencia T2A a Puro-delta-tk, con la opción de insertar un ARN de guía individual o múltiples usando sitios de restricción únicos (RS). El posicionamiento de los sitios lox está dispuesto de manera que solo una vez se inserta el ADN de intrusión que contiene Cas9 en la plataforma de aterrizaje, puede activar el promotor PGK en la plataforma de aterrizaje la transcripción y por tanto la expresión de puromicina y, a través de T2A, la transcripción y expresión de la producción de Cas9. Usando este enfoque, puede conseguirse una expresión estable de Cas9 individual. Después de 4-6 días de selección en puromicina, pueden escindirse la Cas9 entera y el módulo floxeado de ARN de guía usando transposasa PiggyBac (Pbase) y puede analizarse en los clones individuales la edición genómica resultante del ARN de guía introducido. Como opción, puede generarse una estirpe de banco celular estable que expresa Cas9 a partir de la cual pueden generarse múltiples estirpes celulares genomanipuladas. Para hacer esto, se insertará solo Cas9-T2A-Puro-delta-tk sin ARNg en la fase de RMCE. Esto producirá una estirpe celular genérica de expresión de Cas9 de una copia individual en que su genoma puede editarse por transfección de ARNg individual o múltiples.

Figura 7: Representación esquemática de la posición de ARNg con respecto al gen X, la estructura del vector de orientación y el par de oligos usado para genotipar los clones diana resultantes.

Figura 8: Una imagen en gel que muestra los resultados de genotipado después de rotura de ADN bicatenario mediada por nucleasa Cas9 y la posterior orientación a ADN. El genotipado muestra el producto de PCR (880 pb) específico del brazo de homología orientado a 5’ usando el par de oligos HAP341/HAP334. El gel a la izquierda muestra los datos de genotipado de 96 clones de citoblastos embrionarios transfectados con ARNg, nucleasa Cas9 humana y un vector de orientación circular (placa 1) o bien un vector de orientación lineal (placa 2). Los geles en el lado derecho muestran 96 clones de citoblastos embrionarios transfectados con ARNg y un vector de orientación circular (placa 3) o bien un vector de orientación lineal (placa 4), pero sin nucleasa Cas9 humana. Se muestra el porcentaje de clones correctamente orientados para cada transfección.

Figura 9: Esquema que muestra la posición de los ARNg en un gen para permitir una deleción definida de la región entre los dos ARNg. Se usó el par de oligos cebadores 1 y 2 para detectar clones de citoblastos embrionarios que contienen la deleción de 55 pb específica.

Figura 10: Un gel de agarosa al 3 % que contiene productos de PCR amplificados a partir de 96 clones de citoblastos embrionarios transfectados con ARNg 1 y 2. Se usaron los cebadores 1 y 2 para amplificar alrededor de los dos ARNg y puede observarse cualquier clon que contenga la deleción definida como un producto de PCR menor, que se destaca por un asterisco.

Figura 11: Genotipado por PCR mediante amplificación de los brazos de homología orientados en 5’ (gel superior) y 3’ (gel inferior) en el gen Rosa26 localizado en el cromosoma 6. Se marcan con un asterisco los clones orientados correctamente que procuran producto de PCR para ambas uniones 5’ y 3’.

Figura 12: Genotipado para la inserción correcta del módulo de ADN de Cas9 por amplificación por PCR del brazo 5’ (gel superior) y 3’ (gel inferior) del módulo de ADN insertado.

Figura 13: Genotipado por PCR mediante amplificación de la región alrededor del ARN de guía y valoración en el producto de PCR de la presencia de indeles. Pueden observarse los indeles mayores directamente en el gel, ya que procuraban un producto de PCR más corto que el ADN WT esperado, sugiriendo una deleción significativa. Para control positivo, se usó ADN genómico de ratón AB2.1 para dimensionar el producto de PCR WT correspondiente. El control negativo era un control de agua sin ADN.

Figura 14: Amplificación por PCR de la región flanqueante del ARN de guía usando ADN extraído de cachorros después de inyección de Cas9 de cigoto/ARNm de guía para análisis de la formación de indeles.

El carril 14 muestra una gran deleción en ese ratón y los carriles marcados con un asterisco indican aquellos ratones que contienen indeles menores.

Tabla 3: Se muestran el compendio de los datos de secuenciación de los 8 ratones analizados y los detalles de los indeles detectados. Los números hacen referencia a la frecuencia de ese indel particular identificado en los clones analizados y la descripción de los indeles se muestra entre paréntesis.

Descripción detallada

Los inventores abordaron la necesidad de técnicas de modificación de ácido nucleico mejoradas. Es un ejemplo de una técnica para la modificación de ácido nucleico la aplicación del sistema CRISPR/Cas. Se ha mostrado que este sistema es hasta ahora el sistema de edición genómica más avanzado disponible debido, entre otras cosas, a su amplia aplicación, la velocidad relativa a la que pueden editarse los genomas para crear mutaciones y su facilidad de uso. Sin embargo, los inventores creían que esta tecnología puede progresar a aplicaciones aún más amplias que las evidentes a partir del estado de la técnica.

Los inventores se dieron cuenta de que un aspecto importante para conseguir esto sería encontrar un modo de mejorar la fidelidad de las modificaciones de ácido nucleico más allá de la contemplada por los métodos de CRISPR/Cas conocidos en la materia.

Adicionalmente, los inventores se dieron cuenta de que solo se habían reseñado modificaciones de ácido nucleico modestas hasta la fecha. Sería deseable efectuar deleciones o inserciones de ADN predefinidas y precisas relativamente grandes usando el sistema CRISPR/Cas.

Los inventores han ideado un enfoque para introducir una o más inserciones y/o deleciones deseadas de tamaños conocidos en una o más localizaciones predefinidas en un ácido nucleico (p.ej., en un genoma de célula u organismo). Han desarrollado técnicas para hacer esto de forma secuencial o bien insertando un fragmento de ADN discreto de tamaño definido en el genoma precisamente en una localización predefinida, o bien llevando a cabo una deleción discreta de un tamaño definido en una localización precisa. La técnica está basada en la observación de que las roturas monocatenarias de ADN se reparan preferencialmente mediante la ruta de HDR, y esto reduce la oportunidades de indeles (p.ej., producidos por NHEJ) y por tanto es más eficaz que las técnicas de la técnica anterior.

Con este fin, se proporciona:

Un método de recombinación de ácido nucleico, comprendiendo el método proporcionar un ADN bicatenario (ADNbc) que comprende una primera y segunda hebras y

(a) usar escisión de ácido nucleico para crear extremos de corte 5' y 3' en la primera hebra; y

(b) usar recombinación homóloga para insertar una secuencia nucleotídica entre los extremos, produciendo así una primera hebra modificada; produciendo así ADN en el que la primera hebra se ha modificado por dicha recombinación, pero la segunda hebra no se ha modificado.

Opcionalmente, el método comprende además replicar la primera hebra modificada para producir un ADNbc de progenie en el que cada hebra del mismo comprende una copia de la secuencia nucleotídica de inserto. Opcionalmente, el método comprende (c) aislar el ADNbc de progenie, p.ej. obteniendo una célula que contiene dicho ADNbc de progenie. La replicación puede efectuarse, por ejemplo, en una célula. Por ejemplo, las etapas (a) y (b) se llevan a cabo en una célula y la célula se replica, en las que la maquinaria de la célula replica la primera hebra modificada, p.ej. produciendo una progenie de ADNbc en que cada hebra comprende la modificación.

Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, se aísla la hebra de ADN modificada resultante de la etapa (b).

Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, se lleva a cabo el método in vitro. Por ejemplo, se lleva a cabo el método en una célula o población celular in vitro.

Como alternativa, opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, se lleva a cabo el método para modificar el genoma de un virus.

Como alternativa, opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, se lleva a cabo el método in vivo en un organismo. En un ejemplo, el organismo es un organismo no humano. En un ejemplo, es una planta o un animal o un insecto o una bacteria o una levadura. Por ejemplo, el método se practica en un vertebrado (p. ej., un paciente humano o un vertebrado no humano (p.ej., un ave, por ejemplo un pollo) o mamífero no humano (tal como un ratón, una rata o un conejo).

Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, el método es un método de tratamiento cosmético de un ser humano o un método no terapéutico, no quirúrgico, no diagnóstico, p.ej. practicado en un ser humano o vertebrado o mamífero no humano (p.ej., un ratón o una rata).

También se proporciona:

Un método de recombinación de ácido nucleico, comprendiendo el método

(b) usar recombinación homóloga para insertar una secuencia nucleotídica entre los extremos, en la que la secuencia de inserto comprende un elemento regulador o codifica toda o parte de una proteína; y

(c) opcionalmente obtener la hebra de ácido nucleico modificada en la etapa (b) o una hebra de ácido nucleico de progenie que comprende la secuencia nucleotídica insertada, p.ej. obteniendo una célula que contiene dicha hebra de ácido nucleico de progenie.

En un ejemplo, la hebra de progenie es un producto de la replicación de la hebra producida por la etapa (b). La hebra de progenie se produce, por ejemplo, por replicación de ácido nucleico en una célula. Por ejemplo, se llevan a cabo las etapas (a) y (b) en una célula y se replica la célula, en la que la maquinaria de la célula replica la hebra modificada producida en la etapa (b), p.ej., produciendo una progenie de ADNbc en que cada hebra comprende la modificación.

En un ejemplo, la hebra de ácido nucleico individual es una hebra de ADN o ARN.

En un ejemplo, el elemento regulador es un promotor o potenciador.

Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, la secuencia nucleotídica insertada es una secuencia de planta, animal, vertebrado o mamífero, p.ej. una secuencia humana. Por ejemplo, la secuencia codifica una proteína completa, polipéptido, péptido, dominio o una pluralidad (p.ej., uno, dos o más) de uno cualquiera de estos. En un ejemplo, la secuencia insertada confiere una propiedad de resistencia a una célula que comprende el ácido nucleico modificado producido por el método (p.ej., resistencia herbicida, vírica o bacteriana). En un ejemplo, la secuencia insertada codifica una interleucina, receptor (p.ej., un receptor de superficie celular), factor de crecimiento, hormona, anticuerpo (o dominio variable o sitio de unión del mismo), antagonista o agonista; p.ej. una versión humana de cualquiera de estos. En un ejemplo, la secuencia insertada es un exón.

Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, la secuencia nucleotídica insertada reemplaza una secuencia ortóloga u homóloga de la hebra (p.ej., el inserto es una secuencia humana que reemplaza una secuencia de planta, humano o ratón). Por ejemplo, se lleva a cabo el método en un ratón o célula de ratón (tal como un citoblasto embrionario) y el inserto reemplaza una secuencia de ratón ortóloga u homóloga (p.ej., una proteína diana biológica de ratón implicada en enfermedad). Por ejemplo, se lleva a cabo el método (p.ej. in vitro) en una célula humana y el inserto reemplaza una secuencia humana ortóloga u homóloga (p.ej., una proteína diana biológica humana implicada en enfermedad, p.ej. se reemplaza una forma mutada de una secuencia por una secuencia humana diferente (p.ej. de tipo silvestre), lo que puede ser útil para corregir un defecto génico en la célula. Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, la secuencia nucleotídica insertada es de al menos 10 nucleótidos de longitud, p.ej. al menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 o 900 nucleótidos, o al menos 1,2, 3, 5, 10, 20, 50 o 100 kb de longitud.

Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, la secuencia de inserto comprende un sitio de recombinación específica de sitio, p.ej. un sitio lox, frt o rox. Por ejemplo, el sitio puede ser un sitio loxP, Iox511 o Iox2272.

También se proporciona:

Un método de recombinación de ácido nucleico, comprendiendo el método

(b) usar recombinación homóloga para eliminar la secuencia nucleotídica; y

(c) opcionalmente obtener la hebra de ácido nucleico modificada en la etapa (b) o una hebra de ácido nucleico de progenie que comprende la deleción.

En un ejemplo, la secuencia eliminada comprende un elemento regulador o codifica toda o parte de una proteína. En una realización, el elemento regulador eliminado es un promotor o potenciador.

Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, la secuencia nucleotídica eliminada es una secuencia de planta, animal, vertebrado o mamífero, p.ej. una secuencia humana. Por ejemplo, la secuencia codifica una proteína completa, polipéptido, péptido, dominio o una pluralidad (p.ej. uno, dos o más) de uno cualquiera de estos. En un ejemplo, la secuencia eliminada codifica una interleucina, receptor (p.ej., un receptor de superficie celular), factor de crecimiento, hormona, anticuerpo (o dominio variable o sitio de unión del mismo), antagonista o agonista; p.ej. una versión no humana de cualquiera de estos. En un ejemplo, la secuencia eliminada es un exón.

Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, se reemplaza la secuencia nucleotídica eliminada por una secuencia ortóloga u homóloga de una especie o cepa diferente (p.ej., una secuencia humana reemplaza una secuencia de planta o ratón ortóloga u homóloga). Por ejemplo, se lleva a cabo el método en un ratón o célula de ratón y el inserto reemplaza una secuencia de ratón ortóloga u homóloga (p.ej., una proteína diana biológica de ratón implicada en enfermedad). Por ejemplo, se lleva a cabo el método (p.ej., in vitro) en una célula humana y el inserto reemplaza una secuencia humana ortóloga u homóloga (p.ej., una proteína diana biológica humana implicada en enfermedad, p.ej. se reemplaza una forma mutada de una secuencia por una secuencia humana diferente (p.ej. de tipo silvestre), lo que puede ser útil para corregir un defecto génico en la célula. En esta realización, la célula puede ser un citoblasto totipotente o pluripotente o ES o iPS humano y se puede introducir posteriormente en un paciente humano en un método de terapia génica para tratar y/o prevenir una enfermedad o afección médica en el paciente).

Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, la secuencia nucleotídica eliminada es de al menos 10 nucleótidos de longitud, p.ej. al menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 o 900 nucleótidos, o al menos 1,2, 3, 5, 10, 20, 50 o 100 kb de longitud.

Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, se ejecuta la etapa (c) aislando una célula que comprende la primera hebra modificada, u obteniendo un vertebrado no humano en que se ha ejecutado el método o una progenie de mismo.

Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, el producto del método comprende una hebra de ácido nucleico que comprende un motivo PAM en 3’ de la inserción o deleción. En un ejemplo, el motivo PAM está dentro de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 o 3 nucleótidos de la inserción o deleción. Esto es útil para posibilitar inserciones y/o deleciones en serie según el método explicado adicionalmente a continuación.

Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, el producto del método comprende una hebra de ácido nucleico que comprende un motivo PAM en 5’ de la inserción o deleción. En un ejemplo, el motivo PAM está dentro de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 o 3 nucleótidos de la inserción o deleción. Esto es útil para posibilitar inserciones y/o deleciones en serie según el método explicado adicionalmente a continuación.

Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, se ejecuta la etapa (b) llevando a cabo recombinación homóloga entre un ácido nucleico de partida que comprende un primer y segundo brazos de homología, en los que los brazos de homología son sustancialmente homólogos respectivamente de una secuencia que se extiende en 5’ desde el extremo 5’ y una secuencia que se extiende en 3’ desde el extremo 3’. El especialista estará familiarizado con la construcción de vectores y moléculas de ADN para uso en recombinación homóloga, incluyendo consideraciones tales como tamaño y secuencia del brazo de homología y la inclusión de marcadores de selección entre los brazos. Por ejemplo, el ácido nucleico de entrada comprende un primer y segundo brazos de homología, la secuencia de inserto y una secuencia marcadora de selección opcional (p.ej., secuencia nucleotídica neo). Los brazos pueden ser de al menos 20, 30, 40, 50, 100 o 150 nucleótidos de longitud, por ejemplo, Cuando se requiere deleción, se omite el inserto (aunque puede incluirse o no una secuencia marcadora de selección opcional entre los brazos).

Por tanto, en una realización, se ejecuta la etapa (b) llevando a cabo recombinación homóloga entre un ácido nucleico de entrada que comprende una secuencia nucleotídica de inserto flanqueada por el primer y segundo brazos de homología, en la que la secuencia nucleotídica de inserto se inserta entre los extremos 5’ y 3’.

En otra realización, el inserto está entre los brazos de homología y no hay una secuencia adicional entre los brazos. En un ejemplo, cada brazo de homología es de al menos 20, 30, 40, 50, 100 o 150 nucleótidos de longitud.

Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, se lleva a cabo la etapa (a) usando una endonucleasa, p.ej. una nicasa. Las nicasas cortan solo en una hebra individual de ADNbc. Por ejemplo, la endonucleasa es une endonucleasa de un sistema CRISPR/Cas, p.ej. una endonucleasa Cas9 o Cys4 (p.ej., una nicasa Cas9 o Cys4). En un ejemplo, la endonucleasa reconoce un PAM enumerado en la Tabla 1 siguiente, por ejemplo la endonucleasa es una endonucleasa Cas que reconoce un PAM seleccionada de CCN, TCN, TTC, AWG, CC, NNAGNN, NGGNG GG, NGG, WGG, CWT, CTT y GM. En un ejemplo, la endonucleasa Cas es una endonucleasa de S pyogenes, p.ej. una endonucleasa Cas9 de S pyogenes. En un ejemplo, se usa una secuencia de PAM de S pyogenes o PAM LMD-9 de Streptococcus thermophilus.

En un ejemplo, la endonucleasa es una endonucleasa Cas de grupo 1. En un ejemplo, la endonucleasa es una endonucleasa Cas de grupo 2. En un ejemplo, la endonucleasa es una endonucleasa Cas de grupo 3. En un ejemplo, la endonucleasa es una endonucleasa Cas de grupo 4. En un ejemplo, la endonucleasa es una endonucleasas Cas de grupo 7. En un ejemplo, la endonucleasa es una endonucleasa Cas de grupo 10.

En un ejemplo, la endonucleasa reconoce un PAM de grupo 1 de CRISPR/Cas. En un ejemplo, la endonucleasa reconoce un PAM de grupo 2 de CRISPR/Cas. En un ejemplo, la endonucleasa reconoce un PAM de grupo 3 de CRISPR/Cas. En un ejemplo, la endonucleasa reconoce un PAM de grupo 4 de CRISPR/Cas. En un ejemplo, la endonucleasa reconoce un PAM de grupo 7 de CRISPR/Cas. En un ejemplo, la endonucleasa reconoce un PAM de grupo 10 de CRISPR/Cas.

En un ejemplo, se usa escisión mediada por endonucleasa Cas en la etapa (a); opcionalmente mediante reconocimiento de un motivo PAM GG o NGG.

En un ejemplo, el primer y/o segundo brazo de homología comprende un motivo PAM. Esto es útil para posibilitar inserciones y/o deleciones en serie según el método explicado adicionalmente a continuación.

Es un ejemplo de una nicasa adecuada la nicasa Cas9 D10A de S pyogenes (véase Cong et al. y la sección de Ejemplos siguiente.

Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, se llevan a cabo las etapas (a) y (b) del método en una célula, p.ej. una célula bacteriana, de levadura o eucariótica, célula de planta, animal, mamífero, vertebrado, animal no humano, roedor, rata, ratón, conejo, pez, ave o pollo. Por ejemplo, la célula es una célula de E coli o CHO o HEK293 o célula de Picchia o Saccharomyces. En un ejemplo, la célula es una célula humana in vitro. En una realización, la célula es un citoblasto embrionario, (citoblasto embrionario, p.ej. un citoblasto embrionario humano o no humano tal como un citoblasto embrionario de ratón), o un citoblasto pluripotente inducido (célula iPS, p.ej. una célula iPS humana, de roedor, rata o ratón), o una célula pluripotente o totipotente. Opcionalmente, la célula no es una célula embrionaria, p.ej. en la que la célula no es una célula embrionaria humana. Opcionalmente, la célula no es una célula pluripotente o totipotente. En un ejemplo, el método se usa par producir un citoblasto humano para terapia en humanos (p.ej., una célula iPS generada a partir de una célula de un paciente para la reintroducción dentro del paciente una vez que el método se ha llevado a cabo en la célula), donde el citoblasto comprende una secuencia nucleotídica o secuencia genómica insertada por el método. Los rasgos de los ejemplos en este apartado pueden combinarse.

En un ejemplo, se lleva a cabo el método en una célula de mamífero. Por ejemplo, la célula es una célula humana in vitro o una célula de mamífero no humana. Por ejemplo, un cigoto no humano (p.ej., de roedor, rata o ratón). Por ejemplo, un cigoto no humano monocelular.

En un ejemplo, se lleva a cabo el método en una planta o mamífero no humano, p.ej. un roedor, ratón o rata o conejo, o un tejido u órgano de los mismos (p.ej., in vitro).

En un ejemplo, el sitio 3’ o cada sitio de escisión está flanqueado en 3’ por un motivo PAM (p.ej., un motivo divulgado en la presente memoria, tal como una secuencia NGG o NGGNG, en la que N es cualquier base y G es una guanina). Por ejemplo, uno o más o todos los sitios de escisión están flanqueados en 3’ por la secuencia 5'-TGGTG-3'. Al contrario que el ADNbc, el PAM no es absolutamente necesario para la unión y escisión de ADNmc: un oligodesoxinucleótido monocatenario que contiene un protoespaciador con o sin una secuencia de PAM se une casi tan bien como el ADNbc y puede usarse en el método en el que se modifica una hebra individual de ADN. Además, en presencia de iones de Mg2+, Cas9 corta el ADNmc unido al ARNcr usando su sitio activo HNH independientemente de PAM.

Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, se lleva a cabo la etapa (a) por escisión en una única hebra de ADNbc o en ADNmc.

Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, se lleva a cabo la etapa (a) combinando en una célula la hebra de ácido nucleico, una endonucleasa Cas, un ARNcr y un ARNtracr (p.ej., proporcionado por uno o más ARNg) para orientar la endonucleasa a llevar a cabo la escisión, y opcionalmente una secuencia de inserto para recombinación homóloga con la hebra de ácido nucleico. En lugar de una secuencia de inserto, puede usarse una secuencia de entrada que contiene brazos de homología pero no secuencia de inserto, para efectuar la deleción como se describe anteriormente. En un ejemplo, la endonucleasa Cas se codifica por una secuencia nucleotídica que se ha introducido en la célula. En un ejemplo, el ARNg se codifica por una secuencia de ADN que se ha introducido en la célula.

En un ejemplo, se lleva a cabo el método en presencia de Mg2+.

Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, se ejecuta la etapa (b) llevando a cabo recombinación homóloga con un ácido nucleico de entrada que comprende un primer y segundo brazos de homología, en la que los brazos de homología son sustancialmente homólogos respectivamente de una secuencia que se extiende en 5’ desde el extremo 5’ y una secuencia que se extiende en 3’ desde el extremo 3’, en la que el segundo brazo de homología comprende una secuencia de PAM tal que la recombinación homóloga entre el segundo brazo de homología y la secuencia que se extiende en 3’ desde el extremo 3’ produce una secuencia que comprende un motivo PAM en el producto del método. El PAM puede ser cualquier secuencia de PAM divulgada en la presente memoria, por ejemplo. Por tanto, el método produce una hebra de ácido nucleico modificado que comprende un PAM que puede usarse para modificación de ácido nucleico posterior según cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, en el que se usa una endonucleasa Cas para cortar el ácido nucleico. Esto es útil, por ejemplo, para ejecutar recombinación dirigida por homología mediada por endonucleasa secuencial (sEHDR), más particularmente la sCHDR descrita a continuación.

Recombinación dirigida por homología mediada por endonucleasa secuencial (sEHDR)

Se proporciona además:

Un método de recombinación dirigida por homología mediada por endonucleasa secuencial (sEHDR) que comprende llevar a cabo el método de cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización anterior una primera vez y una segunda vez, en el que se usa escisión mediada por endonucleasa en cada etapa (a); en el que se usa el producto de la primera vez para la escisión mediada por endonucleasa de la segunda vez; con lo que (i) se eliminan una primera y segunda secuencias nucleotídicas la primera vez y la segunda vez, respectivamente; o bien (ii) se elimina una primera secuencia nucleotídica la primera vez y se inserta una segunda secuencia nucleotídica la segunda vez; o bien (iii) se inserta una primera secuencia nucleotídica la primera vez y se elimina una segunda secuencia nucleotídica la segunda vez; o bien (iv) se insertan una primera y segunda secuencias nucleotídicas la primera y segunda veces, respectivamente; opcionalmente en el que la modificación de hebra de ácido nucleico la segunda vez está dentro de 20, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 o menos nucleótidos de la modificación de hebra de ácido nucleico la primera vez o directamente adyacente a la modificación de hebra de ácido nucleico la primera vez.

Por ejemplo, se insertan la primera y segunda secuencias nucleotídicas de modo que sean contiguas después de la inserción la segunda vez. Como alternativa, la primera y segunda deleciones son tales que se elimine una secuencia contigua después de ejecutar la primera y segunda deleciones.

En una realización de sEHDR, el método usa una endonucleasa Cas. Por tanto, se proporciona:

Un método de recombinación dirigida por homología mediada por Cas secuencial (sCHDR) que comprende llevar a cabo el método de cualquier sentencia anterior una primera vez y una segunda vez, en el que se usa escisión mediada por endonucleasa Cas en cada etapa (a); en el que se lleva a cabo la etapa (b) de la primera vez ejecutando recombinación homóloga con un ácido nucleico de entrada que comprende un primer y segundo brazos de homología, en el que los brazos de homología son sustancialmente homólogos respectivamente de una secuencia que se extiende en 5’ desde el extremo 5’ y una secuencia que se extiende en 3’ desde el extremo 3’, en el que el segundo brazo de homología comprende una secuencia de PAM tal que la recombinación homóloga entre el segundo brazo de homología y la secuencia que se extiende en 3’ desde el extremo 3’ produce una secuencia que comprende un motivo PAM en el producto del método; en el que se usa el motivo PAM del producto de la primera vez para escisión mediada por endonucleasa Cas la segunda vez, con lo que (i) se eliminan una primera y segunda secuencias nucleotídicas la primera vez y segunda vez, respectivamente; o bien (ii) se elimina una primera secuencia nucleotídica la primera vez y se inserta una segunda secuencia nucleotídica la segunda vez; o bien (iii) se inserta una primera secuencia nucleotídica la primera vez y se elimina una segunda secuencia nucleotídica la segunda vez; o bien (iv) se insertan la primera y segunda secuencias nucleotídicas la primera y segunda veces, respectivamente; opcionalmente en el que la modificación de hebra de ácido nucleico la segunda vez está dentro de 20, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 o menos nucleótidos de la modificación de hebra de ácido nucleico la primera vez o directamente adyacente a la modificación de hebra de ácido nucleico la primera vez.

Por ejemplo, se insertan la primera y segunda secuencias nucleotídicas de modo que estén contiguas después de la inserción la segunda vez. Como alternativa, la primera y segunda deleciones son tales que se elimine una secuencia contigua después de ejecutar la primera y segunda deleciones.

En una realización (primera realización), se lleva a cabo la primera vez según la tercera configuración, en la que el ácido nucleico de entrada no comprende secuencia entre el primer y segundo brazos de homología, en la que la secuencia entre los extremos 5’ y 3’ se elimina por recombinación homóloga; y/o se lleva a cabo la segunda vez según la tercera configuración, en la que se ejecuta la etapa (b) llevando a cabo recombinación homóloga entre un ácido nucleico de entrada que comprende el primer y segundo brazos de homología, en la que los brazos de homología son sustancialmente homólogos respectivamente de una secuencia que se extiende en 5’ desde el extremo 5’ y una secuencia que se extiende en 3’ desde el extremo 3’, en la que el ácido nucleico de entrada no comprende secuencia entre el primer y segundo brazos de homología de tal modo que la secuencia entre los extremos 5’ y 3’ se elimina por recombinación homóloga; opcionalmente en la que el segundo brazo comprende un motivo PAM tal que el producto de la segunda vez comprende un motivo PAM para uso en un método mediado por endonucleasa Cas posterior según cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización.

En una realización (segunda realización), se lleva a cabo la primera vez según la primera o segunda configuración, en la que el ácido nucleico de entrada comprende la secuencia de inserto entre el primer y segundo brazos de homología, en la que se inserta la secuencia de inserto entre los extremos 5' y 3' por recombinación homóloga; y/o se lleva a cabo la segunda vez según la primera o segunda configuración, en la que se ejecuta la etapa (b) llevando a cabo recombinación homóloga entre un ácido nucleico de entrada que comprende el primer y segundo brazos de homología, en la que los brazos de homología son sustancialmente homólogos respectivamente de una secuencia que se extiende en 5’ desde el extremo 5’ y una secuencia que se extiende en 3’ desde el extremo 3’, en la que se inserta la secuencia de inserto entre los extremos 5' y 3' por recombinación homóloga; opcionalmente en la que el segundo brazo comprende un motivo PAM tal que el producto de la segunda vez comprende un motivo PAM para uso en un método mediado por endonucleasa Cas posterior según cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización.

En un ejemplo, se lleva a cabo una de dichas primera y segunda veces como se especifica en la primera realización, y se lleva a cabo la otra vez como se especifica en la segunda realización, en el que se ejecuta al menos una deleción de secuencia y al menos una inserción de secuencia.

Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, se lleva a cabo la etapa (a) por escisión mediada por endonucleasa Cas usando una endonucleasa Cas, uno o más ARNcr y un ARNtracr. Por ejemplo, se lleva a cabo el método en una célula y se introduce el ARNcr y ARNtracr en la célula como moléculas de ARN. Por ejemplo, se lleva a cabo el método en un cigoto (p.ej., un cigoto no humano, p.ej. un cigoto de roedor, rata o ratón) y se inyectan el ARNcr y ARNtracr en el cigoto. En otra realización, el ARNcr y el ARNtracr están codificados por ADN dentro de una célula u organismo y se transcriben dentro de la célula (p.ej., una célula ES, p. ej., una célula ES no humana, p.ej. una célula ES de roedor, rata o ratón) u organismo para producir el ARNcr y el ARNtracr. El organismo es, por ejemplo, un animal no humano o planta o bacteria o levadura o insecto. En una realización, el ARNtracr está codificado de este modo por ADN, pero se introducen uno o más ARNcr como ácido nucleico ARN en la célula u organismo para efectuar el método.

Adicionalmente o como alternativa a estos ejemplos, puede introducirse la endonucleasa como una proteína o vector que codifica la endonucleasa en la célula u organismo para efectuar el método. En otro ejemplo, la endonucleasa está codificada por ADN que se integra genómicamente en la célula u organismo y se transcribe y traduce dentro de la célula u organismo.

En un ejemplo, se lleva a cabo el método en un citoblasto embrionario (p.ej., un citoblasto embrionario no humano, p.ej. un citoblasto embrionario de roedor, rata o ratón) que se ha pregenomanipulado para comprender una secuencia de endonucleasa Cas genómicamente integrada expresable (o se ha incluido un vector que porta ésta en la célula). Sería posible introducir (o codificar) un ARNtracr. Al introducir un ARNcr con una secuencia de oligo de guía para orientar al área deseada del genoma celular, pueden llevarse a cabo modificaciones en el genoma celular. En un ejemplo, se introduce un ARNg como se describe en la presente memoria en el citoblasto embrionario. La secuencia de endonucleasa Cas expresable genómicamente integrada puede, por ejemplo, expresarse constitutivamente o ser induciblemente expresable. Como alternativa o adicionalmente, la secuencia puede ser expresable de manera específica de tejido en un organismo de progenie (p.ej. un roedor) desarrollado usando el citoblasto embrionario.

Puede usarse el citoblasto embrionario inicial que comprende una secuencia de endonucleasa Cas expresable genómicamente integrada, mediante técnicas estándares, para producir una progenie de animal no humano que contiene la secuencia de endonucleasa Cas expresable. Por tanto, se proporciona:

Un animal no humano (p.ej., un vertebrado, mamífero, pez o ave), célula de animal, insecto, célula de insecto, planta o célula de planta que comprende una secuencia nucleotídica de endonucleasa Cas expresable genómicamente integrada y opcionalmente un ARNtracr y/o una secuencia nucleotídica que codifica un ARNtracr. La endonucleasa Cas es, por ejemplo, Cas9 o Cys4. En un ejemplo, el genoma de animal, insecto o planta comprende una secuencia de ADN cromosómico flanqueada por sitios de recombinación específicos de sitio y/o elementos de transposón (p.ej., elementos de repetición de transposón piggyBac), en el que la secuencia codifica la endonucleasa y opcionalmente uno o más ARNg. Como se describe en los ejemplos siguientes, puede usarse intercambio de módulos mediado por recombinasa (RMCE) para insertar tal secuencia. Pueden usarse los elementos de transposón para escindir la secuencia del genoma una vez se ha usado la endonucleasa para ejecutar la recombinación. Puede ejecutarse el RCME y/o escisión mediada por transposón en una célula (p.ej., un citoblasto embrionario) que se usa más tarde para derivar un animal o planta de progenie que comprende la modificación genómica deseada.

También se proporciona un citoblasto embrionario derivado o derivable de tal animal, en el que el citoblasto embrionario comprende una secuencia nucleotídica de endonucleasa Cas expresable genómicamente integrada. En un ejemplo, el citoblasto embrionario es un citoblasto embrionario de roedor, p.ej. un ratón o rata, o es un citoblasto embrionario de conejo, perro, cerdo, gato, vaca, primate no humano, pez, anfibio o ave.

Se proporciona también un método de aislamiento de un citoblasto embrionario, comprendiendo el método derivar un citoblasto embrionario de un animal (p.ej., un animal no humano, p.ej. un roedor, p.ej. una rata o un ratón), en el que el animal comprende una secuencia nucleotídica de endonucleasa Cas expresable genómicamente integrada como se describe en la presente memoria.

En cualquiera de estos aspectos, en lugar de un citoblasto embrionario, la célula puede ser un citoblasto pluripotente inducido o una célula totipotente o pluripotente. Por tanto, un citoblasto o citoblasto pluripotente inducido se puede derivar a partir de (p. ej., una célula somática de) un humano, genomanipulada in vitro para comprender una secuencia nucleotídica genómicamente integrada expresable de una endonucleasa Cas y opcionalmente una o más secuencias de ADN que codifican un tracrARN o gARN. La divulgación, por tanto, se refiere también a un método tal, y a un citoblasto o citoblasto pluripotente inducido que comprende una secuencia nucleotídica genómicamente integrada expresable de una endonucleasa Cas y opcionalmente una o más secuencias de ADN que codifican un tracrARN o gARN. Esta célula se puede usar en un método de la divulgación para llevar a cabo modificación genómica (p. ej, para corregir un defecto genético, p. ej., mediante sustitución de la secuencia defectuosa con un secuencia deseada, opcionalmente con posterior escisión mediada por transposón de la secuencia que codifica la endonucleasa). Tras la escisión opcional de la secuencia de endonucleasa Cas, el citoblasto o citoblasto pluripotente inducido se puede introducir en el donante humano (o un humano diferente, p. ej., un relativo genético del mismo) para llevar a cabo terapia genética o profilaxis. En una alternativa, se usa una célula humana totipotente o pluripotente y posteriormente se desarrolla en tejido humano o un órgano o parte del mismo. Esto es útil para proporcionar material para terapia o profilaxis humana o para producir materiales de ensayo (p. ej., para la implantación en modelos animales no humanos) o para usar en ensayos in vitro (p. ej., de fármacos).

En un ejemplo, el método usa un ARN guiado (ARNg o ARNsg) individual que comprende un ARNcr y un ARNtracr. El ARNcr comprende una secuencia oligonucleotídica (“X” en la estructura 5'-X-Y-3' mencionada a continuación) que se elige para orientarse a una parte deseada del ácido nucleico o genoma para modificar. El especialista será capaz de seleccionar fácilmente la secuencia o secuencias de oligos. En un ejemplo, la secuencia es de 3 a 100 nucleótidos de longitud, p.ej. de 3 a 50, 40, 30, 25, 20, 15 o 10 nucleótidos de longitud, p.ej. de 5, 10, 15 o 20 a 100 nucleótidos de longitud, p.ej. de 5, 10, 15 o 20 a 50 nucleótidos de longitud.

Por ejemplo, el ARNg es un ácido nucleico individual que comprende tanto el ARNcr como el ARNtracr. Un ejemplo de ARNg comprende la secuencia 5'-[oligo]-[UUUUAGAGCUA(SN1UUUUAN2N3GCUA)]-[LIGADOR]-[UAGCAAGUUAAAA (SEQ ID NO:2)]-3', en la que el LIg ADo R comprende una pluralidad (p.ej., 4 o más, p.ej. 4, 5 o 6) nucleótidos (p.ej., 5'-GAAA-3').

Por ejemplo, el ARNcr tiene la estructura 5'-X-Y-3', en la que X es una secuencia nucleotídica de ARN (opcionalmente de al menos 5 nucleótidos de longitud) e Y es una secuencia de ARNcr que comprende un motivo nucleotídico que hibrida con un motivo comprendido por el ARNtracr, en el que X es capaz de hibridar con una secuencia nucleotídica en 5’ del sitio deseado del extremo de corte 5’, p.ej. que se extiende en 5’ desde el sitio deseado de corte 5’.

En un ejemplo, Y es 5'-N1UUUUAN2N3GCUA-3' (SEQ ID NO:3), en el que cada uno de N1-3 es una A, U, C o G y/o el ARNtracr comprende la secuencia (en sentido 5' a 3') UAGCM1UUAAAAM2 (SEQ ID NO:4), en la que M1 es una secuencia nucleotídica espaciadora y M2 es un nucleótido; p.ej., N1= G, N2= G y N3= A. La secuencia espaciadora es, p.ej., de 5, 4, 3, 2 o 1 nucleótidos de ARN de longitud (p.ej., AAG en sentido 5' a 3'). M2 es, por ejemplo, una A, U, C o G (p.ej., M2 es una G). En una realización, se usa un ARNg quimérico que comprende una secuencia 5'-X- Y-Z-3', en la que X e Y son como se definen anteriormente y Z es un ARNtracr que comprende la secuencia (en sentido 5' a 3') UAGCM1UUAAAAM2 (SEQ ID NO:4), en la que M1 es una secuencia nucleotídica espaciadora y M2 es un nucleótido. En un ejemplo, Z comprende la secuencia 5'-UAGCAAGUUAAAA-3' (SEQ ID NO:2), p.ej., Z es 5'-UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG-3' (SEQ ID NO:5). En un ejemplo, el ARNg tiene la secuencia:

5'-GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCA

CCGAGUCGGUGC-3' (SEQ ID NO:6)

Cuando se desea usar el presente método para insertar una secuencia exógena en el ácido nucleico para modificar, la secuencia exógena puede proporcionarse en ácido nucleico lineal o circular (p.ej., ADN). Típicamente, la secuencia exógena está flanqueada por brazos de homología que pueden experimentar recombinación homóloga con las secuencias en 5' y 3' respectivamente del sitio donde se va a insertar la secuencia exógena. El especialista está familiarizado con la elección de los brazos de homología para recombinación homóloga.

Los métodos pueden usarse en un método de producción de un organismo transgénico, p.ej. cualquier organismo citado en la presente memoria. Por ejemplo, el organismo puede ser un organismo no humano usado como modelo de ensayo para probar un producto farmacéutico o para expresar una proteína exógena o una parte de la misma (p.ej., una diana proteica humana activada génicamente en un organismo de ensayo animal no humano). En otro ejemplo, se han usado los métodos para desactivar génicamente una secuencia endógena (p.ej., una proteína diana) en un organismo, tal como un organismo no humano. Esto puede ser útil para valorar el efecto (fenotipo) de la desactivación génica y por tanto valor las dianas farmacológicas potenciales o proteínas implicadas en enfermedad. En un ejemplo, el organismo es un animal no humano (p.ej., un vertebrado, mamífero, ave, pez, roedor, ratón, rata o conejo) en que se ha activado génicamente una proteína diana humana usando los métodos descritos en la presente memoria. Opcionalmente, se han usado los métodos para desactivar génicamente una diana endógena ortóloga u homologa del organismo (p.ej., se ha reemplazado una secuencia diana endógena en la posición endógena por una secuencia diana humana ortóloga u homóloga). De este modo, puede producirse un modelo de ensayo para probar productos farmacéuticos que actúan a través de la diana humana.

En una realización, el organismo es un vertebrado no humano que expresa regiones variables de anticuerpo humano cuyo genoma comprende un reemplazo de una diana endógena por una secuencia humana ortóloga u homóloga. En un ejemplo, se usa el método para producir un vertebrado generador de anticuerpos o vertebrado de ensayo como se divulgan en el documento WO2013061078.

En un ejemplo, se activa génicamente un elemento regulador exógeno usando el método. Por ejemplo, se activa génicamente reemplazando un elemento regulador endógeno.

En un aspecto, se proporciona un método de producción de una célula o un organismo no humano transgénico (p.ej., cualquier organismo no humano citado en la presente memoria), comprendiendo el método:

(a) llevar a cabo el método de cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización para (i) desactivar génicamente una secuencia nucleotídica diana en el genoma de una primera célula y/o (ii) activar génicamente una secuencia nucleotídica de inserción en el genoma de una primera célula, opcionalmente en el que la secuencia de inserto reemplaza una secuencia diana total o parcialmente en la localización endógena de la secuencia diana en el genoma; en el que la célula o progenie de la misma puede desarrollarse hasta un organismo o célula no humano; y

(b) desarrollar la célula o progenie hasta un organismo no humano o una célula no humana.

En un ejemplo, el organismo o célula es homocigótico para la modificación (i) y/o (ii).

En un ejemplo, la célula es un citoblasto embrionario (tal como un citoblasto embrionario de ratón), citoblasto pluripotente inducido, célula totipotente o célula pluripotente. En un ejemplo, la célula es una célula de vertebrado no humano o una célula humana in vitro. En un ejemplo, la célula es una célula de planta, levadura, insecto o bacteriana.

En un ejemplo, la célula u organismo es una célula de roedor (p.ej., un ratón o rata) o una célula de conejo, ave, pez, pollo, primate no humano, mono, cerdo, perro, camélido, tiburón, oveja, vaca o gato.

En un ejemplo, la secuencia diana es una secuencia endógena que comprende todo o parte de un elemento regulador o codifica toda o parte de una proteína.

En un ejemplo, la secuencia de inserto es una secuencia sintética; o comprende una secuencia que codifica toda o parte de una proteína de una especie distinta de la especie de la que deriva la primera célula; o comprende un elemento regulador de dicha primera especie. Esto es útil para combinar genes con nuevos elementos reguladores. En un ejemplo, la secuencia de inserto codifica toda o parte de una proteína humana o subunidad o dominio de proteína humana. Por ejemplo, la secuencia de inserto codifica una proteína de membrana celular, proteína secretada, proteína intracelular, citocina, proteína receptora (p.ej., proteína receptora de Fc, tal como una proteína receptora FcRn o FcY), proteína del sistema inmunitario humano o dominio de la misma (p.ej., una proteína Ig o dominio, tal como un anticuerpo o proteína o dominio de TCR, o una proteína MHC), una hormona o factor de crecimiento.

Se proporciona también:

Una célula (p.ej., una célula aislada o purificada, p.ej. una célula in vitro, o cualquier célula divulgada en la presente memoria) o un organismo no humano (p.ej., cualquier organismo divulgado en la presente memoria, tal como un ratón) cuyo genoma comprende una modificación que comprende una secuencia nucleotídica no endógena flanqueada por secuencias nucleotídicas endógenas, en los que la célula u organismo es obtenible mediante el método de cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, y en los que la secuencia no endógena está flanqueada en 3' y/o 5' por (p.ej., dentro de 20, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 o menos nucleótidos de, o directamente adyacente a) un motivo PAM Cas; en los que la célula no está incluida en un ser humano; y se aplican uno, más o todos de (a) a (d) (por ejemplo, (a); (b); (c); (d); (a) y (b); (a) y (c); (a) y (d); (b) y (c); (b) y (d); (c) y (d); (a), (b) y (c); (a), (b) y (d); (a), (c) y (d); (b), (c) y (d) o todos de (a), (b), (c) y (d)).

(a) El genoma es homocigótico para la modificación; o comprende la modificación en un alelo y no está modificado por recombinación homóloga mediada por Cas en el otro alelo;

(b) la secuencia no endógena comprende todo o parte de un elemento regulador o codifica toda o parte de una proteína;

(c) la secuencia no endógena es de al menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 o 900 nucleótidos, o al menos 1,2, 3, 5, 10, 20, 50 o 100 kb de longitud;

(d) la secuencia no endógena reemplaza una secuencia ortóloga u homologa en el genoma.

La célula puede ser una célula humana, o incluida en tejido humano pero no parte de un ser humano.

Por ejemplo, la célula es una célula humana in vitro.

En un ejemplo, la secuencia no endógena es una secuencia humana.

En un ejemplo, el motivo PAM es cualquier PAM divulgado en la presente memoria o comprende una secuencia seleccionada de CCN, TCN, TTC, AWG, CC, NNAGNN, NGGNG GG, NGG, WGG, CWT, CTT y GAA. Por ejemplo, el motivo es un motivo PAM Cas9. Por ejemplo, el PAM es NGG. En otro ejemplo, el PAM es GG.

En un ejemplo, hay un motivo PAM a no más de 10 nucleótidos (p.ej., 3 nucleótidos) en 3’ y/o 5’ de la secuencia no endógena.

En un ejemplo, el motivo PAM se reconoce por una Cas9 de Streptococcus.

En un ejemplo, la célula u organismo es una célula de vertebrado no humano o un vertebrado no humano que expresa uno o más dominios variables de cadena pesada de anticuerpo humano (y opcionalmente ningún dominio variable de cadena pesada de una especie de vertebrado no humano). Por ejemplo, el organismo es un vertebrado generador de anticuerpos o vertebrado de ensayo divulgado en el documento WO2013061078.

En un ejemplo, la célula u organismo es una célula de vertebrado no humano o un vertebrado no humano que expresa uno o más dominios variables de cadena ligera kappa de anticuerpo humano (y opcionalmente ningún dominio variable de cadena ligera kappa de una especie de vertebrado no humano).

En un ejemplo, la célula u organismo es una célula de vertebrado no humano o un vertebrado no humano que expresa uno o más dominios variables de cadena ligera lambda de anticuerpo humano (y opcionalmente ningún dominio variable de cadena ligera kappa de una especie de vertebrado no humano).

En un ejemplo, la secuencia no endógena codifica una proteína receptora de Fc humana o subunidad o dominio de la misma (p.ej., una proteína receptora FcRN o Fcy humana, subunidad o dominio).

En un ejemplo, la secuencia no endógena comprende uno o más segmentos génicos de anticuerpo humano, una región variable de anticuerpo o una región constante de anticuerpo.

En un ejemplo, la secuencia de inserto es una secuencia humana que reemplaza o suplementa una secuencia no humana ortóloga.

Se proporciona también:

Un anticuerpo monoclonal o policlonal preparado mediante inmunización de un vertebrado (p.ej., ratón o rata) descrito en la presente memoria (o producido mediante un método descrito en la presente memoria) con un antígeno.

Se proporciona también:

Un método de aislamiento de un anticuerpo que se une a un antígeno predeterminado, comprendiendo el método:

(a) proporcionar un vertebrado (opcionalmente un ratón o rata) descrito en la presente memoria (o producido por un método descrito en la presente memoria);

(b) inmunizar dicho vertebrado con dicho antígeno;

(c) retirar linfocitos B del vertebrado y seleccionar uno o más linfocitos B que expresen anticuerpos que se unen al antígeno;

(d) opcionalmente, inmortalizar dichos linfocitos B seleccionados o progenie de los mismos, opcionalmente produciendo hibridomas a partir de los mismos; y

(e) aislar un anticuerpo (p.ej., un anticuerpo de tipo IgG) expresado por los linfocitos B.

En un ejemplo, el método comprende la etapa de aislar de dichos linfocitos B ácido nucleico que codifica dicho anticuerpo que se une a dicho antígeno; opcionalmente intercambiar la secuencia nucleotídica de región constante de cadena pesada del anticuerpo por una secuencia nucleotídica que codifica una región constante de cadena pesada humana o humanizada y opcionalmente madurar por afinidad la región variable de dicho anticuerpo; y opcionalmente insertar dicho ácido nucleico en un vector de expresión y opcionalmente un hospedador.

En un ejemplo, el método comprende elaborar un mutante o derivado del anticuerpo producido por el método.

Se proporciona el uso de un anticuerpo monoclonal o policlonal aislado, descrito en la presente memoria, o un anticuerpo mutante o derivado del mismo que se une a dicho antígeno, en la fabricación de una composición para uso como medicamento.

Se proporciona el uso de un anticuerpo monoclonal o policlonal aislado descrito en la presente memoria, o un anticuerpo mutante o derivado del mismo que se une a dicho antígeno, para uso en medicina.

Se proporciona un método de tratamiento de un paciente necesitado de ello (p.ej., un paciente humano), que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo monoclonal o policlonal aislado descrito en la presente memoria, o un anticuerpo mutante o derivado de mismo que se une a un antígeno.

Se proporciona una secuencia nucleotídica que codifica un anticuerpo descrito en la presente memoria, opcionalmente en el que la secuencia nucleotídica es parte de un vector. La divulgación proporciona también una célula hospedadora que comprende dicha secuencia nucleotídica.

Se proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o anticuerpos descritos en la presente memoria y un diluyente, excipiente o portador.

Se proporciona un citoblasto embrionario no humano, un animal no humano o un blastocito no humano que comprende una secuencia nucleotídica genómicamente integrada expresable que codifica una endonucleasa Cas (p.ej., Cas9 o Cys4) y opcionalmente una secuencia nucleotídica genómicamente integrada expresable que codifica un ARNtracr o un ARNg. Por ejemplo, el citoblasto embrionario es cualquier tipo de citoblasto embrionario descrito en la presente memoria.

En un ejemplo de célula, animal o blastocito, la secuencia de endonucleasa es constitutivamente expresable.

En un ejemplo de célula, animal o blastocito, la secuencia de endonucleasa es expresable induciblemente.

En un ejemplo de célula, animal o blastocito, la secuencia de endonucleasa es expresable de manera específica de tejido en el animal o progenie del mismo, o en un animal no humano que es progenie de la célula o blastocito.

En un ejemplo, la célula, animal o blastocito comprende uno o más ARNg o una secuencia nucleotídica expresable que codifica un ARNg o una pluralidad de secuencias nucleotídicas expresables que codifican cada una un ARNg diferente.

Se proporciona el uso de la célula, animal o blastocito en un método según cualquier configuración, aspecto, realización o ejemplo.

Un aspecto proporciona un anticuerpo producido por el método de la divulgación, opcionalmente para uso en medicina, p.ej. para el tratamiento y/o la prevención (tal como en un método de tratamiento y/o prevención) de una afección médica o enfermedad en un paciente, p.ej. un ser humano.

Un aspecto proporciona una secuencia nucleotídica que codifica el anticuerpo de la divulgación, opcionalmente en el que la secuencia nucleotídica es parte de un vector. Los vectores adecuados resultarán fácilmente evidentes para el especialista, p.ej. un vector de expresión de anticuerpo convencional que comprende la secuencia nucleotídica ligada operativamente con uno o más elementos de control de la expresión.

Un aspecto proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la divulgación y un diluyente, excipiente o portador, opcionalmente en el que la composición está contenida en un envase intravenoso (IV) (p.ej., una bolsa IV) o un envase conectado con una jeringa IV.

Un aspecto proporciona el uso del anticuerpo de la divulgación en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la profilaxis de una enfermedad o afección en un paciente, p.ej. un ser humano.

En un aspecto adicional, la divulgación se refiere a anticuerpos humanizados y cadenas de anticuerpos producidos según la presente divulgación, tanto en forma quimérica como totalmente humanizada, y al uso de dichos anticuerpos en medicina. La divulgación se refiere también a una composición farmacéutica que comprende tal anticuerpo y un portador u otro excipiente farmacéuticamente aceptable.

Las cadenas de anticuerpo que contienen secuencias humanas, tales como cadenas de anticuerpo quiméricas humanas-no humanas, se consideran humanizadas en la presente memoria en virtud de la presencia de regiones de codificación de la proteína humana. Pueden producirse anticuerpos totalmente humanos a partir de ADN que codifica una cadena de anticuerpo quimérico de la divulgación usando técnicas estándares.

Los métodos para la generación tanto de anticuerpos monoclonales como policlonales son bien conocidos en la materia, y la presente divulgación se refiere tanto a anticuerpos policlonales como monoclonales de anticuerpos quiméricos o totalmente humanizados producidos en respuesta a la exposición a antígeno en vertebrados no humanos de la presente divulgación.

En un aspecto adicional más, los anticuerpos quiméricos o cadenas de anticuerpo generados en la presente divulgación pueden manipularse, adecuadamente a nivel de ADN, para generar moléculas con propiedades o estructura de tipo anticuerpo, tales como una región variable humana de una cadena pesada o ligera con ausencia de una región constante, por ejemplo un anticuerpo de dominio; o una región variable humana con cualquier región constante de cadena pesada o bien ligera de la misma o diferente especie; o una región variable humana con una región constante de origen no natural; o una región variable humana junto con cualquier otro copartícipe de fusión. La divulgación se refiere a todos tales derivados de anticuerpo quiméricos derivados de anticuerpos quiméricos identificados según la presente divulgación.

En un aspecto adicional, la divulgación se refiere al uso de animales descritos en la presente memoria en el análisis de los efectos probables de fármacos y vacunas en el contexto de un repertorio de anticuerpos casi humanos. La divulgación se refiere también a un método para la identificación o validación de un fármaco o vacuna, comprendiendo el método suministrar la vacuna o fármaco a un mamífero descrito en la presente memoria y monitorizar uno o más de: respuesta inmunitaria, perfil de seguridad y efecto sobre la enfermedad.

La divulgación se refiere también a un kit que comprende un anticuerpo o derivado de anticuerpo como se divulga en la presente memoria y a instrucciones para el uso de tal anticuerpo o bien a un reactivo de laboratorio adecuado, tal como un tampón o reactivo de detección de anticuerpo.

Se entenderá que las realizaciones particulares descritas en la presente memoria se muestran a modo de ilustración y no como limitaciones de la invención. El uso de la palabra “un” o “una” cuando se usa junto con el término “comprender” en las reivindicaciones y/o la memoria descriptiva puede significar “uno”, pero es también consistente con el significado de “uno o más”, “al menos uno” y “uno y más de uno”. El uso del término “o” en las reivindicaciones se usa para significar “y/o” a menos que se indique explícitamente que se hace referencia a alternativas solo o las alternativas sean mutuamente exclusivas, aunque la divulgación apoya una definición que hace referencia a solo alternativas e “y/o”. A lo largo de esta solicitud, el término “aproximadamente” se usa para indicar que un valor incluye la variación de error inherente para el dispositivo, el método que se emplea para determinar el valor o la variación que existe entre los sujetos de estudio.

Como se usa en esta memoria descriptiva y reivindicaciones, las palabras “comprender” (y cualquier forma de comprender, tal como “comprenden” y “comprende”), “tener” (y cualquier forma de tener, tal como “tienen” y “tiene”), “incluir” (y cualquier forma de incluir, tal como “incluye” e “incluyen”) o “contener” (y cualquier forma de contener, tal como “contiene” y “contienen”) son inclusivas o de extremos abiertos y no excluyen elementos o etapas del método adicionales no citados.

El término “o combinaciones de los mismos” como se usa en la presente memoria hace referencia a todas las permutaciones y combinaciones de los artículos enumerados antes del término. Por ejemplo, “A, B, C o combinaciones de los mismos” pretende incluir al menos uno de: A, B, C, AB, AC, BC o ABC, y si el orden es importante en un contexto particular, también BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC o CAB. Continuando con este ejemplo, se incluye expresamente combinaciones que contienen repeticiones de uno o más artículos o términos, tales como BB, AAA, Mb , BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB y demás. El especialista en la técnica entenderá que típicamente no hay límite al número de artículos o términos en cualquier combinación, a menos que sea evidente otra cosa a partir del contexto.

Cualquier parte de esta divulgación puede leerse en combinación con cualquier otra parte de la divulgación, a menos que sea evidente otra cosa a partir del contexto.

Todas las composiciones y/o métodos divulgados y reivindicados en la presente memoria pueden elaborarse y ejecutarse sin experimentación indebida a la vista de la presente divulgación.

REFERENCIAS

1. Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu X, Jiang W, Marraffini LA et al: Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 2013, 339(6121): 819-823.

2. Wang H, Yang H, Shivalila CS, Dawlaty MM, Cheng AW, Zhang F, Jaenisch R: One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell 2013, 153(4): 910-918.

3. Mali P, Yang L, Esvelt KM, Aach J, Guell M, DiCarlo JE, Norville JE, Church GM: RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 2013, 339(6121): 823-826.

4. Gaj T, Gersbach CA, Barbas CF, 3°: ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol2013, 31(7): 397-405.

5. Perez-Pinera P, Ousterout DG, Gersbach CA: Advances in targeted genome editing. Curr Opin Chem Biol 2012, 16(3-4): 268-277.

6. Shah SA, Erdmann S, Mojica FJ, Garrett RA: Protospacer recognition motifs: Mixed identities and functional diversity. RNA Biol 2013, 10(5).

7. Haurwitz RE, Sternberg SH, Doudna JA: Csy4 relies on an unusual catalytic dyad to position and cleave CRISPR RNA. EMBO J 2012, 31 (12): 2824-2832.

8. Yusa K, Zhou L, Li MA, Bradley A, Craig NL: A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc Natl Acad Sci USA 2011,108(4): 1531-1536.

9. Qiao J, Oumard A, Wegloehner W, Bode J: Novel tag-and-exchange (RMCE) strategies generate master cell clones with predictable and stable transgene expression properties. J Mol Biol2009, 390(4): 579-594. 10. Oumard A, Qiao J, Jostock T, Li J, Bode J: Recommended Method for Cromosoma Exploitation: RMCE-based Cassette-exchange Systems in Animal Cell Biotechnology. Cytotechnology 2006, 50(1-3): 93-108.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Modificaciones de ADN precisas

(a) Uso de nicasa para HDR

Se ha reseñado que la nucleasa Cas9 puede convertirse en una nicasa mediante la sustitución de un aspartato por alanina (D10A) en el dominio RuvCI de SpCas9 (Cong et al.). Cabe destacar que las roturas monocatenarias de ADN se reparan preferencialmente mediante la ruta de HDR. La nicasa Cas9 D10A, cuando está en un complejo con ARNcr:ARNtracr maduro, puede inducir específicamente muescas de ADN en una localización precisa. Teniendo esto en mente, se propone extender la aplicación del sistema CRISPR/Cas creando una muesca en una localización dada en un genoma usando la nicasa Cas9 D10A y explotando entonces la ruta de HDR para insertar un fragmento de ADN monocatenario (endógeno o exógeno) que contendrá homología de ADN (típicamente, para recombinería, son suficientes 50 pb para una recombinación eficaz) flanqueante de la unión de ADN con muesca para llevar e insertar un ADN dado en la localización precisa; se usará una homología de tamaño similar con el presente ejemplo (Figura 1A). Se diseñará el ARN de guía (ARNg) individualmente por secuencia protoespaciadora diana o se incorporará a una matriz de CRISPR individual que codifica 2 o más secuencias espaciadoras que permiten una edición genómica multiplexada a partir de un ensayo de CRISPR individual.

(b) Ejemplo de deleción de ADN precisa

Para demostrar una deleción precisa usando Cas9 en asociación con ARNg y sin vector de orientación ni ADN donante, se diseñaron dos ARNg en un gen que estaban separados 55 pb. Los dos ARNg estaban en hebras de ADN opuestas como se muestra en la Figura 9.

Se transfectaron citoblastos embrionarios de ratón con nucleasa Cas9 humana y los dos ARNg. Se llevó a cabo el procedimiento de transfección como se detalla anteriormente, pero no se seleccionaron los clones resultantes. Se genotiparon los clones de citoblastos embrionarios transfectados usando un par de oligos que cubren los dos ARNg (cebador 1 y 2) para detectar la deleción de 55 pb específica (Figura 10).

La mayoría de los clones no mostraba la deleción de 55 pb específica, sin embargo, se identificaron claramente clones que contenían la deleción definida. De los 384 clones analizados, se encontró que aproximadamente un 4 % de los clones contenían la deleción de 55 pb específica. Nota: No se muestran todos los datos de genotipado. Los clones que contenían la deleción de 55 pb específica se analizaron adicionalmente por secuenciación de los productos de PCR como confirmación final (datos no mostrados). Además, cuando se vio la deleción específica, se observó que ambos alelos contenían la deleción específica. Estos datos confirmaban, que cuando se usan dos ARNg, puede hacerse una deleción precisa y específica sin el requisito de un vector de orientación. Sin embargo, puede suponerse que la eficacia de la deleción definida puede potenciarse en gran medida usando la combinación de dos ARNg con un vector de orientación o un fragmento de ADN donante que contiene brazos de homología flanqueantes de la región de deleción pretendida.

(c) Metodología alternativa para la deleción de ADN

En un escenario separado, pueden diseñarse dos ARNg o una matriz de CRISPR individual que codifica múltiples secuencias espaciadoras flanqueantes de un gen o una región de interés, y con la asociación de la nicasa Cas9 D10A pueden inducirse dos roturas monocatenarias separadas. Esto, en asociación con un fragmento de ADN monocatenario que contiene homología de ADN con la unión de punto de rotura en 5’ de la primera muesca de ADN, y homología de ADN con la unión de punto de rotura en 3’ de la segunda muesca, hace que la región entre las dos muescas de ADN monocatenarias pueda eliminarse precisamente (Figura 2A).

(d) Metodología alternativa para el reemplazo de ADN

En otro escenario, pueden diseñarse dos ARNg separados o una matriz de CRISPR individual multiplexada flanqueantes de un gen o una región de interés y, con la asociación de la nicasa Cas9 D10A, pueden inducirse dos roturas monocatenarias separadas. En este caso, el fragmento de ADN monocatenario de intrusión (o ADN bicatenario) puede contener una secuencia de ADN de fuente endógena o bien exógena que contiene una secuencia de un gen, elemento regulador, promotor, etc. conocido. Este fragmento de ADN monocatenario (o ADN bicatenario) puede integrarse para reemplazar la región de ADN de interés flanqueada por la muesca de ADN dotándolo con homología de ADN de la región 5’ de la primera muesca y la región 3’ de la segunda muesca (Figura 3A). Debido a la alta eficacia del sistema CRISPR/Cas para escindir ADN, la estrategia propuesta anterior no requerirá la introducción de ningún marcador de selección, creando por tanto una edición genómica continua exacta de manera precisa y definida. Como opción, puede incluirse un marcador de selección flanqueado por LTR PiggyBac para permitir la selección directa de clones correctamente modificados. Una vez se han identificado los clones correctos, puede retirarse el marcador de selección convenientemente mediante la expresión de transposasa piggyBac hiperactiva (Yusa K., Zhou L., Li MA, Bradley A., Craig N.L.: A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2011,108(4): 1531-1536). Además, pueden aplicarse los enfoques anteriores a citoblastos embrionarios, células de mamífero, células de levadura, células bacterianas, células de planta así como ejecutarse directamente en cigotos para acelerar el proceso de genomanipulación homocigótica en corto tiempo. Sería también posible multiplexar este sistema generando múltiples inserciones (KI) y deleciones (KO) simultáneas de ADN y deleción e inserción secuencial (KO^KI).

(e) Ejemplo de deleción e inserción de ADN en una localización predefinida (KO^KI)

Para demostrar que puede manipularse una región de ADN deseada usando Cas9, se seleccionó un ARN de guía (ARNg) individual en una región deseada (exón 1 del gen X) Figura 7. Se construyó también un vector de orientación que contenía brazos de homología de aproximadamente 300 pb (HA 5’ y 3’) flanqueantes del ARNg. Los brazos de homología hibridarán exactamente en la región definida y por tanto eliminarán una región de 50 pb, que se pretende para deleción. El vector de orientación permite también la inserción de cualquier secuencia de ADN de interés. En este experimento de prueba de concepto, se incluyó un módulo de PGK-puromicina de aproximadamente 1,6 kb. Se transfectaron el ARN de guía (0,5 gg) junto con el vector de orientación (1 gg) y vector de nucleasa Cas9 (1 gg) en citoblastos embrionarios y se escogieron 96 clones después de selección en puromicina usando el protocolo descrito anteriormente. Nota: como prueba de la eficacia de orientación, se comparó el vector de orientación lineal frente al circular. También como control negativo, se hizo el mismo experimento no usando vector Cas9 para comparar la eficacia de orientación mediante recombinación homóloga con y sin expresión de Cas9.

Todos los clones seleccionados eran resistentes a puromicina y se genotiparon los 96 clones escogidos de cada una de las cuatro transfecciones usando el par de oligos HAP341/HAP334. Los clones correctamente orientados procuraron un producto de PCR de 880 pb. Se muestran los datos de genotipado resultantes en la Figura 8.

A partir de los datos de genotipado de este experimento, puede verse que la rotura de ADN bicatenario mediada por Cas9 mejora en gran medida la eficacia de recombinación homóloga del vector de orientación, ya que el 62 % y 49 % de los clones que usan vector de orientación circular o lineal, respectivamente, se orientaban correctamente hacia solo un clon individual que usa vector de orientación circular cuando no se usaba Cas9. También puede verse a partir de estos datos que el vector de orientación circular procuraba una eficacia de orientación ligeramente mejor que cuando se usaba el vector lineal, pero no puede extraerse una conclusión general a partir de este experimento individual más que decir que tanto el vector de orientación circular como el lineal procuraban una eficacia de orientación mejorada en gran medida cuando se asociaban con Cas9 y un ARN de guía específico. Este experimento demostraba también que usar Cas9 para crear una rotura de ADN definida puede usarse para eliminar una región de ADN definida y posteriormente insertar cualquier fragmento de ADN de interés.

Ejemplo de referencia 2: Reciclado de PAM para inserciones o deleciones secuenciales

En ciertos escenarios, puede ser útil editar un genoma por paseo cromosómico. Usando cualquiera de los tres ejemplos esbozados anteriormente, podría ser posible llevar a cabo una edición genómica secuencial por etapas, con lo que la secuencia de PAM usada en una ronda anterior de edición genómica mediada por CRISPR/Cas puede reutilizarse para llevar a cabo múltiples rondas de edición genómica tales como deleciones, inserciones o deleción e inserción simultáneas. Se muestra un ejemplo de deleción secuencial mediante el cual se recicla la secuencia de PAM de la etapa de edición genómica anterior en la Figura 4A. Usando el enfoque de reciclado de PAM, es posible llevar a cabo inserciones secuenciales así como deleción e inserción simultáneas secuenciales.

Se recicla la secuencia de PAM mediante su reintroducción por recombinación homóloga y como parte del brazo de homología. La secuencia de PAM puede estar opcionalmente acompañada por una única secuencia de ARN de guía, creando un sitio novedoso en el genoma del hospedador para una ronda adicional de edición genómica.

Ejemplo de referencia 3: Inserción rápida de sitios Lox usando el sistema CRISPR/Cas

La eficacia de orientación usando métodos de recombinación homóloga convencionales en citoblastos embrionarios es baja. En un escenario diferente, puede usarse el sistema CRISPR/Cas para introducir rápida y eficazmente sitios lox u otra secuencia de reconocimiento de recombinasa tal como Frt en una localización definida para actuar como plataforma de aterrizaje para edición genómica usando intercambio de módulos mediado por recombinasa (RMCE) (Qiao J., Oumard A, Wegloehner W., Bode J.: Novel tag-and-exchange (RMCE) strategies generate master cell clones with predictable and stable transgene expression properties, J. Mol. Biol., 2009, 390 (4): 579-594; y Oumard A, Qiao J., Jostock T., Li J., Bode J.: Recommended Method for Cromosoma Exploitation: RMCE-based Cassetteexchange Systems in Animal Cell Biotechnology., Cytotechnology, 2006, 50(1-3): 93-108). Una vez se introducen los sitios lox en el genoma, pueden realizarse la inversión, deleción o intercambio de módulos para eliminar e introducir un fragmento de ADN de tamaño variable en este sitio mediante expresión de la recombinasa Cre. Se muestra un ejemplo de inserción de lox mediada por CRISPR/Cas seguida de RMCE en la Figura 5A. La etapa de RMCE puede usarse para invertir la región flanqueada por el sitio lox o para eliminar esta región, así como para eliminar e insertar simultáneamente ADN de interés en esta región. Además, la etapa de RMCE puede adaptarse para llevar a cabo múltiples rondas secuenciales de RMCE (sRMCE).

Ejemplo de referencia 4A:

Se hace referencia a la Figura 6A. Se orienta un transposón piggyBac que alberga un gen neoR flanqueado por loxP/lox mutante regulado por el promotor PGK a un genoma de citoblasto embrionario mediante recombinación homóloga estándar. Los clones diana pueden seleccionarse por G418. Esto proporciona una plataforma de aterrizaje para el intercambio de módulos mediado por recombinasa (RMCE) siguiente. Tal clon de citoblasto embrionario puede usarse como célula parental para cualquier modificación adicional. Se inserta un módulo que contiene los genes de PuroA TK-T2A-Cas9 sin promotor flanqueado por loxP/lox mutante y ARN de guía (ARNg) regulado por el promotor de polimerasa III U6 en la plataforma de aterrizaje mediante expresión transitoria de cre. Los genes de ARNg pueden ser uno o más de uno que se orientan al mismo gen o diferentes genes. Los clones insertados pueden seleccionarse con puromicina y confirmarse por PCR de unión. Durante la selección, la expresión de Cas9 y ARNg del módulo insertado da como resultado una orientación o modificación génica más eficaz que la que puede conseguir la expresión transitoria de Cas9 y ARNg. Después de 4-6 días de selección, se escinde el módulo modificado completo por expresión transitoria de transposasa piggyBac (PBasa). Los clones de citoblastos embrionarios finales no contendrían ninguna secuencia de Cas9 ni ARNg. Los clones con genes modificados homocigóticos se confirmarían por PCR y secuencia.

El rasgo principal de este método es controlar que la expresión de Cas9 y ARNg durante cierto tiempo sea suficiente para generar tasas de orientación eficaces.

Ejemplo de referencia 4B: expresión de Cas9 de una copia individual

Como se detalla en el ejemplo 6, para demostrar la expresión individual y estable de Cas9 del cromosoma de una célula, se orientó un vector de plataforma de aterrizaje al alelo Rosa26 en el cromosoma 6. Se usaron brazos de homología de ADN para orientar el vector de plataforma de aterrizaje entre los exones 2 y 3 de Rosa26. Se orientó el vector de plataforma de aterrizaje a citoblastos embrionarios usando el procedimiento descrito anteriormente. Se seleccionaron los clones de citoblastos embrionarios transfectados con G418 y se genotiparon para una orientación correcta (Figura 11) por PCR que amplifica las uniones de brazo de homología en 5’ y 3’.

La orientación de la plataforma de aterrizaje procuró muchos clones de citoblastos embrionarios diana. Se usó una selección de los clones diana para insertar un módulo de ADN que contiene nucleasa Cas9 ligada con Puro-delta-tk a través de una secuencia T2A en la plataforma de aterrizaje diana a través de RMCE, lo que implicaba la expresión de recombinasa Cre. Los correspondientes sitios loxP y Io2272 tanto en la plataforma de aterrizaje como en el vector de entrada aseguraban el sentido correcto de la inserción. Puesto que la plataforma de aterrizaje contenía un promotor PGK sin gen, la inserción correcta del ADN de vector de entrada que contenía Cas9 activaba la expresión de puromicina y por tanto los clones se seleccionaban positivamente en puromicina. La orientación no específica de este módulo de ADN no procurará clones resistentes a puromicina debido a la ausencia de un promotor que dirija la transcripción del gen de puromicina sin promotor en el módulo de ADN insertado. El vector de Cas9 inicial insertado en la plataforma de aterrizaje no contenía ninguna secuencia de ARN de guía. Se genotiparon los clones de citoblastos embrionarios resistentes a puromicina por PCR para la inserción correcta de Cas9 (Figura 12).

Como se esperaba a causa de la selección positiva, la mayoría de los clones genotipados para inserción del vector Cas9 estaban correctamente orientados a través de RCME basándose en los resultados de genotipado por PCR. Se usaron dos de los clones correctos (KHK1.6 Z2-24-27 y KHK1.10 Z2-25-4 hacían referencia a clones Z positivos) que contienen ahora la Cas9 de copia individual integrada en el gen Rosa26 como copia individual para probar si la expresión de Cas9 era suficiente para inducir la edición genómica mediada por Cas9. En los dos clones Z positivos, se transfectó ARN de guía frente a un gen al que se hace referencia como gen Y usando procedimiento descritos anteriormente. Después de la transfección y expansión de los clones de citoblastos embrionarios resultantes, se aislaron 36 clones individuales de cada transfección y se analizaron inicialmente por PCR usando oligos que flanquean el ARN de guía (Figura 13).

La mayoría de los genes procuraban un producto de PCR de tamaño equivalente al PCR de control positivo donde se usaba ADN de citoblastos embrionarios AB2.1 de ratón. Sin embargo, puede verse claramente que algunos clones procuraban un producto de PCR distintivamente menor que el del control positivo, sugiriendo que estos clones contienen una deleción significativa a través de indel. Para verificar esto y comprobar si el resto de los productos de PCR, aunque similares en tamaño al control positivo, no contenían indeles, se purificaron todos los productos de PCR usando el kit de extracción con gel Qiagen y se analizaron por secuenciación. Los datos de secuenciación confirmaron una deleción significativa para aquellos productos de PCR que procuraban productos más cortos que el control positivo. También resaltaban que algunos de los otros clones con tamaño de producto de PCR similar al control positivo contenían indeles, lo que incluía diversas combinaciones de inserción y deleción (datos de secuenciación no mostrados). De los clones analizados, el 18 % de ellos contenían un indel. Estos datos demostraban claramente que puede usase la expresión de copia individual de Cas9 para llevar a cabo edición genómica y que estos clones pueden usarse ahora como células hospedadoras de Cas9 para llevar a cabo una multitud de ediciones genómicas. Estos clones de citoblastos embrionarios se están usando ahora para generar estirpes transgénicas de ratón mediante las cuales puede llevarse a cabo una edición genómica en una etapa mediante inyección solo de ARNm de guía directamente en cigotos, sin el requisito de transcribir ARNm de Cas9 para simplificar el protocolo de edición genómica de una etapa.

Ejemplo de referencia 5(A): Metodología

A _____ Reconstrucción del sistema de vector de CRISPR/Cas (Nucleasa)

El sistema de edición genómica CRISPR/Cas se ha reconstruido in vitro y ejemplificado en citoblastos embrionarios de ratón usando el vector pX330 que contiene S pyogenes humanizado (hSpCsn1) (Cong et al.). El sistema CRISPR/Cas puede reconstruirse como se describe en Cong et al usando tiras de ADN sintético y ensamblaje de ADN. En el presente ejemplo, el ensamblaje de ADN completo constituiría un fragmento de 6006 pb que contiene 45 pb de homología con el vector pBlueScript KS+ en 5' del sitio de corte EcoRV, el promotor U6 humano, dos sitios de restricción Bbsl para clonar en la secuencia espaciadora que se fusiona con una secuencia de ARN de guía quimérica, el promotor de beta-actina de pollo con 3 FLAG, la señal de localización nuclear (NLS) seguida de la secuencia de hSpCsn1 y otra NLS, poliA de bGH, secuencia de repetición terminal invertida y finalmente otros 45 pb de homología con pBlueScript KS+ en 3’ del sitio de corte de EcoRV. Este tramo de 6006 pb de ADN se sintetizará como 7 fragmentos de ADN individuales en que cada fragmento tendrá una superposición de 45 pb con el fragmento de ADN adyacente para permitir el ensamblaje de ADN. La secuencia de ADN de estos fragmentos se muestra a continuación en el orden de ensamblaje.

Fragmento 1A (1340 pb)

GGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCT TCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGA TATTAGTACAAAATACGTG ACGTAG AAAGTAATAATTTCTT GGGTAGTTTGC AGTTTTAAAATTATGTTT TAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGA AAGG ACG AAACACCGGGTCTTCG AG AAG ACCTGTTTTAG AGCTAG AAATAGC AAGTTAAAATAAGGCTA GTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC l i l i l í GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT AAAATAAGGCTAGTCCG I I I I IAGCGCGTGCGCCAATTCTGCAGACAAATGGCTCTAGAGGTACCCGTTA CATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAGTAAC GCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACAT CAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTGTG CCCAGTACATG ACCTTATGGG ACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTC ATCGCTATTACCAT GGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTAT TTATTTAI l i l i IAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGG GGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGC GCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCG GCGGGCGGGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGC CCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTA ATTAGCTG AGC AAG AGGTAAGGGTTTAAGGG ATGGTTGGTTGGTGGGGTATTAATGTTTAATTACCTGG AGCACCTGCCTGAAATCACI M i l i ICAGGTTGGACCGGTGCCACCATGGACTATAAGGACCACGACGGA GACTACAAGGATCATGATATT (SEQ ID NO:7)

Fragmento 2 (852 pb)

AT GGACT AT AAGGACCACGACGGAGACT ACAAGGATCAT GAT ATTGATT ACAAAGACGAT GACGAT AAGA T GGCCCCAA AGAAG AAGCGGAAGGT CGGT AT CCACGG AGT CCCAGCAGCCGACAAGAAGT ACAGCAT CG GCCT GGACAT CGGCACCAACT CT GT GGGCT GGGCCGT GAT CACCGACGAGT ACAAGGT GCCCAGCAAGA AATT CAAGGT GCT GGGCAACACCGACCGGCACAGCAT CAAGAAGAACCT GAT CGGAGCCCT GCT GTT CG ACAGCGGCGAAACAGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGACGGAAGA ACCGGAT CT GCT AT CT GCAAGAGAT CTT CAGCAACGAGAT GGCCAAGGT GGACGACAGCTT CTT CCACA GACT GGAAGAGT CCTT CCT GGT GGA AGAGGAT A AGAAGCACG AGCGGCACCCCAT CTT CGGCA ACAT CG T GGACGAGGT GGCCT ACCACGAGAAGT ACCCCACCAT CT ACCACCT GAGAAAGA AACT GGT GGACAGCA CCGACAAGGCCGACCT GCGGCT GAT CT AT CT GGCCCT GGCCCACAT GAT CAAGTT CCGGGGCCACTT CC T GAT CGAGGGCGACCT GAACCXXGACAACAGCGACGT GGACAAGCT GTT CAT CCAGCT GGT GCAGACCT ACAACCAGCT GTT CG AGGAAAACCCCAT CAACGCCAGCGGCGT GGACGCCAAGGCCAT CCT GT CT GCCA GACT GAGCAAGAGCAGACGGCT GGAAAAT CT GAT CGCCCAGCT GCCCGGCGAGA AGAAG AAT GGCCT GT TCGGAAACCTGATTGCCCTGAGC (SEQ ID NO:8)

Fragmento 3 (920 pb)

GGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGAAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAG AGCAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGAC AACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCC ATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCTCTATGATCA AGAGATACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAAGCTCTCGTGCGGCAGCAGCTGCCTGAGA AGTACAAAGAGAI I I ICI ICGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATTGACGGCGGAGCCAGCC AGGAAGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAAAAGATGGACGGCACCGAGGAACTGCTCGTGA AGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCC ACCTGGGAGAGCTGCACGCCATTCTGCGGCGGCAGGAAGAI I I I IACCCATTCCTGAAGGACAACCGGG AAAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGCATCCCCTACTACGTGGGCCCTCTGGCCAGGGGAAACAGCA GATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAAGTGGTGGACA AGGGCGCTTCCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCCAACGAGAAGG TGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTATAACGAGCTGACCAAAGTGAAATACGT GACCGAGGGAATGAGAAAGCC (SEQ ID N0:9)

Fragmento 4 (920 pb)

CGAGCTGACCAAAGTGAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAA AAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGACTA CTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAAATCTCCGGCGTGGAAGATCGGTTCAACGCCTCCCTG GGCACATACCACGATCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAAAACGAGGACA TTCTGGAAGATATCGTGCTGACCCTGACACTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAA CCTATGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGAGATACACCGGCTGGGGCA GGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACAATCCTGGATTTCCTGA AGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAAGAGGA CATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGATAGCCTGCACGAGCACATTGCCAATCTGGCCGGCAG CCCCGCCATTAAGAAGGGCATCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTCGTGAAAGTGATGGGCCG GCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGACAGAAGAA CAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACA CCCCGTGGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGGCGGGATAT GTACGTGGACCAGGAACTGG (SEQ ID NO: 10)

Fragmento 5 (920 pb)

ACTACCTGCAGAATGGGCGGGATATGTACGTGGACCAGGAACTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACG ATGTGGACCATATCGTGCCTCAGAGCTTTCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCAGAA GCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCTCCGAAGAGGTCGTGAAGAAGATGAAGAACTACT GGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTCGACAATCTGACCAAGGCCGAGAGAG GCGGCCTGAGCGAACTGGATAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAA AGCACGTGGCACAGATCCTGGACTCCCGGATGAACACTAAGTACGACGAGAATGACAAGCTGATCCGGG AAGTGAAAGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTTTACAAAGT GCGCGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTCGTGGGAACCGCCCTGATC AAAAAGTACCCTAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATG ATCGCCAAGAGCGAGCAGGAAATCGGCAAGGCTACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACT TTTTCAAGACCGAGATTACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCTCTGATCGAGACAAACGGCG AAACCGGGGAGATCGTGTGGGATAAGGGCCGGGATTTTGCCACCGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCC AAGTGAATATCGTGAAAAAGACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTATCCTGCCCAAGA GGAACAGCGATAAGCTGATC(SEQ ID NO: 11)

Fragmento 6 (789 pb) AGCAAAGAGTCTATCCTGCCCAAGAGGAACAGCGATAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCT AAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTATTCTGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAG GGCAAGTCCAAGAAACTGAAGAGTGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTC GAGAAGAATCCCATCGACTTTCTGGAAGCCAAGGGCTACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTGATCATCAAGC TGCCTAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGGCCGGAAGAGAATGCTGGCCTCTGCCGGCGAACTGC AGAAGGGAAACGAACTGGCCCTGCCCTCCAAATATGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAA GCTGAAGGGCTCCCCCGAGGATAATGAGCAGAAACAGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGCACTACCTGGA CGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCTCCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCTAATCTGGACAAAGT GCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGATAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCACCTGTTT ACCCTGACCAATCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTTGACACCACCATCGACCGGAAGAGGTACA CCAGCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACACGGA TCGACCTGTCTCAGCTGGGAGGCGAC (SEQ ID NO: 12)

Fragmento 7 (535 pb)

GGCCT GT ACGAGACACGGAT CGACCT GT CT CAGCT GGG AGGCX3ACAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAG GCX3GGCCAGGCAAAA AAGA AAAAGT AAGAATT CCT AGAGCT CGCT GAT CAGCCT CG ACT GT GCCTT CTAG TT GCCAGCCAT CT GTT GTTT GCCCCT CCCCCGT GCCTT CCTT GACCCT GGAAGGT GCCACT CCCACT GT C CTTT CCT AAT AAAAT GAGGAAATT GCAT CGCATT GT CTG AGT AGGT GT CATT CT ATT CT GGGGGGT GGG GT GGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATT GGGA AGAGA AT AGCAGGCAT GCT GGGGAGCGGCCGCAGG AACCCCT AGT GAT GGAGTT GGCCACT CCCT CT CT GCGCGCT CGCT CGCT CACT GAGGCCGGGCGACCAA AGGT CGC(XG ACGCCCGGGCTTT GCCCGGGCGGCCT CAGT GAGCGAGCGAGCGCGCAGCT GCCT GCAG GGGCGCX:TATCGAATT(XTGCAGCXXGGGGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCC (SEQ ID NO: 13) Para reconstruir el sistema CRISPR/Cas descrito en Cong et al., se ensamblarán los fragmentos de ADN anteriores además del vector pBlueScript KS+ linealizado con EcoRV usando el kit de ensamblaje Gibson (n° de cat. NEB E5510S). Como enfoque alternativo, el fragmento de 6006 pb puede ensamblarse mediante PCR de ensamblaje mezclando conjuntamente la relación molar de los fragmentos de ADN individuales y usando la mezcla de ADN como molde de PCR. El producto de PCR ensamblado puede clonarse entonces directamente en el vector pBlueScript o un sistema de vector de clonación estándar tal como un kit de clonación TOPO TA (Invitrogen).

B: Reconstrucción del sistema de vector de CRISPR/Cas (nicasa D10A)

La versión de nicasa D10A del sistema CRISPR/Cas puede reconstruirse convenientemente ensamblando los fragmentos anteriores, en que el fragmento 2 se reemplaza por el fragmento 2A que contiene la sustitución D10A (véase la secuencia siguiente).

Fragmento 2A (852 pb) ATGGACTATAAGGACCACGACGGAGACTACAAGGATCATGATATTGATTACAAAGACGATGACGATAAGA TGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCGGTATCCACGGAGTCCCAGCAGCCGACAAGAAGTACAGCATCG GCCTGgccATCGGCACCAACTCTGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGA AATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCCCTGCTGTTCG ACAGCGGCGAAACAGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGACGGAAGA ACCGGATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACA GACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGATAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCG TGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCA CCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTATCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCC TGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCT ACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCTGCCA GACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAATGGCCTGT TCGGAAACCTGATTGCCCTGAGC (SEQ ID NO: 14)

Se resalta el aspartato sustituido por alanina en negrita y subrayado.

C: Clonación de la secuencia diana (espaciadora)

Puede clonarse la secuencia espaciadora diana en el sistema de vector de CRISPR/Cas anterior a través de sitios de restricción BbsI localizados en dirección 5’ de la secuencia de ARN de guía quimérica. La secuencia espaciadora puede ordenarse como pares de oligos y reasociarse conjuntamente con salientes como se muestra a continuación para permitir la clonación directa en el vector de CRISPR/Cas linealizado con BbsI usando protocolos de biología molecular estándares.

Secuencia de un ejemplo de par de oligos con secuencia espaciadora:

5’ - CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3’ (SEQ ID NO: 15)

3' - CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5’ (SEQ ID NO: 16)

El saliente de 4 pb subrayado se requiere incluir en los oligos espaciadores para facilitar la clonación en el sitio de restricción Bbsl en el vector de CRISPR/Cas. Usando este enfoque, puede clonarse convenientemente cualquier secuencia espaciadora en el vector de CRISPR/Cas.

D: Reconstrucción del sistema CRISPR/Cas para la generación en una etapa de animales transgénicos Para reconstituir un sistema CRISPR/Cas para la generación en una etapa de animales transgénicos como se describe en Wang et al. (Wang H., Yang H., Shivalila C.S., Dawlaty M.M., Cheng A.W., Zhang F., Jaenisch R.: Onestep generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering., Cell, 2013, 153(4): 910-918) en que se usa inyección directa en embrión, el sistema de vector de CRISPR/Cas anteriormente detallado tiene que modificarse para incorporar un promotor de polimerasa T7 a la secuencia de codificación de Cas9. Además, el ARNg tiene que retirarse y sintetizarse separadamente por reasociación de oligos o producirse sintéticamente. (Véase a continuación para un ejemplo de secuencia espaciadora T7 fusionada con una secuencia de ARN de guía quimérica, T7-ARNg). Nota: idealmente, la secuencia espaciadora se diseñará en una única región de un cromosoma dado para minimizar los efectos fuera de diana y también la secuencia genómica protoespaciadora respectiva tiene que tener un PAM en el extremo 3’.

Ejemplo de secuencia de T7-ARNg

TT AAT ACGACT CACT AT AGGN NNNNNNNNNNNNNNNNNNN GTTTTAG AGCT AGAAAT AGCAAGTT AAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT (SEQ ID NO: 17) Las 20 pb subrayadas de N representan la secuencia espaciadora para un ADN diana dado.

Para reconstruir el sistema CRISPR/Cas de una etapa, los fragmentos de ADN detallados anteriormente (fragmentos 2, 3, 4, 5, 6 y 7) pueden ensamblarse conjuntamente, donde el fragmento 1A (que contiene 45 pb de homología con el vector pBlueScript KS+ en 5' del sitio de restricción EcoRV, promotor U6 humano, sitios de restricción Bbsl, secuencia de ARN de guía qumérica y promotor de b-actina de pollo) se reemplaza por el fragmento 1, que contiene solo 45 pb de homología con el vector pBlueScript KS+ y la secuencia de ADN del promotor de polimerasa T7 con 45 pb de homología con el fragmento 2. Esto creará la versión de nucleasa del sistema CRISPR/Cas para la generación en una etapa de animales transgénicos. Para crear la versión de nicasa, el fragmento 2 puede reemplazarse por el fragmento 2A, como se detalla anteriormente, y entonces pueden ensamblarse conjuntamente los fragmentos 1,2A, 3, 4, 5, 6 y 7 por ensamblaje de Gibson o bien por PCR de ensamblaje.

Fragmento 1 (111 pb)

GGT ACCGGGCXXXXXCT CGAGGT CGACGGT AT CGAT AAGCTT GAT AAT ACGACT CACT ATAGGGAG AAT GGACTATAAGGACCACX3ACGGAGACTACAAGGATCATGATATT (SEQ ID NO: 18)

E: Preparación de oligos/fragmentos de ADN para reparación mediada por HDR

Se sintetizarán oligos de ADN que oscilan de 15 pb en adelante hasta más de >125 pb mediante el servicio Sigma Custom Oligo Synthesis. Los oligos pueden contener cualquier secuencia tal como una mutación definida, sitios de restricción introducidos o una secuencia de interés que incluye una secuencia de reconocimiento de recombinación tal como loxP o derivados de la misma, Frt y derivados de la misma o LTR PiggyBac o cualquier otro elemento de transposón o elemento regulador incluyendo potenciadores, secuencia promotora, gen indicador, marcadores de selección y marcajes. El diseño de oligo incorporará homología de ADN a la región en que Cas9 media la rotura de ADN bicatenaria o muesca de ADN. El tamaño de la homología oscilará desde unos pocos pares de bases (2-5 pb) en adelante hasta más de 80 pb. Los fragmentos de ADN más grandes (intervalo de >100 pb hasta varias kilobases) se prepararán sintéticamente (GeneArt) o bien por PCR. El fragmento de ADN se sintetizará con o sin NLS flanqueada o bien solo con una NLS individual y con o sin un promotor (p.ej., promotor de polimerasa T7). El ADN puede prepararse como un fragmento de ADN monocatenario usando el método de secuencia de ADN diana biotinilado de captura (Invitrogen: Dynabeads M-270 Streptavidin) o bien cualquier otra metodología de preparación de ADN monocatenario estándar y establecida. El ADN monocatenario puede prepararse para microinyección por IVT como se describe anteriormente y coinyectarse el ARNm con ARNm de Cas9 y ARNg. El fragmento de ADN puede coinyectarse también como un fragmento de ADN bicatenario. El fragmento de ADN estará flanqueado por homología de ADN con el sitio en que Cas9 media la rotura de ADN bicatenaria o muesca de ADN. La homología de ADN puede oscilar de unos pocos pares de bases (2-5 pb) hasta o más de varias kilobases. El fragmento de ADN puede usarse para introducir cualquier ADN endógeno o exógeno.

La reparación mediada por HDR puede realizarse también en citoblastos embrionarios después de la escisión de ADN mediada por CRISPR/Cas. El oligo donante o fragmento de ADN anteriormente mencionado puede cotransfectarse en citoblastos embrionarios junto con el vector de expresión de CRISPR/Cas.

F: Producción de ARNm de Cas9 y ARNg

Se amplificará por PCR el vector que contiene el promotor de polimerasa T7 con la región codificante de Cas9 humanizada usando los oligos Cas9-F y Cas9-R. El producto de PCR T7-Cas9 puede extraerse en gel y purificarse el ADN usando el kit de extracción en gel Qiagen. Se usará el ADN de T7-Cas9 purificado para transcripción in vitro (IVT) usando el kit mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra (n° de cat. Life Technologies AM1345). El vector que contiene T7-ARNg puede amplificarse por PCR usando los oligos ARNg-F y ARNg-R y de nuevo purificarse en gel los productos de PCR. La IVT de T7-ARNg se llevará a cabo usando el kit MEGAshortscript T7 (n° de cat. Life Technologies AM1354) y se purificará el ARNg usando el kit MEGAclear (n° de cat. Life Technologies AM1908) y se eluirá con agua libre de ARNAsa.

Cas9-F: TTAATACGACTCACTATAGG (SEQ ID NO: 19)

Cas9- R: GCGAGCTCTAGGAATTCTTAC (SEQ ID NO: 20)

g RN A- F: TT AAT ACGACT CACT AT AGG (SEQ ID NO: 21)

gRNA-R: AAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC (SEQ ID NO:22)

Ejemplo 5B: Generación en una etapa de animales transgénicos

A: Procedimiento de transfección de citoblastos embrionarios

Se usarán citoblastos embrionarios de ratón AB2.1 y derivados de esta estirpe para transfectar Cas9 optimizada para codón de mamífero y ARNsg de un vector de expresión individual o de vectores separados si se desea. Se cultivarán los citoblastos embrionarios AB2.1 en una capa de alimentación PSNL76/7/4 MEF en M-15: DMEM de desactivación génica (Gibco, sin piruvato, rico en glucosa, 15 % de FBS, 1xGPS, 1xBME) con técnicas de cultivo de citoblastos embrionarios estándares. La transfección del vector de expresión de CRISPR/Cas junto con la adición opcional de un oligo donante o fragmento de ADN se realizará por electroporación usando el protocolo Amaxa 4D-Nucleofector® (Lonza). Se contransfectará opcionalmente también un plásmido que expresa PGK-Puro para promover la eficacia de transfección.

En un método, después de la transfección se sembrarán de nuevo citoblastos embrionarios sobre placas de alimentación y se añadirá puromicina (2 gg/ml) 72 horas después de la transfección durante 7 días, después de lo cual se escogerán las colonias y se genotiparán por PCR. Las colonias positivas se cultivarán adicionalmente y se expandirán en capa de alimentación y se escindirán los marcadores de selección cuando sea necesario usando un sistema transposón PiggyBac. Esto se realizará mediante electroporación de citoblastos embrionarios con un plásmido que contiene HyPbase usando el protocolo Amaxa 4D-Nucleofector® (Lonza). Se sembrará de nuevo el citoblasto embrionario sobre placas de alimentación. Se someterán a pases los citoblastos embrionarios 2-3 días después de la transfección y, después de 2-3 días adicionales, se depositarán a diferentes densidades celulares (1:10, 1:20, 1:100 y 1:300) y se añadirá selección con FIAU (2 gg/ml) 24 horas después de resembrar. Se escogerán las colonias y se analizarán por genotipado por PCR después de 7-10 días en medio de selección. Se cultivarán adicionalmente los clones positivos, se expandirán en capa de alimentación y se enviarán para microinyección en cigoto (blastocito).

En un método alternativo, 8 horas antes de la transfección se siembran citoblastos embrionarios a una densidad de 0,5x106 células usando DMEM de desactivación génica M-15 libre de antibiótico (Gibco, sin piruvato, rico en glucosa, 15 % de FBS, 1xL-glutamina, 1xBME) sobre placas de alimentación 6w. Se ejecuta la transfección transitoria usando el reactivo Lipofectamine® LTX con reactivo PLUS™ (Invitrogen™) por protocolo estándar. Después del tiempo de incubación, se transfieren los reactivos de transfección a placas de alimentación (cultivadas en medio libre de antibiótico), los medios (M-15) no se cambiarán en estas placas durante al menos 24 horas después de la transfección. 48 horas después de la transfección, se tripsinizan los citoblastos embrionarios en una suspensión monocelular, se lleva a cabo un recuento celular y se depositan las células a diferentes densidades celulares que oscilan de 100 a 5000 células por placa de alimentación de 10 cm. 24 horas después de resembrar, se aplica selección en Puro a 2 gg/ml (dihidrocloruro de puromicina de polvo de Streptomyces alboniger, P8833 Sigma) a las células durante 4 días, después de lo cual se cultivan de nuevo las células en M-15. Se escogen las colonias 10-13 días después de la transfección.

Método 5C: Microinyección de cigotos de ratón- Método 1

Materiales y reactivos:

• M2 (Sigma M7167)

• Embryo Max KSOM (medio especializado MR-020P-F)

• hialuronidasa (Sigma H4272)

• aceite mineral (Sigma, M-8410)

Posibles cepas donantes:

• S3F/S3F; KF3/KF3

• S3F/S3F; K4/K4

• S7F/S7F

• K5F/K5F

Preparación de cigotos y microinyección:

El protocolo es como se describe en: A.Nagy et al. Manipulating the Mouse Embryo 3a edición. Capítulo 7, Protocolos 7-1, 7-6, 7-10, 7-11. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Brevemente:

1. Se recolectan cigotos de ratones hembra superovulados en E0,5 dpc (día poscoital).

2. Se incuban los cigotos en hialuronidasa para dispersas las células de cúmulo.

3. Se recogen los cigotos y se transfieren a varias gotas de medio M2 para aclarar la disolución de hialuronidasa y desechos. Se disponen los cigotos en medios KSOM y se incuban a 37 °C, 5 % de CO2 hasta que sea necesario.

4. Se valora la calidad del cigoto y se seleccionan los cigotos con morfología normal para inyección, se disponen estos en medios KSOM y se incuban a 37 °C, 5 % de CO2 hasta que sea necesario.

Ajustes de microinyección:

Se ejecutan los procedimientos de inyección en un microscopio inverso Nikon Eclipse Ti con micromanipuladores Eppendorf y un sistema de inyección Eppendorf femtojet. Se prepara un portaobjetos añadiendo una gota grande, ~200 microlitros de M2, al centro.

Microinyección:

Se dispone un número apropiado de cigotos sobre el portaobjetos. Se examinan los cigotos y se seleccionan solo aquellos con morfología normal (están visibles 2 pronúcleos distintos). Manteniendo un cigoto con un pronúcleo macho muy cercano a la pipeta de inyección, se empuja cuidadosamente la pipeta de inyección a través de la zona pelúcida hasta el pronúcleo, se aplica presión de inyección, el pronúcleo debería hincharse visiblemente, y se retira la pipeta de inyección rápidamente. El cigoto inyectado puede fijarse mientras se inyecta el resto.

Al final de la sesión de inyección, deberían disponerse todos los cigotos inyectados viables en discos preparados que contienen gotas de KSOM e incubarse hasta estar listos para implante quirúrgico. Se incuban durante 2-3 horas antes de implantar quirúrgicamente en hembras seudopreñadas. Los cachorros nacerán 21 días después.

Método 5C: Microinyección de cigotos de ratón- método 2

Materiales y reactivos

• PMSG

• hCG

• M2 (Sigma M7167)

• Embryo Max KSOM (medios especializados MR-020P-F)

• Aceite mineral (Sigma, M-8410)

• hialuronidasa (Sigma H 4272)

• placas Petri Falcon de 35 mm (Fisher 08-757-100A)

• tijeras Sharp

• pinzas de relojero Sharp

Preparación de ovocitos:

1. Día 0: Se aporta PMSG (5 U.I.) a las hembras por inyección I. P.

2. Día 2. Se aporta hCG (5 U.I.) a las hembras 48 horas después por inyección I. P. Se emparejan las hembras con machos sementales.

3. Día 3: Se comprueban los tapones vaginales, se sacrifican los ratones hembra con tapones por asfixia con CO2 o dislocación cervical en 0,5 dpc a las 8:00 AM.

4. Se disecciona el abdomen, se localizan el ovario y la almohadilla grasa, se extrae el oviducto dejando ovario y grasa, recortando el cuerno uterino a ~1 cm y se dispone en una placa Petri de 35 mm que contiene M2 a temp. ambiente.

5. Se dispone un ovario cada vez en un disco que contiene disolución de hialuronidasa en M2 (~0,3 mg/ml) a temp. ambiente. Se visualiza a través de un estereoscopio a 20x o 40x aumentos.

6. Se usa un par de pinzas para agarrar el oviducto y mantenerlo en la parte inferior del disco. Se usa un segundo par de pinzas o una aguja de 26 G para rasgar el oviducto cerca de donde se localizan los cigotos (la ampolla), liberando el acoplamiento de células de cúmulo.

7. Los cigotos deberían dejarse en hialuronidasa solo pocos minutos, después de cuyo tiempo los cigotos pueden dañarse. Si es necesario, se pipetea dentro y fuera unas pocas veces para ayudar a la liberación de los cigotos de las células de cúmulo.

8. Se usa una pipeta bucal para escoger los cigotos y transferirlos a un disco reciente de M2, se transvasan entonces varias gotas de M2 para aclarar la hialuronidasa, células de cúmulo y desechos. Se revisan los cigotos retirando cualquiera obviamente defectuoso (fragmentado, deforme, no fertilizado) y se disponen los buenos (deberían ser visibles dos cuerpos polares y cualquiera con cuerpos polares) en gotas equilibradas de KSOM+ AA a 37 °C y 5 % de CO2 y se mantiene incubando hasta que sea necesario. Se disponen aproximadamente 50 huevos por gota.

Microinyección pronuclear

1. Ajustes de microinyección: Se ejecutan los procedimientos de inyección en un microscopio inverso Nikon Eclipse Ti con micromanipuladores Eppendorf. Se prepara una placa Petri de 60 mm para disponer en ella los cigotos inyectados. Se pipetean 4 a 6 gotas de 40 gl de KSOM+ AA, se cubren con aceite y se disponen en una incubadora con 5 % de CO2 para equilibrar. Se prepara un portaobjetos con cavidad haciendo una gota grande (~200 gl) de medios M2 sobre el centro del pocillo y se añade una gota pequeña de medio en el lado izquierdo del portaobjetos con la pipeta sostenida.

2. Microinyección: Se asegura de que el inyector a presión se ha conectado y está listo para usar. Se disponen el número apropiado de cigotos sobre el portaobjetos, no se añaden más cigotos que los que puedan inyectarse en 20-30 min. Se dispone la pipeta sostenida en la gota de M2 a la izquierda del portaobjetos; se rellenará usando la acción capilar, una vez llenada hasta aproximadamente la unión del tope con el manipulador. Se examinan cuidadosamente los cigotos, asegurándose de que están visibles dos pronúcleos y la morfología es buena, se desecha cualquiera que parezca anormal. Para probar si la aguja de inyección está abierta, se dispone la punta cerca pero sin tocar un cigoto en el mismo plano focal. Se aplica presión usando el sistema a presión, si el cigoto se mueve la aguja está abierta, si no lo hace la aguja está cerrada. En este caso, se aplica presión usando la función “aclarar”, si la punta sigue sin abrir, se rompe manualmente la punta. “Se golpea” cuidadosamente la punta con la pipeta sostenida y se repite la prueba anterior, asegurándose de que la punta no queda demasiado grande, si sucede esto se reemplaza la aguja y se empieza de nuevo. Se dispone la punta de la pipeta sostenida cerca de un cigoto y se succiona por el extremo de la pipeta aplicando presión negativa. Se enfoca el microscopio para localizar los pronúcleos, el cigoto deberían estar situado de tal modo que permita la inyección en el cigoto sin alcanzar los pronúcleos, preferiblemente con un hueco entre la zona pelúcida y el ovolema. Se lleva la punta de la aguja de inyección al mismo plano focal que la zona pelúcida. Se lleva la pipeta de inyección a la misma posición del eje y que la zona pelúcida, se ajusta la atura de la aguja de modo que la punta parezca completamente nítida sin cambiar el foco. Esto asegura que la aguja se orientará al cigoto exactamente. Se empuja la pipeta de inyección a través de la zona pelúcida, a través del citoplasma hacia la parte trasera del cigoto. La aguja creará una “burbuja” a través de ovolema, esta necesita romperse y se verá rebotar de vuelta, en cuyo punto se retira la aguja rápidamente, se verá mover el citoplasma indicando que el ARN está fluyendo de la aguja. Los gránulos citoplasmáticos fluyendo fuera de los ovocitos después de la retirada de la pipeta de inyección son un signo claro de que el cigoto se lisará pronto. En este caso, o si los componentes nucleares/citoplasmáticos están pegados a la pipeta de inyección, los ovocitos deberían desecharse después de la inyección. Si el cigoto parece estar intacto e inyectado exitosamente, se clasifica este en el grupo bueno. Se escoge un nuevo cigoto para inyección. Puede usarse la misma pipeta de inyección a condición de que continúe inyectando exitosamente. Se cambia a una nueva pipeta de inyección si (a) no puede verse distorsión citoplasmática, (b) los cigotos se lisan uno tras otro; (c) la punta de la pipeta se vuelve visiblemente “sucia” o se pegan contenidos nucleares a la pipeta. Una vez se han inyectado todos los cigotos, se retiran y se disponen en KSOM AA equilibrado y se disponen en incubadora a 37 °C durante una noche. Se transfieren solo aquellos cigotos que han sobrevivido a la inyección, y se cultivan hasta la fase celular 2. Se dejan los lisados y los cigotos que no se han desarrollado.

3. Se cuenta el número total inyectado y se registran los números transferidos por recipiente.

Resultados

Para demostrar la eficacia de la generación en una etapa de ratones transgénicos, se usó el vector de nucleasa T7-Cas9 para generar ARNm a través de la transcripción in vitro detallada anteriormente. Se produjo también ARNm a partir del ARN de guía usando la transcripción in vitro descrita anteriormente. Antes de inyectar la mezcla de ARNm en el citoplasma, se prepararon ovocitos de ratones hembra usando el protocolo detallado anteriormente. Se inyectó una mezcla de ARNm que contenía 100 ng/ul de ARNm de nucleasa Cas9 y 50 ng/ul de ARNm de guía por microinyección en el citoplasma como se detalla anteriormente. Se realiza la microinyección en la fase monocelular. Se cultivaron los cigotos que sobrevivieron a la inyección hasta la fase celular 2, que se transfirieron entonces a ratones receptores.

En total, se inyectaron 107 cigotos de los cuales 49 sobrevivieron y pasaron a la fase celular 2. Se transfirieron estos a dos ratones hembra receptores. Esto dio como resultado 19 cachorros de 2 camadas. La camada 1 procuró 3 machos y 6 hembras. La camada 2 procuró 4 machos y 6 hembras. Se anilló la oreja de los cachorros 3 semanas después del nacimiento y se extrajo ADN. Se llevó a cabo la PCR usando oligos flanqueantes del ARNg para detectar posibles indeles (Figura 14).

La PCR de amplificación alrededor del ARN de guía y la separación de los productos de PCR en un gel de agarosa resaltaron que al menos un ratón contenía un indel grande en forma de deleción, mientras que otros ratones parecían tener indeles menores a juzgar por la nitidez del producto de PCR en el gel. Como análisis bruto inicial, se enviaron todos los productos de PCR para secuenciación, y aquellos marcados con un asterisco (7 ratones en total, Figura 14) procuraban secuencias mixtas alrededor del ARNg, confirmando adicionalmente que contienen indeles. Para confirmar esto, se clonaron individualmente los productos de PCR de estos 7 ratones junto con el producto de PCR de otro ratón que no procuraba una secuencia mixta (producto de PCR del carril 19, Figura 14) en un vector de clonación general. A partir de cada clonación individual, se escogieron 28 clones y se analizaron por secuenciación. La secuenciación confirmó que los 7 ratones contienen indeles y que los ratones que no contenían secuencias mixtas no contenían indeles. Los datos de secuenciación se resumen en la Tabla 3.

Los datos de secuenciación confirmaron que todos los ratones analizados contenían indeles. Sugiere también que usando el protocolo de inyección de cigoto detallado anteriormente y el método de preparación de ARNm para Cas9 y ARN de guía, la Cas9 funciona eficazmente en una etapa temprana y hasta el punto en que las células empiezan a dividirse más allá de la fase celular 2, a juzgar por el hecho de que en todos los ratones analizados no se identificaron más de 3 tipos de indeles. De los 7 ratones que contenían indeles, 3 de ellos no tenían secuencia WT detectable. El ratón hembra (KMKY6.1j) que no mostraba secuencia mixta por el análisis de secuenciación inicial no contenía de hecho indeles, de modo que valida el análisis de secuenciación inicial de los productos de PCR.

El ratón macho (KMKY5.1c) que no mostraba secuencia WT se usó como pareja de apareamiento para los dos ratones hembra (KMKY5.1e y KMKY6.1e) que no mostraban secuencia WT tampoco. Los cachorros resultantes de los dos apareamientos procuraron 14 cachorros en total de la primera camada. Después de análisis de secuenciación similares con los que se clonaron productos de PCR amplificados de la región alrededor del ARN de guía individualmente, se analizó entonces en varios clones la presencia de indeles. Por cada ratón, se analizaron 24 clones por secuenciación. Los datos de secuenciación de todos los 14 cachorros confirmaron solo dos secuencias de indel, reflejando los dos alelos que surgen del ratón macho y hembra parentales. Este dato demuestra inequívocamente que el protocolo de edición genómica en una etapa funciona muy eficazmente en una etapa temprana y no más allá de la fase celular 2, evitando por tanto una formación de indel de mosaico compleja. Usando el protocolo establecido, pueden llevarse a cabo deleciones definidas directamente en cigotos o llevarse a cabo deleción definida seguida de inserción para acelerar el proceso de generación de ratones transgénicos hasta homocigosidad en poco tiempo.

Ejemplo de referencia 6:

Expresión de Cas9 de copia individual en citoblastos embrionarios

Se hace referencia a la figura 6B.

1. Se orientará una plataforma de aterrizaje consistente en el elemento de transposón PiggyBac con los siguientes rasgos a citoblastos embrionarios de ratón (p.ej., citoblastos embrionarios derivados de 129 tales como citoblastos embrionarios AB2.1; Baylor College of Medicine, Tejas, EE.UU.) y se seleccionará en G418. El elemento de transposón PiggyBac contendrá el gen de resistencia a neomicina flanqueado por IoxP y Iox2272. Tendrá también un promotor PGK sin gen. En este ejemplo, la plataforma de aterrizaje se orientará a la región intrónica del gen Rosa26 localizado en el cromosoma 6, pero podría orientarse a otro lado. Orientar esta plataforma de aterrizaje al gen Rosa26 proporcionará un citoblasto embrionario universal para insertar precisamente cualquier fragmento de ADN deseado, incluyendo fragmentos de ADN que contienen Cas9, Cas9 mutante o cualquier otro gen de interés a través de RCME con alta eficacia. Orientar a Rosa26 es beneficioso, puesto que el constructo diana se insertará como una copia individual (al contrario que la integración aleatoria en otro lado) y es improbable que produzca un efecto fenotípico indeseado.

Nota: esta plataforma de aterrizaje puede insertarse en cualquier gen en cualquier cromosoma o incluso en cualquier estirpe celular eucariótica o de mamífero, p.ej. una estirpe celular de humano, insecto, planta, levadura, ratón, rata, conejo, roedor, cerdo, perro, gato, pez, pollo o ave, seguido de la generación del organismo transgénico respectivo que expresa Cas9.

Locus Rosa 26

Puede conseguirse la expresión ubicua de transgén en citoblasto embrionario de ratón mediante orientación génica al locus ROSA26 (también conocido como: trampa génica ROSA26 o Gt(ROSA)26) por recombinación homóloga (Ref. (a) y (b) a continuación). Las coordenadas genómicas para el gen C57BL/6J Rosa26 de ratón basado en Ensemble edición 73 - septiembre de 2013 es: cromosoma 6: 113.067.428-113.077.333; hebra inversa.

El locus Rosa26 puede usarse también como localización receptora para activación génica en un transgén. En el ejemplo, se ha usado el locus Rosa26 para activación génica del vector de plataforma de aterrizaje por orientación mediante recombinación homóloga a la región intrónica localizada entre los exones 2 y 3 de citoblastos embrionarios derivados de la cepa de ratón 129 usando brazos de homología de aprox. 3,1 kb. Se recuperaron los brazos de homología por ingeniería recombinante a partir de un clon BAC generado a partir de la cepa 129 de ratón. Se da a continuación la secuencia de los brazos de homología de Rosa26 usados para orientación

Secuencia del brazo de homología 5’ de Rosa26

CACATTTGGTCCTGCTTGAACATTGCCATGGCTCTTAAAGTCTTAATTAAGAATATTAATTGTGTAATTAT T GI I M i CCTCCTTTAGATCATTCCTTGAGGACAGGACAGTGCTTGTTTAAGGCTATATTTCTGCTGTCT GAGCAGCAACAGGTCTTCG AGATCAACATGATGTTCATAATCCCAAGATGTTGCCATTTATGTTCTCAGA AGCAAGCAGAGGCATGATGGTCAGTGACAGTAATGTCACTGTGTTAAATGTTGCTATGCAGTTTGGATT TTTCTAATGTAGTGTAGGTAG AACATATGTGTTCTGTATG AATTAAACTCTTAAGTTACACCTTGTATAAT CCATGCAATGTGTTATGCAATTACCATTTTAAGTATTGTAGCTTTCTTTGTATGTGAGGATAAAGGTGTT TGTCATAAAATGTTTTGAACATTTCCCCAAAGTTCCAAATTATAAAACCACAACGTTAGAACTTATTTATG AACAATGGTTGTAGTTTCATGCTTTTAAAATGCTTAATTATTCAATTAACACCGTTTGTGTTATAATATAT ATAAAACTGACATGTAGAAGTGTTTGTCCAGAACAI I ICI IAAATGTATACTGTCTTTAGAGAGTTTAAT ATAGCATGTCmTGCAACATACTAACTTTTGTGTTGGTGCGAGCAATATTGTGTAGTCATTTTGAAAGG AGTCATTTCAATGAGTGTCAGATTGTTTTGAATGTTATTGAACATTTTAAATGCAGACTTGTTCGTGTTT TAGAMGCAAAACTGTCAGAAGCmGAACTAGAAATTAAAAAGCTGAAGTATTTCAGAAGGGAMTAAG CTACTTGCTGTATTAGTTGAAGG AAAGTGTAATAGCTTAG AAAATTTAAAACC ATATAGTTGTCATTGCT G AATATCTG GC AG ATG AAAAG AAATACTCAGTGGTTCTTTTG AGCAATATAAC AGCTTGTTATATTAAAA ATTTTCCCCAC AG ATATAAACTCTAATCTATAACTC ATAAATGTTAC AAATGG ATG AAGCTTACAAATGTG GCTTG ACTTGTCACTGTGCTTGTTTTAGTTATGTG AAAGTTTGGC AATAAACCTATGTCCTAAATAGTC A AACTGTGGAATGACI I I I IAATCTATTGGTTTGTCTAGAACAGTTATGTTGCCATTTGCCCTAATGGTGA AAGAAAAAGTGGGGAGTGCCTTGGCACTGTTCATTTGTGGTGTGAACCAAAGAGGGGGGCATGCACTTA CACTTCAAACATCCTTTTGAAAGACTGACAAGTTTGGGTCTTCACAGTTGGAATTGGGCATCCCTTTTGT CAGGGAGGGAGGGAGGGAGGGAGGCTGGCTTGTTATGCTGACAAGTGTGATTAAATTCAAACTTTGAG GTAAGTTGGAGGAACTTGTACATTGTTAGGAGTGTGACAATTTGGACTCTTAATGATTTGGTCATACAAA ATG AACCTAG ACCAACTTCTGG AAG ATGTATATAATAACTCCATGTTACATTG ATTTC ACCTGACTAATAC TTATCCCTTATCAATTAAATAC AG AAG ATGCCAGCCATCTGGGCCTTTTAACCCAG AAATTTAGTTTCAAA CTCCTAGGTTAGTGTTCTCACTG AGCTAC ATCCTG ATCTAGTCCTG AAAATAGG ACC ACCATCACCCCCA AAAAAATCTC AAATAAG ATTTATGCTAGTGTTTC AAAATTTTAGG AATAGGTAAG ATTAG AAAGTTTTAAA TTTTGAGAAATGGCTTCTCTAGAAAGATGTACATAGTGAACACTGAATGGCTCCTAAAGAGCCTAGAAAA CTGGTACTGAGCACACAGGACTGAGAGGTCTTTCTTGAAAAGCATGTATTGCTTTACGTGGGTCACAGAA GGCAGGCAGGAAGAACTTGGGCTG AAACTGGTGTCTTAAGTGGCTAACATCTTCACAACTGATGAGCAA GAACTTTATCCTGATGCAAAAACCATCCAAACAAACTAAGTGAAAGGTGGCAATGGATCCCAGGCTGCTC TAG AGG AGG ACTTG ACTTCTC ATCCC ATCACCCACACC AG ATAGCTC ATAG ACTGCC AATTAACACCAGC TTCTAGCCTCCACAGGCACCTGCACTGGTACACATAATTTCACACAAACACAGTAAGAAGCCTTCCACCT GGCATGGTATTGCTTATCTTTAGTTCCCAACACTTGGGAGGCAGAGGCCAGCCAGGGCTATGTGACAAA AACCTTGTCTAG AGG AG AAACTTCATAGCTTATTTCCTATTCACGTAACCAGGTTAGC AAAATTTACC AG CCAG AG ATG AAGCTAACAGTGTCC ACTATATTTGTAGTGTTTTAAGTCAATTTTTTAAATATACTTAATAG AATTAAAGCTATGGTGAACC AAGTAC AAACCTGGTGTATTAACTTG AG AACTTAGC ATAAAAAGTAGTTC ATTTGTTC AGTAAATATTAAATGCTTACTGGCAAAG ATTATGTCAGG AACTTGGTAAATGGTG ATG AAAC AATCATAGTTGTACATCTTGGTTCTGTGATCACCTTGGTTTGAGGTAAAAGTGGTTCCTTTGATCAAGGA TGG AATTTTAAGTTTATATTC AATCAATAATGTATTATTTTGTG ATTGCAAAATTGCCTATCTAGGGTATA AAACCTTTAAAAATTTC ATAATACCAGTTCATTCTCCAGTTACTAATTCCAAAAAGCC ACTG ACTATGGTG CCAATGTGGATTCTGTTCTCAAAGGAAGGATTGTCTGTGCCCTTTATTCTAATAGAAACATCACACTGAA AATCTAAGCTGAAAGAAGCCAGACTTTCCTAAATAAATAACTTTCCATAAAGCTCAAACAAGGATTACTTT TAGG AGGCACTGTTAAGG AACT G ATAAGTAATG AGGTTACTTATATAATG ATAGTCCC ACAAG ACTATCT GAGGAAAAATCAGTACAACTCGAAAACAGAACAACCAGCTAGGCAGGAATAACAGGGCTCCCAAGTCAG GAGGTCTATCCAACACCCTTTTCTGTTGAGGGCCCCAGACCTACATATTGTATACAAACAGGGAGGTGGG TGATTTTAACTCTCCTGAGGTAC (SEQ ID NO:23)

Secuencia del brazo de homología 3’ de Rosa26

CTTGGTAAATCTTTGTCCTG AGTAAGC AGTAC AGTGTACAGTTTAC ATTTTCATTTAAAG ATAC ATTAGCT CCCTCTACCCCCTAAGACTGACAGGCACmGGGGGTGGGGAGGGCTTTGGAAAATAACGCTTCCATAC ACTAAAAG AG AAATTTCTTTAATTAGGCTTGTTGGTTCCATAC ATCTACTGGTGTTTCTACTACTTAGTAA TATTATAATAGTCACACAAGCATCTTTGCTCTGTTTAGGTTGTATATTTATTTTAAGGCAG ATG ATAAAAC TGTAGATCTTAAGGGATGCTTCTGCTTCTGAGATGATACAAAGAATTTAGACCATAAAACAGTAGGTTGC ACAAGCAATAGAATATGGCCTAAAGTGTTCTGACACTTAGAAGCCAAGCAGTGTAGGCTTCTTAAGAAAT ACCATTACAATCACCTTGCTAGAAATCAAGCATTCTGGAGTGGTCAAGCAGTGTAACCTGTACTGTAAGT TACTTTTCTGCTAI I I I ICTCCCAAAGCAAGTTCTTTATGCTGATATTTCCAGTGTTAGGAACTACAAATA TTAATAAGTTGTCTTCACTCTTTTCTTTACCAAGGAGGGTCTCTTCCTTCATCTTGATCTGAAGGATGAAC AAAGGCTTGAGCAGTGCGCTTTAGAAGATAAACTGCAGCATGAAGGCCCCCGATGTTCACCCAGACTACA TGGACCTTTCGCCACACATGTCCCATTCCAGATAAGGCCTGGCACACACAAAAAACATAAGTCATTAGGC TACCAGTCT G ATTCTAAAACAACCTAAAATCTTCCCACTTAAATGCTATGGGTGGTGGGTTGG AAAGTTG ACTCAGAAAATCACTTGCTG I I I I IAGAGAGGATCTGGGTTCAGTTTCTGATACATTGTGGCTTACAACT ATAACTCCAGTTCTAGGGGGTCCATCCAACATCCTCTTCTGTTGAGGGCACCAAATAAATGTATTGTGTA C AAACAGGG AGGTG AGTG ATTTAACTCTCGTGTATAGTACCTTGGTAAAAC AI MCI IGTCCTGAGTAAG CAGTACAGCTCTGCCTGTCCCTGGTCTACAGACACGGCTCATTTCCCGAAGGCAAGCTGGATAGAGATTC CAATTTCTCTTCTTGGATCCCATCCTATAAAAGAAGGTCAAGTTTAATCTATTGCAAAAGGTAAATAGGTA GI I ICI IACATGAGACAAGAACAAATCTTAGGTGTGAAGCAGTCATCTTTTACAGGCCAGAGCCTCTATT CTATGCCAATG AAGG AAACTGTTAGTCCAGTGTTATAG AGTTAGTCCAGTGTATAGTTTTCTATC AG AAC ACTTTTTTTTTAAACAACTGCAACTTAGCTTATTG AAG ACAAACCACG AGTAG AAATCTGTCCAAG AAGCA AGTGCTTCTCAGCCTACAATGTGGAATAGGACCATGTAATGGTACAGTGAGTGAAATGAATTATGGCATG

l i l i ICTGACTGAGAAGACAGTACAATAAAAGGTAAACTCATGGTATTTATTTAAAAAGAATCCAATTTCT ACC l i l i ICC AAATGGC ATATCTGTTACAATAATATCCACAG AAGCAGTTCTC AGTGGG AGGTT GCAG AT ATCCCACTGAACAGCATCAATGGGCAAACCCCAGGTTGII I IICTGTGGAGACAAAGGTAAGATATTTCA ATATATTTTCCCAAGCTAATG AG ATGGCTCAGC AAATAAT GGTACTGGCCATTAAGTCTC ATG ACCTG AG CTTGATCCTCAGGGACCATGTGGTACAAGGAGAGACCTAAATCCTTCAGTTGGACTTCAATCTTCTACCC TCATGTCCACACACAAATAAATACAATAAAAAACATTCTGCAGTCTGAATTTCTAAAGGTTGIMIICTAA AAAG AAATGTTAAAGTAACATAGG AAG AAATATGTCCATAACTG AAATAC AAGTTTTTTAAATGGTTAAG ACTGGTTTT CAAAGG ATGTATGGTTAAG AAAATACCAGGGAAAATG AGCTTACAT GTAAAAAAGTGTCTA AAAGGCCAGAGAAATGACCCAGCTGGCAAAGGTGTCTGCCCTAAGCCAGACAAAAGGAATTTGATTCACA GGAAGAAGAGACCCAACTCTCACTAGTTATCCTCTGACTTCCACACCATGACACAGCTCCATGGCACTCT CAGGCCCCCACACATATACAGATATAAACAGAAACCTAATCCACCAGCCTTCAGAAGCAAAGCAATTGGA GG ATTTAAACAGGCCATGGCTACTAATAG AG ATAACTGGTAGTTTAAAAGTTATGGTAATG ACTTTCATG CTTCTTTCAACTCATATTGTTCTAAATAATTAATTTGGTTTTTCAAGGCAGGGTTTCTCTGTGTAGTTCTG GCTGTCCTGGAACTCACTCTGTAGACCAGGCTGGCCTTGAACTCAGATCCATCTGCCTCTGGAATAAGGG C ACGTGCGTGCCTTTTCTACATAACAAAACCTATACTATAACAAAACCTATACCATACT GTACCGTTTTGG G AAAAG ACAAAAAATAATG AACAAAAAAGG AG AAATAACATTCC AATAAAGTATGG AAATGGTAGTTAAA

TTAATTACAAATGI I I I ICAGTAAATTAGATGTGACTTCTCATACTGTTCATTTGGCTATAATGATACCAC

AAAGCACTGGGGGTGAATAATAATTCCAAGTCAGTAGGGAGAGAGACTTGAAAAGATGCAATGCAATCA

TTGAAGTTAAACTTACCCATCTTTAATCTGGCTCTTAGTCAATAGAGATGAGATGTTATTTGCTGCTCTG

TTCACTGCCAGTGGGTTATTGTCCCCAGCAATATGGTAACAGTGAGACCACTCAGTAGCCCCCTATGAGA

CAGGAGTGTTGGTTAAACATGCCACAAGAGAAAAGGGAAAAGTCACTATGGCCAACTCTCAGTAACATG

GCAATCCGTGCCATTCATTTCCTTGCCAGAAATGTCTTCCCTGTTCTTCTGCCTACTGAACTTTCACCCAC

TAGAAATGTGGCTCCAATGTCATCCACTATGACATCAATGTCAGCGCTAGAAGCACTTTGCACACCTCTG

TTGCTGACTTAG (SEQ ID NO:24)

Referencia:

a) Pablo Pérez-Pinera, David G. Ousterout, Matthew T. Brown y Charles A. Gersbach (2012) Gene targeting to the ROSA26 locus directed by engineered zinc finger nucleases. Nucleic Acids Research, 2012, vol 40, N° 8 3741-3752.

b) Peter Hohenstein, Joan Slight, Derya Deniz Ozdemir, Sally F Burn, Rachel Berry y Nicholas D Hastie (2008) High-efficiency Rosa26 knock-in vector construction for Cre-regulated overexpression and RNAi. PathoGenetics 2008, 1: 3.

2. Un vector posibilitado por intercambio de módulos mediado por recombinasa (RMCE) que contiene puromicina-delta-tk sin promotor con fusión en fase de T2A en el extremo C, seguido de la secuencia nucleotídica de Cas9 o Cas9 mutante y una serie de sitios de restricción únicos flanqueados por IoxP y Iox2272, permitirá la orientación directa de este vector a la plataforma de aterrizaje por RMCE mediado por Cre. Como es conocido, T2A permite la omisión ribosómica durante la traducción. La inserción de la secuencia de codificación de T2A entre dos genes da como resultado dos productos (un gen, un transcrito pero dos proteínas expresadas, en este caso Cas9 y el marcador de selección). Los clones de citoblastos embrionarios que contienen el fragmento de ADN insertado correctamente pueden seleccionarse directamente en puromicina. Este enfoque asegura ventajosamente también la expresión de copia individual de Cas9 a diferencia de un enfoque de integración aleatoria o expresión transitoria. La inserción del vector posibilitado por RMCE en el locus deseado que contiene la plataforma de aterrizaje puede seleccionarse directamente, ya que el promotor PGK en la plataforma de aterrizaje regulará la transcripción de Puro-Delta-Tk sin promotor y Cas9. Puesto que Puro-deltaTk está en la misma unidad transcripcional que Cas9, los clones de citoblastos embrionarios seleccionados en puromicina asegurarán la expresión de Cas9.

3. La estrategia anterior permite tres enfoques separados para expresar el ARNsg diseñado para desestabilizar (mutación mediante formación de indel, deleción o deleción seguida de inserción) el gen de interés.

a. La estirpe celular de citoblastos embrionarios anterior que contiene Cas9 puede usarse para generar ratones transgénicos con Cas9 expresada constitutivamente o bien modificados para expresión inducible de Cas9 o incluso expresión de Cas9 específica de tejido, por ejemplo expresión de Cas9 en una fase embrionaria usando expresión de Cas9 específica del promotor Nanog, Pou5f1 o SoxB. Tal estirpe de ratón derivada que expresa Cas9 puede usarse para edición genómica de forma simplificada, con lo que el ARNsg transcrito in vitro puede inyectarse fácilmente en embriones obtenidos de tales ratones transgénicos. Esto potenciará la eficacia de generación de estirpes de ratón con el genotipo homocigótico deseado y por tanto reducirá drásticamente el número de animales necesarios.

b. El ARNsg puede transfectarse directamente en los citoblastos embrionarios que expresan Cas9 y por tanto evita el requisito de clonación en el vector posibilitado por RMCE de ARNsg individual o múltiples. Este enfoque permitirá insertar múltiples ARNsg en los citoblastos embrionarios simultáneamente muy rápidamente.

c. Pueden clonarse múltiples ARNsg directamente en el sitio de clonación múltiple del vector posibilitado por RMCE (concretamente, usando una pluralidad de diferentes sitios de endonucleasa de restricción), permitiendo la expresión de copia individual del ARN de guía. Este enfoque puede ser útil para limitar los efectos fuera de diana particularmente relevantes para aquellos genes con alta homología de secuencia en el genoma.

4. Los citoblastos embrionarios que expresan Cas9 y ARNsg pueden seleccionarse directamente en medio que contiene puromicina. La selección en puromicina durante 4-6 días permitirá mutar o desestabilizar la localización deseada y la ventaja de manipular citoblastos embrionarios es que pueden analizarse los clones individuales por PCR seguida de secuenciación de la mutación deseada. Solo los clones de citoblastos embrionarios mutados correctamente pueden procesarse adicionalmente, con lo que el elemento de ADN insertado introducido mediante inserción de la plataforma de aterrizaje y posterior inserción del vector de RCME puede retirarse completamente, dejando el citoblasto embrionario desprovisto de cualquier alteración distinta de la mutación pretendida inducida por la acción de Cas9 y ARNsg. Esto puede realizarse mediante la expresión transitoria del transposón PBase seguida de selección en FIAU. La retirada de Cas9 expresada constitutivamente con solo el periodo de tiempo mínimo necesario para inducir mutación en presencia de ARNsg reducirá o eliminará la posibilidad de mutaciones indeseadas inducidas por Cas9.

5. Los clones de citoblastos embrionarios que contienen la mutación deseada pueden inyectarse en blastocitos generando ratones transgénicos.

Tabla 1: Conservación de PAM en repeticiones y secuencias líder para diversos tipos de CRISPR

(reproducido de Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system F. J. M. Mojica, C. Díez-Villaseñor, J. García-Martínez, C. Almendros Microbiology (2009), 155, 733-740).

*Los genomas se abrevian según las denominaciones de las especies o géneros portadores de las correspondientes matrices de CRISPR: Mth, M thermautotrophicus, Lmo, L. monocytogenes; Eco, E coli; Pae, P aeruginosa; Spy, S pyogenes; Xan, Xanthomonas spp.; She, Shewanella spp.; Ype, Y. pestis; Sso, S. solfataricus, Mse, M. sedula; Str, Streptococcus spp.; Lis, Listeria spp.

fLas secuencias coincidentes con PAM están subrayadas.

^Secuencias líder proximales de la matriz de CRISPR representativa. Los nucleótidos coincidentes con PAM están subrayados.

Las SEQ ID NO para las secuencias en la Tabla 1 se exponen en la tabla siguiente.

Tabla 2: Endonucleasas asociadas a CRISPR

[Los números de Gene ID hacen referencia a genes en la base de datos génica NCBI a septiembre de 2013; toda la información de secuencia relativa a las gene ID siguientes se incorpora a la presente memoria como referencia para posible uso en la presente invención]

1. Plav_0099

Proteína de la familia de endonucleasa Csn1 asociada a CRISPR [Parvibaculum lavamentivorans DS-1] Otros alias: Plav_0099

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_009719.1 (105795 ..108908, complemento)

ID :5454634

SEQ ID NO: 62

2. FTN_0757

Proteína de membrana [Francisella novicida U112]

Otros alias: FTN_0757

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_008601.1 (810052..814941)

ID: 4548251

SEQ ID NO: 63

3. Cj1523c

Proteína asociada a CRISPR [Campylobacter jejuni subsp. jejuni NCTC 11168= ATCC 700819]

Otros alias: Cj1523c

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_002163.1 (1456880..1459834, complemento)

ID: 905809

SEQ ID NO: 64

4. mcrA

Endonucleasa de restricción [Bifidobacterium longum DJO10A]

Otros alias: BLD_1902

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_010816.1 (2257993..2261556)

ID: 6362834

SEQ ID NO: 65

5. MGA_0519

Proteína asociada a CRISPR de la familia de Csn1 [Mycoplasma gallisepticum cepa R(bajo)] Otros alias: MGA_0519

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_004829.2 (919248..923060)

ID :1089911

SEQ ID NO: 66

6. Emin_0243

Proteína de la familia de endonucleasa Csn1 asociada a CRISPR [Elusimicrobium minutum Pei191] Otros alias: Emin_0243

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_010644.1 (261119..264706)

ID: 6263045

SEQ ID NO: 67

7. FTW_1427

Proteína grande asociada a CRISPR [Francisella tularensis subsp. tularensis WY96-3418] Otros alias: FTW_1427

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_009257.1 (1332426..1335803, complemento)

ID: 4958852

SEQ ID NO: 68

8. SMA_1444

Proteína de la familia de Csn1 asociada a CRISPR [Streptococcus macedonicus ACA-DC 198] Otros alias: SMA 1444

Notación: NC_016749.1 (1418337..1421729, complemento)

ID :11601419

SEQ ID NO: 69

9. SSUST3_1318

Proteína de la familia de Csn1 asociada a CRISPR [Streptococcus suis ST3] Otros alias: SSUST3_1318

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_015433.1 (1323872..1327240, complemento)

ID :10491484

SEQ ID NO: 70

10. cas5

Proteína de la familia de Csn1 asociada a CRISPR [Streptococcus gallolyticus UCN34] Otros alias: GALLO_1439

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_013798.1 (1511433..1514825, complemento)

ID: 8776949

SEQ ID NO: 71

11. GALLO_1446

Proteína asociada a CRISPR [Streptococcus gallolyticus UCN34]

Otros alias: GALLO_1446

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_013798.1 (1518984..1523110, complemento)

ID :8776185

SEQ ID NO: 72

12. csn1

Endonucleasa Csn1 asociada a CRISPR [Bifidobacterium dentium Bd1]

Otros alias: BOP_1254

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_013714.1 (1400576..1403992, complemento)

ID: 8692053

SEQ ID NO: 73

13. NMO_0348

Presunta proteína asociada a CRISPR [Neisseria meningitidis alfa14]

Otros alias: NMO_0348

Contexto genómico: Cromosoma

N o ta c ió n : N C _013016.1 (369547..372795 , co m p le m e n to )

ID :8221228

SEQ ID NO: 74

14. csnl

Proteína Csnl asociada a CRISPR [Streptococcus equi subsp. zooepidemicus MGCS10565]

Otros alias: Sez_1330

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_011134.1 (1369339..1373385, complemento)

ID :6762114

SEQ ID NO: 75

15. csnl

Proteína de la familia de endonucleasa Csn1 asociada a CRISPR [Streptococcus gordonii cepa Challis subcepa CH1]

Otros alias: SGO_1381

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_009785.1 (1426750..1430160, complemento)

ID: 5599802

SEQ ID NO: 76

16. M28_Spy0748

Proteína citoplasmática [Streptococcus pyogenes MGAS6180]

Otros alias: M28_Spy0748

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_007296.1 (771231..775337)

ID:3573516

SEQ ID NO: 77

17. SG G BAA2069_c14690

Proteína asociada a CRISPR [Streptococcus gallolyticus subsp. gallolyticus ATCC BAA-2069]

Otros alias: SGGBAA2069_c14690

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_015215.1 (1520905..1525017, complemento)

ID :10295470

SEQ ID NO: 78

18. SAR116_2544

Proteína de la familia de Csn1 asociada a CRISPR [Candidatus Puniceispirillum marinum IMCC1322] Otros alias: SAR116_2544

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_014010.1 (2748992..2752099)

ID :8962895

SEQ ID NO: 79

19. TDE0327

Cas5e asociada a CRISPR [Treponema denticola ATCC35405] Otros alias: TDE0327

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_002967.9 (361021..365208)

ID:2741543

SEQ ID NO: 80

20. csnl

Proteína asociada a CRISPR [Streptococcus pasteurianus ATCC 43144] Otros alias: SGPB_1342

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_015600.1 (1400035..1403427, complemento)

ID :10753339

SEQ ID NO: 81

21. cas9

Proteína asociada a CRISPR [Corynebacterium ulcerans BR-AD22] Otros alias: CULC22_00031

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_015683.1 (30419 ..33112, complemento)

ID :10842578

SEQ ID NO: 82

22. MGAS2096_Spy0843

Presunta proteína citoplasmática [Streptococcus pyogenes MGAS2096] Otros alias: MGAS2096_Spy0843

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_008023.1 (813084..817190)

ID: 4066021

SEQ ID NO: 83

23. MGAS9429_Spy0885

Proteína citoplasmática [Streptococcus pyogenes MGAS9429]

Otros alias: MGAS9429_Spy0885

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_008021.1 (852508..856614)

ID:4061575

SEQ ID NO: 84

24. AZL_009000

Proteína de la familia de Csn1 asociada a CRISPR [Azospirillum sp. B510]

Otros alias: AZL_009000

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_013854.1 (1019522..1023028, complemento)

ID :8789261

SEQ ID NO: 85

25. EUBREC_1713

Contiene dominios de nucleasa de tipo RuvC y nucleasa HNH [Eubacterium rectale ATCC33656] Otros alias: EUBREC_1713

Otras denominaciones: proteína relacionada con el sistema CRISPR

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_012781.1 (1591112..1594456)

ID: 7963668

SEQ ID NO: 86

26. Alide2_0194

Proteína de la familia de Csn1 asociada a CRISPR [Alicycliphilus denitrificans K601] Otros alias: Alide2_0194

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_015422.1 (218107..221196)

ID :10481210

SEQ ID NO: 87

27. Alide_0205

Proteína de la familia de csn1 asociada a CRISPR [Alicycliphilus denitrificans BC]

Otros alias: Alide_0205

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_014910.1 (228371..231460)

ID :10102228

SEQ ID NO: 88

28. STER_1477

Proteína de tipo sistema CRISPR [Streptococcus thermophilus LMD-9]

Otros alias: STER_1477

Contexto genómico: Cromosoma

N o ta c ió n : N C _008532.1 (1379975..1384141 , co m p le m e n to )

ID: 4437923

SEQ ID NO: 89

29. STER_0709

Proteína de tipo sistema CRISPR [Streptococcus thermophilus LMD-9]

Otros alias: STER_0709

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_008532.1 (643235..646600)

ID:4437391

SEQ ID NO: 90

30. cas9

Proteína asociada a CRISPR [Corynebacterium diphtheriae 241]

Otros alias: CD241_2102

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_016782.1 (2245769..2248399)

ID :11674395

SEQ ID NO: 91

31. cas3

Endonucleasa asociada a CRISPR [Corynebacterium diphtheriae 241]

Otros alias: CD241_0034

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_016782.1 (35063 ..38317)

ID :11672999

SEQ ID NO: 92

32. Corgl_1738

Proteína de la familia de Csn1 asociada a CRISPR [Coriobacterium glomerans PW2] Otros alias: Corgl_1738

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_015389.1 (2036091..2040245)

ID :10439994

SEQ ID NO: 93

33. Fluta_3147

Proteína de la familia de Csn1 asociada a CRISPR [Fluviicola taffensis DSM 16823] Otros alias: Fluta_3147

Contexto genómico: Cromosoma

N o ta c ió n : N C _015321.1 (3610221..3614597 , co m p le m e n to )

ID :10398516

SEQ ID NO: 94

34. Acav_0267

Proteína de la familia de Csn1 asociada a CRISPR [Acidovorax avenae subsp. avenae ATCC 19860] Otros alias: Acav_0267

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_015138.1 (295839..298976)

ID :10305168

SEQ ID NO: 95

35. NAL212_2952

Proteína de la familia de Csn1 asociada a CRISPR [Nitrosomonas sp. AL212]

Otros alias: NAL212_2952

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_015222.1 (2941806..2944940, complemento)

ID :10299493

SEQ ID NO: 96

36. SpiBuddy_2181

Proteína de la familia de Csn1 asociada a CRISPR [Sphaerochaeta globosa cepa Buddy] Otros alias: SpiBuddy_2181

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_015152.1 (2367952..2371491, complemento)

ID :10292274

SEQ ID NO: 97

37. Tmz1t_2411

Endonucleasa HNH [Thauera sp. MZ1T]

Otros alias: Tmz1t_2411

Contexto genómico: Plásmido pTha01

Notación: NC_011667.1 (75253..76200, complemento)

ID: 7094333

SEQ ID NO: 98

38. Gdia_0342

Proteína de la familia de Csn1 asociada a CRISPR [Gluconacetobacter diazotrophicus PAl 5] Otros alias: Gdia_0342

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_011365.1 (382737..385748)

ID: 6973736

SEQ ID NO: 99

39. JJD26997 1875

Proteína de la familia de Cas5e asociada a CRISPR [Campylobacter jejuni subsp. doylei 269.97] Otros alias: JJD26997_1875

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_009707.1 (1656109..1659063, complemento)

ID: 5389688

SEQ ID NO: 100

40. Asuc_0376

Proteína de la familia de endonucleasa Csn1 asociada a CRISPR [Actinobacillus succinogenes 130Z] Otros alias: Asuc_0376

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_009655.1 (431928..435116)

ID:5348478

SEQ ID NO: 101

41. Veis_1230

Proteína de la familia de endonucleasa Csn1 asociada a CRISPR [Verminephrobacter eiseniae EF01 -2] Otros alias: Veis_1230

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_008786.1 (1365979..1369185)

ID:4695198

SEQ ID NO: 102

42. MGAS10270_Spy0886

Presunta proteína citoplasmática [Streptococcus pyogenes MGAS10270]

Otros alias: MGAS10270_Spy0886

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_008022.1 (844446..848552)

ID: 4063984

SEQ ID NO: 103

43. gbs0911

Proteína hipotética [Streptococcus agalactiae NEM316]

Otros alias: gbs0911

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_004368.1 (945801..949946)

ID :1029893

SEQ ID NO: 104

44. NMA0631

Proteína hipotética [Neisseria meningitidis Z2491]

Otros alias: NMA0631

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_003116.1 (610868..614116, complemento)

ID :906626

SEQ ID NO: 105

45. Ccan_14650

Proteína hipotética [Capnocytophaga canimorsus Cc5]

Otros alias: Ccan_14650

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_015846.1 (1579873..1584165, complemento)

ID :10980451

SEQ ID NO: 106

46. Ipp0160

Proteína hipotética [Legionella pneumophila cepa Paris]

Otros alias: Ipp0160

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_006368.1 (183831..187949)

ID:3118625

SEQ ID NO: 107

47. Cbei_2080

Proteína hipotética [Clostridium beijerinckii NCIMB 8052]

Otros alias: Cbei_2080

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_009617.1 (2422056..2423096)

ID: 5296367

SEQ ID NO: 108

48. MMOB0330

Proteína hipotética [Mycoplasma mobile 163K]

Otros alias: MMOB0330

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_006908.1 (45652..49362, complemento)

ID: 2807677

SEQ ID NO: 109

49. MGF_5203

Proteína de la familia de Csn1 asociada a CRISPR [Mycoplasma gallisepticum cepa F] Otros alias: MGF 5203

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_017503.1 (888602..892411)

ID :12397088

SEQ ID NO: 110

50. MGAH_0519

Proteína de la familia de Csn1 asociada a CRISPR [Mycoplasma gallisepticum cepa R(alto)] Otros alias: MGAH_0519

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_017502.1 (918476..922288)

ID :12395725

SEQ ID NO: 111

51. Smon_1063

Proteína de la familia de Csn1 asociada a CRISPR [Streptobacillus moniliformis DSM 12112] Otros alias: Smon_1063

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_013515.1 (1159048..1162827, complemento)

ID: 8600791

SEQ ID NO: 112

52. Spy49_0823

Proteína hipotética [Streptococcus pyogenes NZ131]

Otros alias: Spy49_0823

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_011375.1 (821210 ..825316)

ID: 6985827

SEQ ID NO: 113

53. C8J_1425

Proteína hipotética [Campylobacter jejuni subsp. jejuni 81116]

Otros alias: C8J_1425

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_009839.1 (1442672..1445626, complemento)

ID :5618449

SEQ ID NO: 114

54. FTF0584

Proteína hipotética [Francisella tularensis subsp. tularensis FSC198]

Otros alias: FTF0584

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_008245.1 (601115..604486)

ID:4200457

SEQ ID NO: 115

55. FTT_0584

Proteína hipotética [Francisella tularensis subsp. tularensis SCHU S4]

Otros alias: FTT_0584

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_006570.2 (601162..604533)

ID:3191177

SEQ ID NO: 116

56. csnl

Proteína asociada a CRISPR [Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis RE378] Otros alias: GGS_1116

Notación: NC_018712.1 (1169559..1173674, complemento)

ID :13799322

SEQ ID NO: 117

57. SMUGS5_06270

Proteína csn1 asociada a CRISPR [Streptococcus mutans GS-5]

Otros alias: SMUGS5_06270

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_018089.1 (1320641 ..1324678, complemento)

ID :13299050

SEQ ID NO: 118

58. Y1U_C1412

Csn1 [Streptococcus thermophilus MN-ZLW-002]

Otros alias: Y1U_C1412

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_017927.1 (1376653..1380819, complemento)

ID :12977193

SEQ ID NO: 119

59. Y1 U_C0633

Proteína de tipo sistema CRISPR [Streptococcus thermophilus MN-ZLW-002] Otros alias: Y1U_C0633

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_017927.1 (624274..627639)

ID :12975630

SEQ ID NO: 120

60. SALIVA_0715

Endonucleasa de la familia de Csn1 asociada a CRISPR [Streptococcus salivarius JIM8777]

Otros alias: SALlVA_0715

Notación: NC_017595.1 (708034..711417)

ID :12910728

SEQ ID NO: 121

61. csnl

Proteína csn1 asociada a CRISPR [Streptococcus mutans LJ23]

Otros alias: SMULJ23_0701

Notación: NC_017768.1 (751695..755732)

ID :12898085

SEQ ID NO: 122

62. RIA_1455

Proteína SAG0894 asociada a CRISPR [Riemerella anatipestifer RA-GD]

Otros alias: RIA_1455

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_017569.1 (1443996..1448198)

ID :12613647

SEQ ID NO: 123

63. STND_0658

Endonucleasa de la familia de Csn1 asociada a CRISPR [Streptococcus thermophilus ND03]

Otros alias: STND_0658

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_017563.1 (633621 ..636986)

ID :12590813

SEQ ID NO: 124

64. RA0C_1034

Presunta BCR [Riemerella anatipestifer ATCC 11845= DSM 15868]

Otros alias: RA0C_1034

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_017045.1 (1023494..1026931, complemento)

ID :11996006

SEQ ID NO: 125

65. Sinf_1255

Proteína de la familia de SAG0894 asociada a CRISPR [Streptococcus infantarius subsp. infantarius CJ18] Otros alias: Sinf_1255

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_016826.1 (1276484..1280611, complemento)

ID :11877786

SEQ ID NO: 126

66. Nitsa_1472

Proteína de la familia de csn1 asociada a CRISPR [Nitratifractor salsuginis DSM 16511] Otros alias: Nitsa_1472

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_014935.1 (1477331..1480729)

ID :10148263

SEQ ID NO: 127

67. NLA_17660

Proteína hipotética [Neisseria lactamica 020-06]

Otros alias: NLA_17660

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_014752.1 (1890078..1893326)

ID :10006697

SEQ ID NO: 128

68. SmuNN2025_0694

Proteína hipotética [Streptococcus mutans NN2025]

Otros alias: SmuNN2025_0694

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_013928.1 (737258..741295)

ID: 8834629

SEQ ID NO: 129

69. SDEG_1231

Proteína hipotética [Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis GGS_124] Otros alias: SDEG_1231

Cromosoma: 1

Notación: Cromosoma 1NC_012891.1 (1176755..1180870, complemento)

ID :8111553

SEQ ID NO: 130

70. NMCC_0397

Proteína hipotética [Neisseria meningitidis 053442]

Otros alias: NMCC 0397

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_010120.1 (402733..405981, complemento)

ID :5796426

SEQ ID NO: 131

71. SAK_1017

Proteína hipotética [Streptococcus agalactiae A909]

Otros alias: SAK_1

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_007432.1 (980303..984415)

ID:3686185

SEQ ID NO: 132

72. M5005_Spy_0769

Proteína hipotética [Streptococcus pyogenes MGAS5005] Otros alias: M5005_Spy_0769

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_007297.1 (773340 ..777446)

ID:3572134

SEQ ID NO: 133

73. MS53_0582

Proteína hipotética [Mycoplasma synoviae 53]

Otros alias: MS53_0582

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_007294.1 (684155..688099)

ID: 3564051

SEQ ID NO: 134

74. DIP0036

Proteína hipotética [Corynebacterium diphtheriae NCTC 13129] Otros alias: DIP0036

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_002935.2 (34478 ..37732)

ID:2650188

SEQ ID NO: 135

75. WS1613

Proteína hipotética [Wolinella succinogenes DSM 1740] Otros alias: WS1613

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_005090.1 (1525628..1529857)

ID:2553552

SEQ ID NO: 136

76. PM1127

Proteína hipotética [Pasteurella multocida subsp. multocida cepa Pm70]

Otros alias: PM1127

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_002663.1 (1324015..1327185, complemento)

ID :1244474

SEQ ID NO: 137

77. SPs1176

Proteína hipotética [Streptococcus pyogenes SSI-1]

Otros alias: SPs1176

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_004606.1 (1149610..1153716, complemento)

ID :1065374

SEQ ID NO: 138

78. SMU_1405c

Proteína hipotética [Streptococcus mutans UA159]

Otros alias: SMU_1405c, SMU.1405c

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_004350.2 (1330942..1334979, complemento)

ID :1028661

SEQ ID NO: 139

79. lin2744

Proteína hipotética [Listeria innocua Clip11262]

Otros alias: lin2744

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_003212.1 (2770707..2774711, complemento)

ID :1131597

SEQ ID NO: 140

80. csn1B

Proteína asociada a CRISPR [Streptococcus gallolyticus subsp. gallolyticus ATCC43143] Otros alias: SGGB_1441

N o ta c ió n : N C _017576.1 (1489111..1493226 , co m p le m e n to )

ID :12630646

SEQ ID NO: 141

81. csnIA

Proteína asociada a CRISPR [Streptococcus gallolyticus subsp. gallolyticus ATCC43143] Otros alias: SGGB_1431

Notación: NC_017576.1 (1480439..1483831, complemento)

ID :12630636

SEQ ID NO: 142

82. cas9

Proteína asociada a CRISPR [Corynebacterium ulcerans 809]

Otros alias: CULC809_00033

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_017317.1 (30370..33063, complemento)

ID :12286148

SEQ ID NO: 143

83. GDI_2123

Proteína hipotética [Gluconacetobacter diazotrophicus PAI 5]

Otros alias: GDI_2123

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_010125.1 (2177083..2180235)

ID: 5792482

SEQ ID NO: 144

84. Nham_4054

Proteína hipotética [Nitrobacter hamburgensis X14]

Otros alias: Nham_4054

Contexto genómico: Plásmido 1

Notación: NC_007959.1 (13284..16784, complemento)

ID: 4025380

SEQ ID NO: 145

85. str0657

Proteína hipotética [Streptococcus thermophilus CNRZ1066]

Otros alias: str0657

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_006449.1 (619189..622575)

ID :3165636

SEQ ID NO: 146

86. stu0657

Proteína hipotética [Streptococcus thermophilus LMG 18311]

Otros alias: stu0657

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_006448.1 (624007..627375)

ID:3165000

SEQ ID NO: 147

87. SpyM3_0677

Proteína hipotética [Streptococcus pyogenes MGAS315]

Otros alias: SpyM3_0677

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_004070.1 (743040..747146)

ID :1008991

SEQ ID NO: 148

88. HFMG06CAA_5227

Proteína de la familia de Csn1 asociada a CRISPR [Mycoplasma gallisepticum CA06_2006.052-5-2P] Otros alias: HFMG06CAA_5227

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_018412.1 (895338..899147)

ID :13464859

SEQ ID NO: 149

89. HFMG01WIA_5025

Proteína de la familia de Csn1 asociada a CRISPR [Mycoplasma gallisepticum WI01_2001.043-13-2P] Otros alias: HFMG01WIA_5025

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_018410.1 (857648..861457)

ID :13463863

SEQ ID NO: 150

90. HFMG01 NYA_5169

Proteína de la familia de Csn1 asociada a CRISPR [Mycoplasma gallisepticum NY01_2001.047-5-1P] Otros alias: HFMG01NYA_5169

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_018409.1 (883511..887185)

ID :13462600

SEQ ID NO: 151

91. HFMG96NC SEQ ID NO: 127

Proteína de la familia de Csn1 asociada a CRISPR [Mycoplasma gallisepticum NC96_1596-4-2P] Otros alias: HFMG96NCA_5295

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_018408.1 (904664..908473)

ID :13462279

SEQ ID NO: 152

92. HFMG95NCA_5107

Proteína de la familia de Csn1 asociada a CRISPR [Mycoplasma gallisepticum NC95_13295-2-2P] Otros alias: HFMG95NCA_5107

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_018407.1 (871783..875592)

ID :13461469

SEQ ID NO: 153

93. MGAS10750_Spy0921

Proteína hipotética [Streptococcus pyogenes MGAS10750]

Otros alias: MGAS10750_Spy0921

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_008024.1 (875719..879834)

ID: 4066656

SEQ ID NO: 154

94. XAC3262

Proteína hipotética [Xanthomonas axonopodis pv. citri cepa 306]

Otros alias: XAC3262

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_003919.1 (3842310..3842765)

ID :1157333

35 SEQ ID NO: 155

95. SSUST1_1305

Proteína de tipo sistema CRISPR [Streptococcus suis ST1]

Otros alias: SSUST1_1305

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_017950.1 (1293105..1297250, complemento)

ID :13017849

SEQ ID NO: 156

96. SSUD9_1467

Proteína de la familia de Csn1 asociada a CRISPR [Streptococcus suis D9]

Otros alias: SSUD9_1467

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_017620.1 (1456318..1459686, complemento)

ID :12718289

SEQ ID NO: 157

97. BBta_3952

Proteína hipotética [Bradyrhizobium sp. BTAi1]

Otros alias: BBta_3952

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_009485.1 (4149455..4152649, complemento)

ID :5151538

SEQ ID NO: 158

98. CIY_03670

Proteína de la familia de Csn1 asociada a CRISPR [Butyrivibrio fibrisolvens 16/4] Otros alias: CIY_03670

Notación: NC_021031.1 (309663..311960, complemento)

ID :15213189

SEQ ID NO: 159

99. A11Q_912

Proteína de la familia de Csn1 asociada a CRISPR [Bdellovibrio exovorus JSS] Otros alias: A11Q_912

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_020813.1 (904781 ..907864, complemento)

ID :14861475

SEQ ID NO: 160

100. MCYN0850

Proteína de la familia de Csn1 asociada a CRISPR [Mycoplasma cynos C142] Otros alias: MCYN_0850

Notación: NC_019949.1 (951497..955216, complemento)

ID :14356531

SEQ ID NO: 161

101. SaSA20_0769

Proteína asociada a CRISPR [Streptococcus agalactiae SA20-06]

Otros alias: SaSA20_0769

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_019048.1 (803597..807709)

I D : 13908026

S E Q ID NO : 162

102. csnl

Proteína de la familia de Csn1 asociada a CRISPR [Streptococcus pyogenes A20]

Otros alias: A20_0810

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_018936.1 (772038..776144)

ID :13864445

SEQ ID NO: 163

103. P700755_000291

Proteína Cas9/Csn1 de subtipo II asociada a CRISPR [Psychroflexus torquis ATCC700755] Otros alias: P700755_000291

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_018721.1 (312899..317428)

ID :13804571

SEQ ID NO: 164

104. A911_07335

Proteína asociada a CRISPR [Campylobacter jejuni subsp. jejuni PT14]

Otros alias: A911_07335

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_018709.2 (1450217..1453180, complemento)

ID :13791138

SEQ ID NO: 165

105. ASU2_02495

Proteína de la familia de endonucleasa Csn1 asociada a CRISPR [Actinobacillus suis H91 -0380] Otros alias: ASU2_02495

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_018690.1 (552318..555482)

ID :13751600

SEQ ID NO: 166

106. csn1

Proteína asociada a CRI SPR [Listeria monocytogenes SLCC2540]

Otros alias: LMOSLCC2540_2635

N o ta c ió n : N C _018586.1 (2700744..2704748 , co m p le m e n to )

I D : 13647248

S E Q ID NO : 167

107. csnl

Proteína asociada a CRISPR [Listeria monocytogenes SLCC5850]

Otros alias: LMOSLCC5850_2605

Notación: NC_018592.1 (2646023..2650027, complemento)

ID :13626042

SEQ ID NO: 168

108. csnl

Proteína asociada a CRISPR [Listeria monocytogenes serotipp 7 cepa SLCC2482] Otros alias: LMOSLCC2482_2606

Notación: NC_018591.1 (2665393..2669397, complemento)

ID :13605045

SEQ ID NO: 169

109. csnl

Proteína asociada a CRISPR [Listeria monocytogenes SLCC2755]

Otros alias: LMOSLCC2755_2607

Notación: NC_018587.1 (2694850..2698854, complemento)

ID :13599053

SEQ ID NO: 170

110. BN148_1523c

Proteína asociada a CRISPR [Campylobacter jejuni subsp. jejuni NCTC 11168-BN148] Otros alias: BN148_1523c

Notación: NC_018521.1 (1456880..1459834, complemento)

ID :13530688

SEQ ID NO: 171

111. Belba_3201

Proteína Cas9/Csn1 de subtipo II/NMEMI asociada a CRISPR [Belliella baltica DSM 15883] Otros alias: Belba_3201

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_018010.1 (3445311..3449369, complemento)

ID :13056967

SEQ ID NO: 172

112. FN3523_1121

Proteína de membrana [Francisella cf. novicida 3523]

Otros alias: FN3523_1121

Contexto genómico: Cromosoma

N o ta c ió n : N C _017449.1 (1129528..1134468 , co m p le m e n to )

I D : 12924881

S E Q ID NO : 173

113. cas9

Proteína Cas9/Csn1 asociada a CRISPR de subtipo II/NMEMI [Prevotella intermedia 17] Otros alias: PIN17_A0201

Cromosoma: II

Notación: Cromosoma II NC_017861.1 (240722..244864)

ID :12849954

SEQ ID NO: 174

114. csnl

Proteína de la familia de Csn1 asociada a CRISPR [Streptococcus thermophilus JIM 8232] Otros alias: STH8232_0853

Notación: NC_017581.1 (706443..709808)

ID :12637306

SEQ ID NO: 175

115. LMOG_01918

Proteína asociada a CRISPR [Listeria monocytogenes J0161]

Otros alias: LMOG_01918

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_017545.1 (2735374..2739378, complemento)

ID :12557915

SEQ ID NO: 176

116. LMRG_02138

Proteína asociada a CRISPR [Listeria monocytogenes 10403S]

Otros alias: LMRG_02138

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_017544.1 (2641981..2645985, complemento)

ID :12554876

SEQ ID NO: 177

117. CJSA_1443

Presunta proteína asociada a CRISPR [Campylobacter jejuni subsp. jejuni IA3902] Otros alias: CJSA_1443

Contexto genómico: Cromosoma

N o ta c ió n : N C _017279.1 (1454273..1457227 , co m p le m e n to )

I D : 12250720

S E Q ID NO : 178

118. csnl

Proteína Csnl asociada a CRISPR [Streptococcus pyogenes MGAS1882] Otros alias: MGAS1882_0792

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_017053.1 (775696..779799)

ID :12014080

SEQ ID NO: 179

119. csnl

Proteína Csn1 asociada a CRISPR [Streptococcus pyogenes MGAS15252] Otros alias: MGAS15252_0796

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_017040.1 (778271..782374)

ID :11991096

SEQ ID NO: 180

120. cas3

Endonucleasa asociada a CRISPR [Corynebacterium diphtheriae HC02] Otros alias: CDHC02_0036

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_016802.1 (37125..40379)

ID :11739116

SEQ ID NO: 181

121. cas3

Endonucleasa asociada a CRISPR [Corynebacterium diphtheriae C7 (beta)] Otros alias: CDC7B_0035

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_016801.1 (36309..39563)

ID :11737358

SEQ ID NO: 182

122. cas3

Endonucleasa asociada a CRISPR [Corynebacterium diphtheriae BH8] Otros alias: CDBH8_0038

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_016800.1 (37261..40515)

ID :11735325

SEQ ID NO: 183

123. cas3

Endonucleasa asociada a CRISPR [Corynebacterium diphtheriae 31A] Otros alias: CD31A_0036

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_016799.1 (34597..37851)

ID :11731168

SEQ ID NO: 184

124. cas3

Endonucleasa asociada a CRISPR [Corynebacterium diphtheriae VA01] Otros alias: CDVA01_0033

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_016790.1 (34795 ..38049)

ID :11717708

SEQ ID NO: 185

125. cas3

Endonucleasa asociada a CRISPR [Corynebacterium diphtheriae HC01] Otros alias: CDHC01_0034

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_016786.1 (35060..38314)

ID :11708318

SEQ ID NO: 186

126. cas9

Proteína asociada a CRISPR [Corynebacterium diphtheriae HC01] Otros alias: CDHC01_2103

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_016786.1 (2246368..2248998)

ID :11708126

SEQ ID NO: 187

127. PARA_18570

Proteína hipotética [Haemophilus parainfluenzae T3T1]

Otros alias: PARA_18570

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_015964.1 (1913335..1916493)

ID :11115627

SEQ ID NO: 188

128. HDN1 F_34120

Proteína hipotética [gamma proteobacterium HdN1]

Otros alias: HDN1F_34120

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_014366.1 (4143336..4146413, complemento)

ID :9702142

SEQ ID NO: 189

129. SPy_1046

Proteína hipotética [Streptococcus pyogenes M1 GAS]

Otros alias: SPy_1046

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_002737.1 (854757..858863)

ID:901176

SEQ ID NO: 190

130. GBS222_0765

Proteína hipotética [Streptococcus agalactiae]

Otros alias: GBS222_0765

Notación: NC_021195.1 (810875..814987)

ID :15484689

SEQ ID NO: 191

131. NE061598_03330

Proteína hipotética [Francisella tularensis subsp. tularensis NE061598] Otros alias: NE061598_03330

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_017453.1 (601219..604590)

ID :12437259

SEQ ID NO: 192

132. NMV_1993

Proteína hipotética [Neisseria meningitidis 8013]

Otros alias: NMV_1993

Notación: NC_017501.1 (1917073..1920321)

ID :12393700

SEQ ID NO: 193

133. csn1

Proteína hipotética [Campylobacter jejuni subsp. jejuni M1]

Otros alias: CJM1_1467

Contexto genómico: Cromosoma

N o ta c ió n : N C _017280.1 (1433667..1436252 , co m p le m e n to ) I D : 12249021

S E Q ID NO : 194

134. FTU_0629

Proteína hipotética [Francisella tularensis subsp. tularensis TIGB03] Otros alias: FTU_0629

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_016933.1 (677092..680463)

ID :11890131

SEQ ID NO: 195

135. NMAA_0315

Proteína hipotética [Neisseria meningitidis WUE 2594]

Otros alias: NMAA_0315

Notación: NC_017512.1 (377010..380258, complemento)

ID :12407849

SEQ ID NO: 196

136. WS1445

Proteína hipotética [Wolinella succinogenes DSM 1740]

Otros alias: WS1445

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_005090.1 (1388202..1391381, complemento)

ID: 2554690

SEQ ID NO: 197

137. THITE_2123823

Proteína hipotética [Thielavia terrestris NRRL 8126]

Otros alias: THI TE_2123823

Cromosoma: 6

Notación: Cromosoma 6NC_016462.1 (1725696..1725928)

ID :11523019

SEQ ID NO: 198

138. XAC29_16635

Proteína hipotética [Xanthomonas axonopodis Xac29-1]

Otros alias: XAC29_16635

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_020800.1 (3849847..3850302)

I D : 14853997

S E Q ID NO : 199

139. M1GAS476_0830

Proteína hipotética [Streptococcus pyogenes M1476]

Otros alias: M1GAS476_0830

Cromosoma: 1

Notación: NC_020540.1 (792119..796225)

ID :14819166

SEQ ID NO: 200

140. Piso0_000203

Piso0_000203 [Millerozyma farinosa CBS 7064]

Otros alias: GNLVRS01_PISO0A04202g

Otras denominaciones: proteína hipotética

Cromosoma: A

Notación: NC_020226.1 (343553..343774, complemento)

ID :14528449

SEQ ID NO: 201

141. G148_0828

Proteína hipotética [Riemerella anatipestifer RA-CH-2]

Otros alias: G148_0828

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_020125.1 (865673..869875)

ID :14447195

SEQ ID NO: 202

142. csn1

Proteína hipotética [Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis AC-2713] Otros alias: SDSE_1207

Notación: NC_019042.1 (1134173..1138288, complemento)

ID :13901498

SEQ ID NO: 203

143. A964_0899

Proteína hipotética [Streptococcus agalactiae GD201008-001]

Otros alias: A964_0899

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_018646.1 (935164..939276)

ID :13681619

SEQ ID NO: 204

144. FNFX1 0762

Proteína hipotética [Francisella cf. novicida Fx1]

Otros alias: FNFX1_0762

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_017450.1 (781484..786373)

ID :12435564

SEQ ID NO: 205

145. FTV_0545

Proteína hipotética [Francisella tularensis subsp. tularensis TI0902] Otros alias: FTV_0545

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_016937.1 (601185..604556)

ID :11880693

SEQ ID NO: 206

146. FTL_1327

Proteína hipotética [Francisella tularensis subsp. holarctica LVS] Otros alias: FTL_1327

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_007880.1 (1262508..1263689, complemento)

ID: 3952607

SEQ ID NO: 207

147. FTL_1326

Proteína hipotética [Francisella tularensis subsp. holarctica LVS] Otros alias: FTL_1326

Contexto genómico: Cromosoma

Notación: NC_007880.1 (1261927..1262403, complemento)

ID: 3952606

SEQ ID NO: 208

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método de producción de una célula de mamífero o un organismo mamífero no humano transgénico, comprendiendo el método:

(a) llevar a cabo un método de

(i) inactivación génica de una secuencia nucleotídica diana por deleción de una secuencia nucleotídica que es de al menos 20 kb en el genoma de una primera célula; y/o (ii) activación génica de una secuencia nucleotídica de inserción que es de al menos 20 kb en el genoma de una primera célula;

en el que la célula o progenie de la misma puede desarrollarse en un organismo o célula no humana; en el que el método comprende:

(la) usar la escisión de ácido nucleico para crear una primera y segunda roturas en una hebra de ácido nucleico, creando así extremos de corte 5’ y 3’ y una secuencia nucleotídica entre los extremos, en el que la escisión se lleva a cabo combinando en una célula la hebra de ácido nucleico, una endonucleasa Cas9, un ARNcr y un ARNtracr para orientar la endonucleasa;

(^lb) usar la recombinación homóloga para eliminar la secuencia nucleotídica, en el que la recombinación homóloga se lleva a cabo:

(A) entre un ácido nucleico entrante que comprende un primer y segundo brazos de homología, en el que los brazos de homología son sustancialmente homólogos respectivamente de una secuencia que se extiende en dirección 5’ desde el extremo 5’ y una secuencia que se extiende en dirección 3’ desde el extremo 3’; o

(B) entre un ácido nucleico entrante que comprende una secuencia nucleotídica de inserción flanqueada por el primer y segundo brazos de homología, en el que los brazos de homología son sustancialmente homólogos respectivamente de una secuencia que se extiende en dirección 5’ desde el extremo 5’ y una secuencia que se extiende en dirección 3’ desde el extremo 3’, en el que la secuencia nucleotídica de inserción se inserta entre los extremos 5’ y 3’;

y/o

(^lla) usar la escisión de ácido nucleico para crear extremos de corte 5’ y 3’ en una sola hebra de ácido nucleico, en el que la escisión se lleva a cabo combinando en una célula la hebra de ácido nucleico, una endonucleasa Cas9, un ARNcr y un ARNtracr para orientar la endonucleasa;

(^llb) usar la recombinación homóloga para insertar una secuencia nucleotídica entre los extremos, en el que la secuencia de inserción comprende un elemento regulador o codifica toda o parte de una proteína, en el que la recombinación homóloga se lleva a cabo entre un ácido nucleico entrante que comprende una secuencia nucleotídica de inserción flanqueada por el primer y segundo brazos de homología, en el que los brazos de homología son sustancialmente homólogos respectivamente de una secuencia que se extiende en dirección 5’ desde el extremo 5’ y una secuencia que se extiende en dirección 3’ desde el extremo 3’, en el que la secuencia nucleotídica de inserción se inserta entre los extremos 5’ y 3;

2. El método de la reivindicación 1, en el que la secuencia nucleotídica de inserción es de al menos 50 kb o 100 kb.

3. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la secuencia nucleotídica eliminada es de al menos 50 kb o 100 kb.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa (la) y/o la etapa (IIa) se llevan a cabo usando un ARN guía, p. ej. un ARN guía simple (ARNsg), que comprende un ARNcr y un ARNtracr, opcionalmente en el que la etapa (Ia) usa un primer y un segundo ARNg para orientar a una parte deseada del ácido nucleico, definiendo la región para eliminar.

5. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que

i. el ARNcr y ARNtracr se introducen en la célula como moléculas de ARN;

ii. el ARNcr y ARNtracr se codifican por ADN en la célula u organismo y se transcriben dentro de la célula u organismo para producir el ARNcr o ARNtracr; o

iii. el ARNtracr se codifica por ADN en la célula u organismo y se transcribe dentro de la célula u organismo para producir el ARNtracr, pero se introducen uno o más ARNcr como ácido nucleico ARN en la célula u organismo; o

iv. un ARNg que comprende un ARNcr y un ARNtracr se codifica por una secuencia que se ha introducido en la célula.

6. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que

i. la endonucleasa Cas9 se codifica por una secuencia nucleotídica que se ha introducido en la célula; o

ii. la endonucleasa Cas9 se introduce como una proteína en la célula u organismo; o

iii. la endonucleasa Cas9 se introduce como un vector que codifica la endonucleasa Cas9 en la célula u organismo; o

iv. la endonucleasa Cas9 se codifica por ADN que se integra genómicamente en la célula u organismo y se transcribe y traduce dentro de la célula u organismo.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el método se lleva a cabo en una célula de mamífero no humano o una célula ES de roedor o cigoto de roedor o una célula ES de ratón o un cigoto de ratón o un ratón, rata o conejo.

8. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que el organismo o célula es homocigótico de la modificación (i) y/o la modificación (ii).

9. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que la secuencia de inserción es una secuencia sintética; o comprende una secuencia que codifica toda o parte de una proteína de una especie distinta de la especie de la que deriva la primera célula; o comprende un elemento regulador de dicha primera especie, p. ej. la secuencia de inserción codifica toda o parte de una proteína humana o una subunidad o dominio de proteína humana; o es una secuencia humana que reemplaza o suplementa una secuencia no humana ortóloga.

10. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que

i. la célula u organismo es una célula de mamífero no humano o un mamífero no humano que expresa uno o más dominios variables de cadena pesada de anticuerpo humano, y opcionalmente ningún dominio variable de cadena pesada de una especie de mamífero no humano; y/o

ii. la célula u organismo es una célula de mamífero no humano o un mamífero no humano que expresa uno o más dominios variables de cadena ligera kappa de anticuerpo humano; y/o

iii. la célula u organismo es una célula de mamífero no humano o un mamífero no humano que expresa uno o más dominios variables de cadena ligera lambda de anticuerpo humano; y/o

iv. el organismo es un mamífero no humano que expresa regiones variables de anticuerpo humano cuyo genoma comprende un reemplazo de una diana endógena por una secuencia humana ortóloga u homóloga.

11. Una célula de mamífero no humano o un organismo mamífero no humano, p. ej. un ratón, cuyo genoma comprende una modificación que comprende una secuencia nucleotídica no endógena de al menos 20 kb flanqueada por secuencias nucleotídicas endógenas, en los que la célula u organismo es obtenible mediante el método de cualquier reivindicación anterior, y en los que la secuencia no endógena está flanqueada en 3’ y/o 5’ por un motivo PAM de Cas9; en los que la célula no está incluida en un ser humano y

i. la secuencia no endógena comprende todo o parte de un elemento regulador o codifica toda o parte de una proteína; y/o

ii. la secuencia no endógena reemplaza una secuencia ortóloga u homóloga en el genoma.

12. La célula u organismo no humano de la reivindicación 11, en los que

i. la secuencia no endógena está flanqueada en 3’ y/o 5’ a 20, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 o menos nucleótidos por, o es directamente adyacente a, un motivo PAM de Cas9; y/o

ii. el motivo PAM es reconocido por una Cas9 de Streptococcus; y/o

iii. el motivo PAM comprende una secuencia seleccionada de CCN, TCN, TTC, AWG, CC, NNAGNN, NGGNG, GG, NGG, WGG, CWT, CTT y GAA.

13. La célula u organismo no humano de las reivindicaciones 11 o 12, en los que la secuencia no endógena i. comprende uno o más segmentos génicos de anticuerpo humano; y/o

ii. una región variable de anticuerpo; y/o

iii. una región constante de anticuerpo; y/o

iv. codifica una proteína receptora Fc humana o subunidad o dominio de la misma; y/o v. es una secuencia humana.