CN105296478B - 一种多标签抗原及其制备方法和应用 - Google Patents
一种多标签抗原及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105296478B CN105296478B CN201510821610.2A CN201510821610A CN105296478B CN 105296478 B CN105296478 B CN 105296478B CN 201510821610 A CN201510821610 A CN 201510821610A CN 105296478 B CN105296478 B CN 105296478B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- labels
- preparation
- seqidno
- sequence
- tag antigen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种多标签抗原，该多标签抗原包括9种标签，分别为GST标签、HA标签、T7标签、V5标签、Myc标签、StrepII标签、Flag标签、EGFP标签和His标签，这9种标签按照GST‑HA‑T7‑V5‑Myc‑StrepII‑Flag‑EGFP‑His的顺序依次串联。本发明还公开了该多标签抗原的制备方法及其在免疫印迹中的应用。本发明中公开的多标签抗原，可以满足大多数免疫印迹反应设置阳性对照的需求，具有良好的兼容性和很强的免疫印迹反应特异性。
Description
技术领域
本发明涉及免疫印迹领域，尤其涉及一种多标签抗原及其制备方法和应用。
背景技术
免疫印迹技术是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的技术。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测,具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法，如组织抗原的定性定量检测、多肽分子的质量测定及病毒的抗体或抗原检测等，因此免疫印迹技术在分子生物学研究中具有广泛的应用。
在设计表达一种蛋白时，通常都会进行融合蛋白表达，即在蛋白质序列的N端或者C端加入常用的标签序列，如6*His、Flag、Myc等。在做免疫印迹检测目的蛋白表达量时通常只需检测目的蛋白上加入的标签序列即可，即用6*His、Flag、Myc等标签单抗与目的蛋白抗原进行免疫印迹反应，检测出的信号强弱即反应出目的蛋白表达量的高低。在运用质粒转染真核细胞表达目的蛋白，或者利用病毒侵染来表达某种目的蛋白时，往往会遇到蛋白表达量很微量或者不表达的情况，此时采用免疫印迹技术检测目的蛋白的表达情况很可能不会出现明显的信号。在这种情况下，需要判断到底是目的蛋白真实的表达量很微量，还是免疫印迹检测的反应体系出现问题导致没有出现信号。因此在做免疫印迹检测时通常都需要设置阴性对照和阳性对照，在出现上述情况时，若阳性对照工作正常出现明显的反应信号，则说明待研究的目的蛋白表达量确定是微量表达或者不表达。
常用的标签有GST标签、HA标签、StrepII标签、Flag标签、EGFP标签和His标签等多种，在蛋白检测中，不同的目标蛋白根据其性质往往会选择不同的标签序列，现有技术中多以单个标签作为阳性对照，这样当待测的多种蛋白质含有多个不同的标签序列时，则需要多个相对应的阳性对照，即费时费力，也增加了检测成本。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明公开了一种多标签抗原，以满足大多数免疫印迹反应设置阳性对照的需求。其技术方案如下：
本发明提供了一种多标签抗原，包括9种标签，分别为GST标签、HA标签、T7标签、V5标签、Myc标签、StrepII标签、Flag标签、EGFP标签和His标签。
优选地，该9种标签按照GST-HA-T7-V5-Myc-StrepII-Flag-EGFP-His的顺序依次串联。
优选地，9种标签的序列为SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。
本发明还提供了该多标签抗原的制备方法，包括以下步骤：
(a)、人工合成SEQIDNO:1序列，并在SEQIDNO:1序列的5'端和3'端分别设置限制性内切酶位点，将得到的DNA序列克隆至蛋白表达载体，测序，得到包含该SEQIDNO.1序列的质粒；
(b)、将步骤(a)中得到的质粒转化入表达菌株，进行蛋白表达，并使用镍柱纯化该蛋白。
优选地，步骤(a)中，设置在5'端的限制性内切酶位点为Nco I，设置在3'端的限制性内切酶位点为Xho I。
优选地，步骤(a)中，蛋白表达载体为pET28a。
优选地，步骤(b)中，表达菌株为大肠杆菌表达菌株Rosseta(DE3)。
优选地，该多标签抗原的制备方法包括以下步骤：
(a)、人工合成SEQIDNO:1序列，并在SEQIDNO:1序列的5'端和3'端分别设置限制性内切酶位点Nco I和Xho I，将得到的DNA序列克隆至蛋白表达载体pET28a，测序，得到包含该SEQIDNO:1序列的质粒pET28a-MultiTag-G9；
(b)、将步骤(a)中得到的质粒pET28a-MultiTag-G9转化入大肠杆菌表达菌株Rosseta(DE3)，进行蛋白表达，并使用镍柱纯化该蛋白。
本发明还提供了一种多标签抗原的重组载体，即根据上述步骤(a)得到的pET28a-MultiTag-G9。
本发明还提供了上述多标签抗原在免疫印迹中的应用。
本发明公开的多标签抗原，能够满足大多数免疫印迹反应设置阳性对照的需求。其具有良好的兼容性和很强的免疫印迹反应特异性，并大大节省了检测成本。
以下将结合附图对本发明作进一步说明。
附图说明
图1示出了本发明一个较佳实施例中制备的多标签抗原的免疫印记(Westernblot)实验结果。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。以下的实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。
1、MultiTag-G9人工基因合成
MultiTag-G9包含9种常用检测标签，分别是GST、HA、T7、V5、Myc、StrepII、Flag、EGFP和His标签。具体的DNA序列分别是：
GST标签
HA标签
tatccgtatg atgttccgga ttatgca 27
T7标签
atggcatcaa tgacaggcgg ccagcagatg ggc 33
V5标签
ggcaaaccga ttccgaatcc gctgctgggc ctggattcaa ca 42
Myc标签
gaacagaaac tgatttcaga agaagatctg 30
Strep II标签
tggtcacatc cgcagtttga aaaa 24
Flag标签
gattataaag atgatgatga taaa 24
EGFP标签
His标签
catcatcatc atcatcat 18
将上述9种标签DNA序列依次串联在一起通过人工基因合成的方法构建出MultiTag-G9完整序列，并在此DNA序列5'端加上Nco I限制性内切酶位点CCATGG，3'端加上Xho I限制性内切酶位点CTCGAG，通过Nco I和Xho I双酶切、割胶回收、T4连接酶连接克隆至蛋白表达载体pET28a。MultiTag-G9完整编码区为1566bp，共含有522个氨基酸，表达蛋白的理论分子量为59915Da.
2、MultiTag-G9蛋白的表达与纯化
将测序正确的pET28a-MultiTag-G9质粒转化入大肠杆菌表达菌株Rosseta(DE3)，挑取单菌落接种至50ml LB液体培养基，加入卡那霉素终浓度50ug/ml和氯霉素34ug/ml双抗性筛选，37℃，200rpm培养过夜。第二天按照2：100比例转接至250ml LB液体培养基，加入卡那霉素终浓度50ug/ml和氯霉素34ug/ml双抗性筛选，共转接4瓶，37℃，200rpm培养至菌液OD600检测数值为0.8时加入诱导剂异丙基-β-D硫代半乳糖苷使其终浓度为0.1-0.5mM，诱导培养4h后，4℃7000rpm离心收集菌体。将此菌体按照每克加入40ml的比例悬浮于20mMTris.Cl，pH8.0，300mM NaCl，10％Glycerol裂解缓冲液，超声前加入终浓度1mM苯甲基磺酰氟，超声波破碎仪进行菌体破碎。超声裂解条件为超声3秒间隔5秒，30％超声功率，超声15min。当菌液变得清亮时离心收集上清液，取样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，并采用镍柱纯化MultiTag-G9蛋白，具体纯化操作步骤参照Ni NTA Beads 6FF说明书进行，获得纯度约95％的MultiTag-G9蛋白(得到的MultiTag-G9蛋白浓度为350ug/ml)。
3、MultiTag-G9的免疫印迹应用
纯化好的MultiTag-G9进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，按照每泳道上样5ng MultiTag-G9蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭，一抗结合，二抗结合，曝光显色进行Westernblot免疫印迹反应。9种相对应的商品化标签单抗均能与MultiTag-G9蛋白进行灵敏而特异性的免疫印迹反应，结果如附图1所示。
本发明获得的多标签抗原蛋白可作为免疫印迹反应的阳性对照，具有良好的兼容性和很强的免疫印迹反应特异性。一种多标签抗原蛋白即可满足大多数常用标签免疫印迹反应的阳性对照之需，兼容性强；其作为免疫印迹反应的阳性对照灵敏度高，只需低至5ng蛋白即有明显的免疫印记(Western blot)反应信号；免疫印迹反应只有单一目的条带信号出现，特异性强。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (8)
1.一种多标签抗原，其特征在于，所述多标签抗原由9种标签组成，分别为GST标签、HA标签、T7标签、V5标签、Myc标签、StrepII标签、Flag标签、EGFP标签和His标签；所述9种标签按照GST-HA-T7-V5-Myc-StrepII-Flag-EGFP-His的顺序依次串联；编码所述9种标签的序列为SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的多标签抗原的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(a)、人工合成SEQIDNO:1序列，并在所述SEQIDNO:1序列的5'端和3'端分别设置限制性内切酶位点，将得到的DNA序列克隆至蛋白表达载体，测序，得到包含所述SEQIDNO.1序列的质粒；
(b)、将步骤(a)中得到的所述质粒转化入表达菌株，进行蛋白表达，并使用镍柱纯化所述蛋白。
3.如权利要求2所述的多标签抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中，设置在所述5'端的限制性内切酶位点为Nco I，设置在所述3'端的限制性内切酶位点为Xho I。
4.如权利要求2所述的多标签抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中，所述蛋白表达载体为pET28a。
5.如权利要求2所述的多标签抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)中，所述表达菌株为大肠杆菌表达菌株Rosseta(DE3)。
6.如权利要求1所述的多标签抗原的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(a)、人工合成SEQIDNO:1序列，并在所述SEQIDNO:1序列的5'端和3'端分别设置限制性内切酶位点Nco I和Xho I，将得到的DNA序列克隆至蛋白表达载体pET28a，测序，得到包含所述SEQIDNO:1序列的质粒pET28a-MultiTag-G9；
(b)、将步骤(a)中得到的所述质粒pET28a-MultiTag-G9转化入大肠杆菌表达菌株Rosseta(DE3)，进行蛋白表达，并使用镍柱纯化所述蛋白。
7.一种多标签抗原的重组载体，其特征在于，所述重组载体为根据权利要求6所述的步骤(a)得到的pET28a-MultiTag-G9。
8.一种根据权利要求1所述的多标签抗原在免疫印迹中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510821610.2A CN105296478B (zh) | 2015-11-23 | 2015-11-23 | 一种多标签抗原及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510821610.2A CN105296478B (zh) | 2015-11-23 | 2015-11-23 | 一种多标签抗原及其制备方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105296478A CN105296478A (zh) | 2016-02-03 |
| CN105296478B true CN105296478B (zh) | 2018-06-05 |
Family
ID=55194308
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510821610.2A Active CN105296478B (zh) | 2015-11-23 | 2015-11-23 | 一种多标签抗原及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105296478B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111253493A (zh) * | 2020-03-05 | 2020-06-09 | 武汉科技大学 | 一种靶向hiv病毒囊膜双位点的嵌合抗原受体及其表达载体和应用 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106596974A (zh) * | 2016-12-16 | 2017-04-26 | 中南大学 | 炎症性肌病sae1自身抗体的非放射性检测方法与应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101805397A (zh) * | 2009-02-18 | 2010-08-18 | 上海市公共卫生临床中心 | 一种结核杆菌esat-6重组二聚体及其制备方法和应用 |
| CN103725705A (zh) * | 2013-12-31 | 2014-04-16 | 深圳先进技术研究院 | 一种通用型重组表达载体及其构建方法和应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050032173A1 (en) * | 2003-08-05 | 2005-02-10 | Mauricio Rojas | Fusion proteins with a membrane translocating sequence and methods of using same to inhibit an immune response |
-
2015
- 2015-11-23 CN CN201510821610.2A patent/CN105296478B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101805397A (zh) * | 2009-02-18 | 2010-08-18 | 上海市公共卫生临床中心 | 一种结核杆菌esat-6重组二聚体及其制备方法和应用 |
| CN103725705A (zh) * | 2013-12-31 | 2014-04-16 | 深圳先进技术研究院 | 一种通用型重组表达载体及其构建方法和应用 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111253493A (zh) * | 2020-03-05 | 2020-06-09 | 武汉科技大学 | 一种靶向hiv病毒囊膜双位点的嵌合抗原受体及其表达载体和应用 |
| CN111253493B (zh) * | 2020-03-05 | 2021-03-23 | 武汉科技大学 | 一种靶向hiv病毒囊膜双位点的嵌合抗原受体及其表达载体和应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105296478A (zh) | 2016-02-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10527609B2 (en) | Peptide tag systems that spontaneously form an irreversible link to protein partners via isopeptide bonds | |
| US11390653B2 (en) | Amino acid-specific binder and selectively identifying an amino acid | |
| CA2583009C (en) | Ubiquitin or gamma-crystalline conjugates for use in therapy, diagnosis and chromatography | |
| CN111499765A (zh) | 一种冠状病毒融合蛋白及其制备方法与应用 | |
| CN108680744B (zh) | 一种检测新型鸭呼肠孤病毒抗体的间接elisa检测试剂盒及应用 | |
| TW201410709A (zh) | 肽庫及其利用 | |
| CN109402069A (zh) | 一种假病毒颗粒及其制备方法和应用 | |
| CN105296478B (zh) | 一种多标签抗原及其制备方法和应用 | |
| CN113637056A (zh) | 一种用于鉴别牛种布鲁氏菌与其它种布鲁氏菌的试剂盒 | |
| Rahman et al. | Topology-informed strategies for the overexpression and purification of membrane proteins | |
| CN111269324B (zh) | 高斯荧光素酶和地高辛单链抗体的融合蛋白及其应用 | |
| CN108956985B (zh) | 一种检测新型鹅星状病毒抗体的间接elisa检测试剂盒及应用 | |
| CN110568189B (zh) | 犬腺病毒1型抗体elisa检测试剂盒及其应用 | |
| Yumerefendi et al. | Library-based methods for identification of soluble expression constructs | |
| CN111596070A (zh) | 一种三疣梭子蟹原肌球蛋白过敏检测试剂的应用 | |
| CN108982847B (zh) | 一种导致鸭脾脏坏死的鸭呼肠孤病毒的间接elisa检测方法 | |
| CN109852632A (zh) | spoIIIJ蛋白作为芽孢杆菌表面展示系统中锚定蛋白的用途 | |
| CN109055416A (zh) | 一种可溶性重组蛋白的制备方法 | |
| CN109678952B (zh) | 一种基于小麦黄条纹病毒g蛋白的多克隆抗体、制备方法及其应用 | |
| KR101119231B1 (ko) | Ραｓ 변이체 및 이를 포함하는 벡터 | |
| Brudenell et al. | Efficient overexpression and purification of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 nucleocapsid proteins in Escherichia coli | |
| CN112979769B (zh) | 一种氨基酸序列、蛋白质及其制备方法和应用 | |
| CN114199848B (zh) | 一种基于蛋白连接酶的高通量检测蛋白表达的方法 | |
| CN104558135B (zh) | 一种与谷氨酸脱氢酶65抗体特异结合的抗原蛋白质 | |
| CN109096394B (zh) | 一种抗葡萄球菌蛋白a的b亚单位的纳米抗体及核酸分子和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 201203 room 504, No. 781 Cailun Road, Zhangjiang High Tech Park, Pudong New Area, Shanghai Patentee after: Yisheng Biotechnology (Shanghai) Co.,Ltd. Address before: 201203 room 504, No. 781 Cailun Road, Zhangjiang High Tech Park, Pudong New Area, Shanghai Patentee before: YEASEN BIOLOGICAL TECHNOLOGY (SHANGHAI) Co.,Ltd. |
|
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |