JP6980380B2 - 短縮ガイドRNA(tru−gRNA)を用いたRNA誘導型ゲノム編集の特異性の増大 - Google Patents
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Description
本願は、2013年3月15日に出願された米国特許出願第61/799,647号;2013年6月21日に出願された米国特許出願第61/838,178号;2013年6月21日に出願された米国特許出願第61/838,148号および2013年12月26日に出願された米国特許出願第61/921,007号の利益を主張するものである。上記出願の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された助成番号DP1 GM105378の下、政府の支援を受けてなされたものである。政府は本発明に一定の権利を有する。
(X17〜18またはX17〜19)GUUUUAGAGCUA(配列番号2404);
(X17〜18またはX17〜19)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(配列番号2407);または
(X17〜18またはX17〜19)GUUUUAGAGCUAUGCU(配列番号2408);
(X17〜18またはX17〜19)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG(XN)(配列番号1);
(X17〜18またはX17〜19)GUUUUAGAGCUAUGCUGAAAAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(XN)(配列番号2);
(X17〜18またはX17〜19)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUGGAAACAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(XN)(配列番号3);
(X17〜18)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(XN)(配列番号4)、
(X17〜18またはX17〜19)GUUUAAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号5);
(X17〜18またはX17〜19)GUUUUAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号6);または
(X17〜18またはX17〜19)GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号7);
からなるリボ核酸を提供し、配列中、X17〜18またはX17〜19は、選択される標的配列、好ましくはプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)、例えばNGG、NAGまたはNNGGの5’側に隣接する標的配列の相補鎖に相補的な(17〜18ヌクレオチドまたは17〜19ヌクレオチドの)配列であり(例えば、図1の構造を参照されたい)、XNは、リボ核酸とCas9との結合に干渉しない任意の配列であり、(RNA中の)Nは0〜200、例えば、0〜100、0〜50または0〜20であり得る。X17〜18またはX17〜19は、RNAの残りの部分に隣接して自然に発生する配列と同一であることは決してない。いくつかの実施形態では、RNA PolIII転写を停止させる終止シグナルとして用いられる1つまたは複数のTが任意選択で存在するので、RNAは分子の3’末端に1つまたは複数のU、例えば、1〜8つまたはそれ以上のU(例えば、U、UU、UUU、UUUU、UUUUU、UUUUUU、UUUUUUU、UUUUUUUU)を含む。いくつかの実施形態では、RNAは、RNA分子の5’末端に標的配列に相補的ではない1つまたは複数、例えば最大3つ、例えば1つ、2つまたは3つの追加のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的相補性領域は、17〜18ヌクレオチド(の標的相補性)からなる。いくつかの実施形態では、相補性領域は、選択される標的配列の相補鎖の連続する17ヌクレオチドに相補的である。いくつかの実施形態では、相補性領域は、連続する18に相補的である。
Cas9ヌクレアーゼもしくはニッカーゼまたはdCas9−異種機能ドメイン融合タンパク質(dCas9−HFD)と、
tracrRNA、例えば、配列GGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号8)もしくはその活性部分;
UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号2405)もしくはその活性部分;
AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号2407)もしくはその活性部分;
CAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号2409)もしくはその活性部分;
UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG(配列番号2410)もしくはその活性部分;
UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCA(配列番号2411)もしくはその活性部分;または
UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG(配列番号2412)もしくはその活性部分を含むか、これよりなるtracrRNAと、
選択される標的配列、好ましくはプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)、例えばNGG、NAGまたはNNGGの5’側に隣接する標的配列の相補鎖に相補的な17〜18ヌクレオチドまたは17〜19ヌクレオチドからなる配列を含む、crRNAと
を細胞内で発現させるか、細胞内に導入することを含み、いくつかの実施形態では、crRNAは配列:
(X17〜18またはX17〜19)GUUUUAGAGCUA(配列番号2404);
(X17〜18またはX17〜19)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(配列番号2407);または
(X17〜18またはX17〜19)GUUUUAGAGCUAUGCU(配列番号2408)
を有する。
CRISPR RNA誘導型ヌクレアーゼ(RGN)は、簡便で効率的なゲノム編集のプラットフォームとして急速に登場した。Marraffiniら(Jiangら,Nat Biotechnol 31,233−239(2013))は近年、細菌でのCas9 RGNの特異性を体系的に研究したが、ヒト細胞でのRGN特異性については十分に明らかにされていない。これらのヌクレアーゼを研究および治療応用に広く用いるのであれば、ヒトをはじめとする真核細胞においてRGNによるオフターゲット効果が及ぶ範囲を理解することが極めて重要になる。本発明者らは、ヒト細胞ベースのレポーターアッセイを用いてCas9ベースのRGNによるオフターゲット切断の特徴を明らかにした。ガイドRNA(gRNA)−DNA接合部に沿った位置に応じて、様々な程度で単一および二重のミスマッチが許容された。一部ミスマッチのある部位を調べることによって、ヒト細胞の内在遺伝子座を標的とした6種類のRGNのうちの4種類によって誘発されるオフターゲット変化が迅速に検出された。特定されたオフターゲット部位は最大5つのミスマッチを保有しており、その多くが目的とするオンターゲット部位で観察された頻度と同等(またはそれ以上)の頻度で変異していた。したがって、RGNはヒト細胞において、不完全にマッチしたRNA−DNAに対しても高い活性を示し、この観察結果は研究および治療応用での使用を複雑なものにしかねないものである。
本明細書に示されるように、化膿性連鎖球菌(S.pyogenes)Cas9タンパク質を土台とするCRISPR−Cas RNA誘導型ヌクレアーゼは、目的とするオンターゲット活性と同等以上の著しいオフターゲット変異誘発効果を有し得る(実施例1)。このようなオフターゲット効果は、研究の適用する際に、また特に将来治療に適用する際に問題となり得る。したがって、CRISPR−Cas RNA誘導型ヌクレアーゼ(RGN)の特異性を改善する方法が必要とされている。
一般的に言えば、ガイドRNAには2つの系、すなわち、一緒に機能してCas9による切断を誘導する別個のcrRNAとtracrRNAを用いる系1および2つの別個のガイドRNAを単一の系に組み合わせるキメラcrRNA−tracrRNAハイブリッドを用いる系2(単一ガイドRNAまたはsgRNAと呼ばれる。このほか、Jinekら,Science 2012;337:816−821を参照されたい)がある。tracrRNAは様々な長さに短縮することが可能であり、様々な長さのものが別個の系(系1)およびキメラgRNA系(系2)の両方で機能することが示されている。例えば、いくつかの実施形態では、tracrRNAは、その3’末端から少なくとも1nt、2nt、3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、15nt、20nt、25nt、30nt、35ntまたは40nt短縮されていてよい。いくつかの実施形態では、tracrRNA分子は、その5’末端から少なくとも1nt、2nt、3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、15nt、20nt、25nt、30nt、35ntまたは40nt短縮されていてよい。あるいは、tracrRNA分子は、5’末端および3’末端の両方から、例えば、5’末端で少なくとも1nt、2nt、3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、15ntまたは20nt、3’末端で少なくとも1nt、2nt、3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、15nt、20nt、25nt、30nt、35ntまたは40nt短縮されていてよい。例えば、Jinekら,Science 2012;337:816−821;Maliら,Science.2013 Feb 15;339(6121):823−6;Congら,Science.2013 Feb 15;339(6121):819−23;ならびにHwangおよびFuら,Nat Biotechnol.2013 Mar;31(3):227−9;Jinekら,Elife 2,e00471(2013)を参照されたい。系2では一般に、キメラgRNAの長さが長いほどオンターゲット活性が高いことがわかっているが、様々な長さのgRNAの相対的特異性は現時点では明らかにされておらず、したがって、場合によっては短いgRNAを用いる方が望ましいことがある。いくつかの実施形態では、gRNAは、転写開始部位を含む転写開始部位の上流約100〜800bp以内、例えば、転写開始部位の上流約500bp以内、または転写開始部位の下流約100〜800bp以内、例えば、約500bp以内にある領域に相補的である。いくつかの実施形態では、2種類以上のgRNAをコードするベクター(例えば、プラスミド)、例えば、標的遺伝子の同じ領域の異なる部位を対象とする2種類、3種類、4種類、5種類またはそれ以上のgRNAをコードするプラスミドを用いる。
(X17〜18またはX17〜19)GUUUUAGAGCUA(配列番号2404);
(X17〜18またはX17〜19)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(配列番号2407);または
(X17〜18またはX17〜19)GUUUUAGAGCUAUGCU(配列番号2408);
(X17〜18またはX17〜19)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG(XN)(配列番号1);
(X17〜18またはX17〜19)GUUUUAGAGCUAUGCUGAAAAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(XN)(配列番号2);
(X17〜18またはX17〜19)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUGGAAACAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(XN)(配列番号3);(X17〜18またはX17〜19)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(XN)(配列番号4)、
(X17〜18またはX17〜19)GUUUAAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号5);
(X17〜18またはX17〜19)GUUUUAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号6);または(X17〜18またはX17〜19)GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号7);
からなり、配列中、X17〜18またはX17〜19はそれぞれ、標的配列の連続する17〜18ヌクレオチドまたは17〜19ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列である。本明細書にはほかにも、既に文献(Jinekら,Science.337(6096):816−21(2012)およびJinekら,Elife.2:e00471(2013))に記載されている短縮Cas9ガイドRNAをコードするDNAが記載される。
(X17〜18またはX17〜19)GUUUUAGAGCUA(XN)(配列番号2404);
(X17〜18またはX17〜19)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(XN)(配列番号2407);
(X17〜18またはX17〜19)GUUUUAGAGCUAUGCU(XN)(配列番号2408);
(X17〜18またはX17〜19)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG(XN)(配列番号1);
(X17〜18またはX17〜19)GUUUUAGAGCUAUGCUGAAAAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(XN)(配列番号2);
(X17〜18またはX17〜19)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUGGAAACAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(XN)(配列番号3);
(X17〜18)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(XN)(配列番号4)、
(X17〜18またはX17〜19)GUUUAAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号5);
(X17〜18またはX17〜19)GUUUUAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号6);または
(X17〜18またはX17〜19)GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号7);
を含むか、これよりなるものであり得、配列中、X17〜18またはX17〜19はそれぞれ、標的配列、好ましくはプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)、例えばNGG、NAGまたはNNGGの5’側に隣接する標的配列の17〜18ntまたは17〜19ntに相補的な配列であり、さらに配列中、1つまたは複数のヌクレオチド、例えば、配列X17〜18もしくはX17〜19内の1つもしくは複数のヌクレオチド、配列XN内の1つもしくは複数のヌクレオチドまたはtru−gRNAの任意の配列内の1つもしくは複数のヌクレオチドがロックされている。XNは、リボ核酸とCas9との結合に干渉しない任意の配列であり、(RNA中の)Nは0〜200、例えば、0〜100、0〜50または0〜20であり得る。いくつかの実施形態では、RNA PolIII転写を停止させる終止シグナルとして用いられる1つまたは複数のTが任意選択で存在するので、RNAは分子の3’末端に1つまたは複数のU、例えば、1〜8つまたはそれ以上のU(例えば、U、UU、UUU、UUUU、UUUUU、UUUUUU、UUUUUUU、UUUUUUUU)を含む。
(X17〜18またはX17〜19)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(配列番号2407);または
(X17〜18またはX17〜19)GUUUUAGAGCUAUGCU(配列番号2408);とtracrRNA配列とを使用する。この場合、crRNAを本明細書に記載の方法および分子のガイドRNAとして使用し、tracrRNAを同じまたは異なるDNA分子から発現させ得る。いくつかの実施形態では、この方法は、細胞と、配列GGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号8)またはその活性部分(活性部分とは、Cas9またはdCas9と複合体を形成する能力を保持している部分のことである)を含むか、これよりなるtracrRNAとを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、tracrRNA分子は、その3’末端から少なくとも1nt、2nt、3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、15nt、20nt、25nt、30nt、35ntまたは40nt短縮されていてよい。別の実施形態では、tracrRNA分子は、その5’末端から少なくとも1nt、2nt、3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、15nt、20nt、25nt、30nt、35ntまたは40nt短縮されていてよい。あるいは、tracrRNA分子は、5’末端および3’末端の両方から、例えば、5’末端で少なくとも1nt、2nt、3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、15ntまたは20nt、3’末端で少なくとも1nt、2nt、3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、15nt、20nt、25nt、30nt、35ntまたは40nt短縮されていてよい。例示的なtracrRNA配列は配列番号8のほかにも、以下のものを含む:
UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号2405)もしくはその活性部分;
AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号2407)もしくはその活性部分;
CAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号2409)もしくはその活性部分;
UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG(配列番号2410)もしくはその活性部分;
UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCA(配列番号2411)もしくはその活性部分;またはUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG(配列番号2412)もしくはその活性部分。
(X17〜18またはX17〜19)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG(XN)(配列番号1);
(X17〜18またはX17〜19)GUUUUAGAGCUAUGCUGAAAAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(XN)(配列番号2);
(X17〜18またはX17〜19)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUGGAAACAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(XN)(配列番号3);(X17〜18またはX17〜19)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(XN)(配列番号4)、
(X17〜18またはX17〜19)GUUUAAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号5);
(X17〜18またはX17〜19)GUUUUAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号6);または
(X17〜18またはX17〜19)GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号7);
を含むか、これよりなるものであり得、配列中、X17〜18またはX17〜19はそれぞれ、標的配列、好ましくはプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)、例えばNGG、NAGまたはNNGGの5’側に隣接する標的配列の17〜18ntまたは17〜19ntに相補的な配列であり、さらに配列中、1つまたは複数のヌクレオチド、例えば、配列X17〜18もしくはX17〜19内の1つもしくは複数のヌクレオチド、配列XN内の1つもしくは複数のヌクレオチドまたはtru−gRNAの任意の配列内の1つもしくは複数のヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドである。XNは、リボ核酸とCas9との結合に干渉しない任意の配列であり、(RNA中の)Nは0〜200、例えば、0〜100、0〜50または0〜20であり得る。いくつかの実施形態では、RNA PolIII転写を停止させる終止シグナルとして用いられる1つまたは複数のTが任意選択で存在するため、RNAは分子の3’末端に1つまたは複数のU、例えば、1〜8つまたはそれ以上のU(例えば、U、UU、UUU、UUUU、UUUUU、UUUUUU、UUUUUUU、UUUUUUUU)を含む。
いくつかの細菌がCas9タンパク質変異体を発現する。現在、化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9が最もよく用いられているが、他のCas9タンパク質にも化膿性連鎖球菌(S.pyogenes)Cas9と高レベルの配列同一性を有し、同じガイドRNAを利用するものがある。それ以外のものはさらに多様であり、利用するgRNAが異なり、認識するPAM配列(RNAによって定められる配列に隣接するタンパク質によって定められる、2〜5のヌクレオチドの配列)も異なる。Chylinskiらは多数の細菌群のCas9タンパク質を分類し(RNA Biology 10:5,1−12;2013)、その付図1および付表1に多数のCas9タンパク質を列記しており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。ほかのCas9タンパク質については、Esveltら,Nat Methods.2013 Nov;10(11):1116−21およびFonfaraら,“Phylogeny of Cas9 determines functional exchangeability of dual−RNA and Cas9 among orthologous type II CRISPR−Cas systems.” Nucleic Acids Res.2013 Nov 22.[印刷前電子出版]doi:10.1093/nar/gkt1074に記載されている。
Cas9−HFDについては、2013年3月15日に出願された米国仮特許出願第61/799,647号、2013年6月21日に出願された米国特許出願第61/838,148号および国際出願PCT/US14/27335号に記載されており、上記出願はすべてその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
記載されるガイドRNAを使用するためには、それをコードする核酸から発現させるのが望ましいであろう。これは様々な方法で実施することができる。例えば、ガイドRNAをコードする核酸を中間ベクターにクローン化して原核細胞または真核細胞を形質転換し、複製および/または発現させる。中間ベクターは通常、ガイドRNAをコードする核酸を保管または操作しガイドRNAを産生するための原核生物ベクター、例えばプラスミドもしくはシャトルベクターまたは昆虫ベクターである。このほか、ガイドRNAをコードする核酸を発現ベクターにクローン化して植物細胞、動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞もしくはヒト細胞、真菌細胞、細菌細胞または原生動物細胞に投与してもよい。
CRISPR RNA誘導型ヌクレアーゼ(RGN)は、簡便で効率的なゲノム編集のプラットフォームとして急速に登場したものである。この実施例では、ヒト細胞ベースのレポーターアッセイを用いてCas9ベースのRGNのオフターゲット切断の特徴を明らかにすることついて記載する。
実施例1では以下の材料および方法を用いた。
Cas9標的化のための可変20nt配列を保有するDNAオリゴヌクレオチド(表A)をアニールさせて、4bpオーバーハングを有しBsmBI消化プラスミドpMLM3636へのライゲーションに適合した短い二本鎖DNAフラグメントを作製した。このアニールしたオリゴヌクレオチドのクローン化により、U6プロモーターの発現下に20の可変5’ヌクレオチドを有するキメラ+103一本鎖ガイドRNAをコードするプラスミドが得られる(Hwangら,Nat Biotechnol 31,227−229(2013);Maliら,Science 339,823−826(2013))。この研究に使用するpMLM3636および発現プラスミドpJDS246(コドン最適化型のCas9をコードする)はともに非営利プラスミド配布サービスAddgene(addgene.org/crispr−cas)から入手可能である。
EGFP−PEST融合遺伝子の単一コピーが組み込まれたU2OS.EGFP細胞を既に記載されている通りに培養した(Reyonら,Nat Biotech 30,460−465(2012))。トランスフェクションでは、SE Cell Line 4D−Nucleofector(商標)Xキット(Lonza)を製造業者のプロトコルに従って用い、示される量のsgRNA発現プラスミドおよびpJDS246をTd−トマトコードプラスミド30ngとともに200,000個の細胞にヌクレオフェクトした。トランスフェクションの2日後、BD LSRIIフローサイトメータを用いて細胞を解析した。gRNA/Cas9プラスミドの濃度を最適化するトランスフェクションを三重反復で実施し、他のトランスフェクションをいずれも二重反復で実施した。
Phusion Hot Start II高忠実度DNAポリメラーゼ(NEB)およびPCRプライマーならびに表Bに列記される条件を用いてPCR反応を実施した。ほとんどの遺伝子座がタッチダウンPCR([98℃、10秒;72〜62℃、−1℃/サイクル、15秒;72℃、30秒]10サイクル、[98℃、10秒;62℃、15秒;72℃、30秒]25サイクル)を用いて良好に増幅された。必要に応じて、68℃または72℃の一定のアニーリング温度および3%DMSOまたは1Mベタインを用いて残りの標的のPCRを35サイクル実施した。PCR産物をQIAXCELキャピラリー電気泳動系で分析して、その大きさおよび純度を検証した。妥当性が確認された産物をExoSap−IT(Affymetrix)で処理し、サンガー法(MGH DNA Sequencing Core)により配列決定して各標的部位を検証した。
U2OS.EGFP細胞およびK562細胞では、4D Nucleofector System(Lonza)を製造業者の説明書に従って用い、2×105個の細胞にgRNA発現プラスミドまたは空のU6プロモータープラスミド(陰性対照)250ng、Cas9発現プラスミド750ngおよびtd−トマト発現プラスミド30ngをトランスフェクトした。HEK293細胞では、Lipofectamine LTX試薬(Life Technologies)を製造業者の指示に従って用い、1.65×105個の細胞にgRNA発現プラスミドまたは空のU6プロモータープラスミド(陰性対照)125ng、Cas9発現プラスミド375ngおよびtd−トマト発現プラスミド30ngをトランスフェクトした。QIAamp DNA Blood Mini Kit(QIAGEN)を製造業者の説明書に従って用い、トランスフェクトしたU2OS.EGFP細胞、HEK293細胞またはK562細胞からゲノムDNAを回収した。オフターゲット候補部位を増幅するのに十分なゲノムDNAが得られるように、3回のヌクレオフェクション(U2OS.EGFP細胞)、2回のヌクレオフェクション(K562細胞)または2回のLipofectamine LTXトランスフェクションで得られたDNAをプールしてからT7EIを実施した。試験した各条件に対してこの操作を2回実施することにより同じゲノムDNAのプールを2つ作製し、各トランスフェクションを計4回または6回分得た。次いで、これらのゲノムDNAを鋳型に用いてPCRを上記の通りに実施し、Ampure XPビーズ(Agencourt)を製造業者の説明書に従って用い精製した。T7EIアッセイを既に記載されている通りに実施した(Reyonら,2012,上記)。
T7EIアッセイに使用した精製PCR産物をZero Blunt TOPOベクター(Life Technologies)にクローン化し、MGH DNA Automation Coreによりアルカリ溶解ミニプレップ法を用いてプラスミドDNAを単離した。M13順方向プライマー(5’−GTAAAACGACGGCCAG−3’(配列番号1059)を用いてサンガー法(MGH DNA Sequencing Core)によりプラスミドの配列を決定した。
ヒト細胞におけるRGN特異性決定因子を明らかにすることを始めるにあたり、複数のgRNA/標的DNA接合部内の様々な位置に系統的にミスマッチを生じさせることの影響を評価するために大規模な試験を実施した。これを実施するため、既に記載されている標的ヌクレアーゼ活性の迅速の定量化が可能な定量的なヒト細胞ベースの高感度緑色蛍光タンパク質(EGFP)崩壊アッセイ(上の「方法」およびReyonら,2012,上記を参照されたい)(図2B)を用いた。このアッセイでは、ヌクレアーゼ誘発二本鎖切断(DSB)の誤りがちな非相同末端結合(NHEJ)修復によって導入されるフレームシフト挿入/欠失(挿入欠失)変異を不活性化することによって起こるヒトU2OS.EGFP細胞内の蛍光シグナルを評価することによって、単一の組み込まれたEGFPレポーター遺伝子を標的とするヌクレアーゼの活性を定量化することができる(図2B)。ここに記載される研究では、EGFP内の異なる配列を標的とする以下のような3種類の約100ntの単一gRNAを用いた:
EGFP部位1 GGGCACGGGCAGCTTGCCGGTGG(配列番号9)
EGFP部位2 GATGCCGTTCTTCTGCTTGTCGG(配列番号10)
EGFP部位3 GGTGGTGCAGATGAACTTCAGGG(配列番号11)。
上記gRNAはそれぞれ、Cas9仲介性のEGFP発現崩壊を効率的に誘導することができる(実施例1eおよび2aならびに図3E(最上段)および3F(最上段)を参照されたい)。
gRNA/DNA接合部の2つ以上のミスマッチによる影響を試験するため、隣接する位置および離れた位置にワトソン−クリックトランスバージョンミスマッチを2つ有する一連の変異体gRNAを作製し、EGFP崩壊アッセイを用いて、ヒト細胞でこれらのgRNAがCas9ヌクレアーゼ活性を誘導する能力を試験した。全般的に標的部位は3種類とも、一方または両方のミスマッチがgRNA標的化領域の3’側半分に起こる2つの変化に対して感度が高くなることが分かった。しかし、この影響の大きさには部位による差がみられ、標的部位#2がこの2つのミスマッチに対して最も高い感度を示し、標的部位#1が全般的に最も低い感度を示した。許容され得る隣接したミスマッチの数を試験するため、gRNA標的化領域の5’末端の位置19〜15(単一および2つのミスマッチの許容性が高いと思われる位置)の範囲でミスマッチの位置の数が漸増する変異体gRNAを構築した。
内在ヒト遺伝子を標的とするRGNのオフターゲット変異を特定することができるかどうかを明らかにするため、VEGFA遺伝子の3つの異なる部位、EMX1遺伝子の1つの部位、RNF2遺伝子の1つの部位およびFANCF遺伝子の1つの部位を標的とする6種類の単一gRNAを用いた(表1および表A)。上記6種類のgRNAは、T7エンドヌクレアーゼI(T7EI)アッセイによって検出されたように、ヒトU2OS.EGFP細胞のそれぞれの内在遺伝子座におけるCas9仲介性挿入欠失を効率的に誘導するものであった(上の「方法」および表1)。次いで本発明者らは、この6種のRGNそれぞれについて、U2OS.EGFP細胞におけるヌクレアーゼ誘発NHEJ仲介性挿入欠失変異の証拠を得るため、候補となるオフターゲット部位を数十か所(46から64に及ぶ箇所数)検討した。評価した遺伝子座には、ヌクレオチドが1つまたは2つ異なる全ゲノム部位のほかにも、ヌクレオチドが3〜6つ異なるゲノム部位のサブセットを含め、gRNA標的化配列の5’側半分にこのようなミスマッチを1つまたは複数有するものを重視した(表B)。T7EIアッセイを用いて、VEGFA部位1では(検討した53か所の候補部位うち)4か所のオフターゲット部位、VEGFA部位2では(検討した46か所のうち)12か所、VEGFA部位3では(検討した64か所のうち)7か所、EMX1部位では(検討した46か所のうち)1か所(表1および表B)が容易に特定された。RNF2またはFANCF遺伝子について検討したそれぞれ43か所および50か所の候補部位にはオフターゲット変異は検出されなかった(表B)。実証されたオフターゲット部位の変異率は極めて高く、目的とする標的部位に観察された変異率の5.6%から125%(平均40%)に及ぶものであった(表1)。このような真のオフターゲットには、標的部位の3’末端にミスマッチを有し、合計5つに及ぶミスマッチを有する配列が含まれ、ほとんどのオフターゲット部位がタンパク質をコードする遺伝子内にみられた(表1)。一部のオフターゲット部位のDNAシーケンシングから、予測されるRGN切断部位に挿入欠失変異が起こることを示す分子的な裏付けがさらに得られた(図8A〜8C)。
RGNがU2OS.EGFP細胞に高頻度でオフターゲット変異を誘発し得ることが確認されたため、本発明者らは次に、これらのヌクレアーゼが他のタイプのヒト細胞にもこのような影響を及ぼすかどうかを明らかにしようとした。本発明者らは以前、TALEN15の活性を評価するのにU2OS.EGFP細胞を用いたため、本発明者らの最初の実験にはU2OS.EGFP細胞を選択したが、標的化ヌクレアーゼの活性の試験にはヒトHEK293細胞およびK562細胞の方が広く用いられている。したがって、本発明者らはHEK293細胞およびK562細胞についてもVEGFA部位1、2および3ならびにEMX1部位に標的化した4種類のRGNを評価した。本発明者らは、この4種類のRGNが、変異頻度はU2OS.EGFP細胞に観察された頻度よりもいくぶん低いものの、上記のさらなる2種類のヒト細胞系でもその目的とするオンターゲット部位にNHEJ仲介性挿入欠失変異を効率的に誘発することを発見した(T7EIアッセイによる評価)(表1)。最初にU2OS.EGFP細胞で特定された上記4種類のRGNの24か所のオフターゲット部位を評価したところ、多くの部位が、HEK293細胞およびK562細胞でも同様にその対応するオンターゲット部位と同程度の頻度で変異することが明らかになった(表1)。予想された通り、HEK293細胞のこれらのオフターゲット部位の一部のDNAシーケンシングにより、予測されたゲノム遺伝子座に変化が生じることを示す分子的な根拠がさらに得られた(図9A〜9C)。U2OS.EGFP細胞で特定されたオフターゲット部位のうち、HEK293細胞の4か所、K562細胞の11か所が検出可能な変異を示さなかった理由は正確にはわからない。しかし、これらのオフターゲット部位の多くがU2OS.EGFP細胞でも比較的低い変異頻度を示したことが注目される。したがって、本発明者らの実験ではU2OS.EGFP細胞に比してHEK293細胞およびK562細胞の方が全般的にRGNの活性が低いと思われるため、HEK293細胞およびK562細胞のこれらの部位における変異率が本発明者らのT7EIアッセイの信頼できる検出限界(約2〜5%)未満になるものと推測される。以上をまとめると、本発明者らがHEK293細胞およびK562細胞で得た結果は、今回RGNに観察される高頻度のオフターゲット変異が複数のヒト細胞型にみられる一般的な現象である根拠を示すものである。
非相同末端結合を介したフレームシフト変異の誘発がEGFPの発現を確実に崩壊させ得る位置であるEGFPヌクレオチド502の上流に位置する3つの異なる配列(上に示したEGFP部位1〜3)に対して単一gRNAを作製した(Maeder,M.L.ら,Mol Cell 31,294−301(2008);Reyon,D.ら,Nat Biotech 30,460−465(2012))。
最初は反直観的に思われる方法であるが、単にgRNA−DNA接合部の長さを短くことによって、オンターゲット活性を損なわずにRGNのオフターゲット効果が最小限に抑えられるとする仮説を立てた。実際、長いgRNAの方がオンターゲット部位における機能の効率が低い(以下の記述およびHwangら,2013a;Ranら,2013を参照されたい)。これに対して、上の実施例1に示されるように、5’末端に複数のミスマッチを有するgRNAでも依然としてその標的部位に確実な切断を誘発することが可能であり(図2Aおよび2C〜2F)、完全なオンターゲット活性にはこれらのヌクレオチドが不要である可能性が示唆された。したがって、これらの5’ヌクレオチドを欠く短縮gRNAが完全長gRNAと同等の活性を示すのではないかとする仮説を立てた(図2A)。完全長gRNAの5’ヌクレオチドがオンターゲット活性に不要であるならば、その存在がgRNA−標的DNA接合部の他の位置におけるミスマッチも相殺するのではないかと推測された。この推測が正しいとすれば、gRNAのミスマッチに対する感度が高くなることに加えて、Cas9仲介性オフターゲット変異のレベルが実質的に低下するのではないかとする仮説を立てた(図2A)。
実施例2では以下の実験手順を用いた。
gRNA発現プラスミドはいずれも、上記(実施例1)のように相補性領域を保有するオリゴヌクレオチド(IDT)のペアを設計、合成、アニーリングし、プラスミドpMLM3636(Addgene社から入手可能)にクローン化することによって組み立てた。得られたgRNA発現ベクターは、ヒトU6プロモーターによって発現が駆動される約100ntのgRNAをコードする。gRNA発現ベクターの構築に使用した全オリゴヌクレオチドを表Dに示す。QuikChangeキット(Agilent Technologies)を以下のプライマー:Cas9 D10Aセンスプライマー5’−tggataaaaagtattctattggtttagccatcggcactaattccg−3’(配列番号1089);Cas9 D10Aアンチセンスプライマー 5’−cggaattagtgccgatggctaaaccaatagaatactttttatcca−3’(配列番号1090)とともに用いてプラスミドpJDS246を変異させることによって、RuvCエンドヌクレアーゼドメインに変異を有するCas9 D10Aニッカーゼ発現プラスミド(pJDS271)を作製した。この研究に使用した標的化gRNAプラスミドおよびCas9ニッカーゼプラスミドはいずれも、非営利プラスミド配布サービスAddgene(addgene.org/crispr−cas)から入手可能である。
単一コピーの組み込まれたEGFP−PEST遺伝子レポーターを保有するU2OS.EGFP細胞については既に記載されている(Reyonら,2012)。この細胞を10%FBS、2mM GlutaMax(Life Technologies)、ペニシリン/ストレプトマイシンおよび400μg/ml G418を添加したAdvanced DMEM(Life Technologies)で維持した。EGFP発現の崩壊をアッセイするため、LONZA 4D−Nucleofector(商標)にSE溶液およびDN100プログラムを製造業者の説明書に従って用い、2×105個のU2OS.EGFP細胞にgRNA発現プラスミドまたは陰性対照の空のU6プロモータープラスミド、Cas9発現プラスミド(pJDS246)(実施例1およびFuら,2013)およびtd−トマト発現プラスミド(トランスフェクション効率の対照)10ngを二重反復でトランスフェクトした。本発明者らは、EGFP部位#1、#2、#3および#4の実験にgRNA発現プラスミド/Cas9発現プラスミドをそれぞれ25ng/250ng、250ng/750ng、200ng/750ngおよび250ng/750ng用いた。トランスフェクションの2日後、細胞をトリプシンで処理し、10%(vol/vol)ウシ胎仔血清(FBS)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Invitrogen)に再懸濁させ、BD LSRIIフローサイトメータで解析した。各試料について、トランスフェクションおよびフローサイトメトリー測定を二重反復で実施した。
内在ヒト遺伝子を標的とするRGNによって誘発されるオンターゲットおよびオフターゲット挿入欠失変異を評価するため、以下の条件を用いてU2OS.EGFP細胞またはHEK293細胞にプラスミドをトランスフェクトした:U2OS.EGFP細胞は上記のEGFP崩壊アッセイと同じ条件を用いてトランスフェクトした。HEK293細胞は、37℃のCO2インキュベーター中、10%FBSおよび2mM GlutaMax(Life Technologies)を添加したAdvanced DMEM(Life Technologies)を入れた24ウェルプレートに1ウェル当たり1.65×105細胞の密度で播種することによってトランスフェクトした。22〜24時間インキュベートした後、Lipofectamine LTX試薬を製造業者の説明書(Life Technologies)に従って用い、細胞にgRNA発現プラスミドまたは空のU6プロモータープラスミド(陰性対照)125ng、Cas9発現プラスミド(pJDS246)(実施例1およびFuら,2013)375ngおよびtd−トマト発現プラスミド10ngをトランスフェクトした。トランスフェクションの16時間後に培地を交換した。両細胞型とも、トランスフェクションの2日後にAgencourt DNAdvanceゲノムDNA単離キット(Beckman)を製造業者の説明書に従って用い、ゲノムDNAを回収した。アッセイする各RGN試料には、12回の個別の4Dトランスフェクション反復を実施し、この12回のトランスフェクションからそれぞれゲノムDNAを単離した後、これらの試料を合わせて、それぞれが6つのプールしたゲノムDNA試料からなる「二重反復」プールを2つ作製した。次いで、以下に記載するT7EIアッセイ、サンガーシーケンシングおよび/またはディープシーケンシングによって、上記二重反復試料のオンターゲットおよびオフターゲット部位における挿入欠失変異を評価した。
T7EIを既に記載されている通りに実施した(実施例1およびFuら,2013)。簡潔に述べれば、Phusion高忠実度DNAポリメラーゼ(New England Biolabs)に以下のプログラムのうちの一方:(1)タッチダウンPCRプログラム[(98℃、10秒;72〜62℃、−1℃/サイクル、15秒;72℃、30秒)×10サイクル、(98℃、10秒;62℃、15秒;72℃、30秒)×25サイクル]または(2)定常Tm PCRプログラム[(98℃、10秒;68℃または72℃、15秒;72℃、30秒)×35サイクル]を必要に応じて3%DMSOまたは1Mベタインとともに用いて、特異的オンターゲットまたはオフターゲット部位を増幅するPCR反応を実施した。上記の増幅に使用した全プライマーを表Eに列記する。得られたPCR産物は大きさが300〜800bpであり、これを製造業者の説明書に従ってAmpure XPビーズ(Agencourt)により精製した。精製したPCR産物200ngを総体積19μの1×NEB緩衝液2中でハイブリダイズさせ、以下の条件を用いて変性させてヘテロ二本鎖を形成させた:95℃、5分;95〜85℃、−2℃/秒;85〜25℃、−0.1℃/秒;4℃で保持。ハイブリダイズしたPCR産物にT7エンドヌクレアーゼI(New England Biolabs、10単位/μl)を1μl加え、37℃で15分間インキュベートした。0.25M EDTA溶液2μlを加えることによりT7EI反応を停止させ、AMPure XPビーズ(Agencourt)を用いて0.1×EB緩衝液(QIAgen)20μlで溶離させることにより反応生成物を精製した。次いで、QIAXCELキャピラリー電気泳動系で反応生成物を分析し、既に記載されているもの(Reyonら,2012)と同じ式を用いて挿入欠失変異の頻度を計算した。
T7EIアッセイに使用した精製PCR産物をZero Blunt TOPOベクター(Life Technologies)内に連結し、化学的コンピテントTop10細菌細胞中に形質転換した。プラスミドDNAを単離し、マサチューセッツ総合病院(MGH)DNA Automation CoreにM13順方向プライマー(5’−GTAAAACGACGGCCAG−3’)(配列番号1059)を用いて配列決定した。
Phusion高忠実度DNAポリメラーゼ(New England Biolabs)を用いて特異的オンターゲット部位のPCR反応を実施した。タッチダウンPCRプログラム((98℃、10秒;72〜62℃、−1℃/サイクル、15秒;72℃、30秒)×10サイクル、(98℃、10秒;62℃、15秒;72℃、30秒)×25サイクル)を3%DMSOとともに用いてVEGFおよびEMX1遺伝子座を増幅した。これらのPCR反応に用いたプライマーを表Eに列記する。製造業者の説明書に従ってAmpureビーズ(Agencourt)によりPCR産物を精製した。ssODNドナー鋳型によってコードされるBamHI制限部位の検出には、精製PCR産物200ngを37℃で45分間、BamHIにより消化した。Ampure XPビーズ(Agencourt)を用いて20μl 0.1×EB緩衝液で溶離させることにより消化産物を精製し、QIAXCELキャピラリー電気泳動系を用いて分析および定量化した。
遺伝子座特異的プライマーをオンターゲット部位および候補となる検証済みのオフターゲット部位に隣接するように設計して、長さ約300bp〜400bpのPCR産物を作製した。上記のプールした二重反復試料のゲノムDNAをPCRの鋳型として用いた。全PCR産物を製造業者の説明書に従ってAmpure XPビーズ(Agencourt)により精製した。精製PCR産物をQIAXCELキャピラリー電気泳動系で定量化した。プールした二重反復試料(上記)それぞれから各遺伝子座のPCR産物を増幅、精製、定量化した後、ディープシーケンシング用に等量ずつプールした。プールしたアンプリコンを既に記載されている通り(Fisherら,2011)にデュアルインデックスIllumina TruSeqアダプターと連結した。アダプター連結後、ライブラリーを精製し、QIAXCELキャピラリー電気泳動系で泳動させて大きさの変化を確認した。アダプター連結ライブラリーをqPCRにより定量化した後、Illumina MiSeq 250bpペアエンドリードを用いて、配列決定をダナ・ファーバー癌研究所分子生物学コア施設によって実施した。本発明者らは、各試料について75,000〜1,270,000(平均約422,000)のリードを解析した。既に記載されている通り(Sanderら,2013)にTruSeqリードの挿入欠失変異誘発率を解析した。特異性の比をディープシーケンシングによって決定されるオンターゲット遺伝子座に観察された変異誘発の、特定のオフターゲット遺伝子座に観察された変異誘発との比として計算した。tru−RGNの個々のオフターゲット部位に対する特異性の改善倍数を、マッチする完全長gRNAを用いた同じ標的の特異性の比に対するtru−gRNAを用いて観察された特異性の比として計算した。本文で言及されるように、一部のオフターゲット部位についてはtru−gRNAによる挿入欠失変異は観察されなかった。これらの場合、本発明者らは、ポアソン計算器を用いて、変異配列の実際の数の上限値が3になるよう95%の信頼度で計算した。本発明者らは次いで、この上限値を用いて、上記オフターゲット部位の特異性の最小改善倍数を推定した。
5’末端で短縮したgRNAがその完全長対応物と同程度の効率で機能するのではないかとする仮説を検証するため、最初に、以下の配列:5’−GGCGAGGGCGATGCCACCTAcGG−3’(配列番号2241)を有するEGFPレポーター遺伝子の単一の標的部位に対して、徐々に短くなる一連のgRNAを上記の通りに構築した。この特定のEGFP部位を選択したのは、それぞれが5’末端にG(これらの実験に使用するU6プロモーターから効率的に発現させるのに必要である)を有する15nt、17nt、19ntおよび20ntの相補性のgRNAをこの部位に対して作製することが可能であったからである。組み込まれて構成的に発現する単一の高感度緑色蛍光タンパク質(EGFP)遺伝子の崩壊を評価することによってRGN誘発挿入欠失の頻度を定量化することが可能なヒト細胞ベースのレポーターアッセイ(実施例1およびFuら,2013;Reyonら,2012)(図2B)を用いて、上記の長さを変えたgRNAが標的部位にCas9誘発挿入欠失を誘導する能力を測定した。
tru−RGNがオンターゲットゲノム編集変化を誘発するよう効率的に機能し得ることが確認されたため、これらのヌクレアーゼがgRNA/DNA接合部のミスマッチに対して高い感度を示すかどうかを試験した。これを評価するため、既にEGFP部位#1、#2および#3で試験したtru−gRNA(図3Aの上方)の体系的な一連の変異体を構築した。この変異体gRNAは相補性領域内の各位置(U6プロモーターからの発現に必要な5’Gは除く)に単一のワトソン−クリック置換を保有する(図5A)。ヒト細胞ベースのEGFP崩壊アッセイを用いて、実施例1に記載されているものと同じ3つの部位に対して作製したこれらの変異体tru−gRNAおよび対応する類似した一連の変異体完全長gRNAがCas9仲介性挿入欠失を誘導する相対的能力を評価した。その結果から、3つのEGFP標的部位ではいずれも、tru−RGNの方が全般的に、対応する完全長gRNAを保有する標準的なRGNよりも単一ミスマッチに対して高い感度を示すことがわかる(図5Aの上下のパネルを比較されたい)。感度の強さは部位によって異なり、tru−gRNAが17ntの相補性を有する部位#2および#3に最も大きな差がみられた。
tru−RGNが完全長gRNA対応物を保有する標準的なRGNに比してヒト細胞におけるゲノムオフターゲット効果の低減を示すかどうかを明らかにするべく次の実験を実施した。それまでの研究(実施例1およびFuら,2013;Hsuら,2013を参照されたい)でVEGFA部位1、VEGFA部位3およびEMX1部位1(図3Bの上方に記載されている)を標的とする完全長gRNAについて13か所の真のオフターゲット部位が明らかにされていたため、本発明者らはこれらの部位を標的とする対応する完全長gRNAおよびtru−gRNAを検討した。(VEGFA部位2にはU6プロモーターからgRNAが効率的に発現するのに必要な相補性領域の位置17にも位置18にもGがないため、本発明者らの初期の研究6からこの標的配列に対するtru−gRNAを試験することはできなかった。)特筆すべきことに、T7EIアッセイによって判定したところ、これらの真のオフターゲット部位13か所すべてにおいて、tru−RGNが対応する標準的なRGNに比してヒトU2OS.EGFP細胞における変異誘発活性が大幅に低減されていることがわかり(表3A);13か所のオフターゲット部位のうち11か所では、tru−RGNによる変異の頻度がT7EIアッセイの信頼できる検出限界(2〜5%)未満に低下した(表3A)。これらの標準的なRGNとtru−RGNの対応する対を別のヒト細胞系(FT−HEK293細胞)の同じ13か所のオフターゲット部位で試験したところ、ほぼ同じ結果が観察された(表3A)。
近年記載された挿入欠失変異を誘発するための二重Cas9ニッカーゼ法を用いてtru−gRNAを試験した。この試験を実施するため、Cas9−D10Aニッカーゼを、ヒトVEGFA遺伝子の部位(VEGFA部位1および本発明者らがVEGFA部位4と呼ぶ追加の配列)を標的とする2種類の完全長gRNAとともにU2OS.EGFP細胞で共発現させた(図4A)。既に記載されているように(Ranら,2013)、このニッカーゼのペアは協働して機能して、VEGFA標的遺伝子座に高率で挿入欠失変異を誘発した(図4B)。興味深いことに、VEGFA部位4を標的とするgRNAとのみ共発現させたCas9−D10Aニッカーゼでも、ペアの完全長gRNAで観察された変異率よりいくぶん低いものの、高率で挿入欠失変異が誘発された(図4B)。重要なことに、VEGFA部位1に完全長gRNAの代わりにtru−gRNAを使用しても、二重ニッカーゼ法が挿入欠失変異を誘発する効果に影響を及ぼさなかった(図4B)。
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ここまで本発明をその詳細な説明と関連させて記載してきたが、上記説明は例示を目的とするものであり、添付の「特許請求の範囲」の範囲によって定められる本発明の範囲を限定するものではないことを理解するべきである。その他の態様、利点および改変は以下の特許請求の範囲内にある。
本発明は、以下の態様を包含し得る。
[1]
細胞におけるRNA誘導型ゲノム編集の特異性を増大させる方法であって、前記細胞と、選択される標的ゲノム配列の相補鎖の連続する17〜18ヌクレオチドに相補的な17〜18ヌクレオチドからなる相補性領域を含むガイドRNAとを接触させることを含む、方法。
[2]
細胞内の二本鎖DNA分子の標的領域に切断を誘発する方法であって、
Cas9ヌクレアーゼまたはCas9ニッカーゼと、
二本鎖DNA分子の相補鎖の連続する17〜18ヌクレオチドに相補的な17〜18ヌクレオチドからなる相補性領域を含むガイドRNAと
を前記細胞内で発現させるか、前記細胞内に導入することを含む、方法。
[3]
細胞内の二本鎖DNA分子の標的領域を修飾する方法であって、
dCas9−異種機能ドメイン融合タンパク質(dCas9−HFD)と、
選択される標的ゲノム配列の相補鎖の連続する17〜18ヌクレオチドに相補的な17〜18ヌクレオチドからなる相補性領域を含むガイドRNAと
を前記細胞内で発現させるか、前記細胞内に導入することを含む、方法。
[4]
前記ガイドRNAが、
(i)選択される標的ゲノム配列の相補鎖の連続する17〜18ヌクレオチドに相補的な17〜18ヌクレオチドからなる相補性領域を含む単一ガイドRNAまたは
(ii)選択される標的ゲノム配列の相補鎖の連続する17〜18ヌクレオチドに相補的な17〜18ヌクレオチドからなる相補性領域を含むcrRNA、およびtracrRNA
である、上記[1]〜[3]のいずれか一項に記載の方法。
[5]
前記ガイドRNAが、
(X 17〜18 またはX 17〜19 )GUUUUAGAGCUA(配列番号2404);
(X 17〜18 またはX 17〜19 )GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(配列番号2407);または
(X 17〜18 またはX 17〜19 )GUUUUAGAGCUAUGCU(配列番号2408);
(X 17〜18 )GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG(X N )(配列番号1)、
(X 17〜18 )GUUUUAGAGCUAUGCUGAAAAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(X N )(配列番号2)、
(X 17〜18 )GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUGGAAACAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(X N )(配列番号3)、
(X 17〜18 )GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(X N )(配列番号4)、
(X 17〜18 )GUUUAAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号5);
(X 17〜18 )GUUUUAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号6);または
(X 17〜18 )GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号7)
からなる群より選択されるリボ核酸であるか、これを含み、
X 17〜18 が、選択される標的配列、好ましくはプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の5’側に隣接する標的配列の相補鎖の連続する17〜18ヌクレオチドに相補的な相補性領域であり、X N が、前記リボ核酸とCas9との結合に干渉しない任意の配列であり、Nが0〜200、例えば、0〜100、0〜50または0〜20であり得る、
上記[1]〜[3]のいずれか一項に記載の方法。
[6]
17〜18ヌクレオチドの標的相補性領域を有する、ガイドRNA分子。
[7]
前記標的相補性領域が17〜18ヌクレオチドからなる、上記[6]に記載のgRNA。
[8]
前記標的相補性領域が17〜18ヌクレオチドの標的相補性からなる、上記[6]に記載のgRNA。
[9]
以下の配列
(X 17〜18 またはX 17〜19 )GUUUUAGAGCUA(配列番号2404);
(X 17〜18 またはX 17〜19 )GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(配列番号2407);または
(X 17〜18 またはX 17〜19 )GUUUUAGAGCUAUGCU(配列番号2408);
(X 17〜18 )GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG(X N )(配列番号1)、
(X 17〜18 )GUUUUAGAGCUAUGCUGAAAAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(X N )(配列番号2)、
(X 17〜18 )GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUGGAAACAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(X N )(配列番号3)、
(X 17〜18 )GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(X N )(配列番号4)、
(X 17〜18 )GUUUAAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号5);
(X 17〜18 )GUUUUAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号6);または
(X 17〜18 )GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号7)
からなり、
X 17〜18 が、選択される標的配列、好ましくはプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の5’側に隣接する標的配列の相補鎖の連続する17〜18ヌクレオチドに相補的な配列であり、X N が、前記リボ核酸とCas9との結合に干渉しない任意の配列であり、Nが0〜200、例えば、0〜100、0〜50または0〜20であり得る、
上記[6]に記載のgRNA。
[10]
前記リボ核酸が、前記分子の3’末端に1つまたは複数のUを含む、上記[5]に記載の方法または上記[6]に記載のリボ核酸。
[11]
前記リボ核酸が、前記RNA分子の5’末端に前記標的配列に相補的ではない1つまたは複数の追加のヌクレオチドを含む、上記[5]に記載の方法または上記[6]に記載のリボ核酸。
[12]
前記リボ核酸が、前記RNA分子の5’末端に前記標的配列に相補的ではない1つ、2つまたは3つの追加のヌクレオチドを含む、上記[5]に記載の方法または上記[6]に記載のリボ核酸。
[13]
前記相補性領域が、選択される標的配列の相補鎖の連続する17ヌクレオチドに相補的である、上記[1]〜[5]のいずれか一項に記載の方法または上記[6]〜[12]のいずれか一項に記載のリボ核酸。
[14]
前記相補性領域が、選択される標的配列の相補鎖の連続する18ヌクレオチドに相補的である、上記[1]〜[5]のいずれか一項に記載の方法または上記[6]〜[12]のいずれか一項に記載のリボ核酸。
[15]
上記[6]〜[14]のいずれか一項に記載のリボ核酸をコードする、DNA分子。
[16]
上記[15]に記載のDNA分子を含む、ベクター。
[17]
上記[16]に記載のベクターを発現する、宿主細胞。
[18]
前記標的領域が標的ゲノム配列内にある、上記[1]〜[5]のいずれか一項に記載の方法または上記[6]〜[12]のいずれか一項に記載のリボ核酸。
[19]
前記標的ゲノム配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の5’側に隣接する、上記[1]〜[5]のいずれか一項に記載の方法または上記[6]〜[12]のいずれか一項に記載のリボ核酸。
[20]
前記tracrRNAが、以下の配列
GGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号8)もしくはその活性部分;
UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号2405)もしくはその活性部分;
AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号2407)もしくはその活性部分;
CAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号2409)もしくはその活性部分;
UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG(配列番号2410)もしくはその活性部分;
UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCA(配列番号2411)もしくはその活性部分;または
UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG(配列番号2412)もしくはその活性部分
からなる、上記[4]に記載の方法。
[21]
前記cRNAが(X 17〜18 またはX 17〜19 )GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(配列番号2407)であり、前記tracrRNAがGGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号8)であるか;前記cRNAが(X 17〜18 またはX 17〜19 )GUUUUAGAGCUA(配列番号2404)であり、前記tracrRNAがUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号2405)であるか;または前記cRNAが(X 17〜18 またはX 17〜19 )GUUUUAGAGCUAUGCU(配列番号2408)であり、前記tracrRNAがAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号2406)である、上記[4]に記載の方法。
[22]
前記dCas9−異種機能ドメイン融合タンパク質(dCas9−HFD)が、遺伝子発現、ヒストンまたはDNAを修飾するHFDを含む、上記[3]に記載の方法。
[23]
前記異種機能ドメインが、転写活性化ドメイン、DNA脱メチル化を触媒する酵素、ヒストン修飾を触媒する酵素、または転写サイレンシングドメインである、上記[22]に記載の方法。
[24]
前記転写活性化ドメインが、VP64またはNF−κB p65由来のものである、上記[23]に記載の方法。
[25]
前記ヒストン修飾を触媒する酵素が、LSD1、ヒストンメチルトランスフェラーゼ(HNMT)、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT)、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)またはヒストンデメチラーゼである、上記[23]に記載の方法。
[26]
前記転写サイレンシングドメインが、ヘテロクロマチンタンパク質1(HP1)、例えばHP1αまたはHP1β由来のものである、上記[23]に記載の方法。
[27]
前記選択される標的ゲノム配列に挿入欠失変異または配列変化を生じさせる、上記[1]〜[5]のいずれかに記載の方法。
[28]
前記細胞が真核細胞である、上記[1]〜[5]のいずれかに記載の方法。
[29]
前記細胞が哺乳動物細胞である、上記[28]に記載の方法。
Claims (17)
- 細胞におけるStreptococcus pyogenes CRISPR/Cas9(Cas9)RNA誘導型ゲノム編集の特異性を増大させるex vivo方法であって、前記細胞と、選択される標的ゲノム配列の相補鎖の連続する17〜18ヌクレオチドに相補的な17〜18ヌクレオチドからなる相補性領域をその5’末端において含む短縮Cas9ガイドRNA(gRNA)とを接触させることを含み、前記標的配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の5’側に隣接し、
前記短縮Cas9 gRNAは、
(i)二本鎖DNA分子上の前記選択される標的ゲノム配列の相補鎖の連続する17〜18ヌクレオチドに相補的な17〜18ヌクレオチドからなる相補性領域をその5’末端において含む単一ガイドRNA、または
(ii)前記選択される標的ゲノム配列の相補鎖の連続する17〜18ヌクレオチドに相補的な17〜18ヌクレオチドからなる相補性領域をその5’末端において含むcrRNA、および、tracrRNA
であり、
S.pyogenes Cas9ゲノム編集酵素の存在下で、前記ガイドRNA相補性領域は、Cas9ゲノム編集酵素に結合し、これを標的ゲノム配列に誘導し、
それによって細胞におけるRNA誘導型ゲノム編集の特異性を増大させる、方法。 - 細胞内の二本鎖DNA分子の標的領域に切断を誘発するex vivo方法であって、
S.pyogenes CRISPR/Cas9ヌクレアーゼまたはS.pyogenes CRISPR/Cas9ニッカーゼと、
選択される標的ゲノム配列の相補鎖の連続する17〜18ヌクレオチドに相補的な17〜18ヌクレオチドからなる相補性領域をその5’末端において含む短縮Cas9 gRNAと
を前記細胞内で発現させるか、前記細胞内に導入することを含み、前記標的領域の標的配列は、PAMの5’側に隣接し、
前記ガイドRNA相補性領域は、前記Cas9ヌクレアーゼまたはニッカーゼに結合し、これを二本鎖DNA分子の標的領域配列に誘導し、
前記短縮Cas9 gRNAは、
(i)二本鎖DNA分子上の選択される標的ゲノム配列の相補鎖の連続する17〜18ヌクレオチドに相補的な17〜18ヌクレオチドからなる相補性領域をその5’末端において含む単一ガイドRNA、または
(ii)選択される標的ゲノム配列の相補鎖の連続する17〜18ヌクレオチドに相補的な17〜18ヌクレオチドからなる相補性領域をその5’末端において含むcrRNA、および、tracrRNA
であり、
それによって細胞内の二本鎖DNA分子の標的領域に切断を誘発する、方法。 - 細胞内の二本鎖DNA分子の標的領域を修飾するex vivo方法であって、
触媒能不活性化Cas9ヌクレアーゼ(dCas9)−異種機能ドメイン融合タンパク質(dCas9−HFD)であって、前記HFDは、遺伝子発現、ヒストンまたはDNAを修飾するHFD;転写活性化ドメイン;DNA脱メチル化を触媒する酵素;ヒストン修飾を触媒する酵素;および転写サイレンシングドメインからなる群から選択される、dCas9−HFDと、
二本鎖DNA分子上に存在する選択される標的ゲノム配列の相補鎖の連続する17〜18ヌクレオチドに相補的な17〜18ヌクレオチドからなる相補性領域を含む短縮Cas9 gRNAと
を前記細胞内で発現させるか、前記細胞内に導入することを含み、前記選択される標的配列は、PAMの5’側に隣接し、
前記短縮Cas9 gRNAは、
(i)二本鎖DNA分子上の選択される標的ゲノム配列の相補鎖の連続する17〜18ヌクレオチドに相補的な17〜18ヌクレオチドからなる相補性領域をその5’末端において含む単一ガイドRNA、または
(ii)選択される標的ゲノム配列の相補鎖の連続する17〜18ヌクレオチドに相補的な17〜18ヌクレオチドからなる相補性領域をその5’末端において含むcrRNA、および、tracrRNA
であり、
前記ガイドRNA相補性領域は、前記dCas9−HFDに結合し、これを前記二本鎖DNA分子の標的領域に誘導し、
それによって細胞内の二本鎖DNA分子の標的領域を修飾する、方法。 - 前記短縮Cas9ガイドRNAが、(i)選択される標的ゲノム配列の相補鎖の連続する17〜18ヌクレオチドに相補的な17〜18ヌクレオチドからなる相補性領域をその5’末端において含む単一ガイドRNAである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記短縮Cas9 gRNAが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号2404、配列番号2407および配列番号2408からなる群から選択されるリボ核酸を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記相補性領域が、選択される標的ゲノム配列の相補鎖の連続する17ヌクレオチドに相補的である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記相補性領域が、選択される標的ゲノム配列の相補鎖の連続する18ヌクレオチドに相補的である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的領域が標的ゲノム配列内にある、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記転写活性化ドメインが、VP64またはNF−κB p65由来のものである、請求項3に記載の方法。
- 前記ヒストン修飾を触媒する酵素が、LSD1、ヒストンメチルトランスフェラーゼ(HNMT)、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT)、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)またはヒストンデメチラーゼである、請求項3に記載の方法。
- 前記転写サイレンシングドメインが、ヘテロクロマチンタンパク質1α(HP1α)またはHP1βである、請求項3に記載の方法。
- 前記選択される標的ゲノム配列に挿入欠失変異または配列変化を生じさせる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が真核細胞である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項13に記載の方法。
- crRNAが配列番号2407であり、tracrRNAが配列番号8であるか;
crRNAが配列番号2404であり、tracrRNAが配列番号2405であるか;または
mRNAが配列番号2408であり、tracrRNAが配列番号2406である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。 - 前記tracrRNAが、配列番号8、配列番号2405、配列番号2406、配列番号2409、配列番号2410、配列番号2411および配列番号2412からなる群から選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記異種機能ドメインが、転写活性化ドメイン、DNA脱メチル化を触媒する酵素、ヒストン修飾を触媒する酵素、または転写サイレンシングドメインである、請求項3に記載の方法。
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