CN102455360A - 一种新孢子虫病rELISA抗体检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供的一种新孢子虫病rELISA抗体检测试剂盒，根据GenBank中的新孢子虫NcSRS2基因序列设计一对引物，引入酶切位点，截去NcSRS2蛋白的信号肽区，从新疆地方奶牛阳性血清中提取DNA；通过PCR扩增了长约975bp的tNcSRS2基因片段，克隆到pMD-18-T载体上，酶切并测序鉴定；然后将目的片段进一步定向连接到pGEX-4T-2表达载体，转化到大肠杆菌中，诱导表达、纯化；表达融合蛋白的分子量约为62kDa；用于ELISA包被抗原，获取rELISA抗体检测试剂盒；其使用步骤：将包被好的酶标反应板取出，经洗涤、封闭、再洗涤，加检测样品；再经第三次洗涤，加二抗；经第四次洗涤，显色、终止反应；读板OD_450/630值，判定结果；与其商品化ELISA检测盒比符合率均达到95％以上。本检测盒也适用于反刍动物血清和血浆中的犬新孢子虫抗体的酶联免疫检测。

Description

一种新孢子虫病rELISA抗体检测试剂盒

技术领域

本发明涉及基因重组技术，特别针对新孢子虫tNcSRS2基因的克隆与表达及rELISA抗体检测试剂盒的构建。

背景技术

新孢子虫病是1998年新发现的多种家畜共患的一种原虫病。犬是新孢子虫的终末宿主，牛、羊等多种哺乳动物以及野生动物可作为其中间宿主。该病呈世界性分布，50多个国家都有报道。在国外奶牛感染率为10～40％，最高可达82％，已证实新孢子虫病为患畜发生流产的主要根源。新疆是我国重要的畜牧业生产基地，养殖牛业又是我区的主要支柱产业，其血清新孢子虫抗体的阳性率为40％；每年有近5-20％的妊娠母牛发生不明原因的流产，布氏杆菌等感染性流产因素的检测结果均为阴性，难以确诊，造成巨大的经济损失；再加上我区每年引进一些高产奶牛，具有新孢子虫病引入感染的危险。

文献检索披露：国内用ELISA方法进行牛新孢子虫病血清学诊断及流行病学调查的报道有之。①有意大利Euroclone公司产的“Neospora caninum ELISAkit”和美国IDEXX公司产的“Neospora caninum Antibody Test kit”的检测试剂盒，其价格昂贵，针对性不强，有一定的局限性。②刘晶等在“新孢子虫dNcSRS2重组蛋白间接ELISA的建立及其应用”一文中，利用新孢子虫体外重组表面蛋白dNcSRS2蛋白作为包被抗原，建立了检测新孢子虫血清抗体的间接ELISA方法。③余劲术等在“新孢子虫NcSRS2基因的亚克隆和表达”一文中所研究的pGEX-NcSRS2重组质粒为日本国家原虫研究所惠赠的。他们根据NcSRS2基因序列设计合成一对引物，将上、下游引物分别引入EcoRI，XhoI酶切位点，用PCR技术从pGEX-NcSRS2重组质粒扩增截去N端疏水氨基酸序列NcSRS2的基因片段(称dNcSRS2)，插入到pGEX-6p-1质粒后转化大肠杆菌，诱导表达、纯化。④徐雪平等在“新疆部分地区牛新孢子虫病的血清学调查”一文中，应用国外试剂盒检出了1例新疆新孢子虫抗体阳性牦牛。本发明获取的新孢子虫株tNcSRS2基因的克隆与表达及rELISA检测试剂盒的构建及使用，既降低成本又经济实惠，为畜牧业的生产安全提供了高效的防护措施，也确实解决了高端产品贫民化使用的需求。

发明内容

本发明的目的在于：提供的新孢子虫病rELISA抗体检测试剂盒，为牛新孢子虫病的诊断与流行病学调查提供有效的科学与技术手段；该试剂盒与商品化ELISA检测试剂盒的符合率均达到95％以上。

本发明的目的是这样实现的：一种新孢子虫病rELISA抗体检测试剂盒，根据GenBank中的新孢子虫NcSRS2基因序列设计一对引物，引入酶切位点，截去NcSRS2蛋白的信号肽区，从新疆地方奶牛阳性血清中提取DNA；通过PCR扩增了长约975bp的tNcSRS2基因片段，克隆到pMD-18-T载体上，酶切并测序鉴定；然后将目的片段进一步定向连接到pGEX-4T-2表达载体，转化到大肠杆菌中，诱导表达、纯化；表达融合蛋白的分子量约为62kDa；用于ELISA包被抗原，获取rELISA抗体检测试剂盒，其试剂盒的使用；

操作步骤如下：

(1)取出酶标反应板，甩去板内的包被缓冲液，用移液器向每个微量孔中加200μL洗涤缓冲液，室温静置2分钟，然后甩出板中的液体，重复上步洗涤过程两次即可；

(2)封闭：每孔加入200μL自配的0.5％的脱脂乳，置于37℃生化培养箱中培养1小时待用；

(3)洗涤：用移液器向每个微量孔中加200μL洗涤缓冲液，室温静置2分钟，然后甩出板中的液体，重复上步洗涤过程两次即可；

(4)检测样品：将待检血清样用稀释缓冲液按1∶100稀释，加入酶标反应板中，每孔100μL；同时加入标准阳性血清和标准阴性血清；置于37℃生化培养箱中培养1小时待用；

(5)第三次洗涤：同步骤(3)；

(6)加二抗：将辣根过氧化物酶标记羊抗牛IgG抗体用稀释缓冲液进行1∶4000稀释，加入酶标反应板中，每孔100μL，置于37℃生化培养箱中培养1小时待用；

(7)第四次洗涤：同步骤(3)；

(8)显色：在各反应孔中加入配制的TMB溶液100μL，置于37℃生化培养箱中培养25min，在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，在酸的作用下转化成最终显黄色，颜色的深浅与样品的血清阳性强度呈正相关。

(9)终止反应：在各反应孔中加入2M硫酸50μL，即为反应终止；

(10)用酶标仪在450nm、630nm双波长处测定吸光度(OD值)，读OD_450/630nm值，判定其结果。

其关键数据的控制：抗原的包被浓度为7μg/mL，其反应时间为1h；封闭液为0.5％的脱脂奶粉，其封闭时间为1h；血清的稀释倍数为1∶100，其反应时间为1h；二抗稀释倍数为1∶4000，其反应时间为1h；显色时间为25min；包被缓冲液为0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液，洗涤液和稀释液均为PBST(pH7.4PBS+0.05％吐温20)，封闭液为0.05％脱脂乳(PBST+0.05％脱脂乳)。

所述的抗体检测试剂盒，选用的标准阳性血清为新孢子虫病临床阳性血清，经美国IDEXX试剂盒测定，由本实验室保存。

所述的抗体检测试剂盒，选用的标准阴性血清为新孢子虫病临床阴性血清，经美国IDEXX试剂盒测定，由本实验室保存。

所述的抗体检测试剂盒，选用的辣根过氧化物酶标记羊抗牛IgG抗体购自美国的BETHYL公司。

所述的抗体检测试剂盒，选用的pMD-18-T载体购自大连的TaKaRa公司。

所述的抗体检测试剂盒，结果是当OD_450/630值≥0.170时，判定为阳性；当OD_450/630值＜0.121时，判定为阴性；当0.121≤OD_450/630值＜0.17时，判定为疑似阳性；判定为疑似阳性需重新检测，检测仍为疑似阳性时，判定为阳性。

所述的抗体检测试剂盒，检测盒也适用于反刍动物的血清和血浆中的犬新孢子虫抗体的酶联免疫检测。

所述的抗体检测试剂盒，检测盒配制的试剂及材料均为市售产品。

本发明根据GenBank中已发表的新孢子虫NcSRS2基因序列设计一对引物，其上游引物：5′-ACGGATCCTGCGCCGTTCAAGTCG-3′；下游引物：5′-ACCTCGAGAAGGCAACTCGTCGCA-3′；引入酶切位点，截去NcSRS2蛋白的信号肽区，以所采集的新疆地方奶牛阳性血清中提取DNA为模板，通过PCR扩增NcSRS2基因片段，构建质粒并表达蛋白，建立rELISA检测方法，研制rELISA抗体检测试剂盒。实验和临床使用表明，该试剂盒检出率高，特异性强，对国内的地方样品诊断的针对性强，价格低廉，重复性好，且操作简便，适用于大量样品的现场快速检测，也宜于被个体养殖户所接受。

本发明试剂盒的原理：采用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)，已知抗原是经体外重组技术研制的精致抗原(重组抗原)，故称重组酶联免疫吸附试验(rELISA)。使用96孔微量板(可拆板)，该板奇数列的孔已被重组GST-tNcSRS2蛋白包被，偶数列的孔被GST蛋白包被。操作时先加入稀释过的待检血清，再加入二抗，该二抗是一种标记有辣根过氧化物酶的羊抗牛IgG。经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下最终转化成黄色。颜色的深浅与样品的血清浓度呈正相关。用酶标仪在450nm、630nm双波长处测定吸光度(OD值)。

本发明试剂盒的配制：说明书1份、酶标包被板12孔×8条、密封袋1个、洗涤液30ml×20倍×1瓶(按说明书稀释)、稀释缓冲液15ml×1瓶、二抗15ml×1瓶、标准阳性血清1ml×1管、标准阴性血清1ml×1管、TMB 15ml×1瓶、终止液10ml×1瓶。

本发明将首次分离所得新疆虫株，经in vitro培养及tNcSRS2(P43)基因克隆、表达及获取rELISA检测试剂盒，对地方病的防治与预警起到了好的示范作用，彰显技术进步。

附图说明

本发明对照说明书附图作进一步阐述。

附图1为本发明的实验全过程的流程示意图

附图2为rELISA试剂盒检查样品的96孔板的检测结果

如图所示：颜色越深，测得的OD_450/630值越大，说明其阳性越强，颜色越浅，测得的OD_450/630值越小，说明其阳性越弱。

附图3为全血模板DNA提取结果

如图所示：M：DNA分子量标准；1：新孢子虫阳性全血DNA；2：新孢子虫阴性全血DNA

附图4为pMD18-T-NcSRS2的限制性内切酶酶切分析

如图所示：M1：DNA分子质量标准；M2：DNA分子质量标准1：pMD18-T-NcSRS2质粒；2：pMD18-T-NcSRS2的BamHI和Xho I双酶切产物；

附图5为pGEX-4T-NcSRS2的限制性内切酶酶切分析

如图所示：1：DNA分子质量标准；2：pGEX-4T-NcSRS2质粒；3：pGEX-4T-NcSRS2的BamHI和Xho I双酶切产物；4：pGEX-4T-NcSRS2质粒；5：pGEX-4T-NcSRS2的BamHI和Xho I双酶切产物

附图6为GST-NcSRS2蛋白的SDS-PAGE分析

如图所示：1：分子质量蛋白质标准；2：pGEX-4T-2/BL21诱导菌(4h)；3：pGEX-4T-2/BL21未诱导菌；4：pGEX-4T-NcSRS2/BL21未诱导菌；5：pGEX-4T-NcSRS2/BL21诱导菌(4h)；6：pGEX-4T-NcSRS2/BL21诱导菌(4h)上清

附图7为诱导时间及IPTG浓度对表达的影响

如图所示：不同的图形标志代表不同的IPTG诱导浓度，纵坐标为不同条件诱导后的目的蛋白浓度，横坐标为不同的诱导时间

附图8为诱导时间对表达的影响分析

如图所示：1：分子质量蛋白质标准；2-7：IPTG浓度为0.5mmol/L，分别诱导1h、2h、3h、4h、5h、6h pGEX-4T-NcSRS2/BL21诱导菌

附图9为Western blot分析重组GST-NcSRS2蛋白

如图所示：M：分子质量蛋白质标准；1：GST-NcSRS2蛋白印迹；2：阴性对照

附图10为重组蛋白GST-P43蛋白纯化效果

如图所示：M.标准低分子量蛋白质Marker；1-2.经洗涤后的P43包涵体蛋白；3.经GST-agarose试剂盒纯化后的蛋白；4.超声裂解后的上清；5.超声裂解后的沉淀；6未诱导的菌体

附图11为特异性试验结果与间接ELISA判定标准的确定

如图所示：1号组为弓形虫病标准阳性血清；2号组为布鲁氏菌临床阳性血清；3号组为新孢子虫病标准阳性血清；4号组为新孢子虫临床阴性血清；图中虚线表示间接ELISA判定标准。

具体实施方式

A试剂盒的构建

1方法

1.1DNA模板的提取

取抗凝全血200μL，置于1.5mL离心管中。加入450μL的红细胞裂解液(10mmoL/L Tris-Cl，1mmoL/L EDTA，1mg/L SDS，pH8.0)颠倒混匀，4℃放置30min，12000r/min离心10min，弃上清，重复此步骤，直至沉淀为白色。加入300μL提取液(20mmoL/L Tris-Cl，pH7.6)，1.5μL蛋白酶K(0.1mg/ml)，悬浮沉淀，颠倒混匀后，55℃水浴3h。加入100μL异丙醇，充分混合，12000r/min离心5min，弃上清。加入75％乙醇500μL，12000r/min离心5min，弃上清。干燥后，加入灭菌TE水30μL，10mg/L琼脂糖凝胶电泳检测其提取效果，-20℃保存。

1.2新孢子虫NcSRS2基因的扩增

PCR反应体系包括：0.08μg/μL模板DNA，0.2mmoL/L引物，200mmoL/LdNTP，10mmoL/L Tris-HCl(pH 8.8)，2mmoL/L(NH₄)₂SO₄，50mmoL/L KCL，0.4U/μL Taq DNA Polymerase。

反应条件如下：94℃预变性4min；94℃变性40s、68℃退火1min、72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。用10mg/L琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。按胶回收试剂盒说明进行回收。克隆入PMD18-T载体中。将获得的克隆产物pMD18-T-NcSRS2转入大肠杆菌表达菌株DH5α中，由上海生物公司测序。

1.3pGEX-4T-NcSRS2重组质粒构建

参照碱裂解法提取质粒，用BamH I和Xho I分别双酶切pGEX-4T-2质粒和pMD18-T-NcSRS2，电泳胶回收目的片断。然后T4 DNA连结酶连接pGEX-4T-2与目的片断，并将连接产物转入大肠杆菌BL21，筛选获得pGEX-4T-NcSRS2。酶切鉴定重组质粒后将正确构建的重组质粒转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中。

1.4诱导时间与诱导浓度的影响分析

挑取单菌落至10mL LB培养基中，200r/min培养12h。按1∶100接入8个100mL LB培养基中，振荡培养至菌液OD₆₀₀＝0.4。分别加终浓度为0，0.08，0.1，0.3，0.5，0.8，1，1.5mmoL/L的IPTG。分别于诱导后1、2、3、4、5、6、7h各吸取培养液10mL，5000r/min离心10min，尽弃上清，称量菌体湿重。取适量湿菌按1∶15加入2×SDS-PAGE加样缓冲液(g/v)混匀，沸水浴5min，12000r/min离心15min。-20℃保存备用。

1.5表达产物的SDS-PAGE检测

配制12％的聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE分析。用微量进样器分别取各蛋白样10μL加入凝胶点样孔中，以8V/cm电压电泳，当溴酚蓝前沿进入分离胶后，换16V/cm电压电泳。溴酚蓝至分离胶底部后，取出凝胶，进行考马斯亮蓝染色、脱色，至条带清晰。

1.6蛋白表达量的测定

用Quantity One软件分析蛋白样和电泳图谱，得到总蛋白含量和GST-NcSRS2蛋白含量。

1.7Western blotting分析

表达蛋白经SDS-PAGE分离并电转移至硝酸纤维素膜。以5g/L脱脂奶粉封闭2h，加入1∶1000稀释后的新孢子虫阳性血清，室温反应2h，PBS洗3次。加入1∶2000稀释后的酶标二抗，室温反应1h，PBS洗涤3次，最后加底物DAB显色并拍照。

1.8GST-NcSRS2包涵体蛋白的纯化

1.8.1蛋白的诱导与包涵体的洗涤

500mL菌液的沉淀加入20mLPBS吹匀，5000r/min，4℃，离心10min，弃上清，该步骤重复2次。称量湿菌重，每克湿重加入6mLTNE缓冲液(50mMTris-Cl，100mM NaCl，2mM EDTA，PH8.0)，用枪头吹打，使菌体悬起。加入PMSF和溶菌酶，使其浓度分别达到0.15mM和1mg/mL，冰浴超声30min，5000r/min，4℃，离心10min。称量湿重，每克湿重加入30mL包涵体洗涤液(0.5％Tritron-X100，100mMTris-Cl，5mM DTT，PH7.0)，冰浴30min，期间间断性的用20mL注射器吹打混匀，5000r/min，4℃，离心15min，弃上清，该步骤重复二次。加入同样体积的不含Tritron-X100的包涵体洗涤液，洗涤一次，5000r/min，4℃，离心15min，弃上清，得沉淀。称量包涵体湿重，按0.05g分装入1.5ml的离心管中，放于-20℃保存备用。

1.8.2包涵体的溶解与再折叠

取出一支分装有包涵体的离心管加入1ml U缓冲液(8M Urea，50mMTris-Cl，2mM EDTA，5mM DTT，0.15mM PMSF，PH8.0)。吹打悬浮，冰浴2h，4℃，12000r/min，离心15min。将上清移至50ml离心管中，逐滴加入复性缓冲液(10％甘油，50mMTris-Cl，1mM EDTA，2mM GSH，2mM GSSG 0.15mM PMSF，PH8.0)，并缓慢搅拌，至体积20ml。将蛋白液注入处理过的透析袋中，密封后，置于100倍的PBS缓冲液中透析36h，每12h换一次透析液。将透析袋埋入PEG20000中1h，取出透析袋，用蒸馏水，冲洗干净透析袋。倒出袋内的蛋白液，12000r/min，4℃离心15min，取上清，配制12％的聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE分析，并分析蛋白含量。

1.8.3目的蛋白的过柱纯化

用10倍介质体积PBS缓冲液平衡介质。每毫升介质加入10mL复性后的蛋白液，放于摇床上缓慢摇动3h，令其吸附蛋白。加入10倍介质体积PBS过柱，洗去层析柱中剩余上样液并重新平衡介质。加入5倍介质体积洗脱缓冲液(10mMGlutathione，50mM Tris-HCl，pH8.0)，放于摇床上缓慢摇动1h，收集洗脱液。SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度将蛋白置于-20℃保存。

1.8.4蛋白的SDS-PAGE检测

详细方法，参考《分子克隆实验指南》进行。

1.8.5GST-P43重组蛋白rELISA诊断方法的建立

1.8.5.1抗原最适包被浓度和二抗最适稀释度的确定

按方阵滴定法，用碳酸盐包被液将GST-P43蛋白依次稀释为0.5μg/mL、1μg/mL、3μg/mL、5μg/mL、7μg/mL、9μg/mL。每孔100μL包被酶联板孔，4℃过夜。酶标二抗分别做1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶12000稀释。按rELISA一般操作步骤进行。

1.8.5.2血清最适稀释度的确定

重组抗原稀释至7μg/ml，酶标二抗稀释为1∶4000。新孢子虫阳性、阴性血清稀释为1∶50、1∶100、1∶200、1∶400共4个梯度，每孔重复两次。

1.8.5.3最适封闭液的选择

将抗原、一抗血清和酶标二抗分别按确定的最佳浓度稀释。分别用1％BSA、3％脱脂奶粉、0.5％脱脂奶粉、1％明胶、蔗糖+PEG20000做封闭液。

1.8.5.4封闭时间的优化

加入封闭液，分别在37℃温箱中封闭30min、1h、1.5h、2h。P/N值最大时，确定为最佳封闭时间。

1.8.5.5抗原和血清反应时间的优化

加入稀释后的血清，分别在37℃温箱中反应30min、1h、1.5h、2h。P/N值最大时，确定为最佳反应时间。

1.8.5.6显色时间的优化

加入显色液，分别在37℃温箱中反应10min、15min、20min、25min、30min，加入终止液。P/N值最大的确定为最佳的显色时间。

1.8.5.7特异性检测与临界值的确定

应用上述建立好的rELISA方法分别对弓形虫病标准阳性血清、新孢子虫病标准阳性血清、布鲁氏菌临床阳性血清、新孢子虫临床阴性血清、新孢子虫临床阳性血清，进行检测。并对79份健康牛血清进行检测，应用SPSS软件分析结果，确定临界值。

1.8.5.8重复性试验

(1)批内重复性试验用同一批制备的重组抗原包被酶标板，取1份阳性血清和5份阴性血清，每份血清平行测6孔。在同一时间同次试验中按优化好的rELISA操作程序进行操作，对结果进行统计学分析。

(2)批间重复性试验用同一批制备的重组抗原包被6块酶标板，取1份阳性血清和5份阴性血清，按优化好的rELISA操作程序进行操作，对结果进行统计学分析。

2实验结果

2.1新孢子虫NcSRS2基因的扩增结果

经电泳检测，模板提取结果，见图3；新孢子虫NcSRS2基因的扩增产物，与预期片段相一致；同源性为98.68％，未发生移码突变，插入方向和位置与预期结果一致。

2.2重组表达载体pGEX-4T-NcSRS2的筛选与鉴定结果

从pMD18-T-NcSRS2质粒中酶切下的NcSRS2基因，亚克隆到表达载体pGEX-4T-2中，获得了重组质粒pGEX-4T-NcSRS2，酶切鉴定结果，见图5。

2.3GST-NcSRS2蛋白的SDS-PAGE检测

阳性重组质粒表达菌在37℃条件下，经终浓度为1mmoL/L的IPTG诱导表达4h后，在62.2ku处出现一条特异性蛋白条带，与预期的融合蛋白大小一致。未经诱导的pGEX-4T-NcSRS2和pGEX-4T-2菌无上述特异性条带，见图6。

2.4表达条件的优化及可溶性检测结果

用Quantity One软件分析优化条件所得曲线，37℃时，随诱导时间的增加，蛋白表达量逐渐增大；当IPTG浓度为0.5mmol/L时，诱导4h时蛋白表达量最高；继续诱导后，蛋白表达量呈下降趋势，见图7。电泳样品液中目的蛋白含量为7.6μg/10μL，见图8。

2.5Western Blotting鉴定结果

经Western blot试验显示，表达蛋白可被新孢子虫阳性血清所识别，显色后出现清晰条带。而用新孢子虫阴性血清呈阴性反应，见图9。

2.6重组蛋白GST-NcSRS2蛋白纯化效果

原核表达后，在50-90kDa之间出现新增蛋白条带，分析后为包涵体形式。经洗涤复性后，目的蛋白纯度为87％。再经Glutathione Sepharose 4B过柱纯化后，出现单一的目的条带，经测定蛋白浓度为220μg/mL，见图10。

2.7P43重组蛋白rELISA诊断方法的优化结果

2.7.1抗原最适包被浓度和二抗最适稀释度优化结果，见表1。

表1抗原最适包被浓度和二抗最适稀释度优化结果

注：+表示阳性血清；-表示阴性血清；P/N表示阳性血清OD_450/630值/阴性血清OD_450/630值

由上表得知，随着抗原包被浓度的减少、酶标二抗稀释倍数的增大，OD_450/630值不断变小。当抗原的稀释倍数为7μg/mL，酶标二抗的稀释倍数为1∶4000，阴阳性血清的稀释倍数为1∶100时，阳性血清OD_450/630值为0.341，阴性值为0.141，此时P/N值最高；确定最佳的抗原包被浓度为7μg/mL，二抗的稀释倍数为1∶4000。

2.7.2血清稀释度的优化结果的验证：

随着血清稀释度的增大，OD_450/630值不断变小。但是P/N值在血清稀释度为1∶100时最大，所以选择该稀释度为最佳血清稀释度。

2.7.3最适封闭液的选择结果的验证：

P/N值在使用0.5％脂奶粉最大，所以选择该封闭液为最佳封闭液。

2.7.4封闭时间的优化结果，见表2。

表2封闭时间优化结果

由上表得知：P/N值在封闭1h后最大，所以选择该封闭时间为最佳时间。

2.7.5抗原和血清反应时间的优化结果，见表3。

表3抗原和血清反应时间优化结果

由上表得知：抗原与血清作用在反应1h后P/N值最大，所以选择该封闭时间为最佳反应时间。

2.7.6二抗反应时间的优化结果，见表4。

表4二抗反应时间优化结果

由上表得知：酶标二抗在反应1h后P/N值最大，所以选择该封闭时间为最佳反应时间。

2.7.7显色时间的优化结果

显色15-25min P/N值最大，并且较为稳定，所以选择显色25min为最佳显色时间。

2.7.8特异性试验结果与间接ELISA法临界值的确定

见图11所示：建立的rELISA方法检测弓形虫病标准阳性血清、布鲁氏菌临床阳性血清与新孢子虫阴性血清未引起OD_450/630值的升高，说明复性后的GST-P43蛋白，抗原位点折叠正确，所建立的rELISA方法能够特异性的检测出新孢子虫病。

2.7.9重复性试验结果

2.7.9.1批内重复性试验结果，见表5。

表5批内重复性试验结果

由上表得知：其变异系数在1.809％～6.794％之间，小于10％，说明同一样品在同一批试验中变异程度很小，具有较好的重复性。

2.7.9.2批间重复性试验结果，见表6。

表6批间重复性试验结果

由上表得知：其变异系数在1.208％～6.226％之间，小于10％。说明同一样品在不同批次抗原试验中变异程度很小，具有较好的重复性。

B试剂盒的使用

一、样品处置：

血清：室温下自然凝固10-20分钟，离心20-25分钟(2000-3000转/分)后收集上清，如出现沉淀，应再次离心；测样不能含叠氮钠(NaN₃)，因为叠氮钠(NaN₃)是辣根过氧化物酶(HRP)的抑制剂；提取后若不能立即试验时，放于-20℃保存，避免反复冻融；测样品应充分离心，不得有溶血及颗粒。

二、新孢子虫病rELISA抗体检测试剂盒的使用说明

(1)试剂盒中的试剂应置于4℃保存，稀释后的血清及ELISA板条应置于-20℃保存，但使用前保证达到室温，使用后立即冷藏保存；

(2)防治微生物的污染，因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果；

(3)实验中不同批号的试剂不要混用，在保质期内使用；

(4)吸取试剂严格遵守给定的孵育时间和温度，在吸取标准血清，酶结合物或底物时，第一个孔与最后一个孔加样时间不易太长，导致不同的“预孵育”时间，影响其测量值的准确性及重复性；

(5)一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，使用多道移液器加样即可；

(6)检测盒保质期为6个月。

三、新孢子虫病rELISA抗体检测试剂盒的临床应用

采集疑似病区流产奶牛/牦牛血样1329头，应用重组GST-tNcSRS2抗原进行疑似病畜血清学调查，结果见表7。

表7重组抗原GST-tNcSRS2对牛血清新孢子虫抗体的检测

四、新孢子虫病临床检测与对比试验结果

采用美国IDEXX N.caninum Antibody Test kit试剂盒与重组

GST-NcSRS2蛋白rELISA检测结果对比，见表8。

表8新孢子虫病临床检测与对比试验结果

由上表所知：巴伦台镇牦牛牦牛阳性率为3％-4.6％，博乐市郊区奶牛阳性率为21.2-25％；重组GST-NcSRS2抗原的检出率与商品化试剂盒对比，其符合率为97.5％。

Claims (8)

1.一种新孢子虫病rELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：根据GenBank中的新孢子虫NcSRS2基因序列设计一对引物，引入酶切位点，截去NcSRS2蛋白的信号肽区，从新疆地方奶牛阳性血清中提取DNA；通过PCR扩增了长约975bp的tNcSRS2基因片段，克隆到pMD-18-T载体上，酶切并测序鉴定；然后将目的片段进一步定向连接到pGEX-4T-2表达载体，转化到大肠杆菌中，诱导表达、纯化；表达融合蛋白的分子量约为62kDa；用于ELISA包被抗原，获取rELISA抗体检测试剂盒，其试剂盒的使用；

操作步骤如下：

(1)取出酶标反应板，甩去板内的包被缓冲液，用移液器向每个微量孔中加200μL洗涤缓冲液，室温静置2分钟，然后甩出板中的液体，重复上步洗涤过程两次即可；

(2)封闭：每孔加入200μL自配的0.5％的脱脂乳，置于37℃生化培养箱中培养1小时待用；

(3)洗涤：用移液器向每个微量孔中加200μL洗涤缓冲液，室温静置2分钟，然后甩出板中的液体，重复上步洗涤过程两次即可；

(4)检测样品：将待检血清样用稀释缓冲液按1∶100稀释，加入酶标反应板中，每孔100μL；同时加入标准阳性血清和标准阴性血清；置于37℃生化培养箱中培养1小时待用；

(5)第三次洗涤：同步骤(3)；

(6)加二抗：将辣根过氧化物酶标记羊抗牛IgG抗体用稀释缓冲液进行1∶4000稀释，加入酶标反应板中，每孔100μL，置于37℃生化培养箱中培养1小时待用；

(7)第四次洗涤：同步骤(3)；

(8)显色：在各反应孔中加入配制的TMB溶液100μL，置于37℃生化培养箱中培养25min，在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，在酸的作用下转化成最终显黄色，颜色的深浅与样品的血清阳性强度呈正相关。

(9)终止反应：在各反应孔中加入2M硫酸50μL，即为反应终止；

(10)用酶标仪在450nm、630nm双波长处测定吸光度(OD值)，读OD_450/630nm值，判定其结果。

其关键数据的控制：抗原的包被浓度为7μg/mL，其反应时间为1h；封闭液为0.5％的脱脂奶粉，其封闭时间为1h；血清的稀释倍数为1∶100，其反应时间为1h；二抗稀释倍数为1∶4000，其反应时间为1h；显色时间为25min；包被缓冲液为0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液，洗涤液和稀释液均为PBST(pH7.4PBS+0.05％吐温20)，封闭液为0.05％脱脂乳(PBST+0.05％脱脂乳)。

2.根据权利要求1所述的抗体检测试剂盒，其特征在于：选用的标准阳性血清为新孢子虫病临床阳性血清，经美国IDEXX试剂盒测定，由本实验室保存。

3.根据权利要求1所述的抗体检测试剂盒，其特征在于：选用的标准阴性血清为新孢子虫病临床阴性血清，经美国IDEXX试剂盒测定，由本实验室保存。

4.根据权利要求1所述的抗体检测试剂盒，其特征在于：选用的辣根过氧化物酶标记羊抗牛IgG抗体购自美国的BETHYL公司。

5.根据权利要求1所述的抗体检测试剂盒，其特征在于：选用的pMD-18-T载体购自大连的TaKaRa公司。

6.根据权利要求1所述的抗体检测试剂盒，其特征在于：结果是当OD_450/630值≥0.170时，判定为阳性；当OD_450/630值＜0.121时，判定为阴性；当0.121≤OD_450/630值＜0.17时，判定为疑似阳性；判定为疑似阳性需重新检测，检测仍为疑似阳性时，判定为阳性。

7.根据权利要求1所述的抗体检测试剂盒，其特征在于：检测盒也适用于反刍动物的血清和血浆中的犬新孢子虫抗体的酶联免疫检测。

8.根据权利要求1所述的抗体检测试剂盒，其特征在于：检测盒配制的试剂及材料均为市售产品。

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