CN105504071A - 蛋白荧光定位检测系统及其快速检测蛋白相互作用的方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种蛋白荧光定位检测系统及其快速检测蛋白相互作用的方法和应用，所述蛋白荧光定位检测系统由四种融合蛋白组成：(1)荧光蛋白A和待测蛋白A组成的融合蛋白；(2)荧光蛋白A、核定位信号和待测蛋白A组成的融合蛋白；(3)荧光蛋白B和待测蛋白B组成的融合蛋白；(4)荧光蛋白B、核定位信号和待测蛋白B组成的融合蛋白；所述荧光蛋白A与荧光蛋白B的荧光颜色不同；所述待测蛋白A和待测蛋白B为待检测是否存在相互作用的两个蛋白。该方法可以在细胞中检测两个蛋白之间是否存在相互作用，还能够消除荧光双分子互补技术和荧光共振能量转移的假阳性问题。

Description

蛋白荧光定位检测系统及其快速检测蛋白相互作用的方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术和基因工程技术领域，涉及一种通过蛋白荧光定位快速检测蛋白质相互作用的方法。
背景技术
蛋白相互作用网络是生物信息调控的主要表现形式，是决定细胞生命活动的关键因素。阐释蛋白质之间的相互作用关系，是理解细胞的生物学活性、蛋白的信号转导机制及生物代谢等等生命过程至关重要的一环，能为确定蛋白质在整个生命过程中所办扮演的作用提供决定性的线索。
目前蛋白相互作用的研究方法最常用的方法有免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation，Co-IP)、酵母双杂交系统(YeastTwo-HybridSystem)、荧光共振能量转移(FluorescentResonantEnergyTransfer,FRET)、双分子荧光互补(BimolecularFluorescentComplement,BIFC)等。但是，不同的方法都存在不同的优缺点，比如免疫共沉淀法操作复杂、不能保证沉淀的复合物为直接相互作用蛋白；酵母双杂交方法只能验证细胞核内的相互作用，并且容易出现假阳性；双分子荧光互补和荧光共振能量转移方法操作相对较为简单、方便，但是存在假阳性较多的问题。因此仍旧需要对研究蛋白相互作用的方法加以改进。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种蛋白荧光定位检测系统及其快速检测蛋白相互作用的方法，该方法能够在细胞水平上快速检测蛋白的相互作用。
本发明采取的技术方案如下：
1、用于检测蛋白间相互作用的蛋白荧光定位检测系统，所述蛋白荧光定位检测系统由四种融合蛋白组成：(1)荧光蛋白A和待测蛋白A组成的融合蛋白；(2)荧光蛋白A、核定位信号和待测蛋白A组成的融合蛋白；(3)荧光蛋白B和待测蛋白B组成的融合蛋白；(4)荧光蛋白B、核定位信号和待测蛋白B组成的融合蛋白；
所述荧光蛋白A与荧光蛋白B的荧光颜色不同；所述待测蛋白A和待测蛋白B为待检测是否存在相互作用的两个蛋白。
优选的，所述荧光蛋白、核定位信号和待测蛋白顺次连接。
优选的，所述荧光蛋白A、B为红色荧光蛋白或绿色荧光蛋白。
优选的，所述红色荧光蛋白的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述绿色荧光蛋白的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述核定位信号序列如SEQIDNo.3所示。
2、上述蛋白荧光定位检测系统中任一种融合蛋白的编码基因。
3、含有上述蛋白荧光定位检测系统中任一种融合蛋白的编码基因的重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒。
优选的，所述重组表达载体为pIZ-V5/His载体，所述重组菌为大肠杆菌DH5α，所述转基因细胞系为家蚕卵巢细胞系BmN-SWU1。
4、上述蛋白荧光定位检测系统在检测蛋白相互作用中的应用。
5、上述编码基因在检测蛋白相互作用中的应用。
6、上述重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒在检测蛋白相互作用中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明蛋白荧光定位检测系统基本原理示意图如图13所示，本发明通过利用具有核定位信号和没有核定位信号的绿色荧光蛋白及红色荧光蛋白构建四个荧光蛋白融合表达载体，若被研究的蛋白之间存在相互作用，则具有荧光标记的融合蛋白就会被另外一个蛋白拉入细胞核内或被拉出细胞核；若被研究的蛋白之间没有相互作用，则被研究的荧光标记的融合蛋白定位不会发生变化。该方法可以在细胞中检测两个都具有核定位信号的蛋白之间的相互作用、一个具有核定位信号的蛋白和一个没有核定位信号蛋白之间的相互作用以及两个都没有核定位信号的蛋白之间的相互作用。另外，该方法消除了先前荧光双分子互补技术和荧光共振能量转移的假阳性问题。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1为pIZ-NSL-EGFP、pIZ-NSL-DsRed、pIZ–EGFP和pIZ–DsRed构建示意图；
图2为pIZ-NSL-EGFP、pIZ-NSL-DsRed、pIZ–EGFP和pIZ–DsRed表达载体转染到BmN-SWU1细胞中后荧光蛋白的示意图；标尺为5μm；
图3为pIZ-LEF11-DsRed和核定位信号突变的pIZ–LEF11(K100L)-DsRed单独转染细胞后的荧光蛋白定位示意图；标尺为5μm；
图4为pIZ–LEF11(K100L)-DsRed和pIZ–EGFP、pIZ-LEF11-EGFP分别共转染后的荧光蛋白定位示意图；标尺为5μm；
图5为免疫共沉淀验证对Piz-LEF11(K100L)-DsRed和pIZ-LEF11-EGFP相互作用的进一步验证结果；
图6为LEF-11N端截短载体构建示意图；
图7为LEF-11N端截短载体的细胞定位示意图；标尺为5μm；
图8为LEF-11N端截短载体和pIZ-LEF11-EGFP共同转染后，荧光蛋白定位分析示意图；标尺为5μm；
图9为BIFC对LEF-11N端截短载体和pIZ-LEF11-EGFP相互作用的进一步验证示意图；标尺为5μm；
图10为本发明所述蛋白荧光定位检测系统在研究两个不具有核定位信号的蛋白细胞定位和加上核定位信号的示意图；标尺为10μm；
图11为蛋白荧光定位检测系统在一个蛋白加上核定位信号后共定位示意图；标尺为10μm；
图12为蛋白荧光定位检测系统鉴定两个不具有核定位信号蛋白的相互作用进一步免疫共沉淀的验证结果；
图13为蛋白荧光定位检测系统基本原理示意图。
具体实施方式
本发明以研究家蚕核型多角体病毒(BmNPV)中的复制关键因子LEF-11的自身相互作用作为实施例2，鉴定两个同时具有核定位信号蛋白之间相互作用的检测方法；以BmNPVLEF-11自身核定位和多聚化特征为实施例3，鉴定一个具有核定位信号和一个不具有核定位信号的蛋白之间相互作用的检测方法；以家蚕细胞中Gem2基因的相互作用蛋白为实施例4，鉴定两个都没有核定位信号的蛋白之间的相互作用检测的方法。
下面将结合附图，对本发明3个具有不同核定位方式的蛋白之间的相互作用实例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
需要说明的是，本发明所述内容中以NSL表示核定位信号，DsRed表示红色荧光蛋白，EGFP表示绿色荧光蛋白。
实施例1、蛋白荧光定位检测载体构建
登陆NCBI数据库，下载目前已知的表达DsRed和EGFP蛋白的核苷酸序列，其序列分别如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示，根据pIZ-V5/His(Invitrogen公司)载体的多克隆位点设计具有核定位信号序列和不具有核定位信号序列的相应引物，然后送华大基因合成，引物序列如下：
EGFP-F:5’-cccaagcttatggtgagcaagggcgaggagct-3’，(SEQIDNo.10)；
EGFP-R:5’-ggggtacccttgtacagctcgtccatgcc-3’，(SEQIDNo.11)；
NSL-EGFP-F:5’-cccaagcttccgaagaagaagcgaaaggtggaagacccgggaacgatggtgagcaagggcgaggagct-3’，(SEQIDNo.12)；
DsRed-F:5’-cccaagcttatggcctcctccgagaacgtcat-3’，(SEQIDNo.13)；
DsRed-R:5’-ggggtacccaggaacaggtggtggcgg-3’，(SEQIDNo.14)；
NSL-DsRed-F:5’-cccaagcttccgaagaagaagcgaaaggtggaagacccgggaacgatggcctcctccgagaacgtcat-3’，(SEQIDNo.15)。
核定位信号序列如SEQIDNo.3所示。
如图1示意图所示，将合成的引物根据相应的模板扩增并通过HindIII和KpnI酶切连接到经过相应酶切的pIZ-V5/His载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后用含有博来霉素(Zeocin)的LB平板筛选阳性克隆，挑取阳性克隆单菌落，酶切验证正确后使用。
将构建好的pIZ-NSL-EGFP、pIZ-NSL-DsRed、pIZ-EGFP和pIZ-DsRed表达载体转染到BmN-SWU1细胞中，转染后48小时，用1×PBST轻洗细胞3次，每次5min，然后加入质量分数为4％的多聚甲醛溶液，室温固定15min，用1×PBST轻洗细胞3次，每次5min；加入细胞核染料DAPI，37℃避光处理20min，用1×PBST轻洗细胞3次，每次5min。最后取出盖玻片在Olympus激光共聚焦扫描显微镜下观察拍照，结果如图2所示。结果显示具有核定位信号的EGFP和DsRed蛋白能够定位到细胞核内，不具有核定位信号的EGFP和DsRed蛋白在细胞核和细胞质都有分布，证明构建系统可以用于后续实验。
实施例2、蛋白荧光定位检测系统鉴定蛋白相互作用的验证
由实施例1构建的蛋白荧光定位载体，能够定位到相应的位置，为了验证这个系统能够以荧光定位变化观测两个蛋白间是否存在相互作用，首先分析LEF-11具有核定位信号，选择pIZ-EGFP和pIZ-DsRed为目标载体，构建了LEF-11(序列如SEQIDNo.4所示)全长融合DsRed和EGFP的载体pIZ-DsRed-LEF11/pIZ-EGFP-LEF11，同时构建了突变LEF-11第100位的核定位信号关键氨基酸突变体序列如SEQIDNo.5所示；融合DsRed的载体pIZ–LEF11(K100L)-DsRed，对照载体为pIZ-EGFP。载体构建方法同实施例1，所有载体测序正确后使用。
将以上载体pIZ-DsRed-LEF11和pIZ–LEF11(K100L)-DsRed分别转染到BmN-SWU1细胞中，转染后48小时，荧光观察这些荧光蛋白表达载体的定位，结果如图3所示，由图3可知，荧光定位结果与推测结果一致，pIZ-DsRed-LEF11定位到细胞核内，而pIZ–LEF11(K100L)-DsRed由于缺失了核定位信号，定位到细胞质内，说明LEF-11确实具有核定位信号。
将以上荧光蛋白融合表达载体pIZ–LEF11(K100L)-DsRed分别和载体pIZ-EGFP、pIZ-EGFP-LEF11共同转染到细胞中，转染48小时后荧光观察结果如图4所示，由图4可知，pIZ–LEF11(K100L)-DsRed的定位确实因为和pIZ-EGFP-LEF11共同转染发生了变化，定位到细胞核内，但和pIZ-EGFP共同转染的细胞定位并没有发生变化，这一结果说明本发明所述系统确实可以通过观察蛋白的荧光定位检测蛋白之间的相互作用。
为了更进一步确认系统的准确可靠，进一步通过免疫共沉淀进行验证，把pIZ–LEF11(K100L)-DsRed和pIZ-EGFP-LEF11分别共转染到BmN-SWU1细胞中，转染48h后收集细胞，加入1mL含PMSF的细胞IP裂解液重悬细胞，冰浴裂解30min；吸出100μL含有胞内蛋白的裂解混合物作总蛋白组，剩余900μL转到两个1.5mL离心管，每管450μL裂解混合物，并分别加入2μLDsRed抗体(实验组)和2μL小兔IgG(对照组)，4℃轻微摇晃孵育6-8h；分别在两个离心管中加入60μLproteinA+G蛋白磁珠，4℃孵育8h；4℃3000r/min离心5min沉淀磁珠，吸弃上清后以1mL含PMSF的细胞IP裂解液重悬清洗，重复3次；清洗完毕后，4℃3000r/min离心5min，吸弃上清，加入40μL含PMSF的细胞IP裂解液，并加入10μLSDS-PAGE蛋白上样缓冲液，沸水煮10min，做Westernblot验证，结果如图5所示，pIZ–LEF11(K100L)-DsRed蛋白和pIZ-EGFP-LEF11蛋白之间具有直接的相互作用，这一结果证明通过荧光蛋白的定位鉴定蛋白之间的相互作用真实可靠。
实施例3、蛋白荧光定位检测系统在研究具有核定位信号的LEF-11蛋白相互作用中的应用
为了研究实施例1所述蛋白荧光定位检测系统在鉴定蛋白相互作用中的实用性，将仅含有一个寡聚化功能域(氨基酸42-61区域)的LEF-11的N端进行截短突变，并且构建了荧光蛋白融合表达载体，具体参见图6LEF-11N端进行截短突变载体的荧光蛋白构建示意图。载体具体构建方法与实施例1一致，所有载体都经过酶切和测序进行验证。
将构建的荧光蛋白融合表达载体pIZ-DsRed-LEF11(aa2-61)、pIZ-DsRed-LEF11(aa12-61)、pIZ-DsRed-LEF11(aa22-61)、pIZ-DsRed-LEF11(aa32-61)、pIZ-DsRed-LEF11(aa42-61)、pIZ-DsRed-LEF11(aa52-61)、pIZ-DsRed-LEF11(aa2-51)和pIZ-DsRed-LEF11(aa2-41)分别转染到BmN-SWU1细胞中，表达产物分别简写为LEF-11(2-61)、LEF-11(12-61)、LEF-11(22-61)、LEF-11(32-61)、LEF-11(42-61)、LEF-11(52-61)、LEF-11(2-51)和LEF-11(2-41)。转染48小时后，荧光观察，结果如图7所示，LEF-11(2-61)/LEF-11(12-61)/LEF-11(22-61)/LEF-11(32-61)/LEF-11(42-61)/LEF-11(2-51)由于具有多聚化功能域并且不具有核定位信号，在胞质中形成同源多聚体，无法通过核孔复合物，定位于细胞质；而LEF-11(52-61)和LEF-11(2-41)已缺失多聚化功能域关键区段，因此可自由进入细胞核，在细胞质和细胞核中都有分布。
为了进一步判断这些荧光蛋白融合表达载体是哪一段和LEF-11发生的直接相互作用，我们分别将荧光蛋白融合表达载体LEF-11(2-61)、LEF-11(12-61)、LEF-11(22-61)、LEF-11(32-61)、LEF-11(42-61)、LEF-11(52-61)、LEF-11(2-51)、LEF-11(2-41)与pIZ-EGFP-LEF11共同转染到BmN-SWU1细胞中，转染48小时后，荧光观察融合蛋白定位，结果如图8所示，具有完整多聚化功能域的LEF-11(2-61)、LEF-11(12-61)、LEF-11(22-61)、LEF-11(32-61)、LEF-11(42-61)与全长LEF-11的荧光融合蛋白pIZ-EGFP-LEF11发生了明显的共定位，且位于细胞质，这说明原始定位于细胞核的全长LEF-11发生了定位变化，这必然是因与LEF-11N端截短突变体发生相互作用，蛋白大小发生改变，无法再自由进入细胞核；而LEF-11(2-51)本身定位于细胞质，与全长LEF-11共表达后部分进入细胞核，且在细胞核中有共定位，其定位情况与原始不同，暗示了LEF-11(2-51)与全长LEF-11发生相互作用；但LEF-11(52-61)和LEF-11(2-41)已缺失多聚化功能域重要区段，原始定位便分布于细胞质和细胞核，与全长LEF-11共表达后定位情况也没有变化，且无共定位现象。
为验证本发明所述蛋白荧光定位检测系统的可靠性，通过双分子荧光互补技术(BIFC)对上述结果进行验证，具体为：首先构建BIFC表达载体，其序列如SEQIDNo.6和SEQIDNo.7所示，构建方法与实施例1一致，构建的载体分别命名为pBIFC-VN-LEF-11(aa2-61)、pBIFC-VN-LEF-11(aa12-61)、pBIFC-VN-LEF-11(aa22-61)、pBIFC-VN-LEF-11(aa32-61)、pBIFC-VN-LEF-11(aa42-61)、pBIFC-VN-LEF-11(aa52-61)、pBIFC-VN-LEF-11(aa2-51)和pBIFC-VC-LEF-11；表达产物简写为VN-LEF-11(2-61)、VN-LEF-11(12-61)、VN-LEF-11(22-61)、VN-LEF-11(32-61)/VN-LEF-11(42-61)、VN-LEF-11(52-61)、VN-LEF-11(2-51)、VN-LEF-11(2-41)以及VC-LEF-11。将相应的VN载体分别于VC载体共同转染到BmN-SWU1细胞中，转染48小时后，通过共聚焦显微观察是否有黄色荧光激发，结果如图9所示，结果显示LEF-11N端截短突变体VN-LEF-11(2-61)、VN-LEF-11(12-61)、VN-LEF-11(22-61)、VN-LEF-11(32-61)、VN-LEF-11(42-61)、VN-LEF-11(2-51)都可以与VC-LEF-11激发出荧光，VN-LEF-11(52-61)、VN-LEF-11(2-41)与VC-LEF-11则无荧光激发(图9)。这表明LEF-11N端截短突变体LEF-11(2-61)、LEF-11(12-61)、LEF-11(22-61)、LEF-11(32-61)、LEF-11(42-61)、LEF-11(2-51)与全长LEF-11可发生相互作用，形成多聚体。上述结果验证了以荧光定位情况变化检测蛋白是否具有相互作用的系统的可靠性。
实施例4、蛋白荧光定位检测系统在研究不具有核定位信号的蛋白之间相互作用的应用
为进一步鉴定本发明所述的蛋白荧光定位检测系统在检测两个都不具有核定位信号的蛋白之间是否存在相互作用的可靠性，本发明首先构建一个不具有核定位信号的蛋白(Gem2核苷酸序列编码)并将其连接到pIZ-EGFP和pIZ-NSL-EGFP载体上，将构建的载体命名为pIZ-BmGem2-EGFP和pIZ-NSL-BmGem2-EGFP。另外将与上述蛋白具有相互作用的蛋白(6057核苷酸序列编码)连接到pIZ-DsRed载体上，命名为pIZ-DsRed-6057，Gem2核苷酸序列和6057核苷酸序列分别如SEQIDNo.8和SEQIDNo.9所示，载体均按照实施例1的方法进行构建和验证。
将pIZ-BmGem2-EGFP、pIZ-NSL-BmGem2-EGFP、pIZ-DsRed-6057分别单独转染到BmN-SWU1细胞中，转染48小时后荧光观察细胞定位。结果如图10所示，pIZ-BmGem2-EGFP和pIZ-DsRed-6057分别定位到细胞质中，在加上核定位信号后，pIZ-NSL-BmGem2-EGFP能够定位到细胞核内，说明构建的具有核定位信号的载体可以用于研究融合荧光蛋白定位检测。
同时，为证明本发明所述蛋白荧光定位检测系统能够通过加上核定位信号检测两个不具有核定位信号的蛋白之间的相互作用，将pIZ-NSL-BmGem2-EGFP与pIZ-DsRed-6057共同转染到BmN-SWU1细胞中，转染48小时后，荧光显微镜观察，结果如图11所示，pIZ-DsRed-6057在与pIZ-NSL-BmGem2-EGFP共同转染后由细胞质进入细胞核内，通过蛋白荧光定位检测系统鉴定了不具有核定位信号的蛋白之间相互作用。
同样，为了鉴定系统的可靠性，本发明进行了免疫共沉淀分析，分别把pIZ-BmGem2-EGFP与pIZ-DsRed-6057共同转染到BmN-SWU1细胞中，转染48小时后收集蛋白，方法同实施例2一致，免疫共沉淀结果如图12所示，他们之间确实具有明显的相互作用关系。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.用于检测蛋白间相互作用的蛋白荧光定位检测系统，其特征在于，所述蛋白荧光定位检测系统由四种融合蛋白组成：(1)荧光蛋白A和待测蛋白A组成的融合蛋白；(2)荧光蛋白A、核定位信号和待测蛋白A组成的融合蛋白；(3)荧光蛋白B和待测蛋白B组成的融合蛋白；(4)荧光蛋白B、核定位信号和待测蛋白B组成的融合蛋白；
所述荧光蛋白A与荧光蛋白B的荧光颜色不同；所述待测蛋白A和待测蛋白B为待检测是否存在相互作用的两个蛋白。
2.根据权利要求1所述的用于检测蛋白间相互作用的蛋白荧光定位检测系统，其特征在于，所述荧光蛋白、核定位信号和待测蛋白顺次连接。
3.根据权利要求1所述的用于检测蛋白间相互作用的蛋白荧光定位检测系统，其特征在于，所述荧光蛋白A、B为红色荧光蛋白或绿色荧光蛋白。
4.根据权利要求3所述的用于检测蛋白间相互作用的蛋白荧光定位检测系统，其特征在于，所述红色荧光蛋白的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述绿色荧光蛋白的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述核定位信号序列如SEQIDNo.3所示。
5.权利要求1～4任一项所述蛋白荧光定位检测系统中任一种融合蛋白的编码基因。
6.含有权利要求1～4任一项所述蛋白荧光定位检测系统中任一种融合蛋白的编码基因的重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒。
7.根据权利要求6所述的重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒，其特征在于，所述重组表达载体为pIZ-V5/His载体，所述重组菌为大肠杆菌DH5α，所述转基因细胞系为家蚕卵巢细胞系BmN-SWU1。
8.权利要求1～4任一项所述蛋白荧光定位检测系统在检测蛋白相互作用中的应用。
9.权利要求5所述编码基因在检测蛋白相互作用中的应用。
10.权利要求6或7任一项所述重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒在检测蛋白相互作用中的应用。
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