CN115716880A - 一种核定位荧光蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种核定位荧光蛋白及其应用。本发明将入核信号通过柔性连接子与荧光蛋白连接构成核定位荧光蛋白。本发明将多种入核信号组合与不同荧光蛋白组成融合蛋白，能够有效的提高入核效率，并且操作简单，不会造成DNA结构的改变，具有更广阔的应用前景。同时，通过短的柔性连接子连接入核信号和荧光蛋白，能够保证入核信号和荧光蛋白的独立装配，减少入核信号与荧光蛋白的相互干扰，极大的提升了入核效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种核定位荧光蛋白及其应用。
背景技术
核定位信号(Nuclear localization Signal，NLS)是一小段存在于大多数入核蛋白上的一段短的氨基酸序列，在蛋白的入核转运过程中能够识别入核转运受体，从而介导蛋白的入核转运。据研究发现，在几乎所有的入核蛋白中都发现了核定位信号。为了判断不同的蛋白是否在细胞核内分布，通常使用不同的荧光报告基因对其进行标记，常用的荧光报告基因有：EGFP、mCherry、TagBFP、DsRed、tdTomato等。然而，如何高效的将外源基因递送进入细胞核是一个研究中常遇到的问题。
目前已发现入核信号主要分为两类，一类是以SV40(Simian vacuolatingvirus40)为代表的短的富含赖氨酸的经典NLS，其特征是识别入核转运受体主要为Importinα，另一类是富含精氨酸的非经典NLS，包括HIV，Tat，SREBP-2等，这类入核信号识别的入核转运受体主要为Importinβ，其中，目前应用最广泛的为SV40-NLS。
利用NLS信号进行基因传递可通过共价或非共价接合两种方式，NLS信号可以通过共价或非共价的方式连接到DNA或基因载体上，从而提高蛋白入核转运效率。虽然这两种方法都能促进蛋白进入细胞核，但都有自己的缺点。例如，共价结合具有很强的附着性，降低了细胞内运输过程中NLS序列从质粒DNA或基因载体解离的可能性，但同时会阻碍NLS短肽识别入核转运受体。非共价连接虽然保持了NLS短肽结构的完整性及其对导入蛋白的可及性，然而，非共价附着存在NLS短肽与其它细胞内其它因子相互作用的风险，从而导致了核靶向效应的减弱。并且，当带正电荷的NLS信号直接以共价或非共价连接到DNA上时，与带负电荷的DNA的相互作用使它们无法进入细胞核，并阻碍了DNA入核转运。
目前，较为广泛应用的核定位信号有，3xNLS，SV40-NLS，cMYC-NLS，其中SV40-NLS的使用最为广泛，然而，据多篇文献报道，仅使用SV40-NLS无法很好的将荧光蛋白定位在细胞核。为了提高基因的入核效率，可采用以下方法：(1)增加NLS短肽的数量或增加NLS短肽和蛋白之间的空间能提高蛋白的入核效率，但也会带来其它可能的风险，如增如NLS短肽与入核转运蛋白之间的相互作用、DNA缩合、粒子的表面电荷和转录过程等；(2)改善NLS信号与DNA的结合方式，不同的NLS信号与DNA共价结合具有促进DNA入核的效果，但入核效率不够理想，利用新型纳米材料介导NLS短肽与DNA非共价结合虽然有不少的报道，但仍存在操作复杂，普适性低等缺点，不利于广泛应用。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种核定位荧光蛋白及其应用。本发明的核定位荧光蛋白能够有效的提高入核效率，进而高效地将荧光蛋白定位在细胞核，并且还可以区分动物组织的不同细胞，为实现高效的细胞标记和细胞元件筛选奠定了坚实的基础。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一目的，本发明提供了一种核定位荧光蛋白，将入核信号通过柔性连接子与荧光蛋白连接构成核定位荧光蛋白；其中，所述入核信号包括SV40-NLS序列和/或c-Myc-NLS序列。
本发明将多种入核信号组合与不同荧光蛋白组成融合蛋白，能够有效的提高入核效率，并且操作简单，不会造成DNA结构的改变，具有更广阔的应用前景。同时，通过短的柔性连接子连接入核信号和荧光蛋白，能够保证入核信号和荧光蛋白的独立装配，减少入核信号与荧光蛋白的相互干扰，极大的提升了入核效率。
作为本发明所述核定位荧光蛋白的优选实施方式，所述入核信号为SV40-NLS序列和c-Myc-NLS序列的组合，SV40-NLS序列和c-Myc-NLS序列分别通过柔性连接子连在荧光蛋白的两端。
本发明通过将入核信号为SV40-NLS序列和c-Myc-NLS序列作为入核信号组合，该入核信号组合共同作用下，能够极大的提高荧光蛋白的入核效率；并且，当SV40-NLS序列和c-Myc-NLS序列分别通过柔性连接子连在荧光蛋白的两端构成的核定位荧光蛋白，提高荧光蛋白的入核效率更佳，由此说明加入柔性连接子(例如3×GS连接序列等)能够促进入核绿色荧光蛋白的表达，提高绿色荧光蛋白的入核效率。
作为本发明所述核定位荧光蛋白的优选实施方式，所述荧光蛋白包括EGFP、tdTomato和TagBFP2中的至少一种，优选地，所述荧光蛋白包括EGFP。本发明的荧光蛋白不仅包括上述种类，还包括能实现本发明技术效果的荧光蛋白如TurboGFP、hrGFP、ZsGreen1、mNeonGreen、Venus、EYFP、YPet、Cerulean、CyPet、EBFP、dTomato、DsRed_Express2、TurboRFP、mApple、mKate2及以上相关变体。
将SV40-NLS序列和c-Myc-NLS序列作为入核信号组合，该入核信号组合共同作用下，能够很好的介导多种荧光蛋白高效的定位于细胞核。
作为本发明所述核定位荧光蛋白的优选实施方式，所述柔性连接子为3×GS、1×GGGGS或3×GGGGS中的一种。
本发明通过上述柔性连接子连接的双入核信号具有良好的入核效果，为实现高效的细胞标记和细胞元件筛选奠定了坚实的基础。
作为本发明所述核定位荧光蛋白的优选实施方式，所述柔性连接子为3×GS。柔性连接子的连接位置如在目的蛋白如荧光蛋白的两端，N端和C端。
将SV40-NLS序列和c-Myc-NLS序列同时通过3×GS与荧光蛋白连接，能够高效的将荧光蛋白定位在细胞核。短的柔性连接子连接入核信号和荧光蛋白，能够保证入核信号和荧光蛋白的独立装配，减少入核信号与荧光蛋白的相互干扰，极大的提升了入核效率。
第二目的，本发明提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包括所述的核定位荧光蛋白。
作为本发明所述重组表达载体的优选实施方式，所述核定位荧光蛋白包括多个拷贝。
第三目的，本发明提供了一种核定位荧光蛋白的应用，采用所述的核定位荧光蛋白将荧光蛋白定位在细胞核中。
本发明构建的核定位荧光蛋白可以用于表征和定位特定细胞。
第四目的，本发明提供了上述的核定位荧光蛋白在表征和定位特定细胞以筛选特定细胞作用元件中的应用。
本发明提供的核定位荧光蛋白可以解决组织细胞切片时，时常会出现大片不同种类的粘连细胞，造成荧光标记的细胞无法区分的技术问题，将不同的荧光信号仅定位在细胞的细胞核一小块区域，能够很好的区分有荧光标记和没有产生荧光标记的细胞，而通过柔性连接子连接双入核信号具有良好的入核效果，为实现高效的细胞标记和细胞元件筛选奠定了坚实的基础。
与现有技术相比，本发明具有具有以下有益效果：
本发明提供了一种核定位荧光蛋白及其应用，本发明将多种入核信号组合与不同荧光蛋白组成融合蛋白，能够有效的提高入核效率，并且操作简单，不会造成DNA结构的改变，具有更广阔的应用前景。同时，通过短的柔性连接子连接入核信号和荧光蛋白，能够保证入核信号和荧光蛋白的独立装配，减少入核信号与荧光蛋白的相互干扰，极大的提升了入核效率。本发明提供的核定位荧光蛋白可以解决组织细胞切片时，时常会出现大片不同种类的粘连细胞，造成荧光标记的细胞无法区分的技术问题，将不同的荧光信号仅定位在细胞的细胞核一小块区域，能够很好的区分有荧光标记和没有产生荧光标记的细胞，而通过柔性连接子连接双入核信号具有良好的入核效果，为实现高效的细胞标记和细胞元件筛选奠定了坚实的基础。
附图说明
图1为不同载体组合瞬转Hela细胞观察照片；
图2为不同载体组合瞬转BHK21细胞观察照片I；
图3为不同载体组合瞬转293T细胞观察照片；
图4为不同载体组合瞬转BHK21细胞观察照片II；
图5为不同载体组合的流式分析图I；
图6为不同载体组合的流式分析图II；
图7为不同载体组合的流式分析图III；
图8为不同载体组合的流式分析图IV；
图9为组1和组2载体转染Hela细胞48h后染色前和染色后拍照图；
图10为组1和组2载体转染BHK21细胞48h后染色前和染色后拍照图；
图11为组1和组2载体转染BHK21/Hela细胞后，染色前/染色后照片叠加对比图；
图12为是否具有入核信号的EGFP和mCherry载体表达的荧光结果图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
采用Gateway技术和GoldenGate技术构建下表载体，以载体1为对照，将下表1载体1-11分别与载体12共同转染Hela细胞和BHK21细胞，在48小时后，分别在荧光显微镜100×和200×下拍照以观察荧光强度和入核效果，同时将细胞消化下来，通过细胞流式仪上分析荧光表达情况。选出入核效果较好的载体，采用293T和BHK21细胞进行重复实验。
表1
实验步骤如下：
1.通过GoldenGate技术，分别将3×GS，1×GGGGS，3×GGGGS、SV40-NLS或c-Myc-NLS分别插入EGFP之间；
2.采用Gateway技术，分别将含有柔性连接子、入核信号和绿色荧光蛋白基因EGFP克隆到含有EF1A启动子的AAV骨架上，构建载体1-12目标载体(如上表所示1)；
3.使用酶标仪测定载体1-12的浓度，并将载体稀释至10ng/μL；
4.使用Trans-Hi转染试剂将10ng载体1-11分别与10ng的载体12，980ng pUC19瞬时复孔转染Hela和BHK21细胞，并以转染1μg pUC19质粒作为阴性对照；
5.12小时后，换新鲜培养基；
6.48小时后，在荧光显微镜观察入核情况，曝光时间：Bright Field，10ms；绿光，30ms；红光，80ms；放大倍数：200×；
7.选出具有入核效果的载体，按照上述步骤，瞬转293T和BHK21细胞进行重复实验；
使用细胞流式仪检测荧光表达情况。
实验结果：
从图1-图4的荧光图可以看出，载体5，载体6，载体8以及载体11瞬转Hela细胞和BHK21细胞后，绿色荧光绝大多数只分布于细胞内细胞核区域，证明其具有较好的介导荧光蛋白入核的效果，而这四个载体均同时带有SV40-NLS和c-Myc-NLS入核信号，而只带SV40-NLS或c-Myc-NLS的载体2，载体3，载体4，载体7，载体9以及载体10瞬转细胞后，均只有极少部分细胞能观察到绿色荧光蛋白完全定位在细胞核，而绝大多数细胞为绿色荧光蛋白分布于整个细胞，说明在SV40-NLS和c-Myc-NLS核定位信号的共同作用下，能够极大的提高荧光蛋白的入核效率。
载体8在SV40-NLS以及c-Myc-NLS与EGFP之间分别加上了一个3×GS连接序列，而载体11则将SV40-NLS以及c-Myc-NLS直接与EGFP相连，从图5-8的流式分析数据可以看出，入核效果较好的四个载体在瞬转293T，Hela以及BHK21细胞后，瞬转载体8的细胞较瞬转载体11的细胞通过流式分析具有更高的绿色荧光强度，证明载体8较载体11能够促进细胞表达更多的绿色荧光蛋白，3×GS连接序列能够促进入核绿色荧光蛋白的表达，提高绿色荧光蛋白的入核效率。
实施例2
1、构建下表2中的载体，并将载体进行以下分组：
表2
2、利用质粒小提试剂盒提取质粒，然后测定浓度；
3、提前1天向12孔板分别分四个孔293T，Hela，BHK21和HT1080细胞，每个孔2×105个细胞；
4、第2天，细胞密度长到70％-80％；
5、先分别取1.5ug组1载体以及500ng pUC19加入1.5mL EP管中，在另两个1.5mLEP管中分别加入1.5μg组2、组3的载体并补充500ng pUC19；
6、使用振荡器将质粒充分混匀；
7、向两个1.5mL EP管中分别加入250μL基础培养基(DMEM)，再取一个1.5mL EP管，向其中加入500μL基础培养基(DMEM)以及30μL PEI，使用振荡器充分混匀，然后室温静置5min；
8、向装有载体的EP管中分别分装265μL PEI与基础培养基(DMEM)的混合物，用振荡器充分混匀，室温静置15min；
9、分别分装104μL混合物到293T，Hela，BHK21和HT1080细胞中；
10、培养5小时后，消化细胞并按照原细胞体积的5％，10％，20％分装至12孔板的不同孔中，加入1mL包装维持培养基继续培养；
11、培养48h后选取合适细胞密度的孔，分别在不同荧光通道下进行拍照；
12、然后向拍过照片的每个孔中直接加入150μL Hoechst 33342染料(已稀释1500倍)，轻轻摇匀后，室温静置15min，再次在不同荧光通道下进行拍照。
其中，染色试剂为Hoechst 43332；拍照时间为转染后48h；转染的质粒量为300ng；放大倍数为200×。
merge1：黄色荧光(tdTomato)，绿色荧光(EGFP)，蓝色荧光(TagBFP2)照片的叠加。
merge2：黄色荧光，绿色荧光，蓝色荧光照片和白光(10ms)下照片的叠加。
实验结果：
图9-图10中，分别将上表2中的组1和组2载体分别瞬转Hela和BHK21细胞，其中组1载体分别在荧光蛋白两端连上了SV40-NLS和c-Myc-NLS入核信号，然后用细胞核染料Hoechst 43332进行染色。从图9-图10染色前的荧光照片可以看出，带有入核信号的SV40-NLS和c-Myc-NLS的组1载体能够分别介导荧光蛋白tdTomato，EGFP，TagBFP2分布于细胞内一小块区域，从图11可以看出，将介导荧光蛋白tdTomato，EGFP，TagBFP2表达的照片叠加后发现，这一块区域能够很好的重叠，证明这些荧光蛋白均在细胞内同一区域表达，而没有带入核信号的组2载体则表达的荧光蛋白tdTomato，EGFP，TagBFP2分布于整个细胞。在染色后所有细胞的细胞核均被Hoechst 33342染料染成蓝色，通过图11叠加染色后的照片可以看出，组1载体表达的荧光蛋白分布的区域可以很好的重叠Hoechst 33342染料染色区域。从图12可以看出，不具有入核信号的EGFP和mCherry载体表达的荧光广泛表达于细胞质和细胞核，而具有核定位信号的两者荧光均只在细胞核内表达，证明这些荧光蛋白分布于细胞内的细胞核，说明SV40-NLS和c-Myc-NLS的共同作用下能够很好的介导多种荧光蛋白高效的定位于细胞核。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (9)
1.一种核定位荧光蛋白，其特征在于，将入核信号通过柔性连接子与荧光蛋白连接构成核定位荧光蛋白；其中，所述入核信号包括SV40-NLS序列和/或c-Myc-NLS序列。
2.如权利要求1所述的核定位荧光蛋白，其特征在于，所述入核信号为SV40-NLS序列和c-Myc-NLS序列的组合，SV40-NLS序列和c-Myc-NLS序列分别通过柔性连接子连在荧光蛋白的两端。
3.如权利要求1所述的核定位荧光蛋白，其特征在于，所述荧光蛋白包括EGFP、tdTomato、mCherry和TagBFP2中的至少一种。
4.如权利要求1所述的核定位荧光蛋白，其特征在于，所述柔性连接子为3×GS、1×GGGGS或3×GGGGS中的一种。
5.如权利要求4所述的核定位荧光蛋白，其特征在于，所述柔性连接子为3×GS。
6.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括如权利要求1-5任一项所述的核定位荧光蛋白。
7.如权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于，所述核定位荧光蛋白包括多个拷贝。
8.一种核定位荧光蛋白的应用，其特征在于，采用如权利要求1-5任一项所述的核定位荧光蛋白将荧光蛋白定位在细胞核中。
9.如权利要求1-5任一项所述的核定位荧光蛋白在表征和定位特定细胞以筛选特定细胞作用元件中的应用。
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