CN110903373A - 一种枯氏肉孢子虫抗原、编码基因、重组抗原、间接elisa抗体检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种枯氏肉孢子虫抗原、编码基因、重组抗原、间接elisa抗体检测试剂盒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110903373A
CN110903373A CN201911302589.XA CN201911302589A CN110903373A CN 110903373 A CN110903373 A CN 110903373A CN 201911302589 A CN201911302589 A CN 201911302589A CN 110903373 A CN110903373 A CN 110903373A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antigen
sarcocystis
cumingii
recombinant
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201911302589.XA
Other languages
English (en)
Inventor
闫文朝
韩利方
李小军
钱伟锋
吕超超
王天奇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henan University of Science and Technology
Original Assignee
Henan University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henan University of Science and Technology filed Critical Henan University of Science and Technology
Priority to CN201911302589.XA priority Critical patent/CN110903373A/zh
Publication of CN110903373A publication Critical patent/CN110903373A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种枯氏肉孢子虫抗原、编码基因、重组抗原、间接ELISA抗体检测试剂盒及其应用，属于动物疫病检测技术领域。本发明的枯氏肉孢子虫抗原为表面抗原SAG4，其编码基因来自首次通过RT‑PCR和分子克隆技术从枯氏肉孢子虫孢子囊中克隆得到的完整的SAG4表面抗原基因，开放阅读框序列长度为864bp，编码287个氨基酸。本发明的枯氏肉孢子虫抗原具有很强的抗原性和特异性，作为检测抗原能与枯氏肉孢子虫抗体发生有效的抗原抗体反应，而不能与刚地弓形虫和犬新孢子虫阳性血清产生交叉免疫反应，是检测枯氏肉孢子虫抗体的理想抗原，可用于制备间接ELISA抗体检测试剂盒，具有良好的应用前景。

Description

一种枯氏肉孢子虫抗原、编码基因、重组抗原、间接ELISA抗体 检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及一种枯氏肉孢子虫抗原，编码该抗原的基因以及该编码基因在原核表达系统中表达的重组抗原、包含该重组抗原的间接ELISA抗体检测试剂盒及其应用，属于动物疫病检测技术领域。
背景技术
肉孢子虫病是一种重要的食源性人兽共患寄生虫病。肉孢子虫的无性生殖阶段主要寄生于中间宿主各脏器血管内皮细胞内、横纹肌和心肌的肌纤维内和中枢神经系统，有性生殖阶段主要寄生于终末宿主的小肠内。牛等动物感染率较高，枯氏肉孢子虫(S.cruzi)是牛的优势虫种和高致病性虫种。患病动物主要表现发热、贫血、消瘦、运动和呼吸困难、母畜流产，严重的出现死亡等症状，给牛场造成巨大经济损失。所以建立快速准确的生前检测方法对牛肉孢子虫病防控具有重要的指导意义。
目前，国内外还没有肉孢子虫商品化检测试剂盒。国内肖炳南等曾建立了家畜肉孢子虫间接ELISA抗体检测试剂盒；国外也有报道建立了间接血凝、间接免疫荧光抗体试验等方法。但是这些方法共同的缺点是检测抗原均是直接提取包囊中慢殖子的自然抗原，导致检测抗原不能批量化生产，成本太高，严重影响其商品化推广。另外，肉孢子虫的自然抗原包含保守的蛋白，建立的检测方法容易和弓形虫等病原抗体产生交叉免疫反应，导致检测结果不准确。因此，通过分子生物学技术筛选出肉孢子虫特异的抗原基因，经体外表达获得重组蛋白，将为建立动物肉孢子虫病特异性抗体的ELISA检测试剂盒提供理想的检测抗原。
已有文献报道，神经肉孢子虫的表面抗原SAG4基因在子孢子和裂殖子等入侵阶段高水平表达，属于阶段特异性蛋白，在虫体入侵过程中发挥关键作用。然而目前枯氏肉孢子虫的表面抗原SAG4基因序列克隆、表达和应用开发尚未见研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种灵敏度高、特异性强的检测枯氏肉孢子虫抗体的抗原。
本发明还提供一种编码上述枯氏肉孢子虫抗原的基因。
本发明还提供一种包含上述编码基因的重组表达载体。
本发明还提供一种将上述重组表达载体转化到大肠杆菌工程菌中得到的重组菌。
本发明还提供一种由上述重组菌表达的重组抗原。
本发明还提供一种包含上述枯氏肉孢子虫抗原或重组抗原的间接ELISA抗体检测试剂盒。
本发明还提供一种上述枯氏肉孢子虫抗原、重组抗原或间接ELISA抗体检测试剂盒在检测动物枯氏肉孢子虫感染方面的应用。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
一种枯氏肉孢子虫抗原，具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
本发明的枯氏肉孢子虫抗原为表面抗原SAG4，与神经肉孢子虫等其他肉孢子虫的表面抗原的氨基酸序列相似性为95.1％-96.5％，与弓形虫和新孢子虫相关表面抗原的氨基酸序列相似性在40％以下，说明枯氏肉孢子虫的表面抗原SAG4作为检测抗原，与弓形虫和新孢子虫抗体发生交叉免疫反应的几率比较低。因此，该蛋白抗原可以作为枯氏肉孢子虫特异的检测抗原，用于检测枯氏肉孢子虫等肉孢子虫的特异抗体。
编码基因，为编码上述枯氏肉孢子虫抗原的基因，具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
本发明的编码基因为枯氏肉孢子虫的表面抗原SAG4基因，来自首次通过RT-PCR和分子克隆技术从枯氏肉孢子虫孢子囊中克隆得到的枯氏肉孢子虫完整的SAG4表面抗原基因，开放阅读框序列长度为864bp，编码287个氨基酸。生物信息学分析结果表明，该基因编码的蛋白抗原指数较高、亲水性较强(如图1所示)，适用于体外表达获得重组蛋白。
重组表达载体，为包含有上述编码枯氏肉孢子虫抗原的基因的重组表达载体。所述重组表达载体的制备方法为：将编码枯氏肉孢子虫抗原的基因(即枯氏肉孢子虫表面抗原SAG4编码区，如SEQ ID NO.2所示)克隆到原核表达载体中构建得到。原核表达载体可选择常用的原核表达载体，如pET28a。
重组菌，为将上述重组表达载体转化到大肠杆菌工程菌中得到的重组菌。所述重组菌的制备方法为：将克隆有编码上述枯氏肉孢子虫抗原的基因(即枯氏肉孢子虫表面抗原SAG4编码区，如SEQ ID NO.2所示)的重组表达载体导入宿主细菌中得到。宿主细菌可选择常用的含原核表达系统的细菌，如BL21大肠杆菌工程菌。
重组抗原，为由上述重组菌诱导表达得到的可溶性抗原和包涵体抗原。所述重组抗原的制备方法为：诱导上述重组菌原核表达，包涵体抗原用尿素变性缓冲液溶解处理，用Ni2+-NTA层析柱纯化得到可溶性抗原。
具体的，所述重组抗原的制备方法，包括以下步骤：将枯氏肉孢子虫表面抗原SAG4编码区克隆到原核表达载体(如pET28a)中，得到重组表达载体(pET28-ScSAG4)；然后导入含原核表达系统的宿主细菌(如BL21大肠杆菌工程菌)中，进行体外诱导高效表达，得到大量重组抗原rScSAG4，分子量约为30kDa(如图3所示)。
本发明的重组抗原为枯氏肉孢子虫的表面抗原SAG4基因在原核表达系统中表达的可溶性抗原和包涵体抗原。试验证明，将上述由重组表达载体构建的重组菌进行体外诱导表达，然后将表达纯化的重组抗原rScSAG4包被96孔板，分别与枯氏肉孢子虫阳性血清、弓形虫和新孢子虫阳性血清进行间接ELISA抗体检测试验，结果发现重组抗原rScSAG4与枯氏肉孢子虫阳性血清呈阳性反应，而与弓形虫和新孢子虫阳性血清呈阴性反应，说明重组抗原rScSAG4作为检测抗原具有良好的特异性和灵敏性，是一种理想的枯氏肉孢子虫检测抗原。
试剂盒，为包含有上述枯氏肉孢子虫抗原或重组抗原的间接ELISA抗体检测试剂盒。所述试剂盒中枯氏肉孢子虫抗原或重组抗原包被在固相载体上形成包被抗原，可用于间接ELISA抗体检测。除上述组分外，试剂盒中还包含阳性对照血清(重组抗原rScSAG4加强免疫兔血清作为阳性血清)、阴性对照血清(SPF兔血清)、酶标二抗(HRP-羊抗兔二抗)、稀释液(PBST溶液)等。
上述枯氏肉孢子虫抗原、重组抗原或间接ELISA抗体检测试剂盒在检测动物枯氏肉孢子虫感染方面的应用。
本发明的枯氏肉孢子虫抗原(或重组抗原)具有很强的抗原性和特异性，作为检测抗原能与枯氏肉孢子虫抗体发生有效的抗原抗体反应，而不能与刚地弓形虫和犬新孢子虫阳性血清产生交叉免疫反应，是检测牛枯氏肉孢子虫抗体的理想抗原，可用于制备间接ELISA抗体检测试剂盒，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为试验例中枯氏肉孢子虫的表面抗原SAG4的抗原特性分析；
图2为试验例中枯氏肉孢子虫SAG4基因RT-PCR扩增结果；
图3为试验例中枯氏肉孢子虫重组抗原rScSAG4的SDS-PAGE电泳分析结果；
图4为试验例中枯氏肉孢子虫重组抗原rScSAG4的免疫印迹分析结果。
具体实施方式
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。除特殊说明外，各实施例及试验例中所用设备和试剂均可从商业途径购买得到。
实施例1
本实施例中枯氏肉孢子虫抗原具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
实施例2
本实施例中编码枯氏肉孢子虫抗原(如SEQ ID NO.1所示)的基因具有如SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列。该序列为首次通过RT-PCR和分子克隆技术从枯氏肉孢子虫孢子囊中克隆得到的枯氏肉孢子虫完整的SAG4表面抗原基因，开放阅读框序列长度为864bp，编码287个氨基酸。
实施例3
本实施例的重组表达载体包含有实施例2中编码枯氏肉孢子虫抗原的基因序列(如SEQ ID NO.2所示)。重组表达载体的制备方法为：将编码枯氏肉孢子虫抗原的基因克隆到原核表达载体pET28a中，构建重组表达载体pET28-ScSAG4，具体操作参见试验例2。
实施例4
本实施例的重组菌由实施例3的重组表达载体转化到大肠杆菌工程菌中得到，制备方法为：将克隆有编码枯氏肉孢子虫抗原的基因(如SEQ ID NO.2所示)的重组表达载体pET28-ScSAG4导入BL21大肠杆菌工程菌中，得到重组菌，具体操作参见试验例2。
实施例5
本实施例的重组抗原由实施例4的重组菌诱导表达后，经变性溶解、纯化和复性得到，制备方法为：将枯氏肉孢子虫表面抗原SAG4编码区(如SEQ ID NO.2所示)克隆到原核表达载体pET28a中，得到重组表达载体pET28-ScSAG4；然后导入BL21大肠杆菌工程菌中，进行体外诱导高效表达，得到重组抗原rScSAG4，变性溶解，纯化和复性即可；具体操作参见试验例2-3。
实施例6
本实施例中间接ELISA抗体检测试剂盒，包含实施例5的重组抗原，重组抗原被包被在聚苯乙烯96孔板U形孔底部，试剂盒中还包含阳性对照血清(重组抗原rScSAG4加强免疫兔血清作为阳性血清)、阴性对照血清(SPF兔血清)、酶标二抗(HRP-羊抗兔二抗)、稀释液(PBST溶液)等。
实施例7
本实施例中重组抗原rScSAG4或间接ELISA抗体检测试剂盒在检测牛枯氏肉孢子虫感染方面的应用，具体操作参见试验例4。
试验例
1、枯氏肉孢子虫SAG4基因的克隆
用枯氏肉孢子虫包囊阳性新鲜牛肉饲喂无肉孢子虫犬，然后用饱和蔗糖溶液漂浮法收集犬粪便枯氏肉孢子虫卵囊或孢子囊。用TransZol Up Plus RNAkit(ER501-01，北京全式金生物技术有限公司)提取肉孢子虫卵囊/孢子囊的总RNA，用反转录酶(AT301-02，北京全式金生物技术有限公司)合成第一条cDNA链；然后用已发表的神经肉孢子虫扩增SAG4的保守引物，进行PCR扩增，PCR产物经连接、转化和菌落PCR鉴定，克隆到pEASY-T1克隆载体(CT101-01，北京全式金生物技术有限公司)上，进行双向测序。最后成功克隆到枯氏肉孢子虫的SAG4基因编码区序列，枯氏肉孢子虫的SAG4开放阅读框序列长度为864bp(如图2所示，图中1-2：枯氏肉孢子虫的SAG4；M：DL2000 plus marker)，蛋白质序列长度为287个氨基酸(如图1所示)。扩增SAG4的保守引物序列为：
SnSAG4F：5’-AATACCATACCTCGGCGTCA-3’(如SEQ ID NO.3所示)；
SnSAG4R：5’-TCAAATGGCTGTCTCCACAA-3’(如SEQ ID NO.4所示)。
上述引物位于SAG4编码区上、下游转录表达调控区，不位于编码区。
2、枯氏肉孢子虫表面抗原SAG4基因的体外表达
首先通过引物设计将BamH I和Not I酶切位点加到枯氏肉孢子虫表面抗原SAG4编码区序列两端，然后用BamH I和Not I(R0136V，R0189V，NEB(北京)有限公司)酶切含酶切位点的SAG4编码区序列和原核表达载体pET28a，切胶回收后通过连接、转化、菌落PCR和双酶切鉴定，获得重组表达载体pET28-ScSAG4。
热激法将pET28-ScSAG4转化到感受态细胞大肠杆菌工程菌BL21菌株中，1mmol/LIPTG诱导表达该抗原，收集菌液，超声破碎菌体分别收集上清和沉淀，然后进行SDS-PAGE电泳分析。结果显示，在上清和沉淀包涵体中均有重组抗原rScSAG4，蛋白分子量大小约为30kDa(如图3所示，图中1：阳性菌表达蛋白；2：阴性菌表达蛋白；M：
Figure BDA0002322241010000051
I)。
3、Western blotting检测重组抗原rScSAG4抗原性
首先用8mol/L尿素变性结合缓冲液溶解处理包涵体抗原，然后利用Ni2+-NTA层析柱(DP101-01，北京全式金生物技术有限公司)对上清和沉淀包涵体中重组抗原rScSAG4进行过柱亲和层析纯化，洗脱获得纯化的重组抗原；用紫外分光光度计检测260/280nm的OD值，计算蛋白质浓度；纯化后的重组蛋白用8mol/L尿素变性缓冲液稀释至蛋白终浓度为0.05-0.2mg/mL，装入透析袋在4℃用不同梯度复性缓冲液进行复性，透析复性后的样品高速离心后取上清，测定蛋白浓度，抽滤分装于-70℃保存。然后纯化后的重组抗原rScSAG4加弗氏不完全佐剂乳化后，皮下接种实验兔2次，间隔2周，心脏采血，10000g离心30min，分离制备rScSAG4兔多克隆阳性血清。用不接种的SPF实验兔血清作为阴性血清。
重组菌蛋白(即重组抗原rScSAG4)SDS-PAGE电泳后，用半干湿法将凝胶上的蛋白电转移至NC膜(DP151-06，北京全式金生物技术有限公司)上，加脱脂奶粉封闭液室温封闭2h，TPBST缓冲液洗膜后，加兔多克隆阳性血清室温孵育1h，用TBST缓冲液洗膜，然后加HRP标记的羊抗兔二抗(HS101-01，北京全式金生物技术有限公司)室温孵育1h，TBST缓冲液振荡洗膜，最后用DAB显色法检测抗原抗体反应。结果显示，原核表达的重组抗原rScSAG4能被兔多克隆阳性血清特异性识别(如图4所示，图中1-2：兔阳性血清；3：正常兔血清；M：
Figure BDA0002322241010000061
I)，不能与不接种兔血清发生抗原抗体反应，说明重组抗原rScSAG4具有较好的免疫原性和免疫反应性即抗原性，适合作为检测抗原。
4、以重组抗原rScSAG4为包被抗原建立枯氏肉孢子虫间接ELISA抗体检测试剂盒及其效果评价
(1)确定重组抗原rScSAG4包被浓度、待检血清浓度、HRP-羊抗兔二抗的工作浓度
用试验例3中表达纯化的重组抗原rScSAG4包被96孔板，用rScSAG4免疫兔的多克隆血清作为待检血清样品，用不接种的SPF实验兔血清作为阴性对照血清，根据P/N值优化和确定包被抗原的包被浓度、待检血清浓度、HRP-羊抗兔二抗工作浓度。结果显示，重组抗原rScSAG4作为包被抗原的包被浓度为2.5μg/mL，血清稀释倍数为1:50，二抗工作浓度为1:200。
(2)建立枯氏肉孢子虫间接ELISA阴阳性判定标准
用重组抗原rScSAG4免疫兔的多克隆血清为阳性对照血清，共10份；不接种的SPF实验兔血清作为阴性对照血清，共10份，检测450nm/630nm波长处的OD值。结果显示，阴性对照血清的平均OD值为0.133，阳性对照血清的平均OD值为2.128(如下表1所示)。当阴性对照的OD值＜0.2，阳性对照的OD值＞1.0，检测数据才是有效的，否则重新检测。根据公式S/P＝(样本OD值-阴性对照OD值)/(阳性对照OD值-阴性对照OD值)，当S/P≥0.15时，样品为阳性；当0.1≤S/P＜0.15时，样品判定为可疑，需要二次检测；当S/P＜0.1时，样品为阴性。
表1枯氏肉孢子虫间接ELISA检测兔血清结果
Figure BDA0002322241010000071
(3)间接ELISA抗体检测试剂盒特异性检测
除了重组抗原rScSAG4免疫兔的多克隆血清为阳性对照血清和不接种的SPF实验兔血清作为阴性对照血清外，用枯氏肉孢子虫孢子囊破碎抗原二次皮下接种SPF实验兔，制备枯氏肉孢子虫阳性血清；用刚地弓形虫和犬新孢子虫速殖子破碎抗原二次皮下接种SPF实验兔，分别制备弓形虫和新孢子虫阳性血清。上述血清用来评价枯氏肉孢子虫间接ELISA抗体检测试剂盒的特异性，按照优化的条件和浓度进行间接ELISA抗体检测实验操作。结果显示，枯氏肉孢子虫孢子囊阳性血清均为阳性，而刚地弓形虫和犬新孢子虫速殖子阳性血清均为阴性(如下表2所示)，说明重组抗原rScSAG4作为诊断抗原，检测枯氏肉孢子虫抗体具有良好的特异性。
表2枯氏肉孢子虫间接ELISA抗体检测试剂盒的特异性检测结果
Figure BDA0002322241010000072
Figure BDA0002322241010000081
通过试验例1-4的研究结果表明，本发明的枯氏肉孢子虫重组抗原rScSAG4具有良好的抗原性和特异性，作为检测抗原能与枯氏肉孢子虫抗体发生有效的抗原抗体反应，而不能与刚地弓形虫和犬新孢子虫阳性血清产生交叉免疫反应，说明该抗原是检测枯氏肉孢子虫抗体较理想的抗原，可用于牛枯氏肉孢子虫特异性抗体的检测。因此，利用该重组抗原rScSAG4作为检测抗原，可以开发出间接ELISA、间接血凝、乳胶凝集等方法来检测牛枯氏肉孢子虫抗体，作为生前检测的主要手段。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110> 河南科技大学
<120> 一种枯氏肉孢子虫抗原、编码基因、重组抗原、间接ELISA抗体检测试剂盒及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<211> 287
<212> PRT
<213> 枯氏肉孢子虫
<221> 枯氏肉孢子虫抗原
<400> 1
MLRATVLRAT LVATAVIYLA GRLQYVVARN PEQATCVLGQ ATAVTEFETF GGLNIVCPQG 60
SALQQVPPAP GAAGGAQGAG YVFSTDQANP QGVVLEQVVP GAIFAVGQNN QPNVLNVAQL 120
PSAPQSIYFL CRPQENEQQT CFIRVNIPAS PPLGPNACVV HNTEVQFKAG ASNATVQFSC 180
GNAAALQPQQ ATKIFDQTCQ QELDLDTVTP GATCQRPAAG GMVTVTFPRL PPQNRKLCFV 240
CTRGQENCKV IIDVAADPAG GAAVGITART ASALGIVVVA AGLLGVY 287
<211> 864
<212> DNA
<213> 枯氏肉孢子虫
<221> 枯氏肉孢子虫SAG4表面抗原基因
<400> 2
atgctgcgtg ctaccgttct gcgtgctacc ctggttgcta ccgctgttat ctacctggct 60
ggtcgtctgc agtacgttgt tgctcgtaac ccggaacagg ctacctgcgt tctgggtcag 120
gctaccgctg ttaccgaatt cgaaaccttc ggtggtctga acatcgtttg cccgcagggt 180
tctgctctgc agcaggttcc gccggctccg ggtgctgctg gtggtgctca gggtgctggt 240
tacgttttct ctaccgacca ggctaacccg cagggtgttg ttctggaaca ggttgttccg 300
ggtgctatct tcgctgttgg tcagaacaac cagccgaacg ttctgaacgt tgctcagctg 360
ccgtctgctc cgcagtctat ctacttcctg tgccgtccgc aggaaaacga acagcagacc 420
tgcttcatcc gtgttaacat cccggcttct ccgccgctgg gtccgaacgc ttgcgttgtt 480
cacaacaccg aagttcagtt caaagctggt gcttctaacg ctaccgttca gttctcttgc 540
ggtaacgctg ctgctctgca gccgcagcag gctaccaaaa tcttcgacca gacctgccag 600
caggaactgg acctggacac cgttaccccg ggtgctacct gccagcgtcc ggctgctggt 660
ggtatggtta ccgttacctt cccgcgtctg ccgccgcaga accgtaaact gtgcttcgtt 720
tgcacccgtg gtcaggaaaa ctgcaaagtt atcatcgacg ttgctgctga cccggctggt 780
ggtgctgctg ttggtatcac cgctcgtacc gcttctgctc tgggtatcgt tgttgttgct 840
gctggtctgc tgggtgttta ctaa 864
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物SnSAG4F
<400> 3
aataccatac ctcggcgtca 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物SnSAG4R
<400> 4
tcaaatggct gtctccacaa 20

Claims (10)

1.一种枯氏肉孢子虫抗原，其特征在于：所述枯氏肉孢子虫抗原具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
2.编码基因，其特征在于：编码如权利要求1中所述的枯氏肉孢子虫抗原的基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
4.重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体包含有如权利要求2或3中所述的编码基因。
5.重组菌，其特征在于：所述重组菌由权利要求4中所述重组表达载体转入大肠杆菌工程菌中得到。
6.重组抗原，其特征在于：所述重组抗原由权利要求5中所述重组菌诱导表达得到。
7.根据权利要求6所述的重组抗原，其特征在于：所述重组抗原的制备方法，包括以下步骤：将编码如权利要求1中所述枯氏肉孢子虫抗原的基因克隆到原核表达载体中，得到重组表达载体；将重组表达载体导入含原核表达系统的宿主细菌中，进行体外诱导表达，即得。
8.试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含有如权利要求1中所述的枯氏肉孢子虫抗原，或者如权利要求6或7中所述的重组抗原。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述枯氏肉孢子虫抗原或重组抗原被包被在固相载体上形成包被抗原。
10.如权利要求1中所述的枯氏肉孢子虫抗原、或者如权利要求6或7中所述的重组抗原、或者如权利要求8或9中所述的试剂盒在检测动物枯氏肉孢子虫感染方面的应用。
CN201911302589.XA 2019-12-17 2019-12-17 一种枯氏肉孢子虫抗原、编码基因、重组抗原、间接elisa抗体检测试剂盒及其应用 Pending CN110903373A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911302589.XA CN110903373A (zh) 2019-12-17 2019-12-17 一种枯氏肉孢子虫抗原、编码基因、重组抗原、间接elisa抗体检测试剂盒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911302589.XA CN110903373A (zh) 2019-12-17 2019-12-17 一种枯氏肉孢子虫抗原、编码基因、重组抗原、间接elisa抗体检测试剂盒及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110903373A true CN110903373A (zh) 2020-03-24

Family

ID=69826129

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911302589.XA Pending CN110903373A (zh) 2019-12-17 2019-12-17 一种枯氏肉孢子虫抗原、编码基因、重组抗原、间接elisa抗体检测试剂盒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110903373A (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040162418A1 (en) * 2003-02-19 2004-08-19 Howe Daniel K. Nucleic acids encoding Sarcocystis neurona antigen and uses thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040162418A1 (en) * 2003-02-19 2004-08-19 Howe Daniel K. Nucleic acids encoding Sarcocystis neurona antigen and uses thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WENDTE,J.M.，等: "surface antigen 4 [Sarcocystis falcatula]", 《GENBANK:ADG26782》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108148138B (zh) 非洲猪瘟病毒多表位融合诊断抗原及其制备方法和用途
CN104650195B (zh) Ev71病毒vp1重组抗原及其单克隆抗体与应用
CN103487582A (zh) 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体竞争 AlphaLISA检测试剂盒及其方法
CN107056898A (zh) 鲤疱疹病毒3型1301株orf136基因重组表达蛋白、抗体及其应用
CN113637056A (zh) 一种用于鉴别牛种布鲁氏菌与其它种布鲁氏菌的试剂盒
CN111647055A (zh) 一种用于新型冠状病毒检测的n蛋白及其制备与应用
CN103499693A (zh) 猪瘟病毒抗体竞争AlphaLISA检测试剂盒及检测方法
CN110564734A (zh) 一种埃及血吸虫重组融合蛋白ShSAP及其在血吸虫病免疫诊断中的应用
CN110642927A (zh) 一种蛋白在制备预防化脓隐秘杆菌感染的药物中的应用
CN113203854B (zh) 用于检测猫冠状病毒抗体的间接elisa试剂盒
CN111621506B (zh) 牛支原体分泌蛋白MbovP0145及其应用
CN108101974B (zh) 肝片吸虫多表位融合诊断抗原及其应用和制备方法
CN110938127B (zh) 米氏肉孢子虫抗原、编码基因、重组抗原、试剂盒及应用
CN110903373A (zh) 一种枯氏肉孢子虫抗原、编码基因、重组抗原、间接elisa抗体检测试剂盒及其应用
CN110627910A (zh) 一种曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP及其在血吸虫病免疫诊断中的应用
CN108265070B (zh) 一种特异性的检测弓形虫的方法
CN102827292B (zh) 一种融合蛋白TgMEP及其制备方法和应用
CN110922491B (zh) 一种肉孢子虫融合抗原、编码基因、间接elisa抗体检测试剂盒及其应用
CN111393510B (zh) 一种非洲猪瘟病毒重组抗原及其应用
CN115772230A (zh) 一种rsv重组抗原、其制备方法及应用
CN110554187B (zh) 一种用于检测牛病毒性腹泻病毒抗体的表达蛋白、elisa试剂盒及其制备方法和应用
WO2015172706A1 (zh) 曼氏血吸虫诊断抗原的筛选与应用
CN114524869B (zh) 弓形虫微线体蛋白MIC17a及其应用
CN116068197B (zh) 一种旋毛虫间接elisa抗体检测试剂盒及其应用
CN101979406B (zh) 南非ⅱ型口蹄疫多抗原表位蛋白、其制备方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: 471023 No. 263 Kaiyuan Road, Luolong District, Henan, Luoyang

Applicant after: HENAN UNIVERSITY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY

Address before: 471003 Xiyuan Road, Jianxi District, Henan, No. 48, No.

Applicant before: HENAN UNIVERSITY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY

RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200324