CN109182362A - 一种用于外泌体单分子定位超分辨成像的重组质粒和细胞株及其应用 - Google Patents

一种用于外泌体单分子定位超分辨成像的重组质粒和细胞株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于外泌体单分子定位超分辨成像的重组质粒和细胞株及其应用，把具有光激活性质的荧光蛋白基因和外泌体膜上标志性CD63蛋白基因进行融合构建成重组质粒，通过脂质体介导的质粒转染技术转染Hela细胞，通过药物筛选获得能够稳定表达光激活荧光蛋白标记的外泌体的Hela细胞。借助于光激活荧光蛋白，进行分离纯化的外泌体以及细胞内CD63蛋白分布的单分子定位的超分辨成像研究。与传统显微镜相比，单分子定位的超分辨成像提供更好的空间分辨率，实现了有活性的外泌体单分子定位显微成像，同时也实现了细胞内CD63蛋白分布的单分子定位成像研究。

Description

一种用于外泌体单分子定位超分辨成像的重组质粒和细胞株 及其应用
技术领域
本发明属于生物标记技术领域，具体涉及一种用于外泌体单分子定位超分辨成像的重组质粒和细胞株的制备方法及其应用。
背景技术
外泌体是细胞经过“内吞-融合-外排”过程而形成的细胞外小囊泡。直径为30-150nm的脂质双分子层结构囊泡。它作为一种重要的细胞间信息传递分子及遗传物质传递载体，外泌体内含有多种蛋白质和RNA等物质，广泛分布于人体血液、尿液、唾液等体液中以及肿瘤细胞培养液中。肿瘤细胞分泌的外泌体可以促进肿瘤血管生成，也可以通过调控肿瘤微环境来影响肿瘤的生长与转移，外泌体在肿瘤的发展中发挥重要作用。现阶段外泌体相关的荧光成像已经成为研究热点，
考虑到外泌体较小的尺寸(<150nm)，传统光学显微镜存在衍射极限，目前超分辨技术可以克服光学衍射极限问题，光学超分辨成像技术主要包括受激发射损耗显微技术(STED)，结构光照明显微技术(SIM)以及单分子定位显微技术(SMLM)。单分子定位显微技术(SMLM) 是使用特定的荧光探针，用特定波长的激光来激活荧光分子，然后用另一波长的激光激发荧光分子并成像。其中，控制激光的强度，使得每一幅图像中都只有少量稀疏的荧光分子被激活，通过计算拟合来精确定位这些单分子荧光的位置信息。目前单分子定位显微技术主要包括光激活定位显微技术(PALM)和随机光学重构显微技术(STORM)。光激活定位显微技术主要是利用光激活荧光蛋白或光激活染料标记蛋白质，调节激光器的能量，用低能量的激活光照射细胞，可以激活视野下的几个荧光分子，而且一次仅激活这几个荧光分子。然后用激发光检测，通过高斯拟合来精确定位这些被激活的荧光单分子。这些分子的位置被确定之后再使用激发光长时间照射这些分子，漂白这些已经定位正确的荧光分子，这样能够保证在下一轮的激活光照射之下这些分子不能再被激活。通过反复的激活-激发-漂白的循环，持续上千次后，得到细胞内荧光分子的精确定位信息，将这些分子的定位点叠加到一张图上，最后得到了一张比传统光学显微镜至少高10倍以上分辨率的显微成像图。
目前单分子定位超分辨技术用于外泌体研究中，主要是通过外泌体膜上标志性蛋白进行间接免疫荧光(IF)标记以及借助有闪烁功能的细胞膜染料。比如文献中报道外泌体膜蛋白 CD63首先用一抗标记，然后用标记有Alexa Fluor 488或Alexa Fluor 647的二抗偶联进行信号放大(Chen etal.ACS Appl Mater Interfaces 2016,8(39),25825-25833),Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 647染料，在开关状态之间可以可逆地进行数百次循环，非常适合使用在PALM/STORM 的超分辨率成像中。这种标记技术存在一定弊端，间接免疫荧光技术进行生物样品标记需要进行样本固定处理环节，导致生物样本自身是没有活性的。而借助于生物膜染料标记后需要对生物样品进行纯化处理，避免未标记上的染料的干扰。
发明内容
为了解决上述问题，本发明公开一种用于外泌体单分子定位超分辨成像的重组质粒，所述重组质粒由荧光蛋白基因和外泌体膜上标志性CD63蛋白基因进行融合构建而成。
对于上文所述的技术方案，优选的情况下，所述的荧光蛋白选自PAmcherry、Dronpa、 mEos2或mGeos。
优选的，本发明实施例中具体选用的荧光蛋白为PAmCherry光激活荧光蛋白，它是荧光蛋白mCherry的突变体，光照条件下才能被激活，当一定波长的光线照射到它们时，它们就会开始闪烁，发出特定颜色的光。PAmCherry一般不发光，在350-400nm光下暴露一会儿之后，会发出红色荧光。PAmCherry光激活蛋白可以经405nm光激活，532nm光漂白后能出现很好的闪烁的现象，比较适合用来做单分子定位超分辨成像研究。
对于上文所述的技术方案，优选的情况下，所述重组质粒通过基因工程技术将PAmcherry 蛋白基因序列融合构建到CD63基因片段的3’端，表达出CD63蛋白的C端含有PAmcherry 蛋白序列。
另一方面，本发明公开一种用于外泌体单分子定位超分辨成像的细胞株，所述细胞株为利用上文所述重组质粒，通过脂质体介导的质粒转染技术转染Hela细胞获得。
本发明实施例具体公开了一种能稳定分泌PAmcherry光激活荧光蛋白标记外泌体的Hela 细胞株制备方法，通过基因工程技术构建一种融合表达PAmcherry红色荧光蛋白和CD63蛋白的重组质粒载体，通过脂质体介导的质粒转染技术转染Hela细胞，通过药物筛选获得能够稳定表达PAmcherry光激活荧光蛋白标记的外泌体的Hela细胞。借助于PAmcherry光激活荧光蛋白，进行分离纯化的外泌体以及细胞内CD63蛋白分布的单分子定位的超分辨成像研究。
另一方面，本发明上文所述的重组质粒在有活性的外泌体单分子定位超分辨成像技术中具有很好的应用前景。
另一方面，本发明上文所述的细胞株在有活性的外泌体单分子定位超分辨成像技术中具有很好的应用前景。
具体用于细胞内CD63蛋白分布的单分子定位成像，观察和跟踪纳米尺度的外泌体。
光转换荧光蛋白Dronpa，mEos2，mGeos，这些荧光蛋白都可以被405nm激光所激活，被488nm激光关闭，并且可以反复开关多次，因此，也可以很好的应用于本发明的技术方案中。
通过基因工程技术将PAmcherry蛋白基因序列融到CD63基因片段的3’端，可以表达出 CD63蛋白的C端含有PAmcherry蛋白序列。
与传统显微镜相比，单分子定位的超分辨成像提供更好的空间分辨率比较适合观察和跟踪纳米尺度的外泌体。文中前面提到目前单分子定位超分辨技术用于外泌体研究中，主要是通过外泌体膜上标志性蛋白进行间接免疫荧光(IF)标记以及借助有闪烁功能的细胞膜染料。此方法无需对细胞样品进行固定以及标记后洗涤操作，对细胞没有损伤，可以进行活细胞的快速成像研究。
附图说明
图1标记成功的Hela细胞(稳定转染CD63-PAmcherry质粒)经405nm激活后共聚焦成像图。A为405nm激活后荧光场图像；B为经405nm激活后，荧光场和明场叠加图像；
图2外泌体的超分辨成像(借助PAmcherry蛋白)。A，外泌体的宽视场图像B，外泌体的PALM图像C，单个外泌体的尺寸(通过高斯函数拟合)。
图3稳定转染CD63-PAmcherry Hela细胞超分辨成像。A，Hela细胞内CD63蛋白的宽视场图像；B，Hela细胞内CD63蛋白的PALM图像。
图4琼脂糖凝胶电泳分析目标序列PCR产物和目标序列片段回收。A CD63(717bp)序列的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图，B CD63(717bp)序列凝胶回收的琼脂糖凝胶电泳图，C PAmcherry(708bp)序列的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图，D PAmcherry(708bp)序列凝胶回收的琼脂糖凝胶电泳图。
图5CD63-PAmcherry质粒(5000bp左右)的琼脂糖凝胶电泳图(图中箭头所指)。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
1.外泌体标志性蛋白CD63基因和PAmcherry蛋白基因的获得
CD63蛋白是外泌体膜上一种标志性的四跨膜蛋白，CD63蛋白的C端和N端都在外泌体的膜内。通过基因工程技术将PAmcherry蛋白基因序列融到CD63基因片段的3’端，可以表达出CD63蛋白的C端含有PAmcherry蛋白序列，实现对CD63蛋白的荧光标记。以购买的含有CD63目标基因片段(CD63基因如SEQ ID No.5)以及PAmcherry目标基因片段(PAmcherry基因如SEQ ID No.6)的商业化质粒为模版，通过PCR技术，设计上下游引物扩增出含限制性内切酶EcoRV、XhoI位点的CD63基因片段以及含限制性内切酶NotI,XhoI 位点的PAmcherry基因片段，如图4。其中：
所述的CD63的上游引物序列为SEQ ID No.1：
ccggatatca tggcggtgga aggaggaat
所述的CD63的下游引物序列为SEQ ID No.2：
ccactcgagg tacatcacct cgtagccac
所述的PAmcherry质粒的上游引物序列为SEQ ID No.3：
gagctcgaga tggtgagcaa gggcgaggag
所述的PAmcherry质粒的下游引物序列为SEQ ID No.4：
gacgcggccg ctcacttgta cagctcgtcc atgc
胶回收目标片段，加入T4DNA连接酶，与pMD-19T载体在16℃连接过夜。连接产物分别为pMD-19T-CD63质粒，以及pMD-19T-PAmcherry质粒转化感受态大肠杆菌DH5a，挑取平板的阳性单克隆菌于含氨苄霉素(100ug/mL)的LB培养基中活化，首先进行菌液PCR 验证目标序列，取PCR阳性组进行基因测序，结果正确后，利用碱裂解法质粒提取试剂盒提取质粒。1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒条带位置及浓度。
2.重组融合表达质粒载体的构建以及鉴定
按照标准的分子克隆方法构建CD63-PAmcherry重组质粒。取步骤1所得的鉴定正确的 pMD-19T-CD63质粒，经EcoRV和XhoI双酶切，胶回收717bp的CD63片段。同时对商业化的模版质粒载体进行EcoRV和XhoI双酶切，胶回收5000bp大片段，回收后片段继续使用 1％的琼脂糖凝胶电泳，鉴定目标条带位置及浓度。将酶切获得的CD63小片段分别与商业化模版质粒载体大片段混合，于16℃连接过夜。连接产物热激转化感受态大肠杆菌DH5a，使用氨苄青霉素抗性的固体LB平板培养筛选阳性克隆。挑取的单菌落活化后进行菌液PCR鉴定同时进行基因测序，鉴定正确后提取含CD63的模版质粒备用。鉴定正确的含CD63模版质粒经NotI和XhoI双酶切，胶回收5000bp大片段(即含有CD63基因的目的大片段)，鉴定正确的pMD-19T-PAmcherry质粒经NotI和XhoI双酶切，胶回收708bp PAmcherry基因目的小片段，将含有CD63基因的目的大片段和PAmcherry基因目的小片段(摩尔比为1:3)在 T4DNA连接酶作用下，16℃连接过夜，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a，挑取平板的阳性单克隆菌于含氨苄霉素(100ug/mL)的LB培养基中活化，首先进行菌液PCR验证目标序列，取PCR阳性组进行基因测序，结果正确后，获得CD63-PAmcherry重组质粒，如图5。
3.脂质体转染Hela细胞后以及荧光筛选
将生长状态良好的Hela细胞传代计数，按照8×104细胞/孔铺24孔板，贴壁培养24h。当细胞汇合度达到约70-90％，每孔细胞换用0.5mL无抗生素无血清DMEM(高糖)培养基。将1uL Lipofectamine 2000与25uL无血清DMEM(高糖)培养基混匀，另取25uL无血清DMEM(高糖)培养基分别加入0.5ug上述步骤2获得的CD63-PAmcherry重组质粒混匀。将CD63-PAmcherry重组质粒与Lipofectamine2000组分混匀静置5min。将CD63-PAmcherry重组质粒-Lipofectamine 2000混合物加入细胞培养板，继续培养约12h，更换为正常培养基。CD63-PAmcherry质粒含有新霉素抗性基因(neo基因)，可以使用氨基糖苷类抗生素G418(遗传霉素)筛选出质粒整合到基因组并稳定表达的细胞。在荧光显微镜上检查荧光蛋白的表达，将单细胞克隆到96孔板，筛选出稳定表达PAmcherry的Hela细胞株。标记成功的Hela细胞经405nm激活后，细胞质中有红色荧光产生，如图1。
4.标记成功的Hela细胞分泌的外泌体纯化分离
参考文献报道的超速离心的方法进行外泌体的分离纯化，大致实验流程如下所述。能稳定表达CD63-PAmcherry的Hela细胞培养在MEM培养基中，该培养基含有10％去除外泌体的胎牛血清，1％的青霉素和链霉素。用75cm2细胞培养瓶在含5％的CO2培养箱中37℃培养至80％汇合度，收集细胞培养基20mL，以4℃，2000g离心10分钟以除去细胞碎片，然后收集上清过0.22um过滤器，上清液以4℃，100000g超速离心2h。保留沉淀物，用PBS洗涤，4℃下100000g再次离心2h。将外泌体沉淀悬浮在500uLPBS溶液中，-80℃保存备用。
5.标记成功的Hela细胞分泌的外泌体超分辨成像
将清洗干净的玻璃片，用带有正电荷的0.1％聚乙烯亚胺水溶液处理15分钟后，加入带有PAmcherry光激活荧光蛋白的外泌体分离浓缩液，自然沉降15min后进行成像研究。同时设置对照组，对照组除不加带有PAmcherry光激活荧光蛋白的外泌体其他操作与实验组相同。样品分别由68％532nm激光连续激发，与此同时还连续施加20％405nm激活激光，实验组相比对照组出现了很好的闪烁，以20Hz获得5000个图像，通过计算拟合以及图像重构后得到外泌体超分辨成像图像。重构后的外泌体大小尺寸为80nm左右，这与外泌体的实际大小相符合，如图2。
6.标记成功后Hela细胞内CD63蛋白分布的超分辨成像
将清洗干净的玻璃片，铺上能稳定表达CD63-PAmcherry蛋白的Hela细胞，贴壁培养24 h后，更换成含10％FBS的无酚红MEM培养基进行超分辨成像，样品分别由68％532nm激光连续激发，与此同时还连续施加20％405nm激活激光，首先在40％532nm照射下采集宽视野图像，100Hz获得1000个图像，其次样品由68％532nm激光连续激发，与此同时还连续施加20％405nm激活激光，以20Hz获得5000个图像，通过计算拟合以及图像重构后得到。
序 列 表
<110> 大连理工大学
<120> 一种用于外泌体单分子定位超分辨成像的重组质粒和细胞株及其应用
<130> 2015
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> CD63的上游引物序列
<400> 1
ccggatatca tggcggtgga aggaggaat 29
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> CD63的下游引物序列
<400> 2
ccactcgagg tacatcacct cgtagccac 29
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> PAmcherry质粒的上游引物序列
<400> 3
gagctcgaga tggtgagcaa gggcgaggag 30
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> PAmcherry质粒的下游引物序列
<400> 4
gacgcggccg ctcacttgta cagctcgtcc atgc 34
<210> 5
<211> 717
<212> DNA
<213> CD63蛋白的核苷酸序列
<400> 5
atggcggtgg aaggaggaat gaaatgtgtg aagttcttgc tctacgtcct cctgctggcc 60
ttttgcgcct gtgcagtggg actgattgcc gtgggtgtcg gggcacagct tgtcctgagt 120
cagaccataa tccagggggc tacccctggc tctctgttgc cagtggtcat catcgcagtg 180
ggtgtcttcc tcttcctggt ggcttttgtg ggctgctgcg gggcctgcaa ggagaactat 240
tgtcttatga tcacgtttgc catctttctg tctcttatca tgttggtgga ggtggccgca 300
gccattgctg gctatgtgtt tagagataag gtgatgtcag agtttaataa caacttccgg 360
cagcagatgg agaattaccc gaaaaacaac cacactgctt cgatcctgga caggatgcag 420
gcagatttta agtgctgtgg ggctgctaac tacacagatt gggagaaaat cccttccatg 480
tcgaagaacc gagtccccga ctcctgctgc attaatgtta ctgtgggctg tgggattaat 540
ttcaacgaga aggcgatcca taaggagggc tgtgtggaga agattggggg ctggctgagg 600
aaaaatgtgc tggtggtagc tgcagcagcc cttggaattg cttttgtcga ggttttggga 660
attgtctttg cctgctgcct cgtgaagagt atcagaagtg gctacgaggt gatgtac 717
<210> 6
<211> 708
<212> DNA
<213> PAmcherry蛋白的核苷酸序列
<400> 6
atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatta aggagttcat gcgcttcaag 60
gtgcacatgg aggggtccgt gaacggccac gtgttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120
cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggcgg ccccctgccc 180
ttcacctggg acatcctgag ccctcagttc atgtacggct ccaatgccta cgtgaagcac 240
cccgccgaca tccccgacta ctttaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300
gtgatgaaat tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360
ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgtg 420
atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc ctctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480
gccctgaagg gcgaggtcaa gcccagagtg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540
gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600
aaccgcaagc tggacatcac cagccacaac gaggactaca ccatcgtgga gcagtacgag 660
agagccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaag 708

Claims (6)

1.一种用于外泌体单分子定位超分辨成像的重组质粒，其特征在于：所述重组质粒由荧光蛋白基因和外泌体膜上标志性CD63蛋白基因进行融合构建而成。
2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于：所述的荧光蛋白选自PAmcherry、Dronpa、mEos2或mGeos。
3.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于：所述重组质粒通过基因工程技术将PAmcherry蛋白基因序列融合构建到CD63基因片段的3，端，表达出CD63蛋白的C端含有PAmcherry蛋白序列。
4.如权利要求1所述的重组质粒在有活性的外泌体单分子定位超分辨成像技术中的应用。
5.一种用于外泌体单分子定位超分辨成像的细胞株，其特征在于：所述细胞株为利用权利要求1所述重组质粒，通过脂质体介导的质粒转染技术转染Hela细胞获得。
6.如权利要求5所述的细胞株在有活性的外泌体单分子定位超分辨成像技术中的应用。
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