JP2024518793A - 向上した安定性を有するｃａｓ９エフェクタータンパク質 - Google Patents

Abstract

向上した安定性を有するＣａｓ９エフェクタータンパク質が提供される。Ｃａｓ９エフェクタータンパク質の実施形態は、Ｎ末端に結合した第１の核局在化シグナルと、Ｃ末端に結合した第２の核局在化シグナルとを有する。向上した安定性を有するＣａｓ９エフェクタータンパク質と、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質と複合体を形成するガイドポリヌクレオチドと、を含むＣａｓ９系も提供される。更に、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質を用いた、真核細胞中の標的配列の部位特異的改変を提供する方法が提供される。

Description

本開示は、向上した安定性を有するＣａｓ９エフェクタータンパク質を提供する。Ｃａｓ９エフェクタータンパク質の実施形態は、Ｎ末端に結合した第１の核局在化シグナルと、Ｃ末端に結合した第２の核局在化シグナルとを有する。本開示はまた、そのような９エフェクタータンパク質と、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質と複合体を形成するガイドポリヌクレオチドと、を含むＣａｓ９系を提供する。本開示は更に、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質を用いた、真核細胞中の標的配列の部位特異的改変を提供する方法を提供する。

ＣＲＩＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集技術の使用は、バイオテクノロジーに革命をもたらした。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集系は、野生型Ｃａｓ９タンパク質を使用してＤＮＡにおける二本鎖切断（ＤＳＢ）形成を誘導するため、又はＣａｓ９ｎ／Ｃａｓ９ Ｄ１０Ａと称される突然変異タンパク質を使用して単一ＤＮＡ鎖をニッキングするための両方で広範な生物及び細胞系においてうまく使用されている（例えば、非特許文献１及び非特許文献２を参照、それらの各々は参照により全体として本明細書に組み込まれる）。ＤＳＢ形成が遺伝子機能を破壊し得る小さい挿入及び欠失（インデル）の作出をもたらす一方、Ｃａｓ９ｎ／Ｃａｓ９ Ｄ１０Ａニッカーゼは、内因性相同組換え機構を刺激しながらインデル作出を回避する（非相同末端結合を介する修復の結果）。したがって、Ｃａｓ９ｎ／Ｃａｓ９ Ｄ１０Ａニッカーゼを使用してＤＮＡ領域をゲノム中に高いフィデリティで挿入することができる。

ゲノム編集に加え、ＣＲＩＳＰＲ系は、複数の他の用途、例として、とりわけ調節遺伝子発現、遺伝子回路構築、及び機能的ゲノミクスを有する（非特許文献２に概説）。

Ｃａｓ９タンパク質は、様々なｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏ用途で有効であることが示されているが、タンパク質としては、特に細胞環境において潜在的に分解されやすい。

Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３９（６１２１）：８２３－８２６（２０１３） Ｓａｎｄｅｒ ａｎｄ Ｊｏｕｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２（４）：３４７－３５５（２０１４）

本開示は、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質であって：ａ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＮ末端に結合した第１の核局在化シグナルと；ｂ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＣ末端に結合した第２の核局在化シグナルと；を含む、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質に関する。

タンパク質のいくつかの実施形態では、第１の核局在化シグナルは、単節型核局在化シグナルである。いくつかの実施形態では、第１の核局在化シグナルは、双節型核局在化シグナルである。いくつかの実施形態では、第２の核局在化シグナルは、単節型核局在化シグナルである。いくつかの実施形態では、第２の核局在化シグナルは、双節型核局在化シグナルである。いくつかの実施形態では、第１の核局在化シグナルは、双節型核局在化シグナルであり、第２の核局在化シグナルは、単節型核局在化シグナルである。

いくつかの実施形態では、単節型核局在化シグナルは、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ヌクレオプラスミン、ＥＧＬ－１３、ｃ－Ｍｙｃ、ＴＵＳタンパク質の核局在化シグナル、又はこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、双節型核局在化シグナルは、古典的双節型核局在化シグナルである。いくつかの実施形態では、第１の核局在化シグナルは、古典的双節型核局在化シグナルであり、第２の核局在化シグナルは、ＳＶ４０ラージＴ抗原の核局在化シグナルである。

タンパク質のいくつかの実施形態では、第１の核局在化シグナルは、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質に直接結合している。いくつかの実施形態では、第１の核局在化シグナルは、リンカーを介してＣａｓ９エフェクタータンパク質に結合している。いくつかの実施形態では、第２の核局在化シグナルは、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質に直接結合している。いくつかの実施形態では、第２の核局在化シグナルは、リンカーを介してＣａｓ９エフェクタータンパク質に結合している。いくつかの実施形態では、リンカーは、２～３０個の残基を有するペプチドリンカーである。

いくつかの実施形態では、タンパク質は、第１の核局在化シグナルの２つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、第１の核局在化シグナルの３つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、第２の核局在化シグナルの２つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、第２の核局在化シグナルの３つのコピーを含む。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、ＩＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ系を有する細菌種に由来する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号１０～９７のいずれか１つに対して少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、１Ｅ－５のＥ値カットオフを有するＴＩＧＲ０３０３１タンパク質ファミリーにマッチするドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号９８と少なくとも９０％同一のポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号９８の改変ポリペプチドを含み、ここで１つ以上の改変は、Ｎ１１６４Ｒ、Ｎ１２６５Ｒ、Ｎ１３００Ｒ、Ｎ１４１２Ｒ、Ｎ３４７Ｒ、Ｎ６５１Ａ、Ｄ１２６６Ｒ、Ｄ３０９Ｒ、Ｄ３４５Ｒ、Ｄ４８７Ｒ、Ｄ６０７Ｒ、Ｑ１１２９Ｒ、Ｑ１３８１Ａ、Ｑ１３８１Ａ、Ｑ１３８１Ｒ、Ｑ６６１Ａ、Ｑ７１３Ｒ、Ｑ７３４Ｒ、Ｅ１０３２Ｇ、Ｅ１０３２Ｒ、Ｅ１４０９Ａ、Ｅ４３６Ｒ、Ｅ６１１Ｒ、Ｅ６９１Ｒ、Ｅ６９７Ｒ、Ｇ１３３５Ｒ、Ｌ１２５Ｒ、Ｌ１２６４Ｓ、Ｌ１２９９Ｓ、Ｋ１０３１Ｒ、Ｋ４９０Ｒ、Ｋ６１５Ｒ、Ｋ６５６Ｒ、Ｆ６３６Ｒ、Ｓ１３３４Ａ、Ｓ１３３４Ａ、Ｓ１３３４Ｒ、Ｓ１３８０Ｒ、Ｓ１４１０Ｒ、Ｓ１４１３Ｒ、Ｓ６３４Ｒ、Ｓ６３８Ｒ、Ｓ７１１Ｒ、Ｓ１００６Ｒ、Ｓ１０１７Ｒ、Ｔ１２６７Ａ、Ｔ１２６７Ｒ、Ｔ５５１Ｒ、Ｙ１３３８Ａ、Ｙ１３３８Ｒ、Ｖ１２７３Ｓ、Ｖ１２７４Ｓ、Ｖ４８６Ｒ、Ｖ６４４Ｒ、Ｖ７３６Ｒ、及びＶ７３６Ｙから選択される。

本開示は、また、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であって：ａ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質であって：ｉ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＮ末端に結合した第１の核局在化シグナルと；ｉｉ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＣ末端に結合した第２の核局在化シグナルと；を含む、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質と、ｂ）ガイド配列を含み、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質と複合体を形成するガイドポリヌクレオチドであって、ガイド配列が、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズすることができる、ガイドポリヌクレオチドと、を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に関する。

本開示は、更に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であって：ａ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質であって：ｉ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＮ末端に結合した第１の核局在化シグナルと；ｉｉ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＣ末端に結合した第２の核局在化シグナルと；を含む、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質をコードする核酸配列と、ｂ）ガイド配列を含み、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質と複合体を形成するガイドポリヌクレオチドをコードする核酸配列であって、ガイド配列が、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズすることができる、核酸配列と、を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に関する。

系のいくつかの実施形態では、（ａ）及び（ｂ）のヌクレオチド配列は、真核生物プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、（ａ）及び（ｂ）の核酸配列は、単一のベクター中にある。

本開示は、更に、１つ以上のベクターを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であって：ａ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質であって：ｉ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＮ末端に結合した第１の核局在化シグナルと；ｉｉ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＣ末端に結合した第２の核局在化シグナルと；を含む、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質をコードする１つ以上のヌクレオチド配列に操作可能に連結された調節エレメントと、ｂ）ガイド配列を含み、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質と複合体を形成するガイドポリヌクレオチドであって、ガイド配列が、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズすることができる、ガイドポリヌクレオチドと、を含む１つ以上のベクターを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に関する。

系のいくつかの実施形態では、調節エレメントは、真核生物調節エレメントである。

系のいくつかの実施形態では、第１の核局在化シグナルは、単節型核局在化シグナルである。いくつかの実施形態では、第１の核局在化シグナルは、双節型核局在化シグナルである。いくつかの実施形態では、第２の核局在化シグナルは、単節型核局在化シグナルである。いくつかの実施形態では、第２の核局在化シグナルは、双節型核局在化シグナルである。いくつかの実施形態では、第１の核局在化シグナルは、双節型核局在化シグナルであり、第２の核局在化シグナルは、単節型核局在化シグナルである。いくつかの実施形態では、第１の核局在化シグナル及び第２の核局在化シグナルは、各々双節型核局在化シグナルである。

いくつかの実施形態では、単節型核局在化シグナルは、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ヌクレオプラスミン、ＥＧＬ－１３、ｃ－Ｍｙｃ、ＴＵＳタンパク質の核局在化シグナル、又はこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、双節型核局在化シグナルは、古典的双節型核局在化シグナルである。いくつかの実施形態では、第１の核局在化シグナルは、古典的双節型核局在化シグナルであり、第２の核局在化シグナルは、ＳＶ４０ラージＴ抗原の核局在化シグナルである。

系のいくつかの実施形態では、第１の核局在化シグナルは、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質に直接結合している。いくつかの実施形態では、第１の核局在化シグナルは、リンカーを介してＣａｓ９エフェクタータンパク質に結合している。いくつかの実施形態では、第２の核局在化シグナルは、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質に直接結合している。いくつかの実施形態では、第２の核局在化シグナルは、リンカーを介してＣａｓ９エフェクタータンパク質に結合している。いくつかの実施形態では、リンカーは、２～３０個の残基を有するペプチドリンカーである。

系のいくつかの実施形態では、タンパク質は、第１の核局在化シグナルの２つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、第１の核局在化シグナルの３つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、第２の核局在化シグナルの２つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、第２の核局在化シグナルの３つのコピーを含む。

系のいくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、ＩＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ系を有する細菌種に由来する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号１０～９７のいずれか１つに対して少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、１Ｅ－５のＥ値カットオフを有するＴＩＧＲ０３０３１タンパク質ファミリーにマッチするドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号９８と少なくとも９０％同一のポリペプチド配列を含む。

系のいくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、１９～３０塩基長である。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、１９～２５塩基長である。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、２１～２６塩基長である。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を更に含む。

系のいくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、粘着末端を生成する。いくつかの実施形態では、粘着末端は、１～１０ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、粘着末端は、２～６ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、粘着末端は、３～５ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む。

本開示は、上記で記載されるタンパク質を含む真核細胞を提供する。本開示は更に、上記で記載される系を含む真核細胞を提供する。

本開示は、上記で記載されるタンパク質を含む送達粒子を提供する。本開示は更に、系を含む送達粒子を提供する。送達粒子のいくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質及びガイドポリヌクレオチドは、複合体中に存在する。いくつかの実施形態では、複合体は、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むポリヌクレオチドを更に含む。いくつかの実施形態では、送達粒子は、脂質、糖、金属、又はタンパク質を更に含む。

本開示は、上記で記載されるタンパク質を含むベシクルを提供する。本開示は更に、上記で記載される系を含むベシクルを提供する。ベシクルのいくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質及びガイドポリヌクレオチドは、複合体中に存在する。いくつかの実施形態では、ベシクルは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むポリヌクレオチドを更に含む。いくつかの実施形態では、ベシクルは、エキソソーム又はリポソームである。

本開示は、上記で記載されるタンパク質を含むウイルスベクターを提供する。本開示は更に、上記で記載される系を含むウイルスベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列をコードする核酸配列を更に含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルス粒子、アデノ随伴ウイルス粒子、又は単純ヘルペスウイルス粒子である。

本開示は、また、真核細胞中の標的配列の部位特異的改変を提供する方法であって；方法が
ａ）細胞中に；ｉ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質であって：Ａ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＮ末端に結合した第１の核局在化シグナルと；Ｂ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＣ末端に結合した第２の核局在化シグナルと；を含む、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質をコードするヌクレオチドと、ｉｉ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質と複合体を形成し、ガイド配列を含むガイドポリヌクレオチドをコードするヌクレオチドであって、ガイド配列が、宿主ポリヌクレオチド中の標的配列とハイブリダイズすることができる、ヌクレオチドと、を導入することと；
ｂ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質及びガイドポリヌクレオチドにより宿主ポリヌクレオチド中の粘着末端を生成することと；
ｃ）ｉ）（ｂ）の粘着末端と一緒に、又はｉｉ）目的のポリヌクレオチド配列の３’末端を１つの粘着末端に、及びポリヌクレオチド配列の５’末端を１つの粘着末端にライゲートし；それにより標的配列を改変することと、を含む方法を提供する。

方法のいくつかの実施形態では、第１の核局在化シグナルは、単節型核局在化シグナルである。いくつかの実施形態では、第１の核局在化シグナルは、双節型核局在化シグナルである。いくつかの実施形態では、第２の核局在化シグナルは、単節型核局在化シグナルである。いくつかの実施形態では、第２の核局在化シグナルは、双節型核局在化シグナルである。いくつかの実施形態では、第１の核局在化シグナルは、双節型核局在化シグナルであり、第２の核局在化シグナルは、単節型核局在化シグナルである。いくつかの実施形態では、単節型核局在化シグナルは、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ヌクレオプラスミン、ＥＧＬ－１３、ｃ－Ｍｙｃ、ＴＵＳタンパク質の核局在化シグナル、又はこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、双節型核局在化シグナルは、古典的双節型核局在化シグナルである。いくつかの実施形態では、第１の核局在化シグナル及び第２の核局在化シグナルは、各々双節型核局在化シグナルである。いくつかの実施形態では、第１の核局在化シグナルは、古典的双節型核局在化シグナルであり、第２の核局在化シグナルは、ＳＶ４０ラージＴ抗原の核局在化シグナルである。

方法のいくつかの実施形態では、第１の核局在化シグナルは、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質に直接結合している。いくつかの実施形態では、第１の核局在化シグナルは、リンカーを介してＣａｓ９エフェクタータンパク質に結合している。いくつかの実施形態では、第２の核局在化シグナルは、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質に直接結合している。いくつかの実施形態では、第２の核局在化シグナルは、リンカーを介してＣａｓ９エフェクタータンパク質に結合している。いくつかの実施形態では、リンカーは、２～３０個の残基を有するペプチドリンカーである。

方法のいくつかの実施形態では、タンパク質は、第１の核局在化シグナルの２つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、第１の核局在化シグナルの３つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、第２の核局在化シグナルの２つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、第２の核局在化シグナルの３つのコピーを含む。

方法のいくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、ＩＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ系を有する細菌種に由来する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号１０～９７のいずれか１つに対して少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、１Ｅ－５のＥ値カットオフを有するＴＩＧＲ０３０３１タンパク質ファミリーにマッチするドメインを含む。

方法のいくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、１９～３０塩基長である。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、１９～２５塩基長である。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、２１～２６塩基長である。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を更に含む。

方法のいくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、粘着末端を生成する。いくつかの実施形態では、粘着末端は、１～１０ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、粘着末端は、２～６ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、粘着末端は、３～５ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む。実施形態では、粘着末端は、平滑末端である。実施形態では、粘着末端は、５’一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを有する。実施形態では、粘着末端は、３’一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを有する。

方法のいくつかの実施形態では、真核細胞は、動物又はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、植物細胞である。

方法のいくつかの実施形態では、改変は、標的配列の少なくとも一部の欠失である。いくつかの実施形態では、改変は、標的配列の突然変異である。いくつかの実施形態では、改変は、標的配列中への目的配列の挿入である。

本開示は、また、細胞内のＣａｓ９エフェクタータンパク質の分解を低減する方法であって、ａ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＮ末端に第１の核局在化シグナルを結合させることと；ｂ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＣ末端に第２の核局在化シグナルを結合させることと；を含む方法を提供する。

方法の実施形態では、第１の核局在化シグナルは、単節型核局在化シグナルである。実施形態では、第１の核局在化シグナルは、双節型核局在化シグナルである。実施形態では、第２の核局在化シグナルは、単節型核局在化シグナルである。実施形態では、第２の核局在化シグナルは、双節型核局在化シグナルである。実施形態では、第１の核局在化シグナルは、双節型核局在化シグナルであり、第２の核局在化シグナルは、単節型核局在化シグナルである。実施形態では、単節型核局在化シグナルは、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ヌクレオプラスミン、ＥＧＬ－１３、ｃ－Ｍｙｃ、ＴＵＳタンパク質の核局在化シグナル、又はこれらの組み合わせである。実施形態では、双節型核局在化シグナルは、古典的双節型核局在化シグナルである。実施形態では、第１の核局在化シグナルは、古典的双節型核局在化シグナルであり、第２の核局在化シグナルは、ＳＶ４０ラージＴ抗原の核局在化シグナルである。

以下の図面は、本明細書の一部を形成し、更に本発明の特定の態様の例示的な実施形態を実証するために含まれる。

本明細書に記載されるＣａｓ９エフェクタータンパク質で使用され得るＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列を提供する。 本明細書に記載されるＣａｓ９エフェクタータンパク質で使用され得るＣａｓ９タンパク質の更なるアミノ酸配列を提供する。 以下の阻害剤の非存在下又は存在下でのＭＨＣａｓ９の発現を示すウェスタンブロットである：実施例１に記載の１）濃度５μＭのプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２；２）濃度２０ｎＭのリソソームｖＡＴＰアーゼ阻害剤バフィロマイシンＡ１；又は３）濃度１０ｎＭの核外輸送阻害剤レプトマイシンＢ。 各阻害剤及び対照の正規化のためにＭＡＰＫを使用したウェスタンブロットの定量化の棒グラフである。 以下のＣａｓ９コンストラクトの発現を示すウェスタンブロットである：実施例２に記載の１）３ｘＳＶ４０－ＭＨＣａｓ９；２）ＭＨＣａｓ９－ＮＬＳＳＶ４０；３）３ＸＮＬＳＳＶ４０－ＭＨＣａｓ９－ＮＬＳＳＶ４０；及び４）ｂｐＮＬＳ－ＭＨＣａｓ９－ＳＬＳＳＶ４０（ＳｐＯＴ－ＯＮ）。クローニングベクターによって発現されたＧＦＰはトランスフェクション対照として検出され、チューブリンはゲルローディング対照として検出される。 実施例３に記載のＳｐＯＴ－ＯＮ（５Ａ）又はｂｐＮＬＳ－ＳｐＣａｓ９－ＮＬＳＳＶ４０（５Ｂ）の発現のウェスタンブロットを示す。Ｃａｓ９コンストラクトは、以下の阻害剤の非存在下又は存在下で試験された：１）濃度５μＭのプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２；２）濃度２０ｎＭのリソソームｖＡＴＰアーゼ阻害剤バフィロマイシンＡ１；又は３）濃度１０ｎＭの核外輸送阻害剤レプトマイシンＢ。 実施例４に記載のＳｐＯＴ－ＯＮ（ＭＨＣａｓ９）又はＳｐＣａｓ９のいずれかを用いた、異なる部位でのＤＮＡ開裂活性の滴定のプロットを示す。 実施例５に記載されるように、異なるプロトスペーサー長が使用されたときのＤＮＡ開裂速度定数ｋの棒グラフを示す。 実施例６に記載のＥＭＸ１部位（８Ａ）及びＣＤ３４部位（８Ｂ）における異なるプロトスペーサー長についてのマッピングされたリードにおける変異リードの平均パーセンテージをプロットした棒グラフを示す。棒グラフは、アンプリコン－Ｓｅｑ及びＲＩＭＡ分析により評価した、ＣＤ３４又はＥＭＸ１を標的とするｎ＝３の異なるＰＢＭＣドナーのＨＥＫ２９３Ｔ細胞の平均編集効率±ＳＤを表す。対立遺伝子頻度＜０．１％は分析から除外された。 実施例７に記載のＳｐＯＴ－ＯＮ及びＳＰＣａｓ９のオフターゲット部位における改変リードのパーセンテージのプロットを示す。 実施例８に記載のＰＡＭからの位置１、２、及び３にミスマッチを有するＤＮＡ基質の開裂速度定数をプロットした棒グラフを示す。 実施例９に記載の２３ヌクレオチドのガイドＲＮＡを用いて試験したＥＭＸ１のミスマッチ編集について、異なる位置でのマッピングされたリードにおける変異リードの平均パーセンテージの棒グラフを示す。棒グラフは、アンプリコン－Ｓｅｑ及びＲＩＭＡ分析により評価した、ＥＭＸ１を標的とするｎ＝３の異なるＰＢＭＣドナーのＨＥＫ２９３Ｔ細胞の平均編集効率±ＳＤを表す。対立遺伝子頻度＜０．１％は分析から除外された。 実施例１０に記載のＥＭＸ遺伝子座（図１２Ａ）及びＣＤ３４遺伝子座（図１２Ｂ）におけるＤＮＡ編集の定性分析を示す。 ＣＤ３４遺伝子座でのＳｐＣａｓ９ ＤＮＡ開裂後のＤＮＡ修復の比較の定性分析を示す。 示されるような異なるオーバーハングを有する基質についてのＣＤ３４遺伝子座における非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ノックインのパーセンテージを示す棒グラフである。実験を実施例１１のとおり実施した。プロットは、挿入の潜在的な両方の指向性について示されており、濃い灰色は順方向（予想される）挿入を表し、明るい灰色は逆方向挿入を表す。 示されるような異なるオーバーハングを有する基質についてのＳＴＡＴ１遺伝子座におけるＮＨＥＪノックインのパーセンテージを示す棒グラフである。実験を実施例１１のとおり実施した。プロットは、挿入の潜在的な両方の指向性について示されており、濃い灰色は順方向（予想される）挿入を表し、明るい灰色は逆方向挿入を表す。

本開示は、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＮ末端及びＣ末端の両方に核局在化シグナルを含む向上した安定性を有するＣａｓ９エフェクタータンパク質を提供する。本開示はまた、向上した安定性を有するＣａｓ９エフェクタータンパク質と、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質と複合体化する核酸ガイド配列と、を含む系を提供する。本開示はまた、向上した安定性を有するＣａｓ９エフェクタータンパク質を用いた、真核細胞中の標的配列の部位特異的改変のための方法を提供する。本開示は、更に、タンパク質のＮ末端及びＣ末端の両方に核局在化シグナルを結合させることにより、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質の安定性を向上させる方法を提供する。

理論に縛られることを望むものではないが、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質に更なる核局在化シグナルが存在すると、タンパク質の核内輸送が強化されると考えられている。この核内輸送の強化により、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質が細胞質内で過ごす時間が短縮され、ここで細胞質タンパク質の一般的な分解経路であるリソソーム分解の基質となる可能性がある。実施形態では、本明細書に記載のＣａｓ９エフェクタータンパク質は、向上した安定性を有するが、向上した安定性を有さないＣａｓ９タンパク質と比較して、顕著なＣａｓ９エフェクター活性を保持する。

本明細書で使用される場合、「向上した安定性」を有するタンパク質は、細胞などのｉｎ ｖｉｖｏ環境、又はｉｎ ｖｉｔｒｏ環境内部でより長い寿命を有するタンパク質を意味する。いくつかの実施形態では、「向上した安定性」を有するタンパク質は、プロテアーゼなどのタンパク質を分解する因子への曝露が少ないこと、及び／又はタンパク質を分解する因子に対する基質が少ないことにより、例えばタンパク質内の結合の切断に対してより耐性があることにより、環境中での分解に対してより耐性があり得る。実施形態では、「向上した安定性」は、未改変の状態のタンパク質と比較して向上している。実施形態では、本明細書に記載されるＣａｓ９エフェクタータンパク質の「向上した安定性」は、核局在化シグナルを有さないＣａｓ９エフェクタータンパク質と比較して向上している。実施形態では、本明細書に記載されるＣａｓ９エフェクタータンパク質の「向上した安定性」は、核局在化シグナルを１つだけ有するＣａｓ９エフェクタータンパク質と比較して向上している。実施形態では、本明細書に記載されるＣａｓ９エフェクタータンパク質の「向上した安定性」は、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＮ末端に結合している核局在化シグナルを１つだけ有するＣａｓ９エフェクタータンパク質と比較して向上している。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質の安定性は、タンパク質の量を決定するための当業者に公知の手段（例えば、ウェスタンブロット）、又はタンパク質の活性を測定することによってタンパク質の量を決定するための当業者に公知の手段（例えば、本明細書に記載の活性アッセイ）により測定した場合、発現の３０分後、発現の６０分後、発現の９０分後、発現の１２０分後、発現の１５０分後、発現の１２０分後に、１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、１００％超、１２０％超、１４０％超、１６０％超、１８０％超、２００％超、３００％超、又は４００％超向上している。

本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、１つ以上を意味し得る。本明細書において使用され、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同時に使用される場合、語「ａ」又は「ａｎ」は、１つ又は２つ以上を意味し得る。本明細書で使用される場合、「別の」又は「更なる」は、少なくとも第２のもの以上を意味し得る。

本出願全体を通して、「約」という用語は、ある値が、その値を決定するために用いられている方法／デバイスに関する誤差の固有の変動又は試験対象間で存在する変動を含むことを示すために使用される。典型的には、用語「約」は、状況に応じておよそ又は１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％又は２０％未満、又はそれら以上の変動性を包含することを意味する。実施形態では、当業者は、本明細書で用いられる文脈に応じて、用語「約」によって示される変動のレベルを理解するであろう。用語「約」の使用には、具体的に列挙された値も含まれることも理解されるべきである。

特許請求の範囲における用語「又は」の使用は、代替物のみを指すと明示されない限り又はその代替物が相互に排他的でない限り、「及び／又は」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物のみ及び「及び／又は」を指す定義を支持する。

本明細書で使用される場合、用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（並びに、含んでいるの任意のバリアント又は形態、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」）、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」（並びに、有しているの任意のバリアント又は形態、例えば、「有する（ｈａｖｅ）」及び「有する（ｈａｓ）」）、「包含している（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（並びに、包含しているの任意のバリアント又は形態、例えば、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ）」）又は「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（並びに、含有しているの任意のバリアント又は形態、例えば、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」）は、包含的又はオープンエンドであり、追加の引用されない要素又は方法工程を除外するものではない。

「例えば」という用語及びその対応する略語「ｅ．ｇ．（イタリック体であるか否かを問わない）」の使用は、引用される特定の用語が、別途明示的に述べられていない限り、参照されるか又は引用される特定の例に限定されることが意図されていない本開示の代表的な例及び実施形態であることを意味する。

本明細書で使用される場合、「間」とは、範囲の両端を含む範囲である。例えば、ｘとｙの間の数値には、数値ｘとｙ、及びｘとｙに含まれるあらゆる数値が明示的に含まれる。

Ｃａｓ９エフェクタータンパク質
実施形態では、本開示は、向上した安定性を有するＣａｓ９エフェクタータンパク質を提供する。実施形態では、本開示は、２つ以上の核局在化シグナルを含むＣａｓ９エフェクタータンパク質を提供する。実施形態では、本開示は、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質であって：ａ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＮ末端に結合した第１の核局在化シグナルと；ｂ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＣ末端に結合した第２の核局在化シグナルと；を含む、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質を提供する。

本明細書に記載されるように、Ｃａｓタンパク質は、とりわけ、ゲノム編集、遺伝子調節、遺伝子回路構築、及び機能的ゲノミクスに使用することができるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の構成成分である。Ｃａｓ１及びＣａｓ２タンパク質は現在同定されている全てのＣＲＩＳＰＲ系にユニバーサルであると考えられている一方、Ｃａｓ３、Ｃａｓ９及びＣａｓ１０タンパク質は、それぞれＩ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系に特異的であると考えられている。

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系（ＩＩ型系）についての最初の公開後、Ｃａｓ９バリアントが様々な細菌種において同定され、番号は機能的に特徴付けされた。例えば、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｙｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４２（１０）：６０９１－６１０５（２０１４）、Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９”，Ｎａｔｕｒｅ ５２０（７５４６）：１８６－９１（２０１５）、及びＥｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｄｉｔｉｎｇ”，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０（１１）：１１１６－１１２１（２０１３）参照（その全容が参照により本明細書に組み込まれる）。

本開示は、向上したＣａｓ９安定性を有するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系の新規のエフェクタータンパク質を包含する。用語「Ｃａｓ９」、「Ｃａｓ９タンパク質」及び「Ｃａｓ９エフェクタータンパク質」は、互換的であり、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系において使用される場合に粘着末端、平滑末端、又はニックの入ったｄｓＤＮＡを提供し得るエフェクタータンパク質を記載するために本明細書において使用される。

実施形態では、核局在化シグナルは、単節型核局在化シグナル、双節型核局在化シグナル、又はこれらの組み合わせである。核局在化配列又はＮＬＳとも呼ばれる核局在化シグナルは、その配列を有するタンパク質を細胞核に取り込む原因となるアミノ酸配列である。実施形態では、単節型核局在化シグナルは、核内輸送が認識される単一の連続配列を有するシグナルである。実施形態では、双節型核局在化シグナルは、スペーサー配列によって分離された核内輸送が認識される２つの配列を有するシグナルである。単節型と双節型核局在化シグナルの両方の例が、本明細書で提供される。

Ｃａｓ９エフェクタータンパク質の実施形態では、第１の核局在化シグナルは、単節型核局在化シグナルである。実施形態では、第１の核局在化シグナルは、双節型核局在化シグナルである。実施形態では、第２の核局在化シグナルは、単節型核局在化シグナルである。実施形態では、第２の核局在化シグナルは、双節型核局在化シグナルである。

実施形態では、第１及び第２の核局在化シグナルは、どちらも単節型であり得るか、どちらも双節型であり得るか、又は単節型及び双節型の混合物であり得る。実施形態では、第１の核局在化シグナルは、双節型核局在化シグナルであり、第２の核局在化シグナルは、単節型核局在化シグナルである。実施形態では、第１の核局在化シグナルは、単節型核局在化シグナルであり、第２の核局在化シグナルは、双節型核局在化シグナルである。実施形態では、第１の核局在化シグナルは、単節型核局在化シグナルであり、第２の核局在化シグナルは、単節型核局在化シグナルである。実施形態では、第１の核局在化シグナルは、双節型核局在化シグナルであり、第２の核局在化シグナルは、双節型核局在化シグナルである。

実施形態では、単節型核局在化シグナルは、当該技術分野において公知の単節型核局在化シグナルである。実施形態では、単節型核局在化シグナルは、表１に列挙される単節型核局在化シグナルのうちの１つ、又はこれらの組み合わせである。

実施形態では、双節型核局在化シグナルは、当該技術分野において公知の双節型核局在化シグナルである。実施形態では、双節型核局在化シグナルは、古典的双節型核局在化シグナルである。実施形態では、双節型核局在化シグナルは、表２に列挙される双節型核局在化シグナルのうちの１つ、又はこれらの組み合わせである。

タンパク質の実施形態では、第１の核局在化シグナルは、古典的双節型核局在化シグナル（配列番号７）であり、第２の核局在化シグナルは、ＳＶ４０ラージＴ抗原の核局在化シグナル（配列番号１）である。

実施形態では、核局在化シグナルは、当該技術分野において標準的な方法を使用して、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質に結合している。実施形態では、核局在化シグナルをコードする核酸配列は、制限酵素消化及びライゲーションなどの標準的な分子生物学的方法を使用して、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質をコードする核酸配列の上流及び下流に配置され、その結果、そのＮ末端とＣ末端に核局在化シグナルを含むＣａｓ９エフェクタータンパク質をコードする核酸が形成される。次いで、この核酸を細胞、例えば真核細胞内で発現させることができる。その他の実施形態では、そのＮ末端及びＣ末端に核局在化シグナルを含むＣａｓ９エフェクタータンパク質は、固相タンパク質合成を使用して完全又は部分的に合成される。

タンパク質の実施形態では、第１の核局在化シグナルは、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質に直接結合している。実施形態では、第１の核局在化シグナルは、リンカーを介してＣａｓ９エフェクタータンパク質に結合している。実施形態では、第２の核局在化シグナルは、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質に直接結合している。実施形態では、第２の核局在化シグナルは、リンカーを介してＣａｓ９エフェクタータンパク質に結合している。

リンカーが使用される実施形態では、リンカーは、２～３０個の残基を有するペプチドリンカーである。実施形態では、リンカーは、２～２０個の残基を有するペプチドリンカーである。実施形態では、リンカーは、２～１５個の残基を有するペプチドリンカーである。実施形態では、リンカーは、２～１０個の残基を有するペプチドリンカーである。実施形態では、リンカーは、２～５個の残基を有するペプチドリンカーである。実施形態では、リンカーは、置換又は非置換のＣ_２～Ｃ_２０アルキル、アルケン、又はアルキニル鎖である。

実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、そのＮ末端上に、核局在化シグナルの２つ以上のコピーを含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、そのＮ末端上に、核局在化シグナルの２つ以上の型を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、そのＣ末端上に、核局在化シグナルの２つ以上のコピーを含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、そのＣ末端上に、核局在化シグナルの２つ以上の型を含む。

実施形態では、タンパク質は、第１の核局在化シグナルの２つのコピーを含む。実施形態では、タンパク質は、第１の核局在化シグナルの３つのコピーを含む。実施形態では、タンパク質は、第２の核局在化シグナルの２つのコピーを含む。実施形態では、タンパク質は、第２の核局在化シグナルの３つのコピーを含む。

第１及び第２の核局在化シグナルを含むＣａｓ９タンパク質のＣａｓ９部分は、当該技術分野において公知の任意のＣａｓ９エフェクタードメインに由来し得る。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、ＩＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ系を有する細菌種に由来する。好適なＩＩ－Ｂ型Ｃａｓ９タンパク質の例は、国際公開第２０１９／０９９９４３号パンフレットに記載されている（参照として本明細書に組み込まれている）。実施形態では、好適なＩＩ－Ｂ型Ｃａｓ９は、粘着末端を生成することができる。本明細書に記載されるように、ＩＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ系は、とりわけ、ｃａｓオペロン上のｃａｓ４遺伝子の存在により同定され、ＩＩ－Ｂ型Ｃａｓ９タンパク質は、ＴＩＧＲ０３０３１ ＴＩＧＲＦＡＭタンパク質ファミリーのものである。したがって、実施形態では、Ｃａｓ９部分は、ＴＩＧＲ０３０３１ ＴＩＧＲＦＡＭタンパク質ファミリーのものである。実施形態では、Ｃａｓ９部分は、１Ｅ－５のＥ値カットオフを有するＴＩＧＲ０３０３１タンパク質ファミリーにマッチするドメインを含む。実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼは、１Ｅ－１０のＥ値カットオフを有するＴＩＧＲ０３０３１タンパク質ファミリーにマッチするドメインを含む。ＩＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ系は、例えば、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）、ガンマプロテオバクテリア（ｇａｍｍａ ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＨＴＣＣ５０１５、パラサテレラ・エキスクレメンティホミニス（Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｅｘｃｒｅｍｅｎｔｉｈｏｍｉｎｉｓ）、サテレラ・ワズワーセンシス（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ）、スルフロスピリラム属種（Ｓｕｌｆｕｒｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐ．）ＳＣＡＤＣ、ルミノバクター属種（Ｒｕｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）ＲＭ８７、バークホルデリア・バクテリウム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）１＿１＿４７、バクテロイデス・オーラル・タクソン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ）２７４株Ｆ００５８、ウォリネラ・スクシノゲネス（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、バークホルデリア・バクテリウム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＹＬ４５、ルミノバクター・アミロフィラス（Ｒｕｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ ａｍｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、カンピロバクター属種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）Ｐ０１１１、カンピロバクター属種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）ＲＭ９２６１、カンピロバクター・ラニエナエ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｎｉｅｎａｅ）株ＲＭ８００１、カンプリロバクター・ラニエナエ（Ｃａｍｐｌｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｎｉｅｎａｅ）株Ｐ０１２１、ツリシモナス・ムリス（Ｔｕｒｉｃｉｍｏｎａｓ ｍｕｒｉｓ）、レジオネラ・ロンジニエンシス（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｌｏｎｄｉｎｉｅｎｓｉｓ）、サリニビブリオ・シャルメンシス（Ｓａｌｉｎｉｖｉｂｒｉｏ ｓｈａｒｍｅｎｓｉｓ）、レプトスピラ属種（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｓｐ．）単離株ＦＷ．０３０、モリテラ属種（Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ ｓｐ．）単離株ＮＯＲＰ４６、エンドゾイコモナス属種（Ｅｎｄｏｚｏｉｃｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｓ－Ｂ４－１Ｕ、タミルナドゥイバクター・サリナス（Ｔａｍｉｌｎａｄｕｉｂａｃｔｅｒ ｓａｌｉｎｕｓ）、ビブリオ・ナトリエゲンス（Ｖｉｂｒｉｏ ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ）、アルコバクター・スキロウイイ（Ａｒｃｏｂａｃｔｅｒ ｓｋｉｒｒｏｗｉｉ）、フランシセラ・フィロミラギア（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ）、フランシセラ・ヒスパニエンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｈｉｓｐａｎｉｅｎｓｉｓ）、又はパレンドゾイコモナス・ハリクロナエ（Ｐａｒｅｎｄｏｚｏｉｃｏｍｏｎａｓ ｈａｌｉｃｌｏｎａｅ）などの細菌種で見出される。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、二本鎖ポリヌクレオチド開裂、例えば二本鎖ＤＮＡ開裂を生成することができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、１つ以上のヌクレアーゼドメイン、例えばＲｕｖＣ及びＨＮＨなどを含むことができ、二本鎖ＤＮＡを開裂することができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、ＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインとを含み、その各々が二本鎖ＤＮＡの１本の鎖を開裂することができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、平滑末端を生成する。いくつかの実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼのＲｕｖＣ及びＨＮＨは、各ＤＮＡ鎖を同じ位置で開裂し、それによって平滑末端を生成する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、粘着末端を生成する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９のＲｕｖＣ及びＨＮＨは、各ＤＮＡ鎖を異なる位置で開裂（すなわち、「オフセット」で切断）し、それによって粘着末端を生成する。本明細書において使用される用語「粘着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄｓ）」、「段違い末端」、又は「付着末端（ｓｔｉｃｋｙ ｅｎｄｓ）」は、不均等の長さの鎖を有する核酸断片を指す。「平滑末端」と対照的に、粘着末端は、二本鎖核酸（例えば、ＤＮＡ）上の段違い切断により生成される。付着又は粘着末端は、非対合ヌクレオチド、又は「オーバーハング」、例えば、３’又は５’オーバーハングを有する突出一本鎖を有する。

実施形態では、用語Ｃａｓ９は、遺伝子操作されたＣａｓ９バリアント、例えば、ｄｅａｄＣａｓ９－ＦｏｋＩ、Ｃａｓ９ｎ^Ｄ１０Ａ－ＦｏｋＩ、及びＣａｓ９ｎ^{Ｈ８４０Ａ}－ＦｏｋＩなどを指す。本開示の実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は：ａ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＮ末端に結合した第１の核局在化シグナルと；ｂ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＣ末端に結合した第２の核局在化シグナルと；を含む。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９（例えば、融合タンパク質のＣａｓ９ドメイン）は、ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）結合活性を保持し、したがってｇＲＮＡに相補的な標的部位に結合し得るヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９（例えば、ＤＮＡ開裂活性を欠くＣａｓ９；「ｄＣａｓ９」）を含む。実施形態では、融合タンパク質は、ｄＣａｓ９ドメインと転写制御因子ドメインの間にリンカーを含む。実施形態では、ｄＣａｓ９ドメインは転写活性化因子又は抑制因子ドメインと融合し、相補的なｇＲＮＡ配列を介して特定の標的部位に誘導し得るｄＣａｓ９転写制御因子を形成する。リンカーの例は、本明細書で記載されている。実施形態では、ｄＣａｓ９ドメインと転写制御因子ドメインとの融合タンパク質は、本明細書に記載されるように、ｄＣａｓ９ドメインのＮ末端に結合した核局在化シグナルと、転写制御因子ドメインのＣ末端に結合した核局在化シグナルと、を有する。

実施形態では、ｄＣａｓ９ドメインは、転写をブロックするロードブロックとして機能するｄＣａｓ９ドメインである。実施形態では、ｄＣａｓ９ドメインは、ＲＮＡポリメラーゼの転写伸長を立体的にブロックし得る。

実施形態では、ｄＣａ９ドメインは、ＶＰ６４転写活性化ドメインに融合している。実施形態では、ｄＣａｓ９ドメインは、小さなペプチドＧＣＮ４のタンデムリピートを利用して、転写活性化因子ＶＰ６４と融合した単鎖可変断片の複数コピーを動員するＳｕｎＴａｇ遺伝子活性化系を使用して改変される。実施形態では、ｄＣａｓ９ドメインは、相乗活性化メディエーター（ＳＡＭ）系を使用して改変されており、ここでｄＣａｓ９はＶＰ６４に融合されており、ｓｇＲＮＡは転写活性化因子ｐ６５及びヒートショック因子１（ＨＳＦ１）に融合されたＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質（ＭＣＰ）を動員する２つのＭＳ２ＲＮＡアプタマーを含むように改変されている。実施形態では、ｄＣａｓ９ドメインは遺伝子活性化のためにＶＰ６４－ｐ６５－Ｒｔａ（ＶＰＲ）で改変されており、ここでｄＣａｓ９は組み合わせＶＰＲ転写活性化ドメインに融合して活性化効果を増幅する。実施形態では、ｄＣａｓ９ドメインは、遺伝子の活性化及び抑制を同時に行うためにｓｃＲＮＡで改変されており、ここでｓｇＲＮＡ及びＲＮＡアプタマー（例えば、ＭＳ２、ｃｏｍ、ＰＰ７）を結合するハイブリッドＲＮＡスキャホールドは、転写活性化因子又は抑制因子のいずれかに結合したＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＭＣＰ、ＣＯＭ、ＰＣＰ）を動員することができる。

実施形態では、ｄＣａｓ９ドメインは、化学的又は光制御二量化系で改変されており、ここで化学的又は光誘起二量化剤（例えば、ＰＹＬ１：：ＡＢＩ、ＧＩＤ：：ＧＡＩ及びＰｈｙＢ：：ＰＩＦ）は、それぞれ、ｄＣａｓ９及び転写エフェクターに融合される。これらの実施形態では、対応する化学物質（例えば、アブシジン酸［ＡＢＡ］又はジベレリン［ＧＡ］）又は光の添加により、遺伝子調節を誘発することができる。実施形態では、ｄＣａｓ９ドメインは、スプリットｄＣａｓ系又は受容体共役系：Ｉ／Ｏ分子デバイスを使用して改変される。

実施形態では、ｄＣａｓ９は、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，“Ａ ＣＲＩＳＰＲ－ｄＣａｓ Ｔｏｏｌｂｏｘ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０１９，４３１：３４－４７（参照として本明細書に組み込まれている）に記載されているように第２世代又は第３世代の転写制御因子である。

実施形態では、ｄＣａｓ９は、エピゲノム編集用のｄＣａｓ９融合タンパク質である。実施形態では、エピゲノム編集用のｄＣａｓ９は、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０１９，４３１：３４－４７（参照として本明細書に組み込まれている）に記載されているようにｄＣａｓ９融合タンパク質である。実施形態では、ｄＣａｓ９は、メチルトランスフェラーゼ、例えば、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、又はＤＮＭＴ３Ｌに融合している。実施形態では、ｄＣａｓ９は、ＫＲＡＢドメインに融合している。実施形態では、ｄＣａｓ９は、ＤＮＡデメチラーゼ、例えば、ＴＥＴ１に融合している。実施形態では、ｄＣａｓ９は、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、例えば、ＰＲＤＭ９又はＤＯＴ１Ｌに融合している。実施形態では、ｄＣａｓ９は、ヒストンデメチラーゼ、例えば、ＬＳＤ１に融合している。実施形態では、ｄＣａｓ９は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、例えば、ｐ３００に融合している。実施形態では、ｄＣａｓ９は、ヒストンデアセチラーゼ、例えば、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０若しくはＨＤＡＣ１１、又はＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６若しくはＳＩＲＴ７に融合している。

実施形態では、ｄＣａｓ９は、ゲノムイメージング用のｄＣａｓ９融合タンパク質である。実施形態では、ゲノムイメージング用のｄＣａｓ９は、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０１９，４３１：３４－４７（参照として本明細書に組み込まれている）に記載されているようにｄＣａｓ９融合タンパク質である。実施形態では、ｄＣａｓ９は、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、青緑色蛍光タンパク質、橙色蛍光タンパク質、又は赤色蛍光タンパク質に融合している。

実施形態では、ｄＣａｓ９は、塩基編集用のｄＣａｓ９融合タンパク質である。実施形態では、ｄＣａｓ９は、シトシン塩基エディター（Ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒ）に融合している。実施形態では、ｄＣａｓ９は、アデニン塩基エディターに融合している。実施形態では、ｄＣａｓ９は、ウラシル塩基エディターに融合している。実施形態では、ｄＣａｓ９は、シチジンデアミナーゼに融合している。実施形態では、ｄＣａｓ９は、アデニンデアミナーゼに融合している。実施形態では、ｄＣａｓ９は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼに融合している。

実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、塩基編集用Ｃａｓ９ニッカーゼ融合タンパク質である。本明細書で使用される「Ｃａｓ９ニッカーゼ」は、標的ＤＮＡの１本鎖のみを開裂するＣａｓ９タンパク質である。実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、シトシン塩基エディターに融合している。実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、アデニン塩基エディターに融合している。実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ウラシル塩基エディターに融合している。実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、シチジンデアミナーゼに融合している。実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、アデニンデアミナーゼに融合している。実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼに融合している。実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、米国特許出願公開第２０１８／０３１２８２８号明細書、同第２０１８／０２３７７８７号明細書、及び同第２０２０／００１０８３５号明細書（その各々が、参照として本明細書に組み込まれている）で記載されるように塩基編集用Ｃａｓ９ニッカーゼ融合である。

実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、プライム編集用Ｃａｓ９ニッカーゼ融合タンパク質である。実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、逆転写酵素に融合している。実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは国際公開第２０２０／１９１２４８号パンフレット（参照として本明細書に組み込まれている）で記載されるようにプライム編集用Ｃａｓ９ニッカーゼ融合である。

実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、図１及び図２に示される配列番号１０～９７のいずれか１つに対して少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、図１及び図２に示される配列番号１０～９７のいずれか１つに対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、図１及び図２に示される配列番号１０～９７のいずれか１つに対して少なくとも９８％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、図１及び図２に示される配列番号１０～９７のいずれか１つに対して少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、図１及び図２に示される配列番号１０～９７のうちの１つから選択されるポリペプチドを含む。

実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号７１と少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号７１と少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号７１と少なくとも９８％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号７１と少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号７１を含む。

タンパク質の実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号９８と少なくとも９０％同一のポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号９８と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号９８と少なくとも９８％同一のポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号９８と少なくとも９９％同一のポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号９８を含む。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号９８のＲ１３３６、Ｒ１３８９、Ｒ６６８、Ｎ１１６４、Ｎ１２６５、Ｎ１３００、Ｎ１４１２、Ｎ３４７、Ｎ３４８、Ｎ５６２、Ｎ５６５、Ｎ６１８、Ｎ６５１、Ｄ１２６６、Ｄ３０９、Ｄ３４５、Ｄ４８７、Ｄ６０７、Ｄ３０、Ｑ１１２９、Ｑ１３８１、Ｑ６２４、Ｑ６６１、Ｑ７１３、Ｑ７３４、Ｅ１０３２、Ｅ１４０９、Ｅ４３６、Ｅ６１０、Ｅ６１１、Ｅ６９１、Ｅ６９７、Ｇ１２４５、Ｇ１３３５、Ｈ７７７、Ｉ１２４２、Ｌ１２５、Ｌ１１６２、Ｌ１２６４、Ｌ１２９９、Ｋ１０３１、Ｋ４４３、Ｋ４９０、Ｋ６１５、Ｋ６５６、Ｆ１０３５、Ｆ６２０、Ｆ６３６、Ｆ６７０、Ｓ１２４３、Ｓ１３３４、Ｓ１３８０、Ｓ１４１０、Ｓ１４１３、Ｓ６３４、Ｓ６３８、Ｓ７１１、Ｓ１００６、Ｓ１０１７、Ｔ１２６７、Ｔ１３３３、Ｔ５５１、Ｔ６３９、Ｔ６３９、Ｔ６４０、Ｔ６６６、Ｔ８９７、Ｙ１３３８、Ｙ３４３、Ｙ５６６、Ｖ１２７３、Ｖ１２７４、Ｖ４８６、Ｖ６４４、Ｖ６６０、Ｖ６６７、Ｖ７３６のうちの１つ以上、又はこれらの組み合わせの位置でアミノ酸改変を含む配列番号９８を含む。

いくつかの実施形態では、アミノ酸改変は、以下の変異Ｒ６６８Ａ、Ｎ１１６４Ｒ、Ｎ１２６５Ｒ、Ｎ１３００Ｒ、Ｎ１４１２Ｒ、Ｎ３４７Ｒ、Ｎ３４８Ｒ、Ｎ５６２Ｒ、Ｎ５６５Ｒ、Ｎ６１８Ｒ、Ｎ６５１Ａ、Ｎ６５１Ｒ、Ｄ１２６６Ｒ、Ｄ３０９Ｒ、Ｄ３４５Ｒ、Ｄ４８７Ｒ、Ｄ６０７Ｒ、Ｑ１１２９Ｒ、Ｑ１３８１Ａ、Ｑ１３８１Ａ、Ｑ１３８１Ｒ、Ｑ６２４Ｒ、Ｑ６６１Ａ、Ｑ６６１Ｒ、Ｑ７１３Ｒ、Ｑ７３４Ｒ、Ｅ１０３２Ｇ、Ｅ１０３２Ｒ、Ｅ１４０９Ａ、Ｅ１４０９Ｒ、Ｅ４３６Ｒ、Ｅ６１０Ｒ、Ｅ６１１Ｒ、Ｅ６９１Ｒ、Ｅ６９７Ｒ、Ｇ１２４５Ｒ、Ｇ１３３５Ｒ、Ｈ７７７Ａ、Ｉ１２４２Ｓ、Ｌ１２５Ｒ、Ｌ１２５Ｙ、Ｌ１１６２Ｓ、Ｌ１２６４Ｓ、Ｌ１２９９Ｓ、Ｋ１０３１Ｒ、Ｋ４４３Ｒ、Ｋ４９０Ｒ、Ｋ６１５Ｒ、Ｋ６５６Ｒ、Ｆ１０３５Ｒ、Ｆ６２０Ｒ、Ｆ６３６Ｒ、Ｆ６７０Ｙ、Ｓ１２４３Ｒ、Ｓ１３３４Ａ、Ｓ１３３４Ａ、Ｓ１３３４Ｒ、Ｓ１３８０Ｒ、Ｓ１４１０Ｒ、Ｓ１４１３Ｒ、Ｓ６３４Ｒ、Ｓ６３８Ａ、Ｓ６３８Ｒ、Ｓ７１１Ｒ、Ｓ１００６Ｒ、Ｓ１０１７Ｒ、Ｔ１２６７Ａ、Ｔ１２６７Ｒ、Ｔ１３３３Ａ、Ｔ１３３３Ｒ、Ｔ５５１Ｒ、Ｔ６３９Ａ、Ｔ６３９Ｒ、Ｔ６４０Ｒ、Ｔ６６６Ｒ、Ｔ８９７Ｒ、Ｙ１３３８Ａ、Ｙ１３３８Ｒ、Ｙ３４３Ｒ、Ｙ５６６Ｒ、Ｖ１２７３Ｓ、Ｖ１２７４Ｓ、Ｖ４８６Ｒ、Ｖ６４４Ｒ、Ｖ６６０Ｒ、Ｖ６６０Ｙ、Ｖ６６７Ｒ、Ｖ６６７Ｓ、Ｖ７３６Ｒ、又はＶ７３６Ｙのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸改変は、以下の変異Ｎ１１６４Ｒ、Ｎ１２６５Ｒ、Ｎ１３００Ｒ、Ｎ１４１２Ｒ、Ｎ３４７Ｒ、Ｎ６５１Ａ、Ｄ１２６６Ｒ、Ｄ３０９Ｒ、Ｄ３４５Ｒ、Ｄ４８７Ｒ、Ｄ６０７Ｒ、Ｑ１１２９Ｒ、Ｑ１３８１Ａ、Ｑ１３８１Ａ、Ｑ１３８１Ｒ、Ｑ６６１Ａ、Ｑ７１３Ｒ、Ｑ７３４Ｒ、Ｅ１０３２Ｇ、Ｅ１０３２Ｒ、Ｅ１４０９Ａ、Ｅ４３６Ｒ、Ｅ６１１Ｒ、Ｅ６９１Ｒ、Ｅ６９７Ｒ、Ｇ１３３５Ｒ、Ｌ１２５Ｒ、Ｌ１２６４Ｓ、Ｌ１２９９Ｓ、Ｋ１０３１Ｒ、Ｋ４９０Ｒ、Ｋ６１５Ｒ、Ｋ６５６Ｒ、Ｆ６３６Ｒ、Ｓ１３３４Ａ、Ｓ１３３４Ａ、Ｓ１３３４Ｒ、Ｓ１３８０Ｒ、Ｓ１４１０Ｒ、Ｓ１４１３Ｒ、Ｓ６３４Ｒ、Ｓ６３８Ｒ、Ｓ７１１Ｒ、Ｓ１００６Ｒ、Ｓ１０１７Ｒ、Ｔ１２６７Ａ、Ｔ１２６７Ｒ、Ｔ５５１Ｒ、Ｙ１３３８Ａ、Ｙ１３３８Ｒ、Ｖ１２７３Ｓ、Ｖ１２７４Ｓ、Ｖ４８６Ｒ、Ｖ６４４Ｒ、Ｖ７３６Ｒ、又はＶ７３６Ｙのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸改変は、以下の変異Ｎ１２６５Ｒ、Ｎ１３００Ｒ、Ｎ１４１２Ｒ、Ｄ１２６６Ｒ、Ｅ４３６Ｒ、Ｇ１３３５Ｒ、Ｓ１３３４Ｒ、Ｓ１３８０Ｒ、Ｓ１０１７Ｒ、Ｔ１２６７Ｒ、Ｖ７３６Ｒ、又はＶ７３６Ｙのうちの１つ以上を含む。

いくつかの実施形態では、アミノ酸改変により、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質とＤＮＡ間の結合親和性が増加する。

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系
実施形態では、本開示は、向上した安定性を有するＣａｓ９エフェクタータンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提供する。

一般に、ＣＲＩＳＰＲ又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ又はＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列の部位におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメント（内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関してプロトスペーサーとも称される）により特徴付けられる。ＣＲＩＳＰＲ複合体の文脈において、「標的配列」は、ガイドポリヌクレオチドが標的化するように、例えば、相補性を有するように設計される配列を指し、標的配列及びガイドポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションがＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。標的配列に対する相補性が開裂活性に重要であり得るガイドポリヌクレオチドのセクションは、本明細書においてガイド配列と称される。標的配列は、任意のポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡポリヌクレオチドを含み得、目的標的遺伝子座内に局在し得る。実施形態では、標的配列は、細胞の核又は細胞質中に局在する。実施形態では、標的配列は、染色体上に局在する（ＴＳＣ）。実施形態では、標的配列は、ベクター上に局在する（ＴＳＶ）。

実施形態では、本開示は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であって：
ａ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質であって：ｉ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＮ末端に結合した第１の核局在化シグナルと；ｉｉ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＣ末端に結合した第２の核局在化シグナルと；
を含むＣａｓ９エフェクタータンパク質と、
ｂ）ガイド配列を含み、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質と複合体を形成するガイドポリヌクレオチドであって、ガイド配列が、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズすることができる、ガイドポリヌクレオチドと、を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提供する。

実施形態では、本開示は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であって：
ａ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質であって：ｉ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＮ末端に結合した第１の核局在化シグナルと；ｉｉ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＣ末端に結合した第２の核局在化シグナルと；
を含むＣａｓ９エフェクタータンパク質をコードする核酸配列と、
ｂ）ガイド配列を含み、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質と複合体を形成するガイドポリヌクレオチドをコードする核酸配列であって、ガイド配列が、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズすることができる、核酸配列と、を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提供する。

本系の実施形態では、（ａ）及び（ｂ）のヌクレオチド配列は、同じプロモーターの制御下にある。実施形態では、（ａ）及び（ｂ）のヌクレオチド配列は、異なるプロモーターの制御下にある。

本明細書で使用される場合、「プロモーター」、「プロモーター配列」、又は「プロモーター領域」は、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流コード又は非コード配列の転写の開始に関与し得るＤＮＡ調節領域／配列を指す。本開示のいくつかの例において、プロモーター配列は、転写開始部位を含み、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルにおいて転写を開始するために使用される最小数の塩基又はエレメントを含むように上流に伸びる。実施形態では、プロモーター配列は、転写開始部位及びＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメインを含む。真核生物プロモーターは、常にではないが、「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＡＴ」ボックスを含有することが多い。種々のプロモーター、例として誘導性プロモーターを使用して、本開示の種々のベクターを駆動することができる。

実施形態では、（ａ）及び（ｂ）のヌクレオチド配列は、真核生物プロモーターの制御下にある。実施形態では、（ａ）及び（ｂ）のヌクレオチド配列は、２つの異なる真核生物プロモーターの制御下にある。実施形態では、真核生物プロモーターのうち少なくとも１つは、ヒト誘導多能性幹細胞中で活性であるプロモーターである。実施形態では、真核生物プロモーターのうち少なくとも１つは、ＥＦ１ａｌｐｈａ（ＥＦ１ａ）である。実施形態では、真核生物プロモーターのうち少なくとも１つは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。実施形態では、真核生物プロモーターのうち少なくとも１つは、ドキシサイクリン調節性プロモーターＴＲＥ３Ｇである。実施形態では、（ａ）及び（ｂ）のヌクレオチド配列は、細菌プロモーターの制御下にある。実施形態では、（ａ）及び（ｂ）のヌクレオチド配列は、２つの異なる細菌プロモーターの制御下にある。実施形態では、（ａ）及び（ｂ）のヌクレオチド配列は、ウイルスプロモーターの制御下にある。実施形態では、（ａ）及び（ｂ）のヌクレオチド配列は、２つの異なるウイルス生物プロモーターの制御下にある。

実施形態では、（ａ）及び（ｂ）の核酸配列は、単一のベクター中にある。実施形態では、（ａ）及び（ｂ）の核酸配列は、別々のベクター中にある。

実施形態では、本開示は、１つ以上のベクターを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であって：
ａ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質であって：ｉ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＮ末端に結合した第１の核局在化シグナルと；ｉｉ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＣ末端に結合した第２の核局在化シグナルと；
を含むＣａｓ９エフェクタータンパク質をコードする１つ以上のヌクレオチド配列に操作可能に連結された調節エレメントと、
ｂ）ガイド配列を含み、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質と複合体を形成するガイドポリヌクレオチドであって、ガイド配列が、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズすることができる、ガイドポリヌクレオチドと、を含む１つ以上のベクターを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提供する。

本系の実施形態では、調節エレメントは、真核生物調節エレメントである。本系の実施形態では、調節エレメントは、原核細胞調節エレメントである。

実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド及びガイドポリヌクレオチドは、単一ベクター上に存在する。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド、ガイドポリヌクレオチド（又はガイドポリヌクレオチドに転写され得るヌクレオチド）、及びｔｒａｃｒＲＮＡは、単一ベクター上に存在する。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド、ガイドポリヌクレオチド（又はガイドポリヌクレオチドに転写され得るヌクレオチド）、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びダイレクトリピート配列は、単一ベクター上に存在する。実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。実施形態では、ベクターは、哺乳動物発現ベクターである。実施形態では、ベクターは、ヒト発現ベクターである。実施形態では、ベクターは、植物発現ベクターである。

実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド及びガイドポリヌクレオチドは、単一核酸分子である。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド、ガイドポリヌクレオチド、及びｔｒａｃｒＲＮＡは、単一核酸分子である。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド、ガイドポリヌクレオチド、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びダイレクトリピート配列は、単一核酸分子である。実施形態では、単一の核酸分子は、発現ベクターである。実施形態では、単一の核酸分子は、哺乳動物発現ベクターである。実施形態では、単一の核酸分子は、ヒト発現ベクターである。実施形態では、単一の核酸分子は、植物発現ベクターである。

「操作可能に連結された」は、目的ヌクレオチド、すなわち、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質をコードするヌクレオチドが、ヌクレオチド配列の発現を可能とする様式で調節エレメントに連結していることを意味する。したがって、実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。

実施形態では、調節エレメントは、プロモーターである。実施形態では、調節エレメントは、細菌プロモーターである。実施形態では、調節エレメントは、ウイルスプロモーターである。実施形態では、調節エレメントは、真核生物調節エレメント、すなわち真核生物プロモーターである。実施形態では、真核生物調節エレメントは、哺乳動物プロモーターである。

上記系のいずれかの実施形態では、第１の核局在化シグナルは、単節型核局在化シグナルである。実施形態では、第１の核局在化シグナルは、双節型核局在化シグナルである。実施形態では、第２の核局在化シグナルは、単節型核局在化シグナルである。実施形態では、第２の核局在化シグナルは、双節型核局在化シグナルである。

実施形態では、第１及び第２の核局在化シグナルは、どちらも単節型であり得るか、どちらも双節型であり得るか、又は単節型及び双節型の混合物であり得る。実施形態では、第１の核局在化シグナルは、双節型核局在化シグナルであり、第２の核局在化シグナルは、単節型核局在化シグナルである。実施形態では、第１の核局在化シグナルは、単節型核局在化シグナルであり、第２の核局在化シグナルは、双節型核局在化シグナルである。実施形態では、第１の核局在化シグナルは、単節型核局在化シグナルであり、第２の核局在化シグナルは、単節型核局在化シグナルである。実施形態では、第１の核局在化シグナルは、双節型核局在化シグナルであり、第２の核局在化シグナルは、双節型核局在化シグナルである。

上記系のいずれかの実施形態では、単節型核局在化シグナルは、当該技術分野において公知の単節型核局在化シグナルである。実施形態では、単節型核局在化シグナルは、上記表１に列挙される単節型核局在化シグナル（配列番号１～６）のうちの１つ、又はこれらの組み合わせである。

上記系のいずれかの実施形態では、双節型核局在化シグナルは、当該技術分野において公知の双節型核局在化シグナルである。実施形態では、双節型核局在化シグナルは、古典的双節型核局在化シグナルである。実施形態では、双節型核局在化シグナルは、上記表２に列挙される双節型核局在化シグナル（配列番号７～９）のうちの１つ、又はこれらの組み合わせである。

上記系のいずれかの実施形態では、第１の核局在化シグナルは、古典的双節型核局在化シグナル（配列番号７）であり、第２の核局在化シグナルは、ＳＶ４０ラージＴ抗原の核局在化シグナル（配列番号１）である。

上記系のいずれかの実施形態では、第１の核局在化シグナルは、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質に直接結合している。実施形態では、第１の核局在化シグナルは、リンカーを介してＣａｓ９エフェクタータンパク質に結合している。実施形態では、第２の核局在化シグナルは、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質に直接結合している。実施形態では、第２の核局在化シグナルは、リンカーを介してＣａｓ９エフェクタータンパク質に結合している。

リンカーが使用される実施形態では、リンカーは、２～３０個の残基を有するペプチドリンカーである。実施形態では、リンカーは、２～２０個の残基を有するペプチドリンカーである。実施形態では、リンカーは、２～１５個の残基を有するペプチドリンカーである。実施形態では、リンカーは、２～１０個の残基を有するペプチドリンカーである。実施形態では、リンカーは、２～５個の残基を有するペプチドリンカーである。実施形態では、リンカーは、置換又は非置換のＣ_２～Ｃ_２０アルキル、アルケン、又はアルキニル鎖である。

上記系のいずれかの実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、そのＮ末端上に、核局在化シグナルの２つ以上のコピーを含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、そのＮ末端上に、核局在化シグナルの２つ以上の型を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、そのＣ末端上に、核局在化シグナルの２つ以上のコピーを含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、そのＣ末端上に、核局在化シグナルの２つ以上の型を含む。

上記系のいずれかの実施形態では、タンパク質は、第１の核局在化シグナルの２つのコピーを含む。実施形態では、タンパク質は、第１の核局在化シグナルの３つのコピーを含む。実施形態では、タンパク質は、第２の核局在化シグナルの２つのコピーを含む。実施形態では、タンパク質は、第２の核局在化シグナルの３つのコピーを含む。

上記系のいずれかの実施形態では、第１及び第２の核局在化シグナルを含むＣａｓ９タンパク質のＣａｓ９部分は、当該技術分野において公知の任意のＣａｓ９エフェクタードメインに由来し得る。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、ＩＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ系を有する細菌種に由来する。好適なＩＩ－Ｂ型Ｃａｓ９タンパク質の例は、上記に記載されている。実施形態では、Ｃａｓ９部分は、１Ｅ－５のＥ値カットオフを有するＴＩＧＲ０３０３１タンパク質ファミリーにマッチするドメインを含む。実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼは、１Ｅ－１０のＥ値カットオフを有するＴＩＧＲ０３０３１タンパク質ファミリーにマッチするドメインを含む。

上記系のいずれかの実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、図１及び図２に示される配列番号１０～９７のいずれか１つに対して少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、図１及び図２に示される配列番号１０～９７のいずれか１つに対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、図１及び図２に示される配列番号１０～９７のいずれか１つに対して少なくとも９８％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、図１及び図２に示される配列番号１０～９７のいずれか１つに対して少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、図１及び図２に示される配列番号１０～９７のうちの１つから選択されるポリペプチドを含む。

上記系のいずれかの実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号７１と少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号７１と少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号７１と少なくとも９８％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号７１と少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号７１を含む。

上記系のいずれかの実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号９８と少なくとも９０％同一のポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号９８と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号９８と少なくとも９８％同一のポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号９８と少なくとも９９％同一のポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号９８を含む。

上記系のいずれかの他の実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＣａｓ９部分は、ｄＣａｓ９、すなわち、ＤＮＡ二本鎖開裂活性を欠く不活性化された、又は「死んだ（ｄｅａｄ）」Ｃａｓ９を含む。実施形態では、ｄＣａｓ９は、本明細書の他の場所に記載されているように、転写制御因子、エピジェネティクスな調節タンパク質、又は蛍光タンパク質などの他の活性ドメインと融合することができる。ｄＣａｓ９が別の活性ドメインに融合される実施形態では、本明細書に記載される核局在化シグナルは、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質コンストラクト全体のＮ末端及びＣ末端に存在する。

上記系のいずれかの他の実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＣａｓ９部分は、Ｃａｓ９ニッカーゼ、すなわちＤＮＡ二本鎖の一方の鎖のみを開裂するＣａｓ９タンパク質を含む。実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、本明細書の他の場所に記載されているように、転写制御因子、エピジェネティクスな調節タンパク質、又は蛍光タンパク質などの他の活性ドメインと融合することができる。Ｃａｓ９ニッカーゼが別の活性ドメインに融合される実施形態では、本明細書に記載される核局在化シグナルは、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質コンストラクト全体のＮ末端及びＣ末端に存在する。

本明細書に記載の系及び方法は、ガイドポリヌクレオチドを含み得る。実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９構成成分に結合し、それらを標的ＤＮＡ内の特異的局在に標的化するＲＮＡは、本明細書において「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」、又は「小分子ガイドＲＮＡ」と称され、本明細書において「ＤＮＡ標的化ＲＮＡ」と称することもできる。ガイドポリヌクレオチド、例えばガイドＲＮＡは、少なくとも２つのヌクレオチドセグメント、すなわち少なくとも１つの「ＤＮＡ結合セグメント」及び少なくとも１つの「ポリペプチド結合セグメント」を含む。「セグメント」とは、分子の一部、セクション、又は領域、例えば、ガイドポリヌクレオチド分子のヌクレオチドの連続ストレッチを意味する。「セグメント」の定義は、特に具体的に定義されない限り、特定の数の総塩基対に限定されない。

実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのＤＮＡ結合セグメントは、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズするが、細菌細胞中の配列とハイブリダイズしない。本明細書において使用される細菌細胞中の配列は、細菌生物に由来するポリヌクレオチド配列、すなわち、天然発生細菌ポリヌクレオチド配列、又は細菌由来の配列を指す。例えば、配列は、細菌染色体若しくは細菌プラスミド、又は細菌細胞中で天然に見出される任意の他のポリヌクレオチド配列であり得る。

実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのポリペプチド結合セグメントは、本明細書に記載される向上した安定性を有するＣａｓ９エフェクタータンパク質に結合する。

実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは１０～１５０ヌクレオチドである。実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは２０～１２０ヌクレオチドである。実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは３０～１００ヌクレオチドである。実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは４０～８０ヌクレオチドである。実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは５０～６０ヌクレオチドである。実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは１０～３５ヌクレオチドである。実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは１５～３０ヌクレオチドである。実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは２０～２５ヌクレオチドである。

ガイドポリヌクレオチド、例えばガイドＲＮＡは、単離分子、例えばＲＮＡ分子として標的細胞中に導入することができるか、又はガイドポリヌクレオチド、例えばガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを使用して細胞中に導入する。

ガイドポリヌクレオチド、例えば、ガイドＲＮＡの「ＤＮＡ結合セグメント」（又は「ＤＮＡ標的化配列」）は、標的ＤＮＡ内の特異的配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。

本開示のガイドポリヌクレオチド、例えば、ガイドＲＮＡは、ポリペプチド結合配列／セグメントを含み得る。ガイドポリヌクレオチド、例えば、ガイドＲＮＡのポリペプチド結合セグメント（又は「タンパク質結合配列」）は、本開示のＣａｓタンパク質のポリヌクレオチド結合ドメインと相互作用する。このようなポリペプチド結合セグメント又は配列は当業者に公知であり、例えば、それらは米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号明細書、同第２０１４／０２７３０３７号明細書、同第２０１４／０２７３２２６号明細書、同第２０１４／０２９５５５６号明細書、同第２０１４／０２９５５５７号明細書、同第２０１４／０３４９４０５号明細書、同第２０１５／００４５５４６号明細書、同第２０１５／００７１８９８号明細書、同第２０１５／００７１８９９号明細書、及び同第２０１５／００７１９０６号明細書に開示されており、それらの開示は全体として本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、ポリペプチド結合セグメントは、本発明のポリペプチドへの結合を改善するために改変されている。結合を改善するためのポリペプチド結合セグメントの改変方法は、Ｒｉｅｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０２１）及びこの文献の参照文献に記載されている。配列番号９８に好適なガイドＲＮＡの最適化されたポリペプチド結合セグメントは、配列番号１００～１０７として表３に示される。配列番号９９は、最適化前の配列番号９８に好適なポリペプチド結合セグメント配列である。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、又は配列番号１０７から選択される配列を含む。

本開示の実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質及びガイドポリヌクレオチドは、複合体を形成し得る。「複合体」は、２つ以上の会合している核酸及び／又はポリペプチドの群である。実施形態では、複合体は、複合体の全ての成分が一緒に存在する場合に形成され、すなわち、自己集合複合体である。実施形態では、複合体は、複合体の異なる成分間の化学的相互作用、例えば、水素結合などを介して形成される。実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質によるガイドポリヌクレオチドの二次構造認識を介してＣａｓ９エフェクタータンパク質との複合体を形成する。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、それがガイドポリヌクレオチドとの複合体を形成するまで不活性、すなわち、ヌクレアーゼ活性を示さない。ガイドＲＮＡの結合は、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質の立体構造変化を誘導してＣａｓ９エフェクタータンパク質を不活性形態から活性形態、すなわち、触媒的に活性な形態に変換する。

上記の系のいずれかの実施形態では、ガイド配列は、１９～３０塩基長である。実施形態では、ガイド配列は、１９～２５塩基長である。実施形態では、ガイド配列は、２１～２６塩基長である。

上記の系のいずれかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を更に含む。「ｔｒａｃｒＲＮＡ」又はトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡは、プレｃｒＲＮＡ、又はプレＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡとのＲＮＡ二本鎖を形成し、次いでＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼＲＮアーゼＩＩＩにより開裂されてｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドが形成される。実施形態では、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドを含む。実施形態では、ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ構成成分は、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質を活性化させる。

本明細書に開示される系の実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質、ガイドポリヌクレオチド、及びｔｒａｃｒＲＮＡは、複合体を形成することができる。

上記の系のいずれかの実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、粘着末端を生成する。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質により生成される粘着末端は、５’オーバーハングを含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質により生成される粘着末端は、３’オーバーハングを含む。実施形態では、粘着末端は、１～１０ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む。実施形態では、粘着末端は、２～６ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む。実施形態では、粘着末端は、３～５ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む。

実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、５’末端に複数のヌクレオチドを有する粘着末端を好む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、５’末端に３つのヌクレオチドを有する粘着末端を好む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、５’末端に２、３、４、５、又は６つのヌクレオチドを有する粘着末端を好む。実施形態では、この選択は、単一ヌクレオチドの５’粘着末端を好む従来使用されている化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）とは対照的である。

実施形態では、単一ヌクレオチドの５’粘着末端の存在を利用して、目的の核酸を特定の方向に直接挿入することができる。実施形態では、５’粘着末端の３つのヌクレオチドの存在を利用して、目的の核酸を特定の方向に直接挿入することができる。実施形態では、実施形態では、５’粘着末端の２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのヌクレオチドの存在を利用して、目的の核酸を特定の方向に直接挿入することができる。

細胞
実施形態では、本開示は、本明細書で記載されるＣａｓ９エフェクタータンパク質を含む真核細胞を提供する。実施形態では、本開示はまた、本明細書で記載されるＣａｓ９エフェクタータンパク質を含む系を含む真核細胞を提供する。

実施形態では、真核細胞は、動物又はヒト細胞である。実施形態では、真核細胞は、ヒト、又はげっ歯類、又はウシ細胞系、又は細胞株である。このような細胞、細胞系又は細胞株の例としては、限定されるものではないが、マウス骨髄腫（ＮＳＯ）細胞系、チャイニーズハムスター卵母（ＣＨＯ）細胞系、ＨＴ１０８０、Ｈ９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、ＭＤＢＫ Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓細胞）、ＶＥＲＯ、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、Ｙ０、Ｃ１２７、Ｌ細胞、ＣＯＳ、例えば、ＣＯＳ１及び ＣＯＳ７、ＱＣ１－３、ＨＥＫ－２９３、ＶＥＲＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨｅＬＡ、ＥＢ１、ＥＢ２、ＥＢ３、腫瘍溶解又はハイブリドーマ細胞系が挙げられる。実施形態では、真核細胞は、ＣＨＯ細胞株である。実施形態では、真核細胞は、ＣＨＯ細胞である。実施形態では、細胞は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－Ｋ１ ＳＶ細胞、ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞、ＤＵＸＢ１１ ＣＨＯ細胞、ＣＨＯＳ、ＣＨＯ ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯ ＦＵＴ８ ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯＺＮ又はＣＨＯ由来細胞である。ＣＨＯ ＧＳノックアウト細胞（例えば、ＧＳＫＯ細胞）は、例えば、ＣＨＯ－Ｋ１ ＳＶ ＧＳノックアウト細胞である。ＣＨＯ ＦＵＴ８ノックアウト細胞は、例えば、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ＣＨＯＫ１ ＳＶ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．）である。真核細胞は、鳥類細胞、細胞系又は細胞株、例えば、ＥＢｘ（登録商標）細胞、ＥＢ１４、ＥＢ２４、ＥＢ２６、ＥＢ６６、又はＥＢｖｌ３などでもよい。

実施形態では、真核細胞は、ヒト細胞である。実施形態では、ヒト細胞は幹細胞である。幹細胞は、例えば、多能性幹細胞、例として、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞、誘発された多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、組織特異的幹細胞（例えば、造血幹細胞）及び間充織幹細胞（ＭＳＣ）であり得る。実施形態では、ヒト細胞は、本明細書に記載の細胞のいずれかの分化形態である。実施形態では、真核細胞は、培養下の任意の初代細胞に由来する細胞である。実施形態では、細胞は、幹細胞又は幹細胞系である。

実施形態では、真核細胞は、肝細胞、例えばヒト肝細胞、動物肝細胞、又は非実質細胞である。例えば、真核細胞は、付着型代謝試験用ヒト肝細胞、付着型誘導試験用ヒト肝細胞、付着型Ｑｕａｌｙｓｔ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ（商標）ヒト肝細胞、懸濁液試験用ヒト肝細胞（例として、１０－ドナー及び２０－ドナープール肝細胞）、ヒト肝臓クッパー細胞、ヒト肝臓星細胞、イヌ肝細胞（例として、単一及びプールビーグル肝細胞）、マウス肝細胞（例として、ＣＤ－１及びＣ５７ＢＩ／６肝細胞）、ラット肝細胞（例として、Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ、Ｗｉｓｔａｒ Ｈａｎ、及びＷｉｓｔａｒ肝細胞）、サル肝細胞（例として、カニクイザル又はアカゲザル肝細胞）、ネコ肝細胞（例として、ドメスティックショートヘア肝細胞）、及びウサギ肝細胞（例として、ニュージーランドホワイト肝細胞）であり得る。

実施形態では、真核細胞は、植物細胞である。例えば、植物細胞は、作物植物、例えばキャッサバ、トウモロコシ、モロコシ、コムギ又はイネのものであり得る。植物細胞は、藻類、樹木又は野菜のものであり得る。植物細胞は、単子葉若しくは双子葉植物のもの又は作物若しくは穀類植物、生産植物、果実若しくは野菜のものであり得る。例えば、植物細胞は、樹木、例えば柑橘樹木、例えばオレンジ、グレープフルーツ又はレモン樹木；モモ又はネクタリン樹木；リンゴ又はナシ樹木；堅果樹木、例えばアーモンド又はクルミ又はピスタチオ樹木；ナス属の植物、すなわち、ジャガイモ；ブラシカ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の植物、ラクツカ属（Ｌａｃｔｕｃａ）の植物、スピナシア属（Ｓｐｉｎａｃｉａ）の植物；カプシカム属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）の植物；綿、タバコ、アスパラガス、ニンジン、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、トマト、ナス、コショウ、レタス、ホウレンソウ、イチゴ、ブルーベリー、ラズベリー、ブラックベリー、ブドウ、コーヒー、ココアなどのものであり得る。

送達粒子
実施形態では、本開示は、本明細書で記載されるＣａｓ９エフェクタータンパク質を含む送達粒子を提供する。実施形態では、本開示はまた、本明細書で記載されるＣａｓ９エフェクタータンパク質を含む系を含む送達粒子を提供する。

送達粒子が本明細書に記載される系を含む実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質及びガイドポリヌクレオチドは、複合体中に存在する。実施形態では、複合体は、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むポリヌクレオチドを更に含む。

実施形態では、送達粒子は、脂質ベース系、リポソーム、ミセル、マイクロベシクル、エキソソーム、又は遺伝子銃である。実施形態では、送達粒子は、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質及びガイドポリヌクレオチドを含む。実施形態では、送達粒子は、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質及びガイドポリヌクレオチドを含み、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質及びガイドポリヌクレオチドは、複合体中に存在する。実施形態では、送達粒子は、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチド、ガイドポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、及びｔｒａｃｒＲＮＡを含むポリヌクレオチドを含む。実施形態では、送達粒子は、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質、ガイドポリヌクレオチド、及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む。実施形態では、送達粒子は、１つ以上のＣａｓ９エフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチド、１つ以上のガイドポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、及びｔｒａｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む。

実施形態では、送達粒子は、脂質、糖、金属、又はタンパク質を更に含む。実施形態では、送達粒子は、脂質エンベロープである。実施形態では、送達粒子は、糖ベース粒子、例えばＧａｌＮＡｃである。実施形態では、送達粒子は、ナノ粒子である。ナノ粒子の例は、本明細書に記載される。送達粒子の調製は、米国特許出願公開第２０１１／０２９３７０３号明細書、同第２０１２／０２５１５６０号明細書、及び同第２０１３／０３０２４０１号明細書；並びに米国特許第５，５４３，１５８号明細書、同第５，８５５，９１３号明細書、同第５，８９５，３０９号明細書、同第６，００７，８４５号明細書、及び同第８，７０９，８４３号明細書に更に記載されており、それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる。

ベシクル
実施形態では、本開示は、本明細書で記載されるＣａｓ９エフェクタータンパク質を含むベシクルを提供する。実施形態では、本開示はまた、本明細書で記載されるＣａｓ９エフェクタータンパク質を含む系を含むベシクルを提供する。

ベシクルが本明細書に記載される系を含む実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質及びガイドポリヌクレオチドは、複合体中に存在する。実施形態では、複合体は、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むポリヌクレオチドを更に含む。

「ベシクル」は、脂質二重層により封入される流体を有する小部屋内の小型構造である。ベシクルの例は、本明細書に提供される。実施形態では、ベシクルは、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質及びガイドポリヌクレオチドを含む。実施形態では、ベシクルは、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質及びガイドポリヌクレオチドを含み、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質及びガイドポリヌクレオチドは、複合体中に存在する。実施形態では、ベシクルは、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチド、ガイドポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、及びｔｒａｃｒＲＮＡを含むポリヌクレオチドを含む。実施形態では、ベシクルは、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質、ガイドポリヌクレオチド、及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む。実施形態では、ベシクルは、１つ以上のＣａｓ９エフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチド、１つ以上のガイドポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、及びｔｒａｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む。

実施形態では、ベシクルは、エキソソーム又はリポソームである。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質はエキソソームを介して細胞に送達される。エキソソームは、ＲＮＡ及びタンパク質を輸送し、ＲＮＡを脳及び他の標的器官に送達し得る内因性ナノベシクル（すなわち約３０～約１００ｎｍの直径を有する）である。標的器官中への外因性生物材料の送達のための遺伝子操作エキソソームが、例えば、Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９：３４１（２０１１）、Ｅｌ－Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ７：２１１２－２１１６（２０１２）、及びＷａｈｌｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４０（１７）：ｅ１３０（２０１２）により記載されており、それらの各々は参照により全体として本明細書に組み込まれる。

実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質はリポソームを介して細胞に送達される。リポソームは、少なくとも１つの脂質二重層を有する球状ベシクル構造であり、栄養及び医薬物の投与用ビヒクルとして使用することができる。リポソームは、リン脂質、特にホスファチジルコリンから構成されることが多いが、他の脂質、例えば卵ホスファチジルエタノールアミンからも構成される。リポソームの型としては、限定されるものではないが、マルチラメラベシクル、スモールユニラメラベシクル、ラージユニラメラベシクル及び渦巻き型ベシクルが挙げられる。例えば、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，“Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ａｃｔｉｖｅ Ａｇｅｎｔｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９（２０１１）参照。生物材料、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ構成成分の送達用のリポソームは、例えば、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３（８）：１００２－１００７（２００５）、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４４１：１１１－１１４（２００６）、及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １９：７７５－７８０（２０１２）により記載されており、それらの各々は参照により全体として本明細書に組み込まれる。

ウイルスベクター
実施形態では、本開示は、本明細書で記載されるＣａｓ９エフェクタータンパク質を含むウイルスベクターを提供する。実施形態では、本開示はまた、本明細書で記載されるＣａｓ９エフェクタータンパク質を含む系を含むウイルスベクターを提供する。

ウイルスベクターが本明細書に記載される系を含む実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質及びガイドポリヌクレオチドは、複合体中に存在する。実施形態では、複合体は、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むポリヌクレオチドを更に含む。

実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルス粒子、アデノ随伴ウイルス粒子、又は単純ヘルペスウイルス粒子である。実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルス、レンチウイルス、又はアデノ随伴ウイルスのものである。ウイルスベクターの例は、本明細書に提供される。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）及びレンチウイルスベクターによるウイルス形質移入（投与は、局所性、標的化又は全身性であり得る）が、インビボ遺伝子療法の送達法として使用されている。本開示の実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は、形質導入された細胞により細胞内で発現される。

実施形態では、ウイルスベクターは、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質及びガイドポリヌクレオチドを含む。実施形態では、ウイルスベクターは、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質及びガイドポリヌクレオチドを含み、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質及びガイドポリヌクレオチドは、複合体中に存在する。実施形態では、ウイルスベクターは、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチド、ガイドポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、及びｔｒａｃｒＲＮＡを含むポリヌクレオチドを含む。実施形態では、ウイルスベクターは、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質、ガイドポリヌクレオチド、及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む。実施形態では、ウイルスベクターは、１つ以上のＣａｓ９エフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチド、１つ以上のガイドポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、及びｔｒａｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む。

標的配列の部位特異的改変を提供する方法
実施形態では、本開示は、真核細胞中の標的配列の部位特異的改変を提供する方法であって；方法が
ａ）細胞中に；
ｉ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質であって：
Ａ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＮ末端に結合した第１の核局在化シグナルと；
Ｂ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＣ末端に結合した第２の核局在化シグナルと；
を含む、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質をコードするヌクレオチドと、
ｉｉ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質との複合体を形成し、ガイド配列を含むガイドポリヌクレオチドをコードするヌクレオチドであって、ガイド配列が、宿主ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができる、ヌクレオチドと、を導入することと；
ｂ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質及びガイドポリヌクレオチドにより宿主ポリヌクレオチド中の粘着末端を生成することと；
ｃ）
ｉ）（ｂ）の粘着末端と一緒に、又は
ｉｉ）目的のポリヌクレオチド配列の３’末端を１つの粘着末端に、及びポリヌクレオチド配列の５’末端を１つの粘着末端にライゲートし；それにより標的配列を改変することと、を含む方法を提供する。

標的配列の「改変」は、核酸の単一ヌクレオチド置換、複数ヌクレオチド置換、挿入（すなわち、ノックイン）及び欠失（すなわち、ノックアウト）、フレームシフト突然変異、及び他の核酸改変を包含する。

実施形態では、改変は、標的配列の少なくとも一部の欠失である。標的配列は、２つの異なる部位において開裂させ、相補的粘着末端を生成することができ、相補的粘着末端を再ライゲートさせ、それによりその２つの部位間の配列部分を除去することができる。

実施形態では、改変は、標的配列の突然変異である。真核細胞における部位特異的突然変異誘発は、目的突然変異を含有する外因性ポリヌクレオチド鋳型（「ドナーポリヌクレオチド」又は「ドナーベクター」とも呼ばれる）の相同組換えを促進する部位特異的ヌクレアーゼの使用により達成される。実施形態では、目的配列（ＳｏＩ）は、目的突然変異を含む。

実施形態では、改変は、標的配列中への目的配列（ＳｏＩ）の挿入である。ＳｏＩは、外因性ポリヌクレオチド鋳型として導入することができる。実施形態では、外因性ポリヌクレオチド鋳型は、粘着末端を含む。実施形態では、外因性ポリヌクレオチド鋳型は、標的配列中の粘着末端に相補的な粘着末端を含む。

外因性ポリヌクレオチド鋳型は、任意の好適な長さ、例えば約又は少なくとも約１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、５００、又は１０００以上のヌクレオチド長のものであり得る。実施形態では、外因性ポリヌクレオチド鋳型は、標的配列を含むポリヌクレオチドの一部に相補的である。外因性ポリヌクレオチド鋳型は、最適にアラインされる場合、標的配列の１つ以上のヌクレオチド（例えば、約又は少なくとも約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００以上のヌクレオチド）と重複する。実施形態では、外因性ポリヌクレオチド鋳型及び標的配列を含むポリヌクレオチドは、最適にアラインされる場合、外因性ポリヌクレオチド鋳型の最近傍ヌクレオチドは、標的配列から約１、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、１００、１５００、２０００、２５００、５０００、１００００以上のヌクレオチド以内に存在する。

実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、例えばＤＮＡプラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ウイルスベクター、線状一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ片、オリゴヌクレオチド、ＰＣＲ断片、ネイキッド核酸又は送達ビヒクル、例えばリポソームと複合体化している核酸などである。

実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、細胞の内因性ＤＮＡ修復経路を使用して標的配列中に挿入される。内因性ＤＮＡ修復経路としては、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）経路及び相同性配向型修復（ＨＤＲ）経路が挙げられる。ＮＨＥＪ、ＭＭＥＪ及びＨＤＲ経路は、二本鎖ＤＮＡ切断を修復する。ＮＨＥＪにおいて、相同鋳型は、ＤＮＡ中の切断の修復に必要ではない。ＮＨＥＪ修復は、エラープローンであり得るが、エラーは、ＤＮＡ分解が適合性オーバーハングを含む場合に減少する。ＮＨＥＪ及びＭＭＥＪは、それらのそれぞれに関与するＤＮＡ修復酵素の異なるサブセットにより機序的に区別されるＤＮＡ修復経路である。エラープローンと同程度に正確であり得るＮＨＥＪとは異なり、ＭＭＥＪは、常にエラープローンであり、修復下の部位における欠失及び挿入の両方をもたらす。ＭＭＥＩ関連欠失は、二本鎖分解の両側におけるマイクロホモロジー（２～１０塩基対）に起因する。対照的に、ＨＤＲは、修復を指示するために相同鋳型を必要とするが、ＨＤＲ修復は、典型的には、高フィデリティ且つ低エラープローンである。実施形態では、ＮＨＥＪ及びＭＭＥＪ修復のエラープローン性質を活用して、標的配列中の非特異的ヌクレオチド置換を導入する。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、ＨＤＲ修復を容易にする様式で標的配列を切断する。

修復プロセスの間、ＳｏＩを含む外因性ポリヌクレオチド鋳型を標的配列中に導入することができる。実施形態では、上流配列及び下流配列によりフランキングされたＳｏＩを含む外因性ポリヌクレオチド鋳型を細胞中に導入し、上流及び下流配列は、標的配列中の組込みの部位のいずれかの側と配列類似性を共有する。実施形態では、ＳｏＩを含む外因性ポリヌクレオチドは、例えば、突然変異遺伝子を含む。実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、細胞に対して内因性又は外因性である配列を含む。実施形態では、ＳｏＩは、タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は非コード配列、例えば、マイクロＲＮＡなどを含む。実施形態では、ＳｏＩは、調節エレメントに操作可能に連結されている。実施形態では、ＳｏＩは、調節エレメントである。実施形態では、ＳｏＩは、耐性カセット、例えば、抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子を含む。実施形態では、ＳｏＩは、野生型標的配列の突然変異を含む。実施形態では、ＳｏＩは、フレームシフト突然変異又はヌクレオチド置換を作出することにより標的配列を破壊又は補正する。実施形態では、ＳｏＩは、マーカーを含む。標的配列中へのマーカーの導入は、標的化組込みのスクリーニングを容易にし得る。実施形態では、マーカーは、制限部位、蛍光タンパク質又は選択マーカーである。実施形態では、ＳｏＩは、ＳｏＩを含むベクターとして導入する。

外因性ポリヌクレオチド鋳型中の上流及び下流配列は、標的配列及び外因性ポリヌクレオチド間の相同組換えを促進するように選択される。上流配列は、組込みのための標的部位の上流の配列（すなわち標的配列）との配列類似性を共有する核酸配列である。同様に、下流配列は、組込みのための標的化部位の下流の配列との配列類似性を共有する核酸配列である。したがって、実施形態では、ＳｏＩを含む外因性ポリヌクレオチド鋳型は、上流及び下流配列において相同組換えにより標的配列中に挿入する。実施形態では、外因性ポリヌクレオチド鋳型中の上流及び下流配列は、標的化ゲノム配列の上流及び下流配列とそれぞれ少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。実施形態では、上流又は下流配列は、約２０～２０００の塩基対、又は約５０～１７５０の塩基対、又は約１００～１５００の塩基対、又は約２００～１２５０の塩基対、又は約３００～１０００の塩基対、又は約４００～約７５０の塩基対、又は約５００～６００の塩基対を有する。実施形態では、上流又は下流配列は、約５０、約１００、約２５０、約５００、約１００、約１２５０、約１５００、約１７５０、約２０００、約２２５０、又は約２５００の塩基対を有する。

実施形態では、標的配列中の改変は、細胞中の標的配列の発現の不活性化である。例えば、標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の結合時、標的配列は不活性化され、その結果、その配列は転写されず、コードされるタンパク質は産生されず、又は配列は、その野生型配列が機能するようには機能しない。例えば、タンパク質又はマイクロＲＮＡコード配列は、不活性化され得、その結果、タンパク質は、産生されない。

実施形態では、調節配列は、それが調節配列としてもはや機能しないように不活性化させることができる。調節配列の例としては、本明細書に記載のプロモーター、転写終結因子、エンハンサー及び他の調節エレメントが挙げられる。不活性化標的配列としては、欠失突然変異（すなわち１つ以上のヌクレオチドの欠失）、挿入突然変異（すなわち１つ以上のヌクレオチドの挿入）又はナンセンス突然変異（すなわち終止コドンが導入されるような別のヌクレオチドでの単一ヌクレオチドの置換）を挙げることができる。実施形態では、標的配列の不活性化は、標的配列の「ノックアウト」をもたらす。

方法の実施形態では、第１の核局在化シグナルは、単節型核局在化シグナルである。実施形態では、第１の核局在化シグナルは、双節型核局在化シグナルである。実施形態では、第２の核局在化シグナルは、単節型核局在化シグナルである。実施形態では、第２の核局在化シグナルは、双節型核局在化シグナルである。

方法の実施形態では、第１及び第２の核局在化シグナルは、どちらも単節型であり得るか、どちらも双節型であり得るか、又は単節型及び双節型の混合物であり得る。実施形態では、第１の核局在化シグナルは、双節型核局在化シグナルであり、第２の核局在化シグナルは、単節型核局在化シグナルである。実施形態では、第１の核局在化シグナルは、単節型核局在化シグナルであり、第２の核局在化シグナルは、双節型核局在化シグナルである。実施形態では、第１の核局在化シグナルは、単節型核局在化シグナルであり、第２の核局在化シグナルは、単節型核局在化シグナルである。実施形態では、第１の核局在化シグナルは、双節型核局在化シグナルであり、第２の核局在化シグナルは、双節型核局在化シグナルである。

方法の実施形態では、単節型核局在化シグナルは、当該技術分野において公知の単節型核局在化シグナルである。実施形態では、単節型核局在化シグナルは、上記表１に列挙される単節型核局在化シグナル（配列番号１～６）のうちの１つ、又はこれらの組み合わせである。

方法の実施形態では、双節型核局在化シグナルは、当該技術分野において公知の双節型核局在化シグナルである。実施形態では、双節型核局在化シグナルは、古典的双節型核局在化シグナルである。実施形態では、双節型核局在化シグナルは、上記表２に列挙される双節型核局在化シグナル（配列番号７～９）のうちの１つ、又はこれらの組み合わせである。

方法の実施形態では、第１の核局在化シグナルは、古典的双節型核局在化シグナル（配列番号７）であり、第２の核局在化シグナルは、ＳＶ４０ラージＴ抗原の核局在化シグナル（配列番号１）である。

方法の実施形態では、第１の核局在化シグナルは、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質に直接結合している。実施形態では、第１の核局在化シグナルは、リンカーを介してＣａｓ９エフェクタータンパク質に結合している。実施形態では、第２の核局在化シグナルは、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質に直接結合している。実施形態では、第２の核局在化シグナルは、リンカーを介してＣａｓ９エフェクタータンパク質に結合している。

リンカーが使用される実施形態では、リンカーは、２～３０個の残基を有するペプチドリンカーである。実施形態では、リンカーは、２～２０個の残基を有するペプチドリンカーである。実施形態では、リンカーは、２～１５個の残基を有するペプチドリンカーである。実施形態では、リンカーは、２～１０個の残基を有するペプチドリンカーである。実施形態では、リンカーは、２～５個の残基を有するペプチドリンカーである。実施形態では、リンカーは、置換又は非置換のＣ_２～Ｃ_２０アルキル、アルケン、又はアルキニル鎖である。

方法の実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、そのＮ末端上に、核局在化シグナルの２つ以上のコピーを含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、そのＮ末端上に、核局在化シグナルの２つ以上の型を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、そのＣ末端上に、核局在化シグナルの２つ以上のコピーを含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、そのＣ末端上に、核局在化シグナルの２つ以上の型を含む。

方法の実施形態では、タンパク質は、第１の核局在化シグナルの２つのコピーを含む。実施形態では、タンパク質は、第１の核局在化シグナルの３つのコピーを含む。実施形態では、タンパク質は、第２の核局在化シグナルの２つのコピーを含む。実施形態では、タンパク質は、第２の核局在化シグナルの３つのコピーを含む。

方法の実施形態では、第１及び第２の核局在化シグナルを含むＣａｓ９タンパク質のＣａｓ９部分は、当該技術分野において公知の任意のＣａｓ９エフェクタードメインに由来し得る。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、ＩＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ系を有する細菌種に由来する。好適なＩＩ－Ｂ型Ｃａｓ９タンパク質の例は、上記に記載されている。実施形態では、Ｃａｓ９部分は、１Ｅ－５のＥ値カットオフを有するＴＩＧＲ０３０３１タンパク質ファミリーにマッチするドメインを含む。実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼは、１Ｅ－１０のＥ値カットオフを有するＴＩＧＲ０３０３１タンパク質ファミリーにマッチするドメインを含む。

方法の実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、図１及び図２に示される配列番号１０～９７のいずれか１つに対して少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、図１及び図２に示される配列番号１０～９７のいずれか１つに対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、図１及び図２に示される配列番号１０～９７のいずれか１つに対して少なくとも９８％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、図１及び図２に示される配列番号１０～９７のいずれか１つに対して少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、図１及び図２に示される配列番号１０～９７のうちの１つから選択されるポリペプチドを含む。

方法の実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号７１と少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号７１と少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号７１と少なくとも９８％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号７１と少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号７１を含む。

方法の実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号９８と少なくとも９０％同一のポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号９８と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号９８と少なくとも９８％同一のポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号９８と少なくとも９９％同一のポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号９８を含む。

方法のその他の実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＣａｓ９部分は、ｄＣａｓ９、すなわち、ＤＮＡ二本鎖開裂活性を欠く不活性化された、又は「死んだ」Ｃａｓ９を含む。実施形態では、ｄＣａｓ９は、本明細書の他の場所に記載されているように、転写制御因子、エピジェネティクスな調節タンパク質、又は蛍光タンパク質などの他の活性ドメインと融合することができる。ｄＣａｓ９が別の活性ドメインに融合される実施形態では、本明細書に記載される核局在化シグナルは、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質コンストラクト全体のＮ末端及びＣ末端に存在する。

方法のその他の実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＣａｓ９部分は、Ｃａｓ９ニッカーゼ、すなわちＤＮＡ二本鎖の一方の鎖のみを開裂するＣａｓ９タンパク質を含む。実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、本明細書の他の場所に記載されているように、転写制御因子、エピジェネティクスな調節タンパク質、又は蛍光タンパク質などの他の活性ドメインと融合することができる。Ｃａｓ９ニッカーゼが別の活性ドメインに融合される実施形態では、本明細書に記載される核局在化シグナルは、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質コンストラクト全体のＮ末端及びＣ末端に存在する。

実施形態では、方法は、本明細書に記載されるガイドポリヌクレオチドの使用を含む。方法の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。

上記の系のいずれかの実施形態では、ガイド配列は、１９～３０塩基長である。実施形態では、ガイド配列は、１９～２５塩基長である。実施形態では、ガイド配列は、２１～２６塩基長である。

上記の系のいずれかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるｔｒａｃｒＲＮＡ配列を更に含む。本明細書に開示される系の実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質、ガイドポリヌクレオチド、及びｔｒａｃｒＲＮＡは、複合体を形成することができる。

方法の実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、粘着末端を生成する。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質により生成される粘着末端は、５’オーバーハングを含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質により生成される粘着末端は、３’オーバーハングを含む。実施形態では、粘着末端は、１～１０ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む。実施形態では、粘着末端は、２～６ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む。実施形態では、粘着末端は、３～５ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む。

方法の実施形態では、真核細胞は、動物又はヒト細胞である。実施形態では、真核細胞は、本明細書に記載される動物細胞である。実施形態では、真核細胞は、ヒト細胞である。実施形態では、真核細胞は、本明細書に記載されるヒト細胞である。実施形態では、真核細胞は、植物細胞である。実施形態では、真核細胞は、本明細書に記載される植物細胞である。

方法の実施形態では、改変は、標的配列の少なくとも一部の欠失である。実施形態では、改変は、標的配列の突然変異である。実施形態では、改変は、標的配列中への目的配列の挿入である。実施形態では、改変は、本明細書に記載される改変である。

方法の実施形態では、改変により、オフターゲット効果が減少する。方法の実施形態では、改変により、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）によりもたらされるオフターゲット効果と比較して、減少したオフターゲット効果がもたらされる。

本開示は、また、オフターゲット効果が減少した真核細胞中の標的配列の部位特異的改変を提供する方法であって；方法が
ａ）細胞中に；ｉ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質であって：Ａ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＮ末端に結合した第１の核局在化シグナルと；Ｂ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＣ末端に結合した第２の核局在化シグナルと；を含む、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質をコードするヌクレオチドと、ｉｉ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質と複合体を形成し、ガイド配列を含むガイドポリヌクレオチドをコードするヌクレオチドであって、ガイド配列が、宿主ポリヌクレオチド中の標的配列とハイブリダイズすることができる、ヌクレオチドと、を導入することと；
ｂ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質及びガイドポリヌクレオチドにより宿主ポリヌクレオチド中の粘着末端を生成することと；
ｃ）ｉ）（ｂ）の粘着末端と一緒に、又はｉｉ）目的のポリヌクレオチド配列の３’末端を１つの粘着末端に、及びポリヌクレオチド配列の５’末端を１つの粘着末端にライゲートし；それによりオフターゲット効果を減少させながら標的配列を改変することと、を含む方法を提供する。

方法の実施形態では、改変により、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）によりもたらされるオフターゲット効果と比較して、減少したオフターゲット効果がもたらされる。方法の実施形態では、改変により、野生型化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）によりもたらされるオフターゲット効果と比較して、減少したオフターゲット効果がもたらされる。

Ｃａｓ９エフェクタータンパク質の分解を低減する方法
実施形態では、本開示は、細胞内のＣａｓ９エフェクタータンパク質の分解を低減する方法であって：
ａ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＮ末端に第１の核局在化シグナルを結合させることと；
ｂ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＣ末端に第２の核局在化シグナルを結合させることと；
を含む方法を提供する。

実施形態では、結合は、本明細書に記載されているように行うことができる。実施形態では、核局在化シグナルをコードする核酸配列は、制限酵素消化及びライゲーションなどの標準的な分子生物学的方法を使用して、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質をコードする核酸配列の上流及び下流に配置され、その結果、そのＮ末端とＣ末端に核局在化シグナルを含むＣａｓ９エフェクタータンパク質をコードする核酸が形成される。次いで、この核酸を細胞、例えば真核細胞内で発現させることができる。その他の実施形態では、そのＮ末端及びＣ末端に核局在化シグナルを含むＣａｓ９エフェクタータンパク質は、固相タンパク質合成を使用して完全又は部分的に合成される。

方法の実施形態では、第１の核局在化シグナルは、単節型核局在化シグナルである。実施形態では、第１の核局在化シグナルは、双節型核局在化シグナルである。実施形態では、第２の核局在化シグナルは、単節型核局在化シグナルである。実施形態では、第２の核局在化シグナルは、双節型核局在化シグナルである。

方法の実施形態では、第１及び第２の核局在化シグナルは、どちらも単節型であり得るか、どちらも双節型であり得るか、又は単節型及び双節型の混合物であり得る。実施形態では、第１の核局在化シグナルは、双節型核局在化シグナルであり、第２の核局在化シグナルは、単節型核局在化シグナルである。実施形態では、第１の核局在化シグナルは、単節型核局在化シグナルであり、第２の核局在化シグナルは、双節型核局在化シグナルである。実施形態では、第１の核局在化シグナルは、単節型核局在化シグナルであり、第２の核局在化シグナルは、単節型核局在化シグナルである。実施形態では、第１の核局在化シグナルは、双節型核局在化シグナルであり、第２の核局在化シグナルは、双節型核局在化シグナルである。

方法の実施形態では、単節型核局在化シグナルは、当該技術分野において公知の単節型核局在化シグナルである。実施形態では、単節型核局在化シグナルは、上記表１に列挙される単節型核局在化シグナル（配列番号１～６）のうちの１つ、又はこれらの組み合わせである。

方法の実施形態では、双節型核局在化シグナルは、当該技術分野において公知の双節型核局在化シグナルである。実施形態では、双節型核局在化シグナルは、古典的双節型核局在化シグナルである。実施形態では、双節型核局在化シグナルは、上記表２に列挙される双節型核局在化シグナル（配列番号７～９）のうちの１つ、又はこれらの組み合わせである。

方法の実施形態では、第１の核局在化シグナルは、古典的双節型核局在化シグナル（配列番号７）であり、第２の核局在化シグナルは、ＳＶ４０ラージＴ抗原の核局在化シグナル（配列番号１）である。

方法の実施形態では、第１の核局在化シグナルは、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質に直接結合している。実施形態では、第１の核局在化シグナルは、リンカーを介してＣａｓ９エフェクタータンパク質に結合している。実施形態では、第２の核局在化シグナルは、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質に直接結合している。実施形態では、第２の核局在化シグナルは、リンカーを介してＣａｓ９エフェクタータンパク質に結合している。

リンカーが使用される実施形態では、リンカーは、２～３０個の残基を有するペプチドリンカーである。実施形態では、リンカーは、２～２０個の残基を有するペプチドリンカーである。実施形態では、リンカーは、２～１５個の残基を有するペプチドリンカーである。実施形態では、リンカーは、２～１０個の残基を有するペプチドリンカーである。実施形態では、リンカーは、２～５個の残基を有するペプチドリンカーである。実施形態では、リンカーは、置換又は非置換のＣ_２～Ｃ_２０アルキル、アルケン、又はアルキニル鎖である。

方法の実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、そのＮ末端上に、核局在化シグナルの２つ以上のコピーを含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、そのＮ末端上に、核局在化シグナルの２つ以上の型を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、そのＣ末端上に、核局在化シグナルの２つ以上のコピーを含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、そのＣ末端上に、核局在化シグナルの２つ以上の型を含む。

方法の実施形態では、タンパク質は、第１の核局在化シグナルの２つのコピーを含む。実施形態では、タンパク質は、第１の核局在化シグナルの３つのコピーを含む。実施形態では、タンパク質は、第２の核局在化シグナルの２つのコピーを含む。実施形態では、タンパク質は、第２の核局在化シグナルの３つのコピーを含む。

方法の実施形態では、第１及び第２の核局在化シグナルを含むＣａｓ９タンパク質のＣａｓ９部分は、当該技術分野において公知の任意のＣａｓ９エフェクタードメインに由来し得る。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、ＩＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ系を有する細菌種に由来する。好適なＩＩ－Ｂ型Ｃａｓ９タンパク質の例は、上記に記載されている。実施形態では、Ｃａｓ９部分は、１Ｅ－５のＥ値カットオフを有するＴＩＧＲ０３０３１タンパク質ファミリーにマッチするドメインを含む。実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼは、１Ｅ－１０のＥ値カットオフを有するＴＩＧＲ０３０３１タンパク質ファミリーにマッチするドメインを含む。

方法の実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、図１及び図２に示される配列番号１０～９７のいずれか１つに対して少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、図１及び図２に示される配列番号１０～９７のいずれか１つに対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、図１及び図２に示される配列番号１０～９７のいずれか１つに対して少なくとも９８％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、図１及び図２に示される配列番号１０～９７のいずれか１つに対して少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、図１及び図２に示される配列番号１０～９７のうちの１つから選択されるポリペプチドを含む。

方法の実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号７１と少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号７１と少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号７１と少なくとも９８％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号７１と少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号７１を含む。

方法の実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号９８と少なくとも９０％同一のポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号９８と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号９８と少なくとも９８％同一のポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号９８と少なくとも９９％同一のポリペプチド配列を含む。実施形態では、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、配列番号９８を含む。

本明細書に引用される全ての参考文献、例えば特許、特許出願、論文、教科書等及びこれらに引用される参考文献は、それらが既に引用されていない限り、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

実施例１－Ｃａｓ９はリソソーム分解の基質である
腸メタゲノムＭＨ０２４５（ＭＨＣａｓ９）配列からのＣａｓ９タンパク質は－国際公開第２０１９０９９９４３号パンフレット（参照として本明細書に組み込まれている）に記載されているとおり－ＳＶ４０単節型核局在化シグナル（ＮＬＳ；配列番号１）の３つのコピーをコードするプラスミドにクローニングして、Ｎ末端に３つのＳＶ４０ＮＬＳが結合したＣａｓ９タンパク質である３ｘＳＶ４０－ＭＨＣａｓ９を形成した。

プラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。細胞をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地で２４時間培養した後、以下のいずれかを細胞培養物に添加した：１）濃度５μＭのプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２；２）濃度２０ｎＭのリソソームｖＡＴＰアーゼ阻害剤バフィロマイシンＡ１；又は３）濃度１０ｎＭの核外輸送阻害剤レプトマイシンＢ。非処理細胞を対照として使用した。細胞を回収し、続いて全タンパク質を抽出した。

トランスフェクションの前日に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレート上のウェル当たり２５，０００個の細胞密度で播種した。播種の２０時間後、細胞に上記のプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、１００μＬの培地を細胞に添加した。トランスフェクションの６０時間後に細胞を回収した。

回収後、バンド強度の正規化のために、ウェスタンブロットを使用して、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）のブロットと比較して３ｘＳＶ４０－ＭＨＣａｓ９の総レベルを分析した。ブロットを図３Ａに示す。ウェスタンブロットを定量化し、正規化したタンパク質発現を図３Ｂに示すようにプロットした。

図３Ｂに見ることができるように、バフィロマイシンＡ１によるリソソーム機能のブロッキングはＭＨＣａｓ９レベルの増加をもたらし、これはＭＨＣａｓ９がリソソーム内で分解されていることを示唆している。

実施例２－Ｃａｓ９へＮＬＳを追加して分解を防止する
実施例１に記載したＭＨＣａｓ９を、核局在化シグナルをコードするプラスミドにクローニングして、４つの異なるＣａｓ９エフェクタータンパク質コンストラクトを形成した：１）実施例１に記載されている３ｘＳＶ４０－ＭＨＣａｓ９；２）Ｃ末端に単一のＳＶ４０ ＮＬＳを有するＭＨＣａｓ９（ＭＨＣａｓ９－ＮＬＳＳＶ４０）；３）Ｎ末端に３つのＳＶ４０ ＮＬＳ及びＣ末端に単一のＳＶ４０ ＮＬＳを有するＭＨＣａｓ９（３ＸＮＬＳＳＶ４０－ＭＨＣａｓ９－ＮＬＳＳＶ４０）；並びに４）Ｎ末端に単一の双節型ＮＬＳ（配列番号７）及びＣ末端に単一のＳＶ４０ ＮＬＳを有するＭＨＣａｓ９（ｂｐＮＬＳ－ＭＨＣａｓ９－ＳＬＳＳＶ４０）。プラスミドは、トランスフェクションの正規化のために検出された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現した。

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を実施例１に記載したようにトランスフェクトし、増殖させたが、阻害剤では何も処理しなかった。細胞を回収し、ゲルローディング対照としてチューブリンを検出し、トランスフェクション量の正規化にＧＦＰを使用してウェスタンブロットを実施した。ブロットを、図４に示す。見ることができるように、Ｃａｓ９のＣ末端にＮＬＳを追加すると、ｉｎ ｖｉｖｏでのタンパク質の安定性が高まる。ｂｐＮＬＳ－ＭＨＣａｓ９－ＳＬＳＳＶ４０タンパク質は、更なる研究のために選択され、ＳｐＯＴ－ＯＮと名付けられた。

実施例３－両末端にＮＬＳを有するＣａｓ９コンストラクトは、リソソーム分解を防止する
他のＣａｓ９タンパク質に対するＮＬＳの効果を試験するために、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）を実施例２のコンストラクト４と同じベクターにクローン化し、ｂｐＮＬＳ－ＳｐＣａｓ９－ＮＬＳＳＶ４０コンストラクトを形成した。

ＳｐＯＴ－ＯＮ及びｂｐＮＬＳ－ＳｐＣａｓ９－ＮＬＳＳＶ４０を発現する細胞は、未処理のまま放置するか、実施例１で使用したのと同じ濃度の阻害剤ＭＧ１３２、バフィロマイシンＡ１、又はレプトマイシンの存在下で増殖させた。細胞を回収し、実施例１で記載したようにバンド強度の正規化にＭＡＰＫを使用して、ウェスタンブロットを実施した。ＳｐＯＴ－ＯＮについてのブロットを図５Ａに示し、ｂｐＮＬＳ－ＳｐＣａｓ９－ＮＬＳＳＶ４０についてのブロットを図５Ｂに示す。

ブロットに見ることができるように、試料が阻害剤で処理されたか、又は実施例１の分解を有意に遅らせなかった阻害剤（ＭＧ１３２及びレプトマイシンＢ）で処理されたかに関係なく、同じレベルのタンパク質が検出される。追加のＮＬＳシグナルによって提供される核重要性の強化により、細胞質でのタンパク質の分解が防止される可能性がある。更に、Ｎ末端及びＣ末端にＮＬＳシグナルを追加すると、ＭＨＣａｓ９及びＳＰＣａｓ９の両方について向上した安定性をもたらし、これは、この技術が全ての型のＣａｓ９タンパク質の安定性を高めるために一般的に適用できることを示唆している。

実施例４－ＳｐＯＴ－ＯＮは未改変Ｃａｓ９と同じＤＮＡ開裂活性を有する
ＳｐＯＴ－ＯＮのＤＮＡ開裂活性をＮＬＳを欠くＣａｓ９と比較し、同様であることが判明した。

ＳｐＯＴ－Ｏｎ及び化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質（ＳｐｙＣａｓ９）の開裂活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで測定した。２０ｎｔプロトスペーサーを標的とするＣａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を、蛍光標識された標的ＤＮＡ及びプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を欠くローディング対照と混合した。反応物を３７Ｃでインキュベートし、アリコートを異なる時点で採取し、クエンチして、キャピラリー電気泳動を使用して解像した。消化されたＤＮＡの画分を定量化し、ローディング対照及びゼロ時点に対して正規化し、次いで時間に対してプロットした。どちらの酵素も標的ＤＮＡを同じ程度に消化した。データの分析（図示せず）により、次の速度定数（ｋ）が決定された：ＳｐｙＣａｓ９、ｋ＝０．２２４及びＳｐＯＴ－ＯＮ、ｋ＝０．００４。

結果は、ＳｐＯＴ－Ｏｎ Ｃａｓ９がｉｎ ｖｉｔｒｏでＳｐｙＣａｓ９と同程度に標的ＤＮＡを消化できることを示した。しかしながら、様々な速度定数に見られるように、この開裂はＳｐＯＴ－Ｏｎ Ｃａｓ９ではＳｐｙＣａｓ９よりも遅く起こる。

実施例５－ＳｐＯＴ－ＯＮは未改変Ｃａｓ９と同じ編集活性を有する
ＳｐＯＴ－ＯＮのＤＮＡ遺伝子編集活性をＮＬＳを欠くＣａｓ９と比較し、同様であることが判明した。

遺伝子編集活性を、ＳｐＯＴ－ＯＮ及びＳｐＣａｓ９について比較した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、Ｃａｓ９バリアントと、ＨＥＫ３、ＨＥＫ４、ＥＭＸ１、及びＦＡＮＣＦのガイドＲＮＡを発現する発現ベクターによってトランスフェクトした。ＣＤ３４を挿入部位として使用し、ＳＴＡＴ１を欠失部位として使用した。細胞を７２時間培養し、次いで溶解してＤＮＡを得た。発生した編集を評価するために、ディープアンプリコンシーケンシングを実施した。図６に見ることができるように、編集効率はＳｐＯＴ－ＯＮとＳｐＣａｓ９とで同様であった。

実施例６－ＳｐＯＴ－ＯＮの最適なプロトスペーサー長の決定
実施例４に見られるＳｐＯＴ－Ｏｎ Ｃａｓ９によるＤＮＡの遅い開裂は、ｓｇＲＮＡの設計が最適ではないことにより引き起こされ、特にプロトスペーサー長が原因であると仮説が立てられた。実施例４のｉｎ ｖｉｔｒｏ開裂実験を、同じ配列を標的とする様々なプロトスペーサー標的配列長を有する一連のｓｇＲＮＡで形成されたＳｐＯＴ－Ｏｎ Ｃａｓ９ＲＮＰについて繰り返した。

反応効率を最適化するために、実施例４に記載の方法を用いて、様々なスペーサー長を有するガイドＲＮＡの開裂活性を決定し、プロットした。バーは計算された速度定数を表し、エラーバーはフィッティングの標準誤差を表す。結果を図７に示す。

図７に見ることができるように、より短いプロトスペーサー（１８～２０ｎｔ）を標的とするＳｐＯＴ－Ｏｎ Ｃａｓ９は、ＤＮＡ開裂の効率が低くなる。しかしながら、より長いガイドを有するＲＮＰはＤＮＡを１０～５０倍速く消化し、これは、ＳｐＯＴ－Ｏｎ Ｃａｓ９の最適な活性には少なくとも２１ヌクレオチドの標的配列が必要であることを示唆している。

更なる研究を実施して、ｉｎ ｖｉｖｏでの最適なプロトスペーサー長を決定した。開裂活性を２つの異なる標的部位：ＥＭＸ１及びＣＤ３４でｉｎ ｖｉｖｏで試験した。

トランスフェクションの前日に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレート上のウェル当たり２５，０００個の細胞密度で播種した。播種の２０時間後、細胞に上記のプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、１００μＬの培地を細胞に添加した。トランスフェクションの６０時間後に、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ抽出溶液（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用して細胞を回収した。ディープターゲットアンプリコンシーケンシングを実施した。図８で示される棒グラフは、マッピングされたリードにおける変異リードの平均パーセンテージを示す。複製数ｎ＝３（細胞を３つのストックに分離し、次いでトランスフェクトして個別に分析した）。

図８に見ることができるように、ＳｐＯＴ－ＯＮに最適なプロトスペーサー長は１９～２３ヌクレオチドであり、２１ヌクレオチドがピーク活性を示す。

実施例７－ＳｐＯＴ－ＯＮはオフターゲットＤＮＡ編集の減少を示す
遺伝子編集活性を、実施例５で記載したものと同様の方法を使用して、ＳｐＯＴ－ＯＮ及びＳｐＣａｓ９について比較した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、Ｃａｓ９バリアントと、ＨＥＫ３、ＨＥＫ４、ＥＭＸ１、及びＦＡＮＣＦのガイドＲＮＡを発現する発現ベクターによってトランスフェクトした。細胞を７２時間培養し、次いで溶解してＤＮＡを得た。発生した編集を評価するために、ディープアンプリコンシーケンシングを実施した。Ｃｒｉｓｐｒｅｓｓｏ２プール解析を使用して、オフターゲット編集の解析を実施した。解析された１４のオフターゲット部位は、Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５ Ｆｅｂ；３３（２）：１８７－１９７）により決定されるものであった。オフターゲット解析のプロットを図９に示す。

図９に見ることができるように、ＳｐＯＴ－ＯＮは、ＳｐＣａｓ９よりもオフターゲット部位での編集のパーセンテージが大幅に減少しており、ＳｐＯＴ－ＯＮがオンターゲット配列とオフターゲット配列の識別に優れていることを示している。

実施例８－オフターゲットＤＮＡ編集の解析
基質ＤＮＡのミスマッチがＤＮＡ開裂の反応速度にどのような影響を与えるかを調査するために、更なる研究を実施した。ＳｐｙＣａｓ９とＳｐＯＴ－ＯＮの特異性を研究するために、標的配列内に単一塩基対の置換を有するＤＮＡ基質を生成した。Ｃａｓ９酵素の活性は、ＰＡＭからの位置１、２、及び３で完全に一致するＤＮＡ基質及びミスマッチのＤＮＡ基質について測定された。実験は、最適なガイドを用いて、上記の実施例に記載されているように実施した。各ＤＮＡ基質の開裂速度定数を計算し、図１０にプロットした。

図１０にて示すように、Ｃａｓ９酵素は、ミスマッチのＤＮＡ基質を完全に一致するＤＮＡ基質よりもゆっくりと消化する。ＰＡＭのすぐ隣にミスマッチがあると、Ｓｐｙ Ｃａｓ９とＳｐＯＴ－Ｏｎ Ｃａｓ９との両方の開裂速度が大幅に低下する。より遠位のミスマッチは、Ｓｐｙ Ｃａｓ９活性をわずかに低下させるだけであったが、ＳｐＯＴ－Ｏｎ Ｃａｓ９は少なくとも１０倍阻害された。これらのデータは、ＳｐＯＴ－Ｏｎ Ｃａｓ９がｉｎ ｖｉｔｒｏでＳｐｙ Ｃａｓ９よりも特異的な酵素であることを示唆しており、ｉｎ ｖｉｖｏでのＳｐＯＴ－Ｏｎ Ｃａｓ９のオフターゲットゲノム編集活性が低いことを説明できる可能性がある。

実施例９－ｉｎ ｖｉｖｏでのミスマッチ許容性
ｉｎ ｖｉｖｏでのＳｐＯＴ－ＯＮのミスマッチ許容性、ＥＭＸ１のミスマッチ編集は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で２３ヌクレオチドのガイドＲＮＡを用いて試験された。

トランスフェクションの前日に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレート上のウェル当たり２５，０００個の細胞密度で播種した。播種の２０時間後、細胞に上記のプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、１００μＬの培地を細胞に添加した。トランスフェクションの６０時間後に、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ抽出溶液（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用して細胞を回収した。ディープターゲットアンプリコンシーケンシングを実施した。図１１で示される棒グラフは、マッピングされたリードにおける変異リードの平均パーセンテージを示す。複製数ｎ＝３（細胞を３つのストックに分離し、次いでトランスフェクトして個別に分析した）。

図１１で見ることができるように、位置１～１０（１がＰＡＭに最も近い）でのミスマッチは許容されず、編集が全く行われないか、非常に低い編集（＞０．７％）になる。位置１１～２１間のミスマッチは、最大２０％の中程度の編集効率を示した。位置２２でのミスマッチは、ミスマッチのないｓｇＲＮＡと同様の編集効率（約５５％）をもたらした。

実施例１０－切断部位のＤＮＡ編集及び解析
ＤＮＡ修復結果の定性的評価のために、ＥＭＸ及びＣＤ３４遺伝子座におけるＤＮＡ編集を更に解析した。実施例９に記載のように細胞を播種し、増殖させた。ＲＩＭＡを使用して解析したアンプリコンシーケンシングのＮＧＳ結果を、ＥＭＸ１については図１２Ａ、ＣＤ３４については図１２Ｂ、ＳｐＣａｓ９を用いたＣＤ３４対照については図１２Ｃで示した。

これらの結果は、ＳｐＯＴ－ＯＮがＤＮＡを切断してＨＥＫ２９３Ｔ細胞に３ヌクレオチドのオーバーハングを生成することを実証した。

実施例１１－ノックイン実験
実験は、２つの標的部位：ＣＤ３４及びＳＴＡＴ１で平滑末端又は異なるオーバーハングを有するオリゴの指向性非相同末端結合（ＮＨＥＪ）媒介ノックインの効率を評価するために実施した。ＤＮＡ ＰＫ（Ｍ９８３１／ＶＸ－９８４）阻害剤を、ＮＨＥＪ阻害剤として最終濃度１μＭで試料の半分に添加し、ＮＨＥＪが発生していることを実証した。ＳｐＯＴ－ＯＮ Ｃａｓ９とＳｐＣａｓ９とを比較した。実施例９に記載のように細胞を播種し、増殖させた。ディープターゲットアンプリコンシーケンシングを使用して、ＤＮＡを解析した。

ＣＤ３４遺伝子座におけるノックインについての結果を図１３に示す。ＳＴＡＴ１遺伝子座におけるノックインについての結果を図１４に示す。図１３及び図１４に見ることができるように、ＳｐＯＴ－ＯＮは、３ヌクレオチドの５’オーバーハングの選択基質で最高の活性を示し（灰色のボックス）、一方、ＳｐＣａｓ９は、１ヌクレオチドの５’オーバーハングの選択基質で最高の活性を示す（白色のボックス）。プロットは、挿入の潜在的な両方の指向性について示されており、濃い灰色は順方向（予想される）挿入を表し、明るい灰色は逆方向挿入を表す。ＤＮＡＰＫカラムで見られるように、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤処理によりオリゴドナー挿入が完全に阻害され、ノックインがＮＨＥＪ媒介であることが証明される。

データからわかるように、平滑末端ｄｓＤＮＡオリゴは、ＳｐＣａｓ９又はＳｐＯＴ－ＯＮ Ｃａｓ９で二本鎖切断を導入した後、順方向及び逆方向に組み込まれる。ＮＨＥＪを介した挿入は、３ヌクレオチドの短い相同性アームがオリゴの両端に導入されている場合にも見られる。

ＳｐＯＴ－ＯＮ Ｃａｓ９は、１ｂｐの５’オーバーハング、３ヌクレオチド及び４ヌクレオチドのオーバーハングを有するｄｓＤＮＡオリゴの標的組み込みを効率的に可能にし、指向性のある３ヌクレオチドのオーバーハングの効率が最も高くなる。ＳｐＣａｓ９は１ヌクレオチドのオーバーハングを有するｄｓＤＮＡの組み込み効率が高いのに対し、３ヌクレオチド又は４ヌクレオチドのオーバーハングを有するｄｓＤＮＡの組み込み効率は低くなる。これらの結果は、ＳｐＯＴ－ＯＮ Ｃａｓ９ ＤＳＢは主に３ヌクレオチドの５’オーバーハングをもたらし、ＳｐＣａｓ９は１ヌクレオチドのオーバーハングを有する千鳥状の切断を示すことを示唆している。

３’オーバーハング（３ヌクレオチド）を有するｄｓＤＮＡオリゴの連携効率は、ＳｐＣａｓ９及びＳｐＯＴ－ＯＮ Ｃａｓ９では５％未満である。これは、５’オーバーハングが生成されるという理論をさらに裏付ける。

実施例１２ 様々なＳｐＯＴ－ＯＮ酵素の比較
ＤＮＡ結合部位付近の残基に単一アミノ酸置換を導入することにより、ＳｐＯＴ－ＯＮのゲノム編集効率を向上させる実験を実施した。ＤＮＡ結合部位近くのＳｐＯＴ－ＯＮ残基は、Ａｌｐｈａ Ｆｏｌｄ２（Ｊｕｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ２０２１）を使用して、ＳｐＯＴ－ＯＮ構造をモデル化することによって定義された（表図１６Ａ参照）。追跡調査及び突然変異誘発のための残基のサブセットを選択した。例えば、ＳｐＯＴ－ＯＮ複合体のその標的ＤＮＡとの結合を増加させるために、負電荷（アスパラギン酸（ＡＳＰ又はＤ）又はグルタミン酸（ＧＬＵ又はＥ））が除去され、及び／又は正電荷（アルギニン（ＡＲＧ又はＲ）又はリジン（ＬＹＳ又はＫ））が導入された。ＳｐＯＴ－ＯＮバリアントは、実施例５に記載されているように、突然変異誘発によって生成され、細胞にトランスフェクトされた。表３は、ＳｐＯＴ－ＯＮ活性に対する影響について試験された変異を示す。全体として、ＳｐＯＴ－ＯＮのＰＡＭ相互作用領域（ＣＴＤドメイン）付近並びにＲＥＣ３ドメインの変異は、酵素活性の向上を示す。

Claims (124)

1. Ｃａｓ９エフェクタータンパク質であって：
   ａ）前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＮ末端に結合した第１の核局在化シグナルと；
   ｂ）前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＣ末端に結合した第２の核局在化シグナルと；
   を含む、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質。
2. 前記第１の核局在化シグナルが、単節型核局在化シグナルである、請求項１に記載のタンパク質。
3. 前記第１の核局在化シグナルが、双節型核局在化シグナルである、請求項１に記載のタンパク質。
4. 前記第２の核局在化シグナルが、単節型核局在化シグナルである、請求項１～３のいずれか一項に記載のタンパク質。
5. 前記第２の核局在化シグナルが、双節型核局在化シグナルである、請求項１～３のいずれか一項に記載のタンパク質。
6. 前記第１の核局在化シグナルが、双節型核局在化シグナルであり、前記第２の核局在化シグナルが、単節型核局在化シグナルである、請求項１に記載のタンパク質。
7. 前記単節型核局在化シグナルが、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ヌクレオプラスミン、ＥＧＬ－１３、ｃ－Ｍｙｃ、ＴＵＳタンパク質の核局在化シグナル、又はこれらの組み合わせである、請求項２、４、又は６のいずれか一項に記載のタンパク質。
8. 前記双節型核局在化シグナルが、古典的双節型核局在化シグナルである、請求項３、５、又は６のいずれか一項に記載のタンパク質。
9. 前記第１の核局在化シグナルが、古典的双節型核局在化シグナルであり、前記第２の核局在化シグナルが、ＳＶ４０ラージＴ抗原の核局在化シグナルである、請求項６に記載のタンパク質。
10. 前記第１の核局在化シグナルが、前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質に直接結合している、請求項１～９のいずれか一項に記載のタンパク質。
11. 前記第１の核局在化シグナルが、リンカーを介して前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質に結合している、請求項１～９のいずれか一項に記載のタンパク質。
12. 前記第２の核局在化シグナルが、前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質に直接結合している、請求項１～１１のいずれか一項に記載のタンパク質。
13. 前記第２の核局在化シグナルが、リンカーを介して前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質に結合している、請求項１～１１のいずれか一項に記載のタンパク質。
14. 前記リンカーが、２～３０個の残基を有するペプチドリンカーである、請求項１１又は１３に記載のタンパク質。
15. 前記タンパク質が、前記第１の核局在化シグナルの２つのコピーを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のタンパク質。
16. 前記タンパク質が、前記第１の核局在化シグナルの３つのコピーを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のタンパク質。
17. 前記タンパク質が、前記第２の核局在化シグナルの２つのコピーを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のタンパク質。
18. 前記タンパク質が、前記第２の核局在化シグナルの３つのコピーを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のタンパク質。
19. 前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質が、配列番号１０～９７のいずれか１つに対して少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載のタンパク質。
20. 前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質が、１Ｅ－５のＥ値カットオフを有するＴＩＧＲ０３０３１タンパク質ファミリーにマッチするドメインを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載のタンパク質。
21. 前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質が、配列番号９８と少なくとも９０％同一のポリペプチド配列を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載のタンパク質。
22. 前記ポリペプチドが、Ｎ１１６４Ｒ、Ｎ１２６５Ｒ、Ｎ１３００Ｒ、Ｎ１４１２Ｒ、Ｎ３４７Ｒ、Ｎ６５１Ａ、Ｄ１２６６Ｒ、Ｄ３０９Ｒ、Ｄ３４５Ｒ、Ｄ４８７Ｒ、Ｄ６０７Ｒ、Ｑ１１２９Ｒ、Ｑ１３８１Ａ、Ｑ１３８１Ａ、Ｑ１３８１Ｒ、Ｑ６６１Ａ、Ｑ７１３Ｒ、Ｑ７３４Ｒ、Ｅ１０３２Ｇ、Ｅ１０３２Ｒ、Ｅ１４０９Ａ、Ｅ４３６Ｒ、Ｅ６１１Ｒ、Ｅ６９１Ｒ、Ｅ６９７Ｒ、Ｇ１３３５Ｒ、Ｌ１２５Ｒ、Ｌ１２６４Ｓ、Ｌ１２９９Ｓ、Ｋ１０３１Ｒ、Ｋ４９０Ｒ、Ｋ６１５Ｒ、Ｋ６５６Ｒ、Ｆ６３６Ｒ、Ｓ１３３４Ａ、Ｓ１３３４Ａ、Ｓ１３３４Ｒ、Ｓ１３８０Ｒ、Ｓ１４１０Ｒ、Ｓ１４１３Ｒ、Ｓ６３４Ｒ、Ｓ６３８Ｒ、Ｓ７１１Ｒ、Ｓ１００６Ｒ、Ｓ１０１７Ｒ、Ｔ１２６７Ａ、Ｔ１２６７Ｒ、Ｔ５５１Ｒ、Ｙ１３３８Ａ、Ｙ１３３８Ｒ、Ｖ１２７３Ｓ、Ｖ１２７４Ｓ、Ｖ４８６Ｒ、Ｖ６４４Ｒ、Ｖ７３６Ｒ、及びＶ７３６Ｙから選択される１つ以上の改変を含有する、請求項２１に記載のタンパク質。
23. ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であって：
    ａ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質であって：
    ｉ）前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＮ末端に結合した第１の核局在化シグナルと；
    ｉｉ）前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＣ末端に結合した第２の核局在化シグナルと；
    を含む、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質と、
    ｂ）ガイド配列を含み、前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質と複合体を形成するガイドポリヌクレオチドであって、前記ガイド配列が、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズすることができる、ガイドポリヌクレオチドと、
    を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
24. ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であって：
    ａ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質であって：
    ｉ）前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＮ末端に結合した第１の核局在化シグナルと；
    ｉｉ）前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＣ末端に結合した第２の核局在化シグナルと；
    を含む、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質をコードする核酸配列と、
    ｂ）ガイド配列を含み、前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質と複合体を形成するガイドポリヌクレオチドをコードする核酸配列であって、前記ガイド配列が、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズすることができる、核酸配列と、
    を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
25. （ａ）及び（ｂ）の前記ヌクレオチド配列が、真核生物プロモーターの制御下にある、請求項２４に記載の系。
26. （ａ）及び（ｂ）の前記核酸配列が、単一のベクター中にある、請求項２４に記載の系。
27. １つ以上のベクターを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であって：
    ａ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質であって：
    ｉ）前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＮ末端に結合した第１の核局在化シグナルと；
    ｉｉ）前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＣ末端に結合した第２の核局在化シグナルと；
    を含む、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質をコードする１つ以上のヌクレオチド配列に操作可能に連結された調節エレメントと、
    ｂ）ガイド配列を含み、前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質と複合体を形成するガイドポリヌクレオチドであって、前記ガイド配列が、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズすることができる、ガイドポリヌクレオチドと、
    を含む１つ以上のベクターを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
28. 前記調節エレメントが、真核生物調節エレメントである、請求項２７に記載の系。
29. 前記第１の核局在化シグナルが、単節型核局在化シグナルである、請求項２３～２８のいずれか一項に記載の系。
30. 前記第１の核局在化シグナルが、双節型核局在化シグナルである、請求項２３～２８のいずれか一項に記載の系。
31. 前記第２の核局在化シグナルが、単節型核局在化シグナルである、請求項２３～３０のいずれか一項に記載の系。
32. 前記第２の核局在化シグナルが、双節型核局在化シグナルである、請求項２３～３０のいずれか一項に記載の系。
33. 前記第１の核局在化シグナルが、双節型核局在化シグナルであり、前記第２の核局在化シグナルが、単節型核局在化シグナルである、請求項２３～２８のいずれか一項に記載の系。
34. 前記第１の核局在化シグナル及び前記第２の核局在化シグナルが、各々、双節型核局在化シグナルである、請求項２３～２８のいずれか一項に記載の系。
35. 前記単節型核局在化シグナルが、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ヌクレオプラスミン、ＥＧＬ－１３、ｃ－Ｍｙｃ、ＴＵＳタンパク質の核局在化シグナル、又はこれらの組み合わせである、請求項２９、３１、又は３３のいずれか一項に記載の系。
36. 前記双節型核局在化シグナルが、古典的双節型核局在化シグナルである、請求項３０、３２、又は３３のいずれか一項に記載の系。
37. 前記第１の核局在化シグナルが、古典的双節型核局在化シグナルであり、前記第２の核局在化シグナルが、ＳＶ４０ラージＴ抗原の核局在化シグナルである、請求項３３に記載の系。
38. 前記第１の核局在化シグナルが、前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質に直接結合している、請求項２３～３７のいずれか一項に記載の系。
39. 前記第１の核局在化シグナルが、リンカーを介して前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質に結合している、請求項２３～３７のいずれか一項に記載の系。
40. 前記第２の核局在化シグナルが、前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質に直接結合している、請求項２３～３９のいずれか一項に記載の系。
41. 前記第２の核局在化シグナルが、リンカーを介して前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質に結合している、請求項２３～３９のいずれか一項に記載の系。
42. 前記リンカーが、２～３０個の残基を有するペプチドリンカーである、請求項３９又は４１に記載の系。
43. 前記タンパク質が、前記第１の核局在化シグナルの２つのコピーを含む、請求項２３～４２のいずれか一項に記載の系。
44. 前記タンパク質が、前記第１の核局在化シグナルの３つのコピーを含む、請求項２３～４２のいずれか一項に記載の系。
45. 前記タンパク質が、前記第２の核局在化シグナルの２つのコピーを含む、請求項２３～４４のいずれか一項に記載の系。
46. 前記タンパク質が、前記第２の核局在化シグナルの３つのコピーを含む、請求項２３～４４のいずれか一項に記載の系。
47. 前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質が、ＩＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ系を有する細菌種に由来する、請求項２３～４６のいずれか一項に記載の系。
48. 前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質が、配列番号１０～９７のいずれか１つに対して少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項２３～４６のいずれか一項に記載の系。
49. 前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質が、１Ｅ－５のＥ値カットオフを有するＴＩＧＲ０３０３１タンパク質ファミリーにマッチするドメインを含む、請求項２３～４７のいずれか一項に記載の系。
50. 前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質が、配列番号９８と少なくとも９０％同一のポリペプチド配列を含む、請求項２３～４９のいずれか一項に記載の系。
51. 前記ガイドポリヌクレオチドが、ＲＮＡである、請求項２３～５０のいずれか一項に記載の系。
52. 前記ガイド配列が、１９～３０塩基長である、請求項５１に記載の系。
53. 前記ガイド配列が、１９～２５塩基長である、請求項５１に記載の系。
54. 前記ガイド配列が、２１～２６塩基長である、請求項５１に記載の系。
55. 前記ガイドポリヌクレオチドが、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を更に含む、請求項２３～５４のいずれか一項に記載の系。
56. 前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質が、粘着末端を生成する、請求項２３～５５のいずれか一項に記載の系。
57. 前記粘着末端が、１～１０ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項５６に記載の系。
58. 前記粘着末端が、２～６ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項５６に記載の系。
59. 前記粘着末端が、３～５ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項５７に記載の系。
60. 請求項１～２２のいずれか一項に記載のタンパク質を含む真核細胞。
61. 請求項２３～５９のいずれか一項に記載の系を含む真核細胞。
62. 請求項１～２２のいずれか一項に記載のタンパク質を含む送達粒子。
63. 請求項２３～５９のいずれか一項に記載の系を含む送達粒子。
64. 前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質及び前記ガイドポリヌクレオチドが、複合体中に存在する、請求項６３に記載の送達粒子。
65. 前記複合体が、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むポリヌクレオチドを更に含む、請求項６４に記載の送達粒子。
66. 脂質、糖、金属、又はタンパク質を更に含む、請求項６２～６５のいずれか一項に記載の送達粒子。
67. 請求項１～２２のいずれか一項に記載のタンパク質を含むベシクル。
68. 請求項２３～５９のいずれか一項に記載の系を含むベシクル。
69. 前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質及び前記ガイドポリヌクレオチドが、複合体中に存在する、請求項６８に記載のベシクル。
70. ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むポリヌクレオチドを更に含む、請求項６８に記載のベシクル。
71. 前記ベシクルが、エキソソーム又はリポソームである、請求項６７～７０のいずれか一項に記載のベシクル。
72. 請求項１～２２のいずれか一項に記載のタンパク質を含むウイルスベクター。
73. 請求項２３～５９のいずれか一項に記載の系を含むウイルスベクター。
74. ｔｒａｃｒＲＮＡ配列をコードする核酸配列を更に含む、請求項７３に記載のウイルスベクター。
75. 前記ウイルスベクターが、アデノウイルス粒子、アデノ随伴ウイルス粒子、又は単純ヘルペスウイルス粒子である、請求項７２～７４のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
76. 真核細胞中の標的配列の部位特異的改変を提供する方法であって、前記方法が、
    ａ）前記細胞中に；
    ｉ）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質であって：
    Ａ）前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＮ末端に結合した第１の核局在化シグナルと；
    Ｂ）前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＣ末端に結合した第２の核局在化シグナルと；
    を含む、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質をコードするヌクレオチドと、
    ｉｉ）前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質との複合体を形成しガイド配列を含むガイドポリヌクレオチドをコードするヌクレオチドであって、前記ガイド配列が、宿主ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができる、ヌクレオチドと、を導入することと；
    ｂ）前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質及び前記ガイドポリヌクレオチドにより前記宿主ポリヌクレオチド中の粘着末端を生成することと；
    ｃ）
    ｉ）（ｂ）の前記粘着末端と一緒に、又は
    ｉｉ）目的のポリヌクレオチド配列の３’末端を１つの粘着末端に、及び目的の前記ポリヌクレオチド配列の５’末端を１つの粘着末端にライゲートし；それにより前記標的配列を改変することと、
    を含む方法。
77. 前記第１の核局在化シグナルが、単節型核局在化シグナルである、請求項７６に記載の方法。
78. 前記第１の核局在化シグナルが、双節型核局在化シグナルである、請求項７６に記載の方法。
79. 前記第２の核局在化シグナルが、単節型核局在化シグナルである、請求項７６～７８のいずれか一項に記載の方法。
80. 前記第２の核局在化シグナルが、双節型核局在化シグナルである、請求項７６～７８のいずれか一項に記載の方法。
81. 前記第１の核局在化シグナルが、双節型核局在化シグナルであり、前記第２の核局在化シグナルが、単節型核局在化シグナルである、請求項７６～８０のいずれか一項に記載の方法。
82. 前記単節型核局在化シグナルが、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ヌクレオプラスミン、ＥＧＬ－１３、ｃ－Ｍｙｃ、ＴＵＳタンパク質の核局在化シグナル、又はこれらの組み合わせである、請求項７７、７９、又は８１のいずれか一項に記載の方法。
83. 前記双節型核局在化シグナルが、古典的双節型核局在化シグナルである、請求項７８、８０、又は８１のいずれか一項に記載の方法。
84. 前記第１の核局在化シグナル及び前記第２の核局在化シグナルが、各々、双節型核局在化シグナルである、請求項７６～８３のいずれか一項に記載の方法。
85. 前記第１の核局在化シグナルが、古典的双節型核局在化シグナルであり、前記第２の核局在化シグナルが、ＳＶ４０ラージＴ抗原の核局在化シグナルである、請求項８１に記載の方法。
86. 前記第１の核局在化シグナルが、前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質に直接結合している、請求項７６～８５のいずれか一項に記載の方法。
87. 前記第１の核局在化シグナルが、リンカーを介して前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質に結合している、請求項７６～８５のいずれか一項に記載の方法。
88. 前記第２の核局在化シグナルが、前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質に直接結合している、請求項７６～８７のいずれか一項に記載の方法。
89. 前記第２の核局在化シグナルが、リンカーを介して前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質に結合している、請求項７６～８７のいずれか一項に記載の方法。
90. 前記リンカーが、２～３０個の残基を有するペプチドリンカーである、請求項８７又は８９に記載の方法。
91. 前記タンパク質が、前記第１の核局在化シグナルの２つのコピーを含む、請求項７６～９０のいずれか一項に記載の方法。
92. 前記タンパク質が、前記第１の核局在化シグナルの３つのコピーを含む、請求項７６～９０のいずれか一項に記載の方法。
93. 前記タンパク質が、前記第２の核局在化シグナルの２つのコピーを含む、請求項７６～９２のいずれか一項に記載の方法。
94. 前記タンパク質が、前記第２の核局在化シグナルの３つのコピーを含む、請求項７６～９２のいずれか一項に記載の方法。
95. 前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質が、ＩＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ系を有する細菌種に由来する、請求項７６～９４のいずれか一項に記載の方法。
96. 前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質が、配列番号１０～９７のいずれか１つに対して少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項７６～９５のいずれか一項に記載の方法。
97. 前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質が、１Ｅ－５のＥ値カットオフを有するＴＩＧＲ０３０３１タンパク質ファミリーにマッチするドメインを含む、請求項７６～９５のいずれか一項に記載の方法。
98. 前記ガイドポリヌクレオチドが、ＲＮＡである、請求項７６～９７のいずれか一項に記載の方法。
99. 前記ガイドポリヌクレオチドが、１９～３０塩基長である、請求項９８に記載の方法。
100. 前記ガイドポリヌクレオチドが、１９～２５塩基長である、請求項９８に記載の方法。
101. 前記ガイドポリヌクレオチドが、２１～２６塩基長である、請求項９８に記載の方法。
102. 前記ガイドポリヌクレオチドが、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を更に含む、請求項７６～１０１のいずれか一項に記載の方法。
103. 前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質が、粘着末端を生成する、請求項７６～１０２のいずれか一項に記載の系。
104. 前記粘着末端が、１～１０ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項７６～１０３のいずれか一項に記載の方法。
105. 前記粘着末端が、２～６ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項７６～１０４のいずれか一項に記載の方法。
106. 前記粘着末端が、３～５ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項７６～１０５のいずれか一項に記載の方法。
107. 前記粘着末端が、平滑末端を含む、請求項７６～１０６のいずれか一項に記載の方法。
108. 前記粘着末端が、５’一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを有する、請求項７６～１０６のいずれか一項に記載の方法。
109. 前記粘着末端が、３’一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを有する、請求項７６～１０６のいずれか一項に記載の方法。
110. 前記真核細胞が、動物又はヒト細胞である、請求項７６～１０９のいずれか一項に記載の方法。
111. 前記真核細胞が、ヒト細胞である、請求項７６～１０９のいずれか一項に記載の方法。
112. 前記真核細胞が、植物細胞である、請求項７６～１０９のいずれか一項に記載の方法。
113. 前記改変が、前記標的配列の少なくとも一部の欠失である、請求項７６～１１２のいずれか一項に記載の方法。
114. 前記改変が、前記標的配列の突然変異である、請求項７６～１１２のいずれか一項に記載の方法。
115. 前記改変が、前記標的配列中への目的配列の挿入である、請求項７６～１１２のいずれか一項に記載の方法。
116. 細胞内のＣａｓ９エフェクタータンパク質の分解を低減する方法であって、
     ａ）前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＮ末端に第１の核局在化シグナルを結合させることと；
     ｂ）前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＣ末端に第２の核局在化シグナルを結合させることと；
     を含む方法。
117. 前記第１の核局在化シグナルが、単節型核局在化シグナルである、請求項１１６に記載の方法。
118. 前記第１の核局在化シグナルが、双節型核局在化シグナルである、請求項１１６に記載の方法。
119. 前記第２の核局在化シグナルが、単節型核局在化シグナルである、請求項１１６～１１８のいずれか一項に記載の方法。
120. 前記第２の核局在化シグナルが、双節型核局在化シグナルである、請求項１１６～１１８のいずれか一項に記載の方法。
121. 前記第１の核局在化シグナルが、双節型核局在化シグナルであり、前記第２の核局在化シグナルが、単節型核局在化シグナルである、請求項１１６に記載の方法。
122. 前記単節型核局在化シグナルが、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ヌクレオプラスミン、ＥＧＬ－１３、ｃ－Ｍｙｃ、ＴＵＳタンパク質の核局在化シグナル、又はこれらの組み合わせである、請求項１１７、１１９、又は１２１のいずれか一項に記載の方法。
123. 前記双節型核局在化シグナルが、古典的双節型核局在化シグナルである、請求項１１８、１２０、又は１２１のいずれか一項に記載の方法。
124. 前記第１の核局在化シグナルが、古典的双節型核局在化シグナルであり、前記第２の核局在化シグナルが、ＳＶ４０ラージＴ抗原の核局在化シグナルである、請求項１２１に記載の方法。

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