CN104267181A - 一种非洲猪瘟抗原及其制备的荧光纳米晶试纸条 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种非洲猪瘟重组抗原及利用其制备的非洲猪瘟抗体检测荧光纳米晶试纸条。本发明利用基因工程的方法，获得非洲猪瘟病毒的特异性结构蛋白VP73蛋白作为重组抗原，其基因序列如序列表所示。将纯化后的VP73蛋白划线包被在硝酸纤维素膜上作为检测线，同样将兔抗金黄色葡萄球菌A多抗划线包被作为质控线，与用荧光纳米晶标记SPA制备试纸条的标记物释放垫装配成，获得本发明的荧光纳米晶试纸条。本发明可用于检测猪血清中的非洲猪瘟抗体，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、简便快捷的特点，便于现场使用，对我国应对非洲猪瘟的威胁有实际应用价值。

Description

一种非洲猪瘟抗原及其制备的荧光纳米晶试纸条

技术领域

本发明涉及动物病毒抗体检测领域检测领域，特别是涉及一种用于非洲猪瘟病毒抗原蛋白和利用该抗原蛋白制备的非洲猪瘟病毒抗体的快速检测荧光纳米晶试纸条。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus,ASFV)感染引起的一种严重危害猪及野猪的动物传染病，其病程短，死亡率高达100％。该病属于世界动物卫生组织(OIE)要求法定报告的动物疫病，在我国动物病原微生物名录中列为一类动物疫病。目前，全球已有49个国家报道曾经发生或仍有非洲猪瘟流行，主要集中在非洲、欧洲、美洲和欧亚接壤地区，尤其是2007年以来非洲猪瘟先后在格鲁吉亚、亚美尼亚、阿塞拜疆、俄罗斯、乌克兰、白俄罗斯等国暴发，造成巨大的经济损失，也严重威胁我国的养猪业。目前，我国虽然还没有发现ASF疫情，但根据周边国家的发病情况，我国已面临ASFV传入和流行的严重威胁，一旦发病，由于无有效的疫苗和药物可以预防和治疗，将造成巨大的经济损失，甚至会对我国养猪业造成毁灭性打击。由于没有有效的疫苗，检测技术是目前监测和控制非洲猪瘟的有效方法。因此，为了有效地防制非洲猪瘟病毒传入我国，及时准确地掌握进出境贸易中疫情疫病状况，迫切需要发明特异性强、灵敏度高的现场快速检测试纸条，应用于受威胁地区的监测工作中，其具有重要的现实与实践意义。

检测非洲猪瘟的方法包括抗原检测方法和抗体检测方法，由于我国还未有该病的发生，检测抗原的方法难以验证，故不具有现实意义。而检测非洲猪瘟抗体则具有重要意义，且其不存在疫苗免疫抗体的干扰。ASFV整个基因组含有160～175个开放阅读框(ORF)，编码150～200种蛋白质。其中VP73蛋白是ASFV的主要结构蛋白，病毒离子20面体衣壳的重要组成部分，产生与病毒感染的晚期，约占整个病毒粒子蛋白的32％。VP73蛋白在ASFV结合和进入易感细胞的过程中有很重要的作用。ASFV大多数分离毒株免疫原性很低，只有少数几个蛋白具有免疫原型。研究表明，不同区域ASFV分离株诱导产生的抗VP73蛋白抗体的相应抗原表位都相当保守。VP73蛋白免疫原性很稳定，可以被用来作为血清学检测和免疫制剂。

目前，国外检测非洲猪瘟抗体的方法包括酶联免疫吸附试验、间接荧光抗体试验、免疫印迹试验和对流免疫电泳试验等，但这些方法均需要在专业实验室中开展，不能满足现场快速检测的实际工作需要。免疫层析技术自问世以来，得到了迅速发展，已广泛应用于生物检测技术领域，特别是胶体金免疫层析技术具有操作简单、结果清楚、易于判断和保存、无需任何仪器设备等优点，适合于临床的快速检测和基层、农村等流行病学调查，但是其也存在检测灵敏度低的不足。

高特性荧光纳米晶的制备及其在免疫检测中的应用是目前十分活跃的前沿研究领域。将荧光纳米晶新型标记材料引入到免疫层析试纸条中，通过荧光信号来得出检测结果，可以克服胶体金试纸条灵敏度不足的缺点。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种具有敏感性高、特异性强、检测快速、操作方便非洲猪瘟病毒抗体的快速检测荧光纳米晶试纸条。

本发明包括一种非洲猪瘟病毒重组抗原，其制备方法包括以下步骤：

a)根据非洲猪瘟病毒VP73基因序列人工设计并合成该抗原表位的重组基因

序列，所述如序列表SeqIDNo.1所示；

b)将该序列克隆至载体中，用PCR方法扩增该片段；

c)将步骤b)获得的PCR产物，并与线性载体连接，构建重组表达载体；

d)将重组表达载体导入原核表达体系，诱导蛋白表达；

e)对表达产物进行纯化后获得所述非洲猪瘟的重组抗原。

进一步的，步骤d)中，最佳诱导剂及浓度为IPTG1.0mmol/L，最佳诱导时间为3h。

进一步的，步骤b)中，用于所述重组基因序列特异性扩增的PCR引物为：

P1:TAGATCCATGGCTTCTGGTGGCGCGTT

P2:ATTCTCGAGGTCGACTTAGTGATGG，

本发明的内容还包括所述的非洲猪瘟病毒重组抗原，在制备用于检测非洲猪瘟病毒抗体的试剂中的应用。

本发明的内容还包括一种非洲猪瘟抗体检测荧光纳米晶试纸条，包括：依次连接并固定于PVC衬板上样品垫、荧光纳米晶标记物释放垫、包被权利要求1所述非洲猪瘟病毒抗原作为检测线和兔抗金黄色葡萄球菌A多克隆抗体作为质控线的硝酸纤维素膜以及吸水垫。

进一步的，所述标记结合物释放垫为喷有标记物的玻璃纤维膜，所述标记物为金黄色葡萄球菌A蛋白标记荧光纳米晶。

进一步的，所述硝酸纤维素膜上的检测线位于靠近所述标记物释放垫的一端，所述硝酸纤维素膜上的质控线位于靠近所述吸水垫的一端，所述质控线与所述检测线的垂直距离为4mm～7mm。

进一步的，所述非洲猪瘟病毒抗原包被浓度为1.5mg/mL，所述兔抗金黄色葡萄球菌A多克隆抗体包被浓度为1.5mg/mL。

本发明的非洲猪瘟抗体检测荧光纳米晶试纸条的有益效果在于特异性好、灵敏度高、简便快捷，主要是通过采用非洲猪瘟病毒主要免疫原性结构蛋白VP73作为检测抗原获得良好的检测特异性、采用荧光纳米晶标记材料获得高灵敏度、采用免疫层析试纸条技术使得检测过程简便快捷。

与现有技术相比，本发明具有可现场操作、检测快速、结果清晰易于判读，且无需专业仪器设备等优点，适合于非洲猪瘟抗体的快速检测和基层流行病学调查应用，对我国应对非洲猪瘟的威胁有实际应用价值。

为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。

附图说明

图1非洲猪瘟病毒VP73重组表达蛋白的SDS-PAGE分析。

图2非洲猪瘟病毒VP73蛋白的WesternBlot分析。

图3非洲猪瘟病毒VP73蛋白纯化效果的SDS-PAGE分析。

图4非洲猪瘟荧光纳米晶抗体检测试纸条的检测结果图。

具体实施方式

以下实施例是为了进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1标记物释放垫的制备

1、主要试验材料

金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)、牛血清白蛋白(BSA)均为Sigma公司产品；荧光纳米晶颗粒、EDC、sulfo-NHS生物素、BCA蛋白检测试剂盒均为Thermoscientific公司产品；MES购自上海生物工程技术有限公司；玻璃纤维膜为Millipore公司产品。

2、实验方法

(1)荧光纳米晶标记SPA的标记物制备

取荧光纳米晶颗粒50μL，用50mM MES(pH6.0)洗涤颗粒2次，1mL/次；用600μL50mM MES(pH6.0)重悬颗粒；加入100mg/mL的sulfo-NHS和EDC各200μL，室温摇动反应30min后，离心，弃上清；用1mL50mM的MES(pH6.0)洗涤颗粒一次；用1mL50mM的MES(pH6.0)重悬荧光纳米晶颗粒，加入适量SPA，室温振摇反应1h，使SPA和荧光纳米晶颗粒间形成稳定的肽键共价结合；加入等体积的PBS-BSA(BSA含量2％，pH7.4)，继续反应1h；离心，弃上清；用50mM MES(pH6.0)洗涤颗粒3次，1mL/次；用300μL重悬液(10mM Tris-HCl(pH8.0)，10％蔗糖)重悬荧光纳米晶标记SPA的标记物，4℃保存备用。

(2)标记物释放垫的制备

用含2％TritonX100、1％BSA、1％蔗糖的0.02mol/L PBS(pH7.4)溶液处理玻璃纤维膜，真空抽湿4小时后，用上述膜处理缓冲液按1:100稀释荧光纳米晶标记SPA的标记物，采用Bio-Dot XYZ3050喷膜系统将此稀释抗体喷涂至上述处理过的玻璃纤维膜上制成标记物释放垫，真空抽湿干燥备用。

(3)SPA与荧光纳米晶标记的最佳标记量确定

将SPA梯度稀释后，分别取50μg、100μg、150μg、200μg、250μg、300μg蛋白溶液与50μL1mg/mL的荧光纳米晶颗粒偶联，用BCA蛋白检测试剂盒检测偶联标记后的上清中蛋白的浓度。取上清中的蛋白的浓度刚好升高的前一个浓度为最佳蛋白标记用量。

3、试验结果

利用荧光纳米晶标记SPA的试验方法，分别将50μg、100μg、150μg、200μg、250μg、300μg的SPA蛋白溶液与50μL1mg/mL的荧光纳米晶颗粒进行偶联反应，反应后离心取上清，分别检测上清中的蛋白浓度，结果发现200μgSPA的稀释度开始出现明显的蛋白浓度升高，因此确定与50μL1mg/mL荧光纳米晶颗粒共价偶联的最佳SPA蛋白标记量为150μg(即0.15mg)。

实施例2非洲猪瘟病毒VP73蛋白的原核表达及纯化

1、主要试验材料

原核表达质粒pGEX-KG由本单位保存、提供；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG购自Invitrogen公司；牛血清白蛋白(BSA)购自sigma公司；HRP底物显色液购自天根生化科技有限公司；蛋白电泳LoadingBuffer购自上海生工生物工程有限公司；蛋白Marker购自纽英伦生物技术公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、蛋白纯化试剂盒(B-PERTM6×His Fusion Protein Purification Kit)、蛋白稳定剂(Protein Stabilizing Cocktail)购自Thermo公司。

2、试验方法

(1)VP73基因重组原核表达质粒的构建与鉴定

在GenBankS89966.1非洲猪瘟病毒VP73基因序列基础之上优化设计VP73基因全长序列，氨基端加入起始密码子ATG，羧基端加入6×His标签及终止密码子。由上海生工生物工程(上海)有限公司合成含有VP73基因全长序列的质粒，合成的VP73基因长度为1188bp。利用Primer Premier5.0设计一对特异性引物(分别在上下游引入BamHI和XhoI酶切位点)，

P1:TAGATCCATGGCTTCTGGTGGCGCGTT，

P2:ATTCTCGAGGTCGACTTAGTGATGG，

通过PCR扩增得到1188bp的非洲猪瘟病毒VP73基因片段。将该片段与表达载体pGEX-KG连接克隆至大肠杆菌DH5α菌株，提取质粒后，经上海生工测序、PCR和双酶切鉴定，选取VP73基因读码框正确的阳性克隆，命名为pGEX-KG-VP73。

(2)VP73蛋白的诱导表达

将重组原核表达质粒pKG-VP73转化大肠杆菌感受态BL21(DE3)菌，划板筛选后获得用于表达目的蛋白的阳性菌。挑取单菌落接种到含相应抗生素的LB液体培养基中，置于37℃摇床上，180r/min振荡培养12h,第二天以1：100的量转接扩大培养，振荡培养使培养基OD600值达到0.6～0.8之间，加入IPTG诱导剂至终浓度为1.0mmol/L，继续振荡诱导3h。诱导结束后，取1mL菌液于1.5mL EP管中，离心收集细菌，菌体用ddH2O洗涤一次，取适量的1倍蛋白电泳Loading Buffer重悬菌体，95℃加热10min，处理后用于SDS-PAGE检测目的蛋白。同时以未加诱导剂诱导的阳性菌液和加诱导剂诱导的空载体(pGEX-KG)菌液经过同样的处理后作为对照。

(3)诱导表达产物的SDS-PAGE分析

按照常规方法制备SDS-PGAE凝胶，将处理后的待检蛋白样品及对照加入上样孔中，加入电泳缓冲液后开始电泳，电泳初始电压为80V，样品进入分离胶后，将电压调到120V，电泳结束后关闭电源，取下凝胶置于考马斯亮蓝染液中室温振荡染色3h。染色完毕，将染色液换为脱色液，室温振荡脱色数次至蛋白条带清晰时观察结果。

(4)诱导表达产物的Western blot分析

IPTG诱导pGEX-KG-VP73阳性菌液和空载体菌液表达后，处理样品经SDS-PAGE电泳，将电泳结束后的凝胶取下，采用湿法转印硝酸纤维素膜(NC膜)，350mA1h。把NC膜置TBST中漂洗一下，置封闭液中4℃过夜。把NC膜放入一新的平皿中，以0.1～0.15mL/cm2的量加入封闭液稀释的非洲猪瘟标准阳性血清，置37℃水平摇床上温育1h。用TBST洗涤NC膜4～6遍，每次5min，加入封闭液稀释的兔抗猪IgG-HRP，置37℃水平摇床上温育45min，洗涤同上，随后再用TBS洗两遍，吸干洗液后加入适量的HRP底物显色液避光显色至出现蛋白带时，立即用去离子水终止并观察结果。

(5)最佳诱导剂诱导浓度的确定

复苏活化后的pGEX-KG-VP73菌液，振荡培养使培养基OD600值达到0.6～0.8之间时，等量分装，每管5mL，分别加入IPTG诱导剂至终浓度为0.2、0.4、0.8、1.0、1.2和1.4mmol/L，同时诱导表达3h，未加诱导剂诱导的阳性菌液和加1.0mmol/LIPTG诱导的空载体菌液经过同样的处理作为对照。诱导后收集菌体，处理后的样品经SDS-PAGE分析确定VP73蛋白诱导表达的最佳诱导剂浓度。

(6)最佳诱导时间的确定

复苏活化后的pGEX-KG-VP73菌液，振荡培养使培养基OD600值达到0.6～0.8之间时，等量分装，每管5mL，IPTG诱导剂至终浓度为1.0mmol/L，分别诱导表达1h、2h、3h、4h和5h，未加诱导剂诱导的阳性菌液和加1.0mmol/L IPTG诱导的空载体菌液同时诱导3h作为对照。诱导后收集菌体，处理后的样品经SDS-PAGE分析确定VP73蛋白诱导表达的最佳诱导时间。

(7)VP73蛋白诱导表达形式的确定

pGEX-KG-VP73菌液和空载体菌液同时以1.0mmol/L IPTG诱导表达3h，收集菌体，用ddH2O重悬，高压破碎。破碎后，4℃12000r/min离心20min，收集上清，沉淀用ddH2O重悬。取适量上清和沉淀分别加入蛋白电泳LoadingBuffer，95℃加热10min，处理后的样品同时进行SDS-PAGE分析确定VP73蛋白诱导表达形式。

(8)VP73蛋白的大量表达

取活化后的pGEX-KG-VP73菌液，以1:100的接种量接入到含相应抗生素的200mL LB液体培养基中，振荡培养使培养基OD600值达到0.6～0.8，加入1.0mmol/L IPTG诱导表达3h，收集菌体，用20mL bufferA(含20μL DTT)重悬，高压破碎。破碎后，4℃12000r/min离心20min，沉淀用ddH2O洗涤两次，沉淀中加入19.7mL bufferA、0.3mL SKL和20μL DTT，剧烈震荡后冰上静置0.5～2h。4℃12000r/min离心20min，弃沉淀取上清，加入20％PEG4000至终浓度为0.2％，加入50mmol/L氧化型谷胱甘肽至终浓度为1mmol/L，再加入100mmol/L还原型谷胱甘肽至终浓度为2mmol/L，装入透析袋，经TE透析三天后，用PEG8000浓缩蛋白，置于4℃保存备用。

(9)VP73蛋白纯化

按照Thermo公司B-PERTM6×His Fusion Protein Purification Kit说明书对诱导表达的VP73蛋白纯化，纯化后的蛋白加入适量Protein Stabilizing Cocktail，使用Pierce BCA Protein Assay kit测定蛋白浓度，适量分装后置于-80℃保存备用。

3、试验结果

(1)VP73基因重组原核表达质粒的构建及鉴定

BamHI+XhoI双酶切重组原核表达质粒pGEX-KG-VP73，得到预期大小的两个片段，目的片段大小约为1188bp，0.8％的琼脂糖凝胶电泳图谱上显示目的片段条带，表明重组质粒构建正确。使用NCBI中Blast程序对由上海生工测定的重组质粒pGEX-KG-VP73序列与人工合成的ASFVVP73基因标准序列进行比较发现，其同源性为100％，无碱基突变。

(2)VP73蛋白诱导表达的SDS-PAGE分析

SDS-PAGE分析结果表明，重组质粒pGEX-KG-VP73转化大肠杆菌BL21(DE3)后，经终浓度为1.0mmol/L的IPTG37℃诱导3h，产生约71KDa的特异性蛋白带，与预期结果一致，结果见图1。

(3)VP73蛋白诱导表达的Western blot分析

对诱导表达的VP73蛋白进行Western blot分析，结果发现在约71KDa位置上出现特异性杂交条带，而对照则未出现条带，如图2。试验表明体外表达的VP73蛋白与非洲猪瘟标准阳性血清可以特异性结合，证实其具有良好的生物学活性。

(4)最佳诱导剂诱导浓度的确立

SDS-PAGE分析结果表明，VP73蛋白在不同诱导剂诱导浓度的作用下，表达量均较高且相差不大，最终选择1.0mmol/L为诱导剂IPTG的最佳诱导浓度。

(5)最佳诱导时间的确立

SDS-PAGE分析结果表明，VP73蛋白随诱导时间的延长表达量逐渐增多，最终选择3h为最佳诱导时间。

(6)VP73蛋白诱导表达形式的确立

对诱导表达的含VP73重组质粒的菌株高压破碎处理后，分别对收集的上清和沉淀进行SDS-PAGE分析，结果表明VP73蛋白主要以包涵体的形式在大肠杆菌中表达，而空载体GST蛋白表达在上清中。

(7)VP73蛋白的纯化

对大量表达的VP73蛋白进行纯化后，经SDS-PAGE分析，发现纯化得到的VP73蛋白纯化效果好，条带单一，纯化量较高，结果见图3。

(8)VP73蛋白含量的测定

使用Pierce BCA Protein Assay kit测定纯化后VP73蛋白的蛋白质浓度，读取562纳米处的吸光光度值，根据标准曲线计算出VP73纯化蛋白的浓度为2.24mg/mL。

实施例3非洲猪瘟荧光纳米晶抗体检测试纸条的制备及组装

1、试验材料

PVC背衬、硝酸纤维素膜、吸水垫、样品垫和金标垫均为Millipore公司产品；兔抗SPA多克隆抗体为Sigma公司产品。

2、试验方法

(1)非洲猪瘟荧光纳米晶抗体检测试纸条中硝酸纤维素膜的制备

以原核表达并纯化的非洲猪瘟病毒VP73蛋白作为硝酸纤维素膜上的检测线包被蛋白，以兔抗SPA多克隆抗体作为硝酸纤维素膜上的质控线包被蛋白。采用0.02mol/L PBS(pH7.4)缓冲液，将兔抗SPA多克隆抗体和非洲猪瘟病毒VP73蛋白的浓度均配制为1.5mg/mL，利用Bio-Dot XYZ3050喷膜系统将兔抗SPA多克隆抗体喷至硝酸纤维素膜的控制线(Control Line，C线)位置，将非洲猪瘟病毒VP73蛋白喷至检测线(Test Line，T线)位置，C线与T线间的距离为5.0mm喷样速度为1.0μL/cm，然后于相对湿度为10％以下的干燥条件下进行抽湿4小时后，干燥密封保存待用。

(2)非洲猪瘟荧光纳米晶抗体检测试纸条的组装

将喷膜包被了蛋白的硝酸纤维素膜粘贴于PVC衬板上，在硝酸纤维素膜(NC膜)的两端分别粘贴吸水垫和标记物释放垫、样品垫，吸水垫和标记物释放垫均与NC膜重叠3mm，样品垫和标记物释放垫重叠3mm，对齐抹平后进而采用Bio-Dot的CM4000切条机将其裁成5mm宽的条状，4℃密封干燥保存备用。

(3)非洲猪瘟荧光纳米晶抗体检测试纸条的检测反应结果

当待检血清样品沿着试纸条通过毛细作用由样品垫向吸水垫泳动时，被检样品中IgG免疫球蛋白首先与荧光纳米晶颗粒上的SPA结合形成复合物，该复合物继续流动。复合物流经检测线时，如果被检样品中含有抗非洲猪瘟病毒VP73蛋白的IgG抗体时，将与固定在检测线上的非洲猪瘟病毒VP73蛋白结合进而被捕获富集，在紫外光照射激发下检测线处发出红光；没有被结合捕获的复合物继续向前流动，与固定在质控线上的兔抗SPA多克隆抗体结合，并在质控线上富集，在紫外线照射激发下质控线处发出红光。

用试纸条检测血清样品时，在紫外光照射下，如在检测线和质控线同时出现红色条带的判为阳性反应结果，只在质控线出现红色条带的判为阴性反应结果，如果质控线未出现红色条带，则表明操作过程不正确或试纸条失效。

3、试验结果

分别取一滴(约50μL)非洲猪瘟阳性血清和阴性血清，各滴加在制备好的试纸条的样品垫(加样区)上，样品开始在硝酸纤维素膜上扩散，待标记物释放垫释放完全后，在滴加非洲猪瘟阳性血清的试纸条上出现了清晰的T线和C线，而在在滴加非洲猪瘟阴性血清的试纸条上只出现了清晰的C线，见图4。

实施例4非洲猪瘟荧光纳米晶抗体检测试纸条技术指标验证试验

1、试验材料

(1)水泡性口炎病毒(VSV)、猪水泡病病毒(SVDV)、蓝舌病病毒(BTV)、蓝耳病病毒(PRRSV)等多种疫病的阳性血清均由本单位保存。

(2)非洲猪瘟标准阳性血清购自OIE设在英国的非洲猪瘟参考实验室；30份非洲猪瘟阴性血清采集于正常猪，并经ELISA试剂盒检测确认为阴性，由本单位保存、提供。

2、试验方法

(1)非洲猪瘟荧光纳米晶抗体检测试纸条的特异性试验

用研制的非洲猪瘟荧光纳米晶试纸条分别检测非洲猪瘟标准阳性血清、30份非洲猪瘟阴性血清和VSV、SVDV、BTV、PRRSV等4种疫病的阳性血清，在紫外光照射下观察分析结果，进而对该试纸条的特异性进行验证评估。

(2)非洲猪瘟荧光纳米晶抗体检测试纸条的敏感性试验

选用非洲猪瘟标准阳性血清，用ELISA检测其效价约为1:3200，用PBS分别稀释为1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400的待检样品，分别用，用移液器取待检测样品50μL垂直缓慢滴加在试纸条的样品垫上，用手持式紫外灯进行照射，观察检测结果。

(3)非洲猪瘟荧光纳米晶抗体检测试纸条的重复性试验

将5份非洲猪瘟阳性血清作为阳性样品，5份正常猪血清作为阴性样品，用于试纸条的重复性试验。随机取出不同批次和同一批次的试纸条，分别对阳性样品和阴性样品进行重复检测，观察结果评估其重复性。

(4)非洲猪瘟荧光纳米晶抗体检测试纸条的稳定性试验

取非洲猪瘟荧光纳米晶试纸条100条，密封保存于4℃冰箱中，在保存后0、1、2、3、4、5、6、7、8、9个月时分别取出10条，对非洲猪瘟阳性血清、阴性血清及PBS进行检测，通过结果分析来确定试纸条的质保期限。

3、试验结果

(1)特异性试验

用非洲猪瘟荧光纳米晶试纸条分别对非洲猪瘟标准阳性血清以及VSV、SVDV、BTV、PRRSV等多种疫病的阳性血清进行检测，同时以非洲猪瘟阴性血清和PBS作为对照，结果发现该试纸条只与非洲猪瘟标准阳性血清呈阳性反应，在紫外灯下有红色检测线出现，而其它检测均为阴性反应，表明该试纸条具有很好的特异性

(2)敏感性试验

利用非洲猪瘟荧光纳米晶快速检测试纸条对不同稀释度的非洲猪瘟标准阳性血清样品进行检测，结果发现稀释到1:800以下样品均为阳性结果，有明显的检测线；1:1600的样品检测结果为可疑，检测线模糊不清；1:3200的样品检测结果为阴性，从而表明该试纸条的检测灵敏度能达到标准阳性血清的1:800倍稀释，低于ELISA方法的灵敏。

(3)重复性试验

对随机挑取的3个不同批次间的试纸条进行重复试验，每一批次挑取10个试纸条分别对非洲猪瘟阳性血清和阴性血清进行检测，结果发现检测结果与预期完全一致。取30个同一批次的试纸条，分别对非洲猪瘟阳性血清和阴性血清进行3次重复检测，结果发现检测结果完全一致。这些试验结果表明，该非洲猪瘟荧光纳米晶快速检测试纸条的检测重复性良好。

(4)稳定性试验

将同一批次的100个试纸条在4℃条件下保存不同时间(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9个月)，每次取出10条分别检测非洲猪瘟阳性血清和阴性血清，结果发现，在4℃保存7个月内，试纸条检测结果没有任何变化，用在4℃保存8个月试纸条检测时，有2份为假阳性，用在4℃保存9个月的试纸条检测时，有2份为假阳性和1份假阴性。试验结果表明，该试纸条在4℃可以保存7个月，其检测效果不受影响。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种非洲猪瘟病毒重组抗原的制备方法，包括以下步骤： 

a)人工设计并合成该抗原表位的重组基因序列，所述如序列表SeqIDNo.1所示； 

b)将该序列克隆至载体中，用PCR方法扩增该片段； 

c)将步骤b)获得的PCR产物，并与线性载体连接，构建重组表达载体； 

d)将重组表达载体导入原核表达体系，诱导蛋白表达； 

e)对表达产物进行纯化后获得所述非洲猪瘟的重组抗原。 

2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒重组抗原，其特征在于：步骤d)中，诱导剂及浓度为IPTG1.0mmol/L，诱导时间为3h。 

3.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒重组抗原，其特征在于：步骤b)中，用于所述重组基因序列特异性扩增的PCR引物为： 

P1:TAGATCCATGGCTTCTGGTGGCGCGTT 

P2:ATTCTCGAGGTCGACTTAGTGATGG。 

4.权利要求1所述的非洲猪瘟病毒重组抗原，在制备用于检测非洲猪瘟病毒抗体的试剂中的应用。 

5.一种非洲猪瘟抗体检测荧光纳米晶试纸条，包括：依次连接并固定于PVC衬板上的样品垫、荧光纳米晶标记物释放垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫；所述硝酸纤维膜包被有权利要求1所述非洲猪瘟病毒抗原作为检测线和兔抗金黄色葡萄球菌A多克隆抗体作为质控线。 

6.根据权利要求5所述的非洲猪瘟抗体检测荧光纳米晶试纸条，其特征在于：所述标记结合物释放垫为喷有标记物的玻璃纤维膜，所述标记物为金黄色葡萄球菌A蛋白标记荧光纳米晶。 

7.根据权利要求5所述的非洲猪瘟抗体检测荧光纳米晶试纸条，其特征在于： 所述硝酸纤维素膜上的检测线位于靠近所述标记物释放垫的一端，所述硝酸纤维素膜上的质控线位于靠近所述吸水垫的一端，所述质控线与所述检测线的垂直距离为4mm～7mm。 

8.根据权利要求5所述的非洲猪瘟抗体检测荧光纳米晶试纸条，其特征在于：所述非洲猪瘟病毒抗原包被浓度为1.5mg/mL，所述兔抗金黄色葡萄球菌A多克隆抗体包被浓度为1.5mg/mL。