CN104558135B - 一种与谷氨酸脱氢酶65抗体特异结合的抗原蛋白质 - Google Patents

一种与谷氨酸脱氢酶65抗体特异结合的抗原蛋白质 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抗原‑抗体蛋白质的技术领域，特别涉及用于检测糖尿病的截短的谷氨酸脱氢酶65(GAD65)技术领域。目的之一是筛选出与谷氨酸脱羧酶65抗体特异结合的截短的抗原蛋白质。目的之二是开发能满足化学发光封闭系统的抗原蛋白，并应用于化学发光封闭系统。提供了与谷氨酸脱氢酶65抗体特异结合的抗原蛋白质，该抗原蛋白质选自如GAD65中第200‑585、245‑585、110‑585、130‑585、150‑585、160‑585、180‑585、46‑585、66‑585或90‑585位的截短蛋白质中的一种。还提供了纳米磁珠包被的上述截短蛋白质或GAD65全长蛋白质以及包括上述蛋白质的试剂盒。

Description

一种与谷氨酸脱氢酶65抗体特异结合的抗原蛋白质
技术领域
本发明涉及抗原-抗体蛋白质的技术领域，特别涉及用于检测糖尿病的截短的谷氨酸脱羧酶65(GAD65)的技术领域。
背景技术
糖尿病是一种因胰岛素分泌绝对或相对不足而引起的高血糖症为主要特征的代谢性疾病，受多种遗传和环境因素影响。按照1997年美国糖尿病协会及1999年世界卫生组织(WHO)关于糖尿病分类及诊断标准，糖尿病可分为I型、II型、特殊类型糖尿病和妊娠糖尿病。
在1型糖尿病的免疫破坏期间，患者体内会产生多种针对胰岛细胞自身抗原的自身抗体。自20世纪70年代以来，已经发现了多种胰岛素自身抗体，例如：胰岛细胞抗体(ICA)、胰岛细胞表面抗体(ICSA)、胰岛素抗体(IAA)、热休克蛋白抗体(HSP)、谷氨酸脱羧酶65(GAD65，哺乳动物中GAD的存在形式之一)抗体、蛋白质酪氨酸磷酸酶抗体(IA-2A)等。目前临床上在诊断1型糖尿病常用的指标包括ICA、IAA、GADA、IA-2A。
目前临床上体外诊断1型糖尿病指标所用的平台都基于放免或酶联免疫技术(ELASA)，自身免疫性1型糖尿病诊断试剂在敏感性和特异性方面有待于进一步改进。传统的放射免疫或者ELISA方法检测时间长，至少6个小时，甚至过夜反应才能完成测试，主要依靠纯手工加样等系列操作，效率低，特异性不足。化学发光系统有高灵敏度、高特异性的优势，检测结果时间快、效率高，全程全自动仪器自动操作，1个小时即可完成测试，对现在医院的及时诊断治疗起非常大的作用。
随着敏感性和特异性更高的化学发光技术在体外诊断中的应用，开发能适用于化学发光封闭系统的抗原变得尤其重要。
发明内容
本发明的目的之一是筛选出与谷氨酸脱羧酶65抗体特异结合的截短的抗原蛋白质。目的之二是开发能满足化学发光封闭系统的抗原蛋白，并应用于化学发光封闭系统。
截短的抗原蛋白质的表达与全长蛋白质的表达相比，截短后的蛋白更容易表达，表达量更高；在用于检测糖尿病时，其与全长蛋白质相比，截短后的蛋白灵敏度更好；非特异性更低。
本发明提供了一种与糖尿病特定抗体特异结合的抗原蛋白质，所述抗原蛋白质选自如SEQ ID NO:21中的第200-585、245-585、110-585、130-585、150-585、160-585、180-585、46-585、66-585和90-585位的截短蛋白质中的一种。
在一个具体的实施例中，所述抗原蛋白质选自如SEQ ID NO:21中的第110-585、130-585、150-585、160-585、180-585、46-585、66-585和90-585位的截短蛋白质中的一种。
在一个具体的实施例中，所述抗原蛋白质选自如SEQ ID NO:21中的第46-585、66-585和90-585位的截短蛋白质中的一种。
在一个具体的实施例中，所述融合抗原蛋白质为真核表达系统获得的蛋白质。
在一个具体的实施例中，所述抗原蛋白质为昆虫细胞表达系统获得的蛋白质。昆虫细胞表达系统是应用较多的真核表达系统，它可以在昆虫细胞中表达多种外源基因，包括真菌，植物，细菌，病毒的基因。杆状病毒是一类以昆虫细胞为天然宿主的双链DNA病毒，具有高度的种属特异性，不感染脊椎动物，对人、畜无害。目前研究较多的是苜蓿银纹夜蛾核多角体(AcNPV)，其宿主是草地贪夜蛾。而SF9细胞，正是杆状病毒表达系统的宿主细胞之一。SF9细胞属于半贴壁型细胞系，可以进行悬浮培养，也可以进行贴壁培养，在应用于蛋白的表达与制备纯化中，有许多的优点：1)与其他真核表达系统相比，外源基因表达水平高，特别是细胞内蛋白。多数情况下，表达的重组蛋白可溶，折叠正确有翻译后修饰(如糖基化等)，有生物学活性，容易分离纯化；2)利用昆虫细胞悬浮生长，容易放大培养，有利于大规模表达重组蛋白；3)易于表达异源多聚体蛋白，可通过多种重组病毒同时感染昆虫细胞或用含有多个表达框的一种病毒感染昆虫细胞来实现；4)昆虫杆状病毒不感染脊椎动物，具有安全性。
本发明还提供了一种抗原蛋白质，所述抗原蛋白质为上述截短型的蛋白质或GAD65的全长蛋白质，且所述蛋白质为纳米磁珠包被的蛋白质。
本发明又提供了一种用于检测糖尿病的试剂盒，所述试剂盒包括一种抗原蛋白质，所述抗原蛋白质选自如SEQ ID NO:21中的第200-585、245-585、110-585、130-585、150-585、160-585、180-585、46-585、66-585和90-585位的截短蛋白质中的一种。
在一种具体的实施例中，所述试剂盒中的所述抗原蛋白质选自如SEQ ID NO:21中的第110-585、130-585、150-585、160-585、180-585、46-585、66-585和90-585位的截短蛋白质中的一种。
在一个具体的实施例中，所述试剂盒中的所述抗原蛋白质选自如SEQ ID NO:21中的第46-585、66-585和90-585位的截短蛋白质中的一种。需要指出的是，在检测抗体的过程中，所选用的抗原蛋白质并非全长蛋白质是最优的，因为虽然全长蛋白质包含了更多的抗原决定簇，这样能够更容易的识别其相应的抗体，但是由于全长蛋白质包含较多的抗原决定簇，也会带来非特异性增高的结果；此外，蛋白质的片段长度越长，其表达难度以及后续的纯化等一系列的操作的难度也会相应的越高。因此，优选的抗原蛋白质应该是首选满足灵敏性和特异性的前提下，蛋白质的片段越短则越有利于应用于实际。例如，在化学发光法的检测系统中，用于检测糖尿病的GAD65抗体的最优的蛋白质为如SEQ ID NO:21中的第90-585位的截短蛋白质。
在一个具体的实施例中，所述试剂盒中的所述抗原蛋白质为在真核表达系统中表达而获得的蛋白质。
在一个具体的实施例中，所述试剂盒中的所述抗原蛋白质为在昆虫细胞表达系统中表达而获得的蛋白质。
在一个具体的实施例中，所述试剂盒中的所述抗原蛋白质为纳米磁珠包被的蛋白质。
在一个具体的实施例中，所述试剂盒中还包括化学发光标记的蛋白A。利用化学发光法可以提高产品的灵敏度和特异性。其中，蛋白A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能特异性地与人和哺乳动物抗体(主要是IgG)的Fc区结合。
在一个具体的实施例中，所述试剂盒中还包括BSA缓冲液。所述BSA缓冲液为高浓度的缓冲液，例如所述浓度为3％-7％。
本发明还提供了一种与糖尿病特定抗体特异结合的抗原蛋白质的基因序列，所述基因序列为通过表达获得如SEQ ID NO:21中的第200-585、245-585、110-585、130-585、150-585、160-585、180-585、46-585、66-585和90-585位的所述的截短蛋白质的基因序列中的一种。
在一个具体的实施例中，所述基因序列为通过表达获得如SEQ ID NO:21中的第110-585、130-585、150-585、160-585、180-585、46-585、66-585和90-585位的截短蛋白质的基因序列中的一种。
在一个具体的实施例中，所述基因序列为通过表达获得如SEQ ID NO:21中的第46-585、66-585和90-585位的截短蛋白质的基因序列中的一种。
在一个具体的实施例中，所述基因序列在真核表达系统中表达。
在一个具体的实施例中，所述基因序列在昆虫细胞表达系统中表达。
本发明利用真核表达系统表达筛选出适宜的GAD65的截短蛋白质抗原，并将其运用于化学发光封闭系统，以填补目前市场上的空白。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做以下详细说明。
实施例1
截短型的谷氨酸脱羧酶(GAD65)基因的真核表达
(1)主要试剂与设备
PCR试剂盒(包含Taq酶，buffer，dNTP，T4连接酶)和DNA marker购自全式金；蛋白Marker购自碧云天生物；BamH I、XhoI、EcoR I、Nco I、HindⅢ等限制性内切酶购自Takara(大连宝生物)；小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)试剂盒(包含组分：小牛肠碱性磷酸酶、碱性磷酸酶缓冲液)购自Takara；胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒购自OMEGA公司；卡那霉素和氨苄购自BBI；IPTG购自BBI；PCR引物及重组质粒测序由华大基因或Invitrogen完成；其余试剂由深圳市新产业生物医学工程股份有限公司提供。
ABI Veriti PCR仪购自ABI，水平电泳仪RDY-SP1Z购自上海山富科学仪器有限公司，比朗恒温摇床COS-2102C购自上海比朗仪器有限公司，超净工作台BSC-1000II A2购自上海博迅实业有限公司，离心机购自Sigma，倒置显微镜购自奥林巴斯，垂直电泳仪购自BioRad，转膜仪购自BioRad，凝胶成像仪805购自上海山富，其余设备由深圳市新产业生物医学工程股份有限公司提供。
(2)细胞株、菌株和质粒
Human GAD65(hGAD65)购自OriGene；pFastBac1载体、SF9细胞、相应的培养基及其宿主DH10Bac购自life technology；大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞Trans5α购自北京全式金。
(3)引物的设计与合成
利用Primer primer5.0根据hGAD65(NM_000818.2)的cDNA序列设计扩增hGAD65区段全长及其区段的特异性引物，引物设计以BamH I和EcoR I作为酶切位点，正向引物增加起始密码子，反向引物增加终止密码子，并分别在其序列的两端分别引入BamH I和EcoR I酶切位点，引物序列如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:19。详细信息见表1。
表1
(4)hGAD65以及截短的hGAD65的基因在昆虫细胞表达系统中表达
以购买的人的cDNA质粒为模板，利用相应的上下游引物，PCR扩增出目的条带，用胶回收试剂盒回收目的基因的片段，然后分别用BamH I和EcoR I双酶切pFastBac1载体和纯化的目的片段。酶切结束后用胶回收试剂盒直接纯化回收hGAD65片段和pFastBac1线性载体的酶切产物。向酶切后的线性载体中直接加入1μl CIAP，37℃反应1h进行去磷处理(选做)。用T4连接酶酶切纯化后的目的片段和线性载体片段(两者的摩尔数的比例为1:2～1:10)，连接体系为10μl，16℃连接过夜。
将连接体系转化大肠杆菌(E.coli)Trans5α。将转化产物涂布于含氨苄(100μg/ml)的LB固体培养基中，37℃过夜培养。在含有重组杆粒的LB平板上随机挑取多个单菌落，进行菌液PCR和双酶切并测序验证阳性样品。将获得的阳性杆粒载体转化至DH10BacTM中，从中筛选出阳性克隆。然后将阳性的重组杆粒转染至昆虫细胞SF9中，27℃下孵育细胞72h，直至观察到病毒感染征象收获杆状病毒。
收集经过培养的细胞，提取蛋白，然后采用亲和层析纯化重组蛋白，再采用离子交换柱进一步纯化蛋白，使其纯度≥95％。
实施例2
测定上述昆虫细胞表达的17个抗原对hGAD65抗体的敏感性与特异性
化学发光免疫夹心法原理：待测血清样本、缓冲液和抗原包被磁性微球加入反应杯中反应，在37℃下，待测血清样本中抗体和包被在磁性微球上的抗原发生免疫反应，磁场的情况下纳米磁珠会迅速被磁化，该复合物经过清洗，获得抗原和待测抗体的复合物，其他成分被清洗掉，之后再加入标记蛋白A-NHS-ABEI，蛋白A能迅速和待测抗体的C端特异性结合，形成“夹心三明治”免疫复合物。当血清样本中被检测的抗体含量越多，仪器检测出的相对光强度RLU越高，即呈正相关。
(1)抗原的包被
测定A1、B1、C1、D1、E1、F1、G1、H1、I1、J1、K1、L1、M1、N1、O1、P1和Q1蛋白质的浓度。
纳米磁珠采购自Merck公司，抗原包被纳米磁珠和抗原的投料比为1mg:10μg，，室温温浴2小时，置于混匀器上250转/min，后在磁场下清洗去上清，获得磁珠-COOH-NHS-抗原。其中，用磷酸盐缓冲液稀释包被抗原的纳米磁珠，稀释比例为1:20即得到工作浓度。
(2)发光标记物异鲁米诺ABEI的准备
采用蛋白A蛋白标记发光物ABEI，即蛋白A-NHS-ABEI。
用磷酸盐缓冲液稀释标记完成的发光标记物蛋白A-NHS-ABEI，比例为1:1000。
(3)缓冲液的准备
缓冲液为磷酸盐缓冲液，5％BSA，pH6.8。
(4)试验仪器
深圳市新产业生物医学工程股份有限公司研发生产的全自动化学发光免疫分析仪Maglumi 2000Plus，序号：2000200068。
(5)样本
选取正常体检样本20例，以及临床确诊的I型糖尿病样本20例。以英国的RSR公司的GAD65Ab ELISA试剂盒为对照组，测定结果见表2和表3。
表2
表3
以RSR公司的Elisa试剂盒的结果为依据，在Elisa检测结果中，正常人的抗体浓度参考范围为<6IU/ml，也就是说，当抗体浓度小于6IU/ml时，判断几乎不含谷氨酸脱羧酶抗体，为阴性；当抗体浓度大于或等于6IU/ml时，则认为待测样本中含有谷氨酸脱羧酶抗体，为阳性。通过将上述17个截短型的hGAD65抗原以及全长hGAD65测定正常样本和I型糖尿病样本的数值与RSR Elisa结果相比，可知灵敏度依次降低的hGAD65的区域为H1、B1、G1、A1、K1、M1、L1、J1、I1、O1、N1。其中，可用的抗原区域为O1或N1，利用其测定的正常样本和异常样本的相对光强度RLU分开的比较明显；优选的抗原区域为K1、M1、L1、J1、I1或A1，正常样本的RLU均小于25000，弱阳性和阳性样本的RLU均大于30000；更优的抗原区域为H1、B1或G1，正常样本的RLU均小于10000，阳性样本的RLU均大于32000，非特异更低，特异性反应更明显。其他片段均有漏检或者正常人样本虚高现象。
实施例3
原核表达与真核表达的蛋白质用于I型糖尿病检测比较
在大肠杆菌中表达hGAD65及其截短型，将上述hGAD65筛选的优化区段分别连接到pGEX4T-1表达载体上，大肠杆菌表达菌种为BL21(DE3)。表达产物经GST标签纯化后，再用Thrombin切除GST标签后，经亲和层析获得无标签的目的蛋白。
测定原核表达的hGAD65对hGAD65抗体的灵敏度与特异性。
hGAD65及其截短型的原核表达区段，依次编号PA1、PB1、PG1和PH1，其与真核表达的A1、B1、G1和H1分别相对应。
检测平台和方案详情同实施例1，结果见表4。
表4
表4中的PA1、PB1、PG1和PH1的结果与A1、B1、G1和H1的结果相比，原核表达hGAD65及其截短型蛋白质抗原用于检测正常人样本的非特异性结合明显比真核表达抗原的非特异性结合高，弱阳性样本和中度阳性样本信号也明显偏低。由此可见，真核细胞表达优于原核细胞表达。
实施例4
I型糖尿病的检测
检测平台同实施例1。截短型hGAD65为H1。
十点法确定标准曲线：标准品(GAD65抗体，北京博奥森公司)的原始浓度为5600IU/ml,于-20℃保存；用夹心法稀释液按1:20稀释。将稀释的标准品测定其对应的化学发光值，根据标准品浓度和其对应的化学发光值的关系得到标准品浓度与RLU的函数关系式，即标准曲线。
利用标准曲线计算出228例正常人样本的浓度，和108例I型糖尿病的样本的浓度(见表5)，并检测世界卫生组织(WHO)标准品的实际浓度与相对应的标定浓度是否相符合。其中，WHO标准品的标准浓度为100IU/ml。
以英国RSR公司的GAD65Ab ELISA试剂盒为对照，该试剂盒抗原为真核细胞表达的GAD65全长抗原。
结果
表5检测108例I型糖尿病的结果
通过测量228例正常人检测结果，根据统计学分析，得出判断本试剂盒的正常人的阀值为<30IU/ml，而阳性为≥30IU/ml。同时，WHO标准品的实际浓度与其相对应的标定浓度在允许的误差范围内。
经数据分析可知(见表5)，在使用RSR公司的Elisa试剂盒的检测中，第19、49和66号样本显示为阴性；但本方案的H1蛋白利用化学发光免疫法检测结果显示为阳性，从而表明该第19、49、66样本实际为I型糖尿病患者，这就是说本方案提高了检查的灵敏度和特异性，这也意味着本方案可减少漏检现象，由此可知本方案检测结果更符合临床。
通过本方案中的优化表达的hGAD65抗原在化学发光免疫平台上的检测结果可知：其阳性检出率＝86/108*100％＝79.63％。
而用于对比的RSR公司中的GAD65阳性检出率＝83/108*100％＝76.85％。
由上述数据可得出以下结论：
hGAD65经优化表达的H1在化学发光平台上的应用提高了试剂盒的检测效果，也就是说其阳性检出率优于对比试剂盒。因此，H1在化学发光平台上的应用提高了检测的灵敏度和特异性，避免了ELISA的漏检或者出现假阳性的现象。

Claims (9)

1.一种与谷氨酸脱氢酶65抗体特异结合的抗原蛋白质，其特征在于，所述抗原蛋白质选自如SEQ ID NO:21中的第110-585、130-585、150-585、160-585、180-585、46-585、66-585和90-585位的截短蛋白质中的一种。
2.根据权利要求1所述的抗原蛋白质，其特征在于，所述抗原蛋白质选自如SEQ ID NO:21中的第46-585、66-585和90-585位的截短蛋白质中的一种。
3.根据权利要求1或2所述的抗原蛋白质，其特征在于，所述抗原蛋白质为在真核表达系统中表达而获得的蛋白质。
4.根据权利要求3所述的抗原蛋白质，其特征在于，所述抗原蛋白质为在昆虫细胞表达系统中表达而获得的蛋白质。
5.一种抗原蛋白质，其特征在于，所述抗原蛋白质为根据权利要求1-4任意一项所述的蛋白质，且所述蛋白质为纳米磁珠包被的蛋白质。
6.一种用于检测糖尿病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-5所述的抗原蛋白质。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括化学发光标记的蛋白A。
8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括BSA缓冲液。
9.一种与糖尿病特定抗体特异结合的抗原蛋白质的基因序列，其特征在于，所述基因序列为通过表达获得如权利要求1-4任意一项所述的抗原蛋白质的基因序列中的一种。
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