CN110938127A - 一种米氏肉孢子虫抗原、编码基因、重组抗原、间接elisa抗体检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种米氏肉孢子虫抗原、编码基因、重组抗原、间接ELISA抗体检测试剂盒及其应用，属于动物疫病检测技术领域。本发明的米氏肉孢子虫抗原为表面抗原SAG3，其编码基因来自首次通过RT‑PCR和分子克隆技术从米氏肉孢子虫孢子囊中克隆得到的完整的SAG3表面抗原基因，开放阅读框序列长度为849bp，编码282个氨基酸。本发明的米氏肉孢子虫抗原具有很强的抗原性和特异性，作为检测抗原能与米氏肉孢子虫抗体发生有效的抗原抗体反应，而不能与刚地弓形虫和犬新孢子虫阳性血清产生交叉免疫反应，是检测米氏肉孢子虫抗体的理想抗原，具有良好的应用前景。

Description

一种米氏肉孢子虫抗原、编码基因、重组抗原、间接ELISA抗体 检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种米氏肉孢子虫抗原，编码该抗原的基因以及该编码基因在原核表达系统中表达的重组抗原、包含该重组抗原的间接ELISA抗体检测试剂盒及其应用，属于动物疫病检测技术领域。

背景技术

肉孢子虫病是一种重要的食源性人兽共患寄生虫病。肉孢子虫的无性生殖阶段主要寄生于中间宿主各脏器血管内皮细胞内、横纹肌和心肌的肌纤维内和中枢神经系统，有性生殖阶段主要寄生于终末宿主的小肠内。猪等动物感染率较高，米氏肉孢子虫(Sarcocystis miescheriana)是猪的优势虫种和高致病性虫种。患病动物主要表现发热、贫血、消瘦、运动和呼吸困难、母畜流产，严重的出现死亡等症状，给猪场造成巨大经济损失。所以建立快速准确的生前检测方法对猪肉孢子虫病防控具有重要的指导意义。

目前，国内外还没有肉孢子虫商品化检测试剂盒。国内肖炳南等曾建立了家畜肉孢子虫间接ELISA抗体检测试剂盒；国外也有报道建立了间接血凝、间接免疫荧光抗体试验等方法。但是这些方法共同的缺点是检测抗原均是直接提取包囊中慢殖子的自然抗原，导致检测抗原不能批量化生产，成本太高，严重影响其商品化推广。另外，肉孢子虫的自然抗原包含保守的蛋白，建立的检测方法容易和弓形虫等病原抗体产生交叉免疫反应，导致检测结果不准确。因此，通过分子生物学技术筛选出肉孢子虫特异的抗原基因，经体外表达获得重组蛋白，将为建立动物肉孢子虫病特异性抗体的ELISA检测试剂盒提供理想的检测抗原。

已有文献报道，神经肉孢子虫的表面抗原SAG3基因在子孢子和裂殖子等入侵阶段高水平表达，属于阶段特异性蛋白，在虫体入侵过程中发挥关键作用。然而目前米氏肉孢子虫的表面抗原SAG3基因序列克隆、表达和应用开发尚未见研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种灵敏度高、特异性强的检测米氏肉孢子虫抗体的抗原。

本发明还提供一种编码上述米氏肉孢子虫抗原的基因。

本发明还提供一种包含上述编码基因的重组表达载体。

本发明还提供一种将上述重组表达载体转化到大肠杆菌工程菌中得到的重组菌。

本发明还提供一种由上述重组菌表达的重组抗原。

本发明还提供一种包含上述米氏肉孢子虫抗原或重组抗原的间接ELISA抗体检测试剂盒。

本发明还提供一种上述米氏肉孢子虫抗原、重组抗原或间接ELISA抗体检测试剂盒在检测动物米氏肉孢子虫感染方面的应用。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

一种米氏肉孢子虫抗原，具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

本发明的米氏肉孢子虫抗原为表面抗原SAG3，与神经肉孢子虫等其他肉孢子虫的表面抗原的氨基酸序列相似性为90.1％-95.4％，与弓形虫和新孢子虫相关表面抗原的氨基酸序列相似性在40％以下，说明米氏肉孢子虫的表面抗原SAG3作为检测抗原，与弓形虫和新孢子虫抗体发生交叉免疫反应的几率比较低。因此，该蛋白抗原可以作为米氏肉孢子虫特异的检测抗原，用于检测米氏肉孢子虫的特异抗体。

编码基因，为编码上述米氏肉孢子虫抗原的基因，具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

本发明的编码基因为米氏肉孢子虫的表面抗原SAG3基因，来自首次通过RT-PCR和分子克隆技术从米氏肉孢子虫孢子囊中克隆得到的米氏肉孢子虫完整的SAG3表面抗原基因，开放阅读框序列长度为849bp，编码282个氨基酸。生物信息学分析结果表明，该基因编码的蛋白抗原指数高、亲水性较强(如图1所示)，适用于体外表达获得重组蛋白。

重组表达载体，为包含有上述编码米氏肉孢子虫抗原的基因的重组表达载体。所述重组表达载体的制备方法为：将编码米氏肉孢子虫抗原的基因(即米氏肉孢子虫表面抗原SAG3编码区，如SEQ ID NO.2所示)克隆到原核表达载体中得到。原核表达载体可选择常用的原核表达载体，如pET28a。

重组菌，为将上述重组表达载体转化到大肠杆菌工程菌中得到的重组菌。所述重组菌的制备方法为：将克隆有编码上述米氏肉孢子虫抗原的基因(即米氏肉孢子虫表面抗原SAG3编码区，如SEQ ID NO.2所示)的重组表达载体导入宿主细菌中得到。宿主细菌可选择常用的含原核表达系统的细菌，如BL21大肠杆菌工程菌。

重组抗原，为由上述重组菌诱导表达得到的可溶性抗原和包涵体抗原。所述重组抗原的制备方法为：诱导上述重组菌原核表达，包涵体抗原用尿素变性缓冲液溶解处理，用Ni²⁺-NTA层析柱纯化得到可溶性抗原。

具体的，所述重组抗原的制备方法，包括以下步骤：将米氏肉孢子虫表面抗原SAG3编码区克隆到原核表达载体(如pET28a)中，得到重组表达载体(pET28-SmSAG3)；然后导入含原核表达系统的宿主细菌(如BL21大肠杆菌工程菌)中，进行体外诱导高效表达，得到重组抗原rSmSAG3，分子量约为29kDa(如图3所示)。

本发明的重组抗原为米氏肉孢子虫的表面抗原SAG3基因在原核表达系统中表达的可溶性抗原和包涵体抗原。试验证明，将上述由重组表达载体构建的重组菌进行体外诱导表达，然后将表达纯化的重组抗原rSmSAG3包被96孔板，分别与米氏肉孢子虫阳性血清、弓形虫和新孢子虫阳性血清进行间接ELISA抗体检测，发现可溶性抗原rSmSAG3与米氏肉孢子虫阳性血清呈阳性反应，而与弓形虫和新孢子虫阳性血清呈阴性反应，说明可溶性抗原rSmSAG3作为检测抗原具有良好的特异性和灵敏性，是一种理想的米氏肉孢子检测抗原。

试剂盒，为包含有上述米氏肉孢子虫抗原或重组抗原的间接ELISA抗体检测试剂盒。所述试剂盒中米氏肉孢子虫抗原或重组抗原包被在固相载体上，可用于间接ELISA抗体检测。除上述组分外，试剂盒中还包含阳性对照血清(重组抗原rSmSAG3加强免疫兔血清作为阳性血清)、阴性对照血清(SPF兔血清)、酶标二抗(HRP-羊抗兔二抗)、稀释液(PBST溶液)等。

上述米氏肉孢子虫抗原、重组抗原或间接ELISA抗体检测试剂盒在检测动物米氏肉孢子虫感染方面的应用。

本发明的米氏肉孢子虫抗原(或重组抗原)具有很强的抗原性和特异性，作为检测抗原能与米氏肉孢子虫抗体发生有效的抗原抗体反应，而不能与刚地弓形虫和犬新孢子虫阳性血清产生交叉免疫反应，是检测猪米氏肉孢子虫抗体的理想抗原，可用于制备间接ELISA抗体检测试剂盒，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为试验例中米氏肉孢子虫的表面抗原SAG3的抗原特性分析；

图2为试验例中米氏肉孢子虫SAG3基因RT-PCR扩增结果；

图3为试验例中米氏肉孢子虫重组抗原rSmSAG3的SDS-PAGE电泳分析结果；

图4为试验例中米氏肉孢子虫重组抗原rSmSAG3的免疫印迹分析结果。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。除特殊说明外，各实施例及试验例中所用设备和试剂均可从商业途径购买得到。

实施例1

本实施例中米氏肉孢子虫抗原具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

实施例2

本实施例中编码米氏肉孢子虫抗原(如SEQ ID NO.1所示)的基因具有如SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列。该序列为首次通过RT-PCR和分子克隆技术从米氏肉孢子虫孢子囊中克隆得到的米氏肉孢子虫完整的SAG3表面抗原基因，开放阅读框序列长度为849bp，编码282个氨基酸。

实施例3

本实施例的重组表达载体包含有实施例2中编码米氏肉孢子虫抗原的基因序列(如SEQ ID NO.2所示)。重组表达载体的制备方法为：将编码米氏肉孢子虫抗原的基因克隆到原核表达载体pET28a中，构建重组表达载体pET28-SmSAG3，具体操作参见试验例2。

实施例4

本实施例的重组菌由实施例3的重组表达载体转化到大肠杆菌工程菌中得到，制备方法为：将克隆有编码米氏肉孢子虫抗原的基因(如SEQ ID NO.2所示)的重组表达载体pET28-SmSAG3导入BL21大肠杆菌工程菌中，得到重组菌，具体操作参见试验例2。

实施例5

本实施例的重组抗原由实施例4的重组菌诱导表达后，经变性溶解、纯化和复性得到，制备方法为：将米氏肉孢子虫表面抗原SAG3编码区(如SEQ ID NO.2所示)克隆到原核表达载体pET28a中，得到重组表达载体pET28-SmSAG3；然后导入BL21大肠杆菌工程菌中，进行体外诱导高效表达，得到重组抗原rSmSAG3，变性溶解，纯化和复性即可；具体操作参见试验例2-3。

实施例6

本实施例中间接ELISA抗体检测试剂盒，包含实施例5的重组抗原，重组抗原被包被在聚苯乙烯96孔板U形孔底部，试剂盒中还包含阳性对照血清(重组抗原rSmSAG3加强免疫兔血清作为阳性血清)、阴性对照血清(SPF兔血清)、酶标二抗(HRP-羊抗兔二抗)、稀释液(PBST溶液)等。

实施例7

本实施例中重组抗原rSmSAG3或间接ELISA抗体检测试剂盒在检测动物肉孢子虫感染(如猪米氏肉孢子虫感染)方面的应用，具体操作参见试验例4。

试验例

1、米氏肉孢子虫SAG3基因的克隆

用米氏肉孢子虫包囊阳性新鲜猪肉饲喂无肉孢子虫犬，然后用饱和蔗糖溶液漂浮法收集犬粪便米氏肉孢子虫卵囊或孢子囊。用TransZol Up Plus RNAkit(ER501-01，北京全式金生物技术有限公司)提取肉孢子虫卵囊/孢子囊的总RNA，用反转录酶(AT301-02，北京全式金生物技术有限公司)合成第一条cDNA链；然后用已发表的神经肉孢子虫SAG3的保守引物，进行PCR扩增，PCR产物经连接、转化和菌落PCR鉴定，克隆到pEASY-T1克隆载体(CT101-01，北京全式金生物技术有限公司)上，进行双向测序。最后成功克隆到米氏肉孢子虫的SAG3基因编码区序列，米氏肉孢子虫的SAG3开放阅读框序列长度为849bp(如图2所示，图中1-2：米氏肉孢子虫的SAG3；M：DL2000 plus marker)，蛋白质序列长度为282个氨基酸(如图1所示)。扩增SAG3的保守引物序列为：

SnSAG3Fext：5’-TCAAGGACGTTTTTCCTGT-3’(如SEQ ID NO.3所示)；

SnSAG3Rext：5’-CTCTGCATGCTGCAATGAAT-3’(如SEQ ID NO.4所示)。

上述引物位于SAG3编码区上、下游转录表达调控区，不位于编码区。

2、米氏肉孢子虫表面抗原SAG3基因的体外表达

首先通过引物设计将BamH I和Not I酶切位点加到米氏肉孢子虫表面抗原SAG3编码区两端，然后用BamH I和Not I(R0136V，R0189V，NEB(北京)有限公司)酶切含酶切位点的SAG3编码区序列和原核表达载体pET28a，切胶回收后通过连接、转化、菌落PCR和双酶切鉴定，获得重组表达载体pET28-SmSAG3。

热激法将pET28-SmSAG3转化到感受态细胞大肠杆菌工程菌BL21菌株中，1mmol/LIPTG诱导表达该抗原，6h后收集菌液，超声破碎菌体离心后，收集上清和沉淀；SDS-PAGE电泳后发现上清和沉淀包涵体中均有重组抗原rSmSAG3存在；蛋白分子量大小约为29kDa(如图3所示，图中1：上清；2：沉淀；M：

I)。

3、Western blotting检测重组抗原rSmSAG3抗原性

首先用8mol/L尿素变性结合缓冲液溶解处理包涵体抗原，然后利用Ni²⁺-NTA层析树脂柱(DP101-01，北京全式金生物技术有限公司)对上清和沉淀包涵体中重组抗原rSmSAG3进行过柱亲和层析纯化，洗脱获得纯化的重组抗原；用紫外分光光度计检测260/280nm的OD值，计算蛋白质浓度；纯化后的重组蛋白用8mol/L尿素变性缓冲液稀释至蛋白终浓度为0.05-0.2mg/mL，装入透析袋在4℃用不同梯度复性缓冲液进行复性，透析复性后的样品高速离心后取上清，测定蛋白浓度，抽滤分装于-20℃保存。然后纯化后的重组抗原rSmSAG3加弗氏不完全佐剂乳化后，皮下接种实验兔2次，间隔2周，心脏采血，10000g离心30min，分离制备rSmSAG3兔多克隆阳性血清。用不接种的SPF实验兔血清作为阴性血清。

重组菌蛋白(即重组抗原rSmSAG3)SDS-PAGE电泳后，用半干湿法将凝胶上的蛋白电转移至NC膜(DP151-06，北京全式金生物技术有限公司)上，加脱脂奶粉封闭液室温封闭2h，TBST缓冲液洗膜后，加兔多克隆阳性血清室温孵育1h，用TBST缓冲液洗膜，然后加HRP标记的羊抗兔二抗(HS101-01，北京全式金生物技术有限公司)室温孵育1h，TBST缓冲液振荡洗膜，最后用DAB显色法检测抗原抗体反应。结果显示，原核表达的重组抗原rSmSAG3能被兔多克隆阳性血清特异性识别(如图4所示，图中1-2：兔阳性血清；3：正常兔血清；M：

I)，不能与不接种兔血清发生抗原抗体反应，说明重组抗原rSmSAG3具有较好的免疫原性和免疫反应性即抗原性，适合作为检测抗原。

4、以重组抗原rSmSAG3为包被抗原建立米氏肉孢子虫间接ELISA抗体检测试剂盒及其效果评价

(1)确定重组抗原rSmSAG3包被浓度、待检血清浓度、HRP-羊抗兔二抗的工作浓度

用试验例2和3中表达纯化的重组抗原rSmSAG3包被96孔板，用rSmSAG3免疫兔的多克隆血清作为待检血清样品，用不接种的SPF实验兔血清作为阴性对照血清，根据P/N值优化和确定包被抗原的包被浓度、待检血清浓度、HRP-羊抗兔二抗工作浓度。结果显示，重组抗原rSmSAG3作为包被抗原的包被浓度为2.5μg/mL，血清稀释倍数为1:50，二抗工作浓度为1:200。

(2)建立米氏肉孢子虫间接ELISA阴阳性判定标准

用重组抗原rSmSAG3免疫兔的多克隆血清为阳性对照血清，共10份；不接种的SPF实验兔血清作为阴性对照血清，共10份，检测450nm/630nm波长处的OD值。结果显示，阴性对照血清的平均OD值为0.130，阳性对照血清的平均OD值为2.178(如下表1所示)。当阴性对照的OD值＜0.2，阳性对照的OD值＞1.0，检测数据才是有效的，否则重新检测。根据公式S/P＝(样本OD值-阴性对照OD值)/(阳性对照OD值-阴性对照OD值)，当S/P≥0.15时，样品为阳性；当0.1≤S/P＜0.15时，样品判定为可疑，需要二次检测；当S/P＜0.1时，样品为阴性。

表1米氏肉孢子虫间接ELISA检测兔血清结果

(3)间接ELISA抗体检测试剂盒特异性检测

除了重组抗原rSmSAG3免疫兔的多克隆血清为阳性对照血清和不接种的SPF实验兔血清作为阴性对照血清外，用米氏肉孢子虫孢子囊破碎抗原二次皮下接种SPF实验兔，制备米氏肉孢子虫阳性血清；用刚地弓形虫和犬新孢子虫速殖子破碎抗原二次皮下接种SPF实验兔，分别制备弓形虫和犬新孢子虫阳性血清。上述血清用来评价米氏肉孢子虫间接ELISA抗体检测试剂盒的特异性，按照优化的条件和浓度进行间接ELISA抗体检测实验操作。结果显示，米氏肉孢子虫孢子囊阳性血清均为阳性，而刚地弓形虫和犬新孢子虫速殖子阳性血清均为阴性(如下表2所示)，说明重组抗原rSmSAG3作为检测抗原，检测肉孢子虫抗体具有良好的特异性。

表2米氏肉孢子虫间接ELISA抗体检测试剂盒的特异性检测结果

通过试验例1-4的研究结果表明，本发明的米氏肉孢子虫重组抗原rSmSAG3具有良好的抗原性和特异性，作为检测抗原能与米氏肉孢子虫抗体发生有效的抗原抗体反应，而不能与刚地弓形虫和犬新孢子虫阳性血清产生交叉免疫反应，说明该抗原是检测米氏肉孢子虫抗体较理想的抗原，可用于猪米氏肉孢子虫特异性抗体的检测。因此，利用该重组抗原rSmSAG3作为检测抗原，可以开发出间接ELISA、间接血凝等方法来检测猪米氏肉孢子虫抗体，作为生前检测的主要手段。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 河南科技大学

<120> 一种米氏肉孢子虫抗原、编码基因、重组抗原、间接ELISA抗体检测试剂盒及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<211> 282

<212> PRT

<213> 米氏肉孢子虫

<221> 米氏肉孢子虫抗原SAG3

<400> 1

MMNNSFLSLA VACLVWAPVH CIAADPPVAT CVSRDDSQTQ TYQLASIGQV RITCPGGTTL 60

ANRGAEQADD GPTAEVYSEA NAGKNVALNT LLIGGTYVRA DANDDLTVSQ LPTNAVTVYF 120

LCNKTGGGGG VGCWIGVQVA AQPPLGPQGC TVGGSEVTLT VTAANATAQF ACAATKNVFP 180

EGTNVYNSDC STETPLSTAL PGATLTRGDM NALRIPTLPA AAKNLCFVCA TNAGDGADQK 240

CSVKINVSGS PGESPNGSVG LTARAASALG IFMLGAALVR NV 282

<211> 849

<212> DNA

<213> 米氏肉孢子虫

<221> 米氏肉孢子虫SAG3表面抗原基因

<400> 2

atgatgaaca actctttcct gtctctggct gttgcttgcc tggtttgggc tccggttcac 60

tgcatcgctg ctgacccgcc ggttgctacc tgcgtttctc gtgacgactc tcagacccag 120

acctaccagc tggcttctat cggtcaggtt cgtatcacct gcccgggtgg taccaccctg 180

gctaaccgtg gtgctgaaca ggctgacgac ggtccgaccg ctgaagttta ctctgaagct 240

aacgctggta aaaacgttgc tctgaacacc ctgctgatcg gtggtaccta cgttcgtgct 300

gacgctaacg acgacctgac cgtttctcag ctgccgacca acgctgttac cgtttacttc 360

ctgtgcaaca aaaccggtgg tggtggtggt gttggttgct ggatcggtgt tcaggttgct 420

gctcagccgc cgctgggtcc gcagggttgc accgttggtg gttctgaagt taccctgacc 480

gttaccgctg ctaacgctac cgctcagttc gcttgcgctg ctaccaaaaa cgttttcccg 540

gaaggtacca acgtttacaa ctctgactgc tctaccgaaa ccccgctgtc taccgctctg 600

ccgggtgcta ccctgacccg tggtgacatg aacgctctgc gtatcccgac cctgccggct 660

gctgctaaaa acctgtgctt cgtttgcgct accaacgctg gtgacggtgc tgaccagaaa 720

tgctctgtta aaatcaacgt ttctggttct ccgggtgaat ctccgaacgg ttctgttggt 780

ctgaccgctc gtgctgcttc tgctctgggt atcttcatgc tgggtgctgc tctggttcgt 840

aacgtttaa 849

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物SnSAG3Fext

<400> 3

tcaaggacgt ttttcctgt 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物SnSAG3Rext

<400> 4

ctctgcatgc tgcaatgaat 20

Claims (10)

1.一种米氏肉孢子虫抗原，其特征在于：所述米氏肉孢子虫抗原具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

2.编码基因，其特征在于：编码如权利要求1中所述的米氏肉孢子虫抗原的基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

4.重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体包含有如权利要求2或3中所述的编码基因。

5.重组菌，其特征在于：所述重组菌由权利要求4中所述重组表达载体转入大肠杆菌工程菌中得到。

6.重组抗原，其特征在于：所述重组抗原由权利要求5中所述重组菌诱导表达得到。

7.根据权利要求6所述的重组抗原，其特征在于：所述重组抗原的制备方法，包括以下步骤：将编码如权利要求1中所述米氏肉孢子虫抗原的基因克隆到原核表达载体中，得到重组表达载体；将重组表达载体导入含原核表达系统的宿主细菌中，进行体外诱导表达，即得。

8.试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含有如权利要求1中所述的米氏肉孢子虫抗原、或者如权利要求6或7中所述的重组抗原。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述米氏肉孢子虫抗原或重组抗原被包被在固相载体上。

10.如权利要求1中所述的米氏肉孢子虫抗原、或者如权利要求6或7中所述的重组抗原、或者如权利要求8或9中所述的试剂盒在检测动物米氏肉孢子虫感染方面的应用。

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