CN104991072B - 一种昆虫体外蛋白质相互作用检测系统的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种昆虫体外蛋白质相互作用检测系统的制备方法及应用，通过PCR方法将mCherry在第159位和160位氨基酸残基处分割成NmC和CmC两个片段，并分别与一段连接区序列、c‑Myc标签、以及poly(A)序列融合，形成四个融合片段；四个融合片段分别与含有苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒ie1基因启动子和gp64基因poly(A)序列的pIE‑MCS质粒连接；构建成表达质粒；将表达质粒组合构成昆虫细胞双分子荧光互补检测系统。本发明简单易行，所建立的双分子荧光互补系统拓展了昆虫细胞表达系统的应用，并为昆虫蛋白质组学、以及昆虫与其病原微生物之间蛋白质相互作用研究提供便捷、有效的技术手段。

Description

一种昆虫体外蛋白质相互作用检测系统的制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，其涉及一种昆虫体外蛋白质相互作用检测系统的制备方法及应用。
背景技术
在细胞正常的生理代谢条件下，蛋白质是细胞活性和功能的执行者。通过复杂的相互作用，蛋白质参与细胞信号转导、增殖、分化、免疫、凋亡等各个生命过程。近年来，随着大量物种基因组和转录组信息的获得，蛋白质组学---系统研究某一物种蛋白质结构、功能、及其相互作用网络已成为生命科学领域的热点。其中，解析蛋白质相互作用是揭示蛋白质结构与功能的基础，有助于系统解释多种生命现象和过程、探索疾病发生发展、以及寻找新的药物靶标。
迄今，人们已发展了多种蛋白质相互作用检测技术方法，包括经典的酵母双杂交、免疫共沉淀、GST-pull down，以及近年来建立的串联亲和纯化(Tandem affinitypurification，TAP)、荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer，FRET)和蛋白质互补(Protein complementation assay，PCA)技术等。在这些方法中，免疫共沉淀、GST-pull down和TAP技术需要预先裂解细胞、在体外通过亲和纯化获得较多的目标蛋白才能进行下一步的研究，许多蛋白在分离、纯化过程中由于发生降解或其天然活性改变而导致蛋白质功能丧失或检测不到相互作用。同时，这些方法也不适用于检测微弱或瞬时的蛋白质相互作用。酵母双杂交技术虽然应用较广泛，由于融合蛋白相互作用激活报告基因转录是在酵母细胞核内发生，该技术要求相互作用的蛋白必须表达定位在细胞核内。对于存在于细胞质内或细胞膜上的蛋白，酵母双杂交技术不能检测。此外，酵母属低等真核生物，对于一些较高等真核生物的蛋白质不能进行特定的翻译后修饰，进而影响蛋白的正确折叠和相互作用。FRET技术虽适用于细胞内直观检测蛋白质相互作用的定位和定量信息，但其灵敏度较低，荧光探针选择和测试方法复杂，并且需要昂贵的仪器设备。如何将目标蛋白还原到其原有的细胞生理状态下，较简单易行和准确地研究蛋白质之间的相互作用是当前技术发展的重要需求。PCA是近年来基于这种需求发展起来的一类新的蛋白质相互作用检测技术，该技术是基于将一个报告蛋白合理地分割成N-端和C-端两个片段后，单个片段都没有活性、报告蛋白功能丧失，但当两个片段充分靠近和重新折叠、报告蛋白功能恢复。目前，应用于PCA技术的报告蛋白有泛素(ubiquitin)、二氢叶酸还原酶、以及荧光蛋白等。其中，基于荧光蛋白的双分子荧光互补系统(Bimolecular fluorescencecomplementation，BIFC)发展较迅速。
双分子荧光互补技术是利用荧光蛋白，如GFP、YFP、RFP等从中间分割后，两个片段均不产生荧光，而当与这两个片段融合的两个目标蛋白发生相互作用时，荧光蛋白的两个片段重新组合，恢复天然构象并发出荧光，从而形成一个报告系统用于检测目标蛋白的相互作用。相对于其它蛋白质相互作用检测技术，BIFC的优点是：1)不需要裂解细胞，所研究的目标蛋白处于其天然的细胞环境中；2)复合物的形成比较稳定，可用于研究蛋白质之间微弱或瞬时的相互作用，并且能够直观反映相互作用蛋白在细胞中的定位；3)耗时比较短，对仪器配置要求低(一般的倒置荧光显微镜就可以满足实验的需要)，数据处理相对简单。目前，BIFC技术已在植物、哺乳动物细胞、以及一些较低等的真核生物、如线虫中广泛应用。然而，目前广泛应用于其它生物的BIFC技术主要存在以下几个方面的缺点：
1)基于GFP、YFP、RFP等建立的双分子荧光互补系统的背景较高；
2)线虫、植物、哺乳动物细胞等的BIFC技术均采用各类生物特异的启动子系统，而这些启动子系统均不能在昆虫细胞中被识别和指导目标蛋白表达；
3)线虫和植物的BIFC系统操作复杂，转化困难、且仅适用于自身相关的蛋白质相互作用检测，外源蛋白质相互作用(如哺乳动物和昆虫等)不能用该类系统进行检测；
4)哺乳动物细胞的BIFC质粒转染效率较低，并需要昂贵的转染试剂，不适合大规模蛋白质相互作用筛选和检测；
5)哺乳动物细胞培养需在CO2培养箱中进行且提供CO2、其培养过程较复杂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种便捷、有效的昆虫体外蛋白质相互作用检测系统，旨在解决现有的双分子荧光互补检测方法中背景较高，启动子系统均不能在昆虫细胞中被识别和指导目标蛋白表达、无法利用该类系统进行昆虫及其病原微生物蛋白质相互作用检测，哺乳动物细胞BIFC质粒转染效率较低、不适合大规模蛋白质相互作用筛选和检测，哺乳动物细胞培养过程较复杂等问题。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：
昆虫体外蛋白质相互作用检测系统的制备方法，所述昆虫体外蛋白质相互作用检测系统的制备方法利用双分子荧光互补技术，基于红色荧光蛋白mCherry，具体包括以下步骤：
步骤一，将红色荧光蛋白mCherry在第159位和160位氨基酸残基处分割成NmCherry 1-159位氨基酸和CmCherry 160-236位氨基酸两个蛋白序列片段，分别记作NmC和CmC，构成双分子荧光互补探针；
步骤二，将NmC和CmC两个蛋白序列片段分别构建到两个表达载体中，将待测的两个目标蛋白A和B的DNA序列分别与NmC和CmC通过一段连接区序列融合构建用于表达融合蛋白；
步骤三，利用双分子荧光互补现象；将融合蛋白表达载体共转染昆虫细胞，使用倒置荧光显微镜观察是否存在红色荧光：待测蛋白质A和蛋白质B之间存在相互作用，则被分割的NmC和CmC会在空间上靠近而重新组合形成完整的荧光蛋白mCherry，在激发光下能够发射红色荧光；在共转染的昆虫细胞中没有红色荧光产生，证明待测蛋白质A和蛋白质B之间没有相互作用。
进一步，将NmC或者CmC与目标蛋白连接的Linker的氨基酸序列为：
GTSGGSG；
基因编码序列为：
5’-GGGACGTCGGGTGGAAGCGGT-3’。
进一步，指导目标蛋白高效表达的启动子元件为苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒ie1基因的启动子序列599个碱基，而多聚腺苷酸尾序列为苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒囊膜基因gp64的poly(A)218个碱基。
本发明的另一目的在于提供一种昆虫体外蛋白质相互作用检测系统在蛋白质相互作用检测中的应用，所述昆虫体外蛋白质相互作用检测系统在蛋白质相互作用检测中的应用具体包括：
步骤一，利用苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒编码的Ac146，Lef3，GP41，Ac103四个蛋白作为两组组合，Ac146与Lef3，GP41与Ac103验证新构建的昆虫细胞双分子荧光互补系统的有效性；
步骤二，通过PCR方法将Ac146与Lef3编码基因分别克隆到NmCherry-MycpBlue和CmCherry-MycpBlue载体中，获得重组表达质粒NmC-Myc-Ac146pBlue、CmC-Myc-Ac146pBule、CmC-Myc-Lef3pBlue；通过PCR方法将GP41与Ac103编码基因分别克隆到Myc-NmCherrypBlue和Myc-CmCherrypBlue载体中，获得重组表达质粒GP41-Myc-NmCpBlue、GP41-Myc-CmCpBule、Ac103-Myc-CmCpBlue；
步骤三，按照处理组合NmC-Myc-Ac146pBlue和CmC-Myc-Ac146pBlue、NmC-Myc-Ac146pBlue和CmC-Myc-Lef3pBlue、GP41-Myc-NmCpBlue和GP41-Myc-CmCpBlue、以及GP41-Myc-NmCpBlue和Ac103-Myc-CmCpBlue共转染Sf9细胞，在转染后24小时，在倒置荧光显微镜下观察，发现在共转染NmC-Myc-Ac146pBlue和CmC-Myc-Ac146pBlue或GP41-Myc-NmCpBlue和GP41-Myc-CmCpBlue的Sf9细胞中清晰地产生了mCherry的红色荧光信号，而在共转染NmC-Myc-Ac146pBlue和CmC-Myc-Lef3pBlue或GP41-Myc-NmCpBlue和Ac103-Myc-CmCpBlue的Sf9细胞中没有任何荧光产生；进一步通过计数单个视野下的红色荧光细胞数比例，表明所构建的昆虫细胞双分子荧光互补系统可定性和定量检测蛋白质相互作用。
本发明提供的昆虫体外蛋白质相互作用检测系统的制备方法及其应用与现有技术相比，具有以下优点和效果：
1)该系统选用红色荧光蛋白mCherry，在转染的昆虫细胞中，阴性对照背景干净；
2)该系统选用苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒ie1基因的启动子序列，该启动子可利用昆虫细胞RNA聚合酶指导目标基因的转录和高效表达；
3)该系统可用简单、廉价的磷酸钙沉淀法高效转染昆虫细胞，磷酸钙沉淀法转染试剂可自行配置；
4)该系统转染的昆虫细胞可在密闭条件下培养；
5)该系统可用于大规模蛋白相互作用的筛选与鉴定。
本发明可以在较短时间内(转染后16-36小时)检测哺乳动物、植物、昆虫、线虫等多种真核生物及其病原微生物蛋白质之间相互作用，方法简单、成本较低、背景干净。本发明的建立不仅拓展了昆虫细胞表达系统的应用，同时，也为昆虫蛋白质组学、以及昆虫与其病原微生物之间蛋白质相互作用研究提供便捷、有效的技术手段。
附图说明
图1是本发明实施例提供的双分子荧光互补系统原理示意图；
图2是本发明实施例提供的昆虫细胞双分子荧光互补系统表达载体示意图；
图中：Acie1-p:苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒ie1基因启动子；ApR:氨苄青霉素抗性基因；Bait，诱饵蛋白；GP64p(A):苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒gp64基因多聚腺苷酸尾序列(poly(A))；Lac-p:乳糖启动子；Prey，捕获蛋白，(详细的各元件名称中英文对照说明见表2)；
图3是本发明实施例提供的Western blot检测融合蛋白在Sf9细胞中表达示意图；
图4是本发明实施例提供的共转染Sf9细胞荧光观察及目标蛋白Western blot检测示意图；
图5是本发明实施例提供的共转染Sf9细胞中单个视野下的荧光细胞数比例示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明选用红色荧光蛋白mCherry，建立了昆虫细胞BIFC系统。该系统采用在昆虫细胞中指导目标蛋白高效表达的昆虫杆状病毒ie1基因启动子和特异的gp64基因的poly(A)序列，并通过简单的磷酸钙沉淀法高效转染密闭培养的昆虫细胞。昆虫细胞BIFC系统的建立不仅拓展了昆虫细胞表达系统的应用，同时，也为昆虫蛋白质组学、以及昆虫与其病原微生物之间蛋白质相互作用研究提供便捷、有效的技术手段。
所以，本发明的昆虫细胞双分子荧光互补系统，用于蛋白质相互作用检测。该系统基于红色荧光蛋白mCherry，将其分割为N-端和C-端两个蛋白质片段，将待检测的两个目标蛋白DNA序列分别与mCherry的两个片段融合。在昆虫杆状病毒ie1基因的启动子指导下、采用简单的磷酸钙沉淀法转染密闭培养的昆虫细胞表达融合蛋白，并通过倒置荧光显微镜观察和计数单个视野中的荧光细胞数，定性和定量分析蛋白质相互作用，为一种简单、有效、快速、方便的昆虫体外蛋白质相互作用检测系统。
下面结合附图对本发明的原理组详细的说明：
一种昆虫体外蛋白质相互作用检测系统的制备方法，其步骤是：
1.根据双分子荧光互补技术原理(图1)，将红色荧光蛋白mCherry在第159位和160位氨基酸残基处分割成NmCherry(1-159位氨基酸)和CmCherry(160-236位氨基酸)两个蛋白序列片段，分别记作NmC和CmC。通过PCR方法将NmC和CmC分别与一段连接区序列(Linker)、c-Myc标签、以及苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒囊膜基因gp64的poly(A)序列融合，形成NmC-Linker-Myc、CmC-Linker-Myc、Myc-Linker-NmC-poly(A)、以及Myc-Linker-CmC-poly(A)四个融合片段。
2.采用两种限制性内切酶XbaI和BamHI对NmC-Linker-Myc和CmC-Linker-Myc酶切，用另外两种限制性内切酶EcoRI和HindIII对Myc-Linker-NmC-poly(A)和Myc-Linker-CmC-poly(A)酶切。同时，用XbaI和BamHI或EcoRI和HindIII对pIE-MCS质粒酶切(该载体由本实验自主构建，其中携带有苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒ie1基因的启动子和gp64基因的poly(A)序列)。随后，将酶切的融合片段NmC-Linker-Myc、CmC-Linker-Myc、Myc-Linker-NmC-poly(A)、以及Myc-Linker-CmC-poly(A)分别与用同种类限制性内切酶酶切回收的载体pIE-MCS连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取克隆，提取质粒，酶切和测序验证，获得表达质粒NmCherry-MycpBlue,CmCherry-MycpBlue,Myc-NmCherrypBlue，Myc-CmCherrypBLue。其中，将NmCherry-MycpBlue与CmCherry-MycpBlue、Myc-NmCherrypBlue与Myc-CmCherrypBlue组合构成双分子荧光互补蛋白质相互作用检测系统(图2)。
一个由NmCherry-MycpBlue与CmCherry-MycpBlue组成的双分子荧光互补系统的功能，有如下特征：
1)含有苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒ie1基因的启动子序列，该启动子可以启动插入其下游的、与NmC或CmC蛋白质片段C-端融合的待测目标蛋白的表达；
2)含有一个Linker连接区，该连接区的N-端与NmC或CmC的C-端连接，而该连接区的C-端与c-Myc标签的N-端连接，以保证NmC或CmC与待测蛋白之间具有一定的柔性，便于蛋白质折叠；
3)含有一个c-Myc标签，该c-Myc标签位于待测蛋白的N-端，便于检测待测蛋白的表达；
4)含有一个多克隆位点，该多克隆位点位于c-Myc标签之后，具有多个限制性内切酶位点，便于克隆待测蛋白的DNA序列；
5)含有一个氨苄青霉素抗性基因，便于转化有质粒的细菌在相应抗性培养基上的筛选和培养；
6)含有待测蛋白的DNA序列的双分子荧光互补质粒共转染昆虫细胞表达后，在倒置荧光显微镜下可以直接观察mCherry红色荧光，通过观察红色荧光的有无及计数红色荧光细胞数量，可以定性及定量衡量待测蛋白之间的相互作用及其强弱。
一个由Myc-NmCherrypBlue与Myc-CmCherrypBlue组成的双分子荧光互补系统的功能，有如下特征：
1)含有苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒ie1基因的启动子序列，该启动子可以启动插入其下游的、与NmC或CmC蛋白质片段N-端融合的待测目标蛋白的表达；
2)含有一个Linker连接区，该连接区的N-端与c-Myc标签的C-端连接，而该连接区的C-端与NmC或CmC的N-端连接，以保证NmC或CmC与待测蛋白之间具有一定的柔性，便于蛋白质折叠；
3)含有一个c-Myc标签，该c-Myc标签位于待测蛋白的C-端，便于检测待测蛋白的表达。
4)含有一个多克隆位点，该多克隆位点位于c-Myc标签之前，具有多个限制性内切酶位点，便于克隆待测蛋白的DNA序列；
5)含有一个氨苄青霉素抗性基因，便于转化有质粒的细菌在相应抗性培养基上的筛选和培养；
6)含有待测蛋白的DNA序列的双分子荧光互补质粒共转染昆虫细胞表达后，在倒置荧光显微镜下可以直接观察mCherry红色荧光，通过观察红色荧光的有无及计数红色荧光细胞数量，可以定性及定量衡量待测蛋白之间的相互作用及其强弱。
一种昆虫体外蛋白质相互作用检测系统在蛋白质相互作用检测中的应用，其步骤是：
1.利用已知的苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒编码的4个蛋白(Ac146，Lef3，GP41，Ac103)作为两组组合(Ac146与Lef3，GP41与Ac103)验证新构建的昆虫细胞双分子荧光互补系统的有效性。
2.通过PCR方法将Ac146与Lef3编码基因分别克隆到NmCherry-MycpBlue和CmCherry-MycpBlue载体中，获得重组表达质粒NmC-Myc-Ac146pBlue、CmC-Myc-Ac146pBule、CmC-Myc-Lef3pBlue。通过PCR方法将GP41与Ac103编码基因分别克隆到Myc-NmCherrypBlue和Myc-CmCherrypBlue载体中，获得重组表达质粒GP41-Myc-NmCpBlue、GP41-Myc-CmCpBule、Ac103-Myc-CmCpBlue。
3.按照处理组合NmC-Myc-Ac146pBlue和CmC-Myc-Ac146pBlue、NmC-Myc-Ac146pBlue和CmC-Myc-Lef3pBlue、GP41-Myc-NmCpBlue和GP41-Myc-CmCpBlue、以及GP41-Myc-NmCpBlue和Ac103-Myc-CmCpBlue共转染Sf9细胞。在转染后24小时，在倒置荧光显微镜下观察，发现在共转染NmC-Myc-Ac146pBlue和CmC-Myc-Ac146pBlue或GP41-Myc-NmCpBlue和GP41-Myc-CmCpBlue的Sf9细胞中清晰地产生了mCherry的红色荧光信号，而在共转染NmC-Myc-Ac146pBlue和CmC-Myc-Lef3pBlue或GP41-Myc-NmCpBlue和Ac103-Myc-CmCpBlue的Sf9细胞中没有任何荧光产生(图4)。进一步通过计数单个视野下的红色荧光细胞数比例(图5)，表明本发明所构建的昆虫细胞双分子荧光互补系统可以定性和定量检测蛋白质相互作用。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
一、昆虫体外蛋白质相互作用检测方法的原理：
本发明是基于红色荧光蛋白mCherry，依照双分子荧光互补技术的原理建立一种昆虫体外蛋白质相互作用检测技术。其原理是将红色荧光蛋白mCherry在第159位和160位氨基酸残基处分割成NmCherry(1-159位氨基酸)和CmCherry(160-236位氨基酸)两个蛋白序列片段，分别记作NmC和CmC；NmC和CmC分别通过一段连接区序列(Linker)与待检测蛋白质A(本发明中选用苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒蛋白Ac146和GP41)和待测蛋白质B(选用苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒蛋白Lef3和Ac103)融合；若待测蛋白质A和蛋白质B之间存在相互作用，则被分割的NmC和CmC会在空间上靠近而重新组合形成完整的荧光蛋白mCherry，在其激发光下能够发射红色荧光；反之，若蛋白质A和蛋白质B之间没有发生相互作用，则NmC和CmC不能够重新组装成完整mCherry，不能被激发而发射荧光(原理见图1)。
二、昆虫体外蛋白质相互作用检测系统的组成：
考虑到蛋白质空间结构的差异，不同蛋白质在其N-端或者C-端融合其它蛋白时可能会对原有蛋白的空间构象产生位阻，进而影响其表达。本发明构建了能够融合到待检测蛋白的N-端或C-端的NmC和CmC的不同组合以适应各种蛋白质融合位置的选择。按照上述原理方式检测蛋白质A和蛋白质B之间的相互作用，从而完成了本发明。
本发明构建的不同融合方式的荧光互补系统均由蛋白质片段NmC和CmC组成。
红色荧光蛋白mCherry是已知蛋白，其氨基酸序列如Sequence ID：1所示，其基因编码序列如Sequence ID：2所示；
蛋白质片段NmC的氨基酸序列如Sequence ID：3所示，其基因编码序列如SequenceID：4所示；
蛋白质片段CmC的氨基酸序列如Sequence ID：5所示，其基因编码序列如SequenceID：6所示；
将NmC或者CmC与目标蛋白连接的Linker的氨基酸序列为：GTSGGSG，其基因编码序列为：5’-GGGACGTCGGGTGGAAGCGGT-3’；为了方便利用Western blotting技术检测融合蛋白的表达，在Linker序列之前或之后融合了c-Myc标签。c-Myc的氨基酸序列为：EQKLISEEDL，其基因编码序列为：5’-GAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTG-3’；
本发明采用昆虫杆状病毒---苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒极早期基因ie1的启动子和病毒囊膜基因gp64的poly(A)序列。其中，ie1基因的启动子序列如Sequence ID：7所示，gp64基因的ploy(A)序列如Sequence ID：8所示；
本发明使用商品化的pBlueScript(-)质粒为模板所构建的表达载体分别命名为NmCherry-MycpBlue，CmCherry-MycpBlue，Myc-NmCherrypBlue，和Myc-CmCherrypBlue，结构如图3所示；
本发明选用苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒编码的4个蛋白(Ac146，Lef3，GP41，Ac103)作为两组组合(Ac146与Lef3，GP41与Ac103)验证BIFC系统的有效性。已有的研究结果表明，Ac146与Lef3主要分布于昆虫细胞的细胞核，而GP41与Ac103则在细胞质和细胞核中均有分布。其中，Ac146或GP41可以通过自身相互作用形成同源二聚体，而Lef3或Ac103则不能与Ac146或GP41相互作用。另外，在Ac146或Lef3的N-末端融合GFP或在GP41或Ac103的C-末端融合GFP，对这些蛋白的功能没有明显的影响。基于这些研究结果，选择在Ac146和Lef3的N-末端，GP41和Ac103的C-末端融合NmC或CmC。
Ac146的氨基酸序列如Sequence ID：9所示，其基因编码序列如Sequence ID：10所示；
Lef3的氨基酸序列如Sequence ID：11所示，其基因编码序列如Sequence ID：12所示；
GP41的氨基酸序列如Sequence ID：13所示，其基因编码序列如Sequence ID：14所示；
Ac103的氨基酸序列如Sequence ID：15所示，其基因编码序列如Sequence ID：16所示；
通过昆虫体外蛋白质相互作用检测系统的构建方法及其效果验证对本发明作进一步的说明：
下述实验中所用的PCR引物序列如表1所示。
表1PCR引物序列
(一)表达各种融合蛋白的重组表达质粒的构建
1、表达融合蛋白NmC-Myc-Ac146的重组表达载体的构建
(1)NmCherry-Myc-pBlue表达载体的构建
①以本实验室已有的mCherry基因为模板，选用引用primer 1和primer 2组合，通过PCR方法合成NmC-Linker-Myc`融合片段，该融合片段的两端带有XbaI和BamHI酶切位点；
②用限制性内切酶XbaI和BamHI对上述PCR产物进行酶切。37℃酶切反应3小时后，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段NmC-Linker-Myc；
③用限制性内切酶XbaI和BamHI酶切本实验室已有的表达载体pIE-MCS(该载体由本实验自主构建，其中携带有苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒ie1基因的启动子和gp64基因的poly(A)序列)。酶切反应体系20μL，其中包括pIE-MCS质粒16μL，XbaI 1μL，BamHI 1μL，buffer E 2μL，37℃酶切3小时后，琼脂糖凝胶电泳回收载体；
④连接：将②步中回收的目的片段NmC-Linker-Myc 13μL与③步中回收的4μL载体，Ligase buffer 2μL，以及T4 DNA ligase 1μL混合后，16℃连接反应16小时；
⑤转化：将-80℃保存的大肠杆菌DH5α感受态细胞取出后，于冰上放置30分钟。随后，将④步中20μl连接产物小心加入到DH5α中，冰浴30分钟后，42℃恒温水浴中热激90秒，快速移至冰上冰浴2～3分钟，而后加入900μL SOC培养基，于37℃恒温摇床上190转摇动培养3小时，将菌液涂布于氨苄青霉素抗性平板，37℃过夜培养后，挑取单克隆；
⑥验证：将单克隆接种于LB液体培养基培养，37℃培养过夜后提取重组质粒，将质粒进行双酶切和测序验证。结果：重组质粒中，在XbaI和BamHI酶切位点中间插入的NmC-Linker-Myc融合片段正确，其中NmC序列如Sequence ID：4所示，Linker的序列为5’-GGGACGTCGGGTGGAAGCGGT-3’，c-Myc的序列为5’-GAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTG-3’，将该重组载体命名为NmCherry-MycpBlue，其图谱如图2所示。
(2)Ac146编码基因的制备
以苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒基因组DNA为模板，采用引物primer 10和primer11组合进行PCR扩增获得Ac146编码基因，该基因的两端带有BamHI和EcoRI酶切位点；
(3)重组表达载体NmC-Myc-Ac146pBlue的制备
用限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切Ac146基因的PCR产物，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段；同时，用限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切NmCherry-MycpBlue，回收载体片段；将回收的Ac146片段和载体NmCherry-MycpBlue进行连接，得到重组表达载体。酶切、连接、转化等体系和方法如上所述。
验证及结果：将提取的重组质粒进行酶切和测序验证，显示载体中在BamHI和EcoRI酶切位点中间插入的Ac146编码基因的核苷酸序列如Sequence ID：10所示，表明插入的Ac146编码基因和构建的重组表达载体正确。该重组表达载体命名为NmC-Myc-Ac146pBlue。
2、表达融合蛋白CmC-Myc-Ac146的重组表达载体的构建
(1)CmCherry-MycpBlue表达载体的构建
①以实验室已有的mCherry基因为模板，采用引物primer 3和primer 4组合进行PCR扩增获得CmC-Linker-Myc融合片段，该融合片段的两端带有XbaI和BamHI酶切位点；
②用限制性内切酶XbaI和BamHI对CmC-Linker-Myc PCR产物进行双酶切。37℃酶切反应3小时后，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段CmC-Linker-Myc；
③用限制性内切酶XbaI和BamHI酶切载体pIE-MCS(该载体由本实验自主构建，其中携带有苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒ie1基因的启动子和gp64基因的poly(A)序列：酶切反应体系为20μL，其中含有载体16μL，XbaI 1μL，BamHI1μL，buffer E 2μL。37℃酶切3小时后，琼脂糖凝胶电泳回收载体；
④连接：将②步回收的融合片段CmC-Linker-Myc 13μL与③步中回收的载体4μL，Ligase buffer 2μL，T4 DNA ligase 1μL混合，于16℃连接反应16小时；
⑤转化：将大肠杆菌DH5α感受态细胞于冰上放置30分钟复苏。随后，将④步中的20μl连接产物加入到DH5α中，冰浴30分钟后，42℃恒温水浴中热激90秒，快速移至冰上冰浴2～3分钟，而后加入900μL SOC培养基，于37℃恒温摇床上培养3小时，将菌液涂布于氨苄青霉素抗性平板，37℃过夜培养后挑取单克隆；
⑥验证：将单克隆接种于LB液体培养基，37℃过夜培养后提取质粒，将质粒进行双酶切和测序验证。结果：在重组载体的XbaI和BamHI酶切位点中间插入了CmC-Linker-Myc融合片段编码基因的核苷酸序列，其中CmC序列如Sequence ID：6所示，Linker的序列为5’-GGGACGTCGGGTGGAAGCGGT-3’，c-Myc的序列为5’-GAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTG-3’，表明所构建的表达载体正确。该重组载体命名为CmCherry-MycpBlue，其图谱如图2所示。
(2)Ac146编码基因的制备
提取上述已构建正确的NmC-Myc-Ac146pBlue质粒，用限制性内切酶BamHI和EcoRI进行酶切，琼脂糖凝胶电泳分离获得Ac146编码基因片段。
(3)重组表达载体CmC-Myc-Ac146pBlue的制备
用限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切CmCherry-MycpBlue质粒，琼脂糖凝胶电泳分离回收载体片段；将上述回收的Ac146片段与载体进行连接，得到重组表达载体。酶切、连接、转化等体系和方法如上所述。
验证及结果：将提取的质粒进行酶切和测序验证，结果显示在BamHI和EcoRI酶切位点间插入的Ac146编码基因的核苷酸序列如Sequence ID：10所示，表明所构建的重组表达载体正确。该重组表达载体命名为CmC-Myc-Ac146pBlue。
3、表达融合蛋白CmC-Myc-Lef3的重组表达载体的构建
①Lef3编码基因的制备：以苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒基因组DNA为模板，采用引物primer 12和primer 13组合进行PCR扩增获得Lef3编码基因，该基因的两端带有BamHI和EcoRI酶切位点；
②限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切Lef3的PCR产物，37℃酶切3小时后，琼脂糖凝胶电泳回收该片段；
③限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切CmCherry-MycpBlue载体：反应体系为20μL，其中包括载体16μL，XbaI 1μL，BamHI 1μL，buffer E 2μL，37℃酶切3小时后，琼脂糖凝胶电泳回收载体；
④连接：将②步中回收的Lef313μL与③步中回收的CmCherry-MycpBlue载体4μL，Ligase buffer 2μL，T4 DNA ligase 1μL混合，16℃连接反应16小时；
⑤转化：将大肠杆菌DH5α感受态细胞于冰上放置30分钟复苏后，将④步中的20μl连接产物加入到DH5α中，冰浴30分钟后，42℃恒温水浴中热激90秒，快速移至冰上冰浴2～3分钟，加入900μL SOC培养基，于37℃恒温摇床上培养3小时后，将菌液涂布于氨苄青霉素抗性平板，37℃过夜培养后挑取单克隆；
⑥验证：将单克隆接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养后提取质粒，将质粒进行双酶切和测序验证。结果：在载体中的BamHI和EcoRI酶切位点中间插入的Lef3编码基因的核苷酸序列如Sequence ID：12所示，表明所构建的重组表达载体正确。该重组表达载体命名为CmC-Myc-Lef3pBlue。
4、表达融合蛋白GP41-Myc-NmC的重组表达载体的构建
(1)Myc-NmCherrypBlue表达载体的制备
①采用重叠PCR方法，经过两轮PCR反应获得融合片段Myc-Linker-NmC-poly(A)。其中，第一轮PCR反应引物分别为primer 5和primer6，primer 7和primer 8，模板DNA分别为本实验室保存的含有mCherry和gp64基因poly(A)序列的质粒。第二轮PCR反应引物为primer 5和primer 8，模板DNA为第一轮两种PCR产物的混合物。经两轮PCR扩增后获得融合片段Myc-Linker-NmC-poly(A)，该融合片段的两端带有EcoRI和HindIII酶切位点。
②用限制性内切酶EcoRI和HindIII对上述PCR产物进行双酶切。37℃酶切3小时后，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段Myc-Linker-NmC-poly(A)。
③用限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切载体pIE-MCS(该载体由本实验自主构建，其中携带有苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒ie1基因的启动子和gp64基因的poly(A)序列)：酶切反应体系20μL，其中包括载体16μL，XbaI 1μL，BamHI1μL，buffer E 2μL，37℃酶切反应3小时后，琼脂糖凝胶电泳回收载体片段；
④连接：将②步中回收的目的片段13μL与③步中回收的载体4μL，Ligase buffer2μL，以及T4 DNA ligase 1μL混合，16℃连接反应16小时；
⑤转化：将-80℃保存的大肠杆菌DH5α感受态细胞于冰上放置30分钟复苏，将④步的20μl连接产物加入到DH5α中，冰浴30分钟后，42℃恒温水浴中热激90秒，快速移至冰上冰浴2～3分钟，加入900μL SOC培养基，于37℃恒温摇床上培养3小时，将菌液涂布于氨苄青霉素抗性平板，37℃过夜培养后挑取单克隆；
⑥验证：将单克隆接种于LB液体培养基，37℃过夜培养后提取质粒，将质粒进行双酶切和测序验证。结果：在载体中的EcoRI和HindIII酶切位点中间插入了Myc-Linker-NmC-poly(A)融合片段，其中c-Myc的序列为5’-GAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTG-3’，Linker的序列为5’-GGGACGTCGGGTGGAAGCGGT-3’，NmC的序列如Sequence ID：4所示，gp64基因的poly(A)序列如Sequence ID：8所示，表明所构建的重组表达载体正确。该重组表达载体命名为Myc-NmCherrypBlue，其图谱如图2所示。
(2)GP41编码基因的制备
以苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒基因组DNA为模板，采用引物primer 14和primer15组合进行PCR扩增获得GP41编码基因，该基因的两端带有XbaI和EcoRI酶切位点；
(3)重组表达载体GP41-Myc-NmCpBlue的制备
用限制性内切酶XbaI和EcoRI酶切GP41编码基因的PCR产物，回收目的片段；用限制性内切酶XbaI和EcoRI酶切Myc-NmCherrypBlue，回收载体片段；将回收的目的片段与载体进行连接，得到重组表达载体。酶切、连接、转化等体系和方法如上所述。
验证及结果：将提取的质粒进行酶切和测序验证，结果显示在载体的XbaI和EcoRI酶切位点中间插入了GP41编码基因，其核苷酸序列如Sequence ID：14所示，表明所构建的重组表达载体正确。该重组表达载体命名为GP41-Myc-NmCpBlue。
5、表达融合蛋白GP41-Myc-CmCherry的重组表达载体的构建
(1)Myc-CmCherrypBlue表达载体的制备
①采用重叠PCR方法，经过两轮PCR反应获得融合片段Myc-Linker-CmC-poly(A)。其中，第一轮PCR反应的引物分别为primer 6和primer 9，primer 7和primer 8，模板DNA分别为本实验室保存的含有mCherry和gp64基因poly(A)序列的质粒。第二轮PCR反应引物为primer 8和primer 9，模板DNA为第一轮两种PCR产物的混合物。经两轮PCR扩增获得融合片段Myc-Linker-CmC-poly(A)。该融合片段的两端带有EcoRI和HindIII酶切位点。
②用限制性内切酶EcoRI和HindIII对上述PCR产物进行双酶切。37℃酶切反应3小时后。琼脂糖凝胶电泳回收目的片段Myc-Linker-CmC-poly(A)。
③用限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切载体pIE-MCS：酶切反应体系20μL，其中包括载体16μL，EcoRI 1μL，HindIII 1μL，buffer E 2μL，37℃酶切反应3小时后，琼脂糖凝胶电泳回收载体片段；
④连接：将②步中回收的目的片段13μL与③步中回收的载体4μL，Ligase buffer2μL，以及T4 DNA ligase 1μL混合，16℃连接反应16小时；
⑤转化：将-80℃保存的大肠杆菌DH5α感受态细胞于冰上放置30分钟复苏，将④步的20μl连接产物加入到DH5α中，冰浴30分钟后，42℃恒温水浴中热激90秒，快速移至冰上冰浴2～3分钟，加入900μL SOC培养基，于37℃恒温摇床上培养3小时，将菌液涂布于氨苄青霉素抗性平板，37℃过夜培养后挑取单克隆；
⑥验证：将单克隆接种于LB液体培养基，37℃过夜培养后提取质粒，将质粒进行双酶切和测序验证，结果显示在载体的EcoRI和HindIII酶切位点中间插入了Myc-Linker-CmC-poly(A)融合片段，其中，c-Myc的序列为:5’-GAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTG-3’，Linker的序列为:5’-GGGACGTCGGGTGGAAGCG-GT-3’，NmC序列如Sequence ID：4所示，gp64基因的poly(A)序列如Sequence ID：8所示，表明所构建的表达载体正确。该重组表达载体命名为Myc-CmCherrypBlue，其图谱如图2所示。
(2)GP41编码基因的制备
提取上述构建正确的GP41-Myc-NmCpBlue质粒，用限制性内切酶XbaI和EcoRI进行酶切，琼脂糖凝胶电泳分离获得GP41编码基因片段。
(3)重组表达载体GP41-Myc-CmCpBlue的制备
用限制性内切酶XbaI和EcoRI酶切Myc-CmCherrypBlue，回收载体片段；将回收的GP41片段和载体进行连接，得到重组表达载体。酶切、连接、转化等体系和方法如上所述。
验证及结果：将提取的质粒进行酶切和测序验证，结果显示在载体中的XbaI和EcoRI酶切位点中间插入了GP41编码基因，其核苷酸序列如Sequence ID：14所示，表明所构建的重组表达载体正确。该重组表达载体命名为GP41-Myc-CmCpBlue。
6、表达融合蛋白Ac103-Myc-CmCherry的重组表达载体的构建
①Ac103编码基因的制备：以苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒基因组DNA为模板，采用引物primer 16和primer 17组合进行PCR获得Ac103编码基因，该基因的两端带有XbaI和EcoRI酶切位点；
②用限制性内切酶XbaI和EcoRI酶切Ac103编码基因的PCR产物。37℃酶切反应3小时后，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段；
③用限制性内切酶XbaI和EcoRI酶切Myc-CmCherrypBlue载体。酶切反应体系20μL，其中包括载体16μL，XbaI 1μL，EcoRI 1μL，buffer E 2μL，37℃酶切反应3小时后，琼脂糖凝胶电泳回收载体片段；
④连接：将②步中回收的Ac103片段13μL与③步中回收的载体4μL，Ligase buffer2μL，以及T4 DNA ligase 1μL混合，16℃连接反应16小时；
⑤转化：将-80℃保存的大肠杆菌DH5α感受态细胞于冰上放置30分钟复苏，将④步的20μl连接产物加入到DH5α中，冰浴30分钟后，42℃恒温水浴中热激90秒，快速移至冰上冰浴2～3分钟，加入900μL SOC培养基，于37℃恒温摇床上培养3小时，将菌液涂布于氨苄青霉素抗性平板，37℃过夜培养后挑取单克隆；
⑥验证：将单克隆接种于LB液体培养基，37℃过夜培养后提取质粒。将质粒进行双酶切和测序验证，结果显示在载体的XbaI和EcoRI酶切位点中间插入了Ac103编码基因，其核苷酸序列如Sequence ID：16所示，表明所构建的重组表达载体正确；该重组表达载体命名为Ac103-Myc-CmCpBlue。
(二)重组表达质粒转染昆虫细胞
草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞Sf9购自美国模式培养物保藏中心(American type culture collection，ATCC)。Sf9细胞在27℃密闭条件下培养于含有10％胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)(Gibco)的TNMFH培养基中(Sigma-Aldrich)。质粒提取按照质粒中量提取试剂盒(Invitrogen)的说明书进行，随后采用CaPO4沉淀法转染Sf9细胞(转染试剂成分见下述)。细胞转染在12-孔细胞培养板(Corning Costar)中进行，每个细胞培养孔预先(过夜)贴壁培养2×105个Sf9细胞，而后每个培养孔转染2μg各个重组表达质粒，转染后24小时，收集Sf9细胞进行Western blot，检测各个融合蛋白的表达(Westernblot试剂见下述)。随后，在12-孔细胞培养板(每个细胞培养孔预先贴壁培养2×105个Sf9细胞)中进行共转染BIFC组合质粒(各处理组合见下述)，每个细胞培养孔共转染4μg质粒DNA(每个质粒转染2μg DNA)。转染后24小时，在倒置荧光显微镜(Nikon Eclipse Ti)下观察并拍照，而后收集共转染的Sf9细胞进行Western blot检测各个融合蛋白的表达。每组BIFC组合质粒转染3个细胞培养孔作为重复。
CaPO4沉淀法转染试剂由本实验室配置，其成分为：25mM Hepes，140mM NaCl，125mM CaCl2，pH 7.1。
Western blot所用试剂：共转染的Sf9细胞用0.1％-Triton X-100裂解液(150mMNaCl,50mM Tris-HCl(pH8.0),0.1％Triton X-100,protease inhibitor cocktail(Roche))裂解后，加入等体积2×Lammli蛋白电泳上样缓冲液，充分涡旋混匀后，煮沸5min。蛋白样品采用10％SDS-PAGE分离。电泳结束后，将蛋白样品胶转印至PVDF膜(Millipore)，采用anti-Myc单克隆抗体(Abcam)和碱性磷酸酶标记的羊抗鼠二抗、以及NBT/BCIP试剂(Promega)检测。
共转染处理组合：(a)NmC-Myc-Ac146pBlue和CmC-Myc-Ac146pBlue；(b)NmC-Myc-Ac146pBlue和CmC-Myc-Lef3pBlue；(c)GP41-Myc-NmCpBlue和GP41-Myc-CmCpBlue；(d)GP41-Myc-NmCpBlue和Ac103-Myc-CmCpBlue。
(三)检测结果
1.Western blot检测融合蛋白的表达
为了验证各融合蛋白的表达，转染24小时的Sf9细胞用细胞裂解液裂解后经10％SDS-PAGE分离后进行Western blot分析。如图3所示，融合蛋白NmC-Myc-Ac146、CmC-Myc-Ac146、CmC-Myc-Lef3、GP41-Myc-NmC、GP4-Myc-CmC、以及Ac103-Myc-CmC均在转染的Sf9细胞中高效表达。
2.共转染Sf9细胞的荧光观察
为了验证所构建的BIFC表达载体是否在Sf9细胞中起作用。按照处理组合NmC-Myc-Ac146pBlue和CmC-Myc-Ac146pBlue、NmC-Myc-Ac146pBlue和CmC-Myc-Lef3pBlue、GP41-Myc-NmCpBlue和GP41-Myc-CmCpBlue、以及GP41-Myc-NmCpBlue和Ac103-Myc-CmCpBlue共转染Sf9细胞，每组组合质粒在一个细胞培养孔中转染4μg DNA(每个表达质粒转染2μg DNA)。转染24小时后，观察Sf9细胞中是否产生mCherry红色荧光。如图4所示，在共转染NmC-Myc-Ac146pBlue和CmC-Myc-Ac146pBlue或GP41-Myc-NmCpBlue和GP41-Myc-CmCpBlue的Sf9细胞中清晰地产生了mCherry的红色荧光，并且共转染NmC-Myc-Ac146pBlue和CmC-Myc-Ac146pBlue的红色荧光分布在Sf9细胞核内，而共转染GP41-Myc-NmCpBlue和GP41-Myc-CmCpBlue的红色荧光则在Sf9细胞质和细胞核内均有分布，表明在这两组共转染细胞中产生的红色荧光是由于Ac146或GP41自身相互作用后介导了mCherry蛋白的两个分割片段相邻近而发生重新组合，形成了完整的mCherry。相反，在共转染NmC-Myc-Ac146pBlue和CmC-Myc-Lef3pBlue或GP41-Myc-NmCpBlue和Ac103-Myc-CmCpBlue的Sf9细胞中没有任何荧光产生，表明Ac146与Lef3或GP41与Ac103没有发生相互作用。为了验证各个融合蛋白的表达，收集共转染的Sf9细胞进行Western blot。如图4所示，在共转染的Sf9细胞中，各个融合蛋白均高效表达，这也进一步说明在没有荧光产生的共转染细胞中Ac146与Lef3或GP41与Ac103没有发生相互作用。进一步为了衡量目标蛋白相互作用的强弱，计数了单个视野中产生荧光信号的Sf9细胞数量，并用该数量除以单个视野中总的Sf9细胞数，得出荧光细胞数比率。如图5所示，共转染NmC-Myc-Ac146pBlue和CmC-Myc-Ac146pBlue的Sf9细胞单个视野中红色荧光细胞数比率为58.9％，而共转染GP41-Myc-NmCpBlue和GP41-Myc-CmCpBlue的Sf9细胞单个视野中红色荧光细胞数比率为49.0％。考虑到采用CaPO4沉淀法转染Sf9细胞的转染率约为80％左右，在上述共转染实验中，红色荧光细胞数的比率实际可能更高一些。
在本发明的实施例中，表2是实施例中英文对照表
表2
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种昆虫体外蛋白质相互作用检测系统的制备方法，其特征在于，所述昆虫体外蛋白质相互作用检测系统的制备方法利用双分子荧光互补技术，基于红色荧光蛋白mCherry，具体包括以下步骤：
步骤一，将红色荧光蛋白mCherry在第159位和160位氨基酸残基处分割成NmCherry 1-159位氨基酸和CmCherry 160-236位氨基酸两个蛋白质序列片段，分别记作NmC和CmC，构成双分子荧光互补探针；
步骤二，将NmC和CmC两个蛋白序列片段分别构建到两个表达载体中，将待测的两个目标蛋白A和B的DNA序列分别与NmC和CmC通过一段连接区序列融合构建用于表达融合蛋白；
步骤三，利用双分子荧光互补现象；将融合蛋白表达载体共转染昆虫细胞，使用倒置荧光显微镜观察是否存在红色荧光：待测蛋白质A和蛋白质B之间存在相互作用，则被分割的NmC和CmC会在空间上靠近而重新组合形成完整的荧光蛋白mCherry，在激发光下能够发射红色荧光；在共转染的昆虫细胞中没有红色荧光产生，证明待测蛋白质A和蛋白质B之间没有相互作用；
将NmC或者CmC与目标蛋白连接的Linker的氨基酸序列为：
GTSGGSG；
基因编码序列为：
5’-GGGACGTCGGGTGGAAGCGGT-3’；
指导目标蛋白高效表达的启动子元件为昆虫杆状苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒ie1基因的启动子序列599个碱基，而多聚腺苷酸尾序列为苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒囊膜基因gp64的poly(A)218个碱基。
2.一种昆虫体外蛋白质相互作用检测系统在蛋白质相互作用检测中的应用，其特征在于，所述昆虫体外蛋白质相互作用检测系统在蛋白质相互作用检测中的应用具体包括：
步骤一，利用苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒编码的Ac146，Lef3，GP41，Ac103四个蛋白作为两组组合，Ac146与Lef3，GP41与Ac103验证新构建的昆虫细胞双分子荧光互补系统的有效性；
步骤二，通过PCR方法将Ac146与Lef3编码基因分别克隆到NmCherry-MycpBlue和CmCherry-MycpBlue载体中，获得重组表达质粒NmC-Myc-Ac146pBlue、CmC-Myc-Ac146pBule、CmC-Myc-Lef3pBlue；通过PCR方法将GP41与Ac103编码基因分别克隆到Myc-NmCherrypBlue和Myc-CmCherrypBlue载体中，获得重组表达质粒GP41-Myc-NmCpBlue、GP41-Myc-CmCpBule、Ac103-Myc-CmCpBlue；
步骤三，按照处理组合NmC-Myc-Ac146pBlue和CmC-Myc-Ac146pBlue、NmC-Myc-Ac146pBlue和CmC-Myc-Lef3pBlue、GP41-Myc-NmCpBlue和GP41-Myc-CmCpBlue、以及GP41-Myc-NmCpBlue和Ac103-Myc-CmCpBlue共转染Sf9细胞，在转染后24小时，在倒置荧光显微镜下观察，发现在共转染NmC-Myc-Ac146pBlue和CmC-Myc-Ac146pBlue或GP41-Myc-NmCpBlue和GP41-Myc-CmCpBlue的Sf9细胞中清晰地产生了mCherry的红色荧光信号，而在共转染NmC-Myc-Ac146pBlue和CmC-Myc-Lef3pBlue或GP41-Myc-NmCpBlue和Ac103-Myc-CmCpBlue的Sf9细胞中没有任何荧光产生；进一步通过计数单个视野下的红色荧光细胞数比例，表明所构建的昆虫细胞双分子荧光互补系统可定性和定量检测蛋白质相互作用。
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