CN110922491B - 一种肉孢子虫融合抗原、编码基因、间接elisa抗体检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种肉孢子虫融合抗原、编码基因、间接elisa抗体检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种肉孢子虫融合抗原、编码基因、间接ELISA抗体检测试剂盒及其应用，属于动物或人体疫病检测技术领域。本发明的肉孢子虫融合抗原由米氏肉孢子虫的表面抗原SAG3的部分氨基酸序列(第37‑118位)、15个氨基酸的柔性肽和枯氏肉孢子虫的表面抗原SAG4的部分氨基酸序列(第165‑264位)构成；该融合抗原具有很强的抗原性和特异性，作为检测抗原能与米氏肉孢子虫和枯氏肉孢子虫抗体发生有效的抗原抗体反应，而不能与刚地弓形虫和犬新孢子虫阳性血清产生交叉免疫反应，是检测米氏肉孢子虫和枯氏肉孢子虫抗体理想的检测抗原，具有良好的应用前景。

Description

一种肉孢子虫融合抗原、编码基因、间接ELISA抗体检测试剂 盒及其应用
技术领域
本发明涉及一种肉孢子虫融合抗原，编码该融合抗原的基因、包含该融合抗原的间接ELISA抗体检测试剂盒及其应用，属于动物或人体疫病检测技术领域。
背景技术
肉孢子虫病是一种重要的食源性人兽共患寄生虫病。肉孢子虫的无性生殖阶段主要寄生于中间宿主各脏器血管内皮细胞内、横纹肌和心肌的肌纤维内和中枢神经系统，有性生殖阶段主要寄生于终末宿主的小肠内。猪、牛等动物感染率较高，米氏肉孢子虫(Sarcocystis miescheriana)和枯氏肉孢子虫(S.cruzi)分别是猪和牛的优势虫种和高致病性虫种。患病动物主要表现发热、贫血、消瘦、运动和呼吸困难、母畜流产，严重的出现死亡等症状，给猪场和牛场等养殖业造成巨大经济损失。人感染后主要表现发热、嗜酸性粒细胞增多、肌炎、心肌炎、呕吐和腹泻等症状和病变。所以建立快速准确的生前检测方法对人和动物肉孢子虫病防控具有重要的指导意义。
目前，国内外还没有肉孢子虫商品化检测试剂盒。国内肖炳南等曾建立了家畜肉孢子虫间接ELISA抗体检测试剂盒；国外也有报道建立了间接血凝、间接免疫荧光抗体试验等方法。但是这些方法共同的缺点是检测抗原均是直接提取包囊中慢殖子的自然抗原，导致检测抗原不能批量化生产，成本太高，严重影响其商品化推广。另外，肉孢子虫的自然抗原包含保守的蛋白，建立的检测方法容易和弓形虫等病原抗体产生交叉免疫反应，导致检测结果不准确。因此，通过分子生物学技术筛选出肉孢子虫属特异的抗原基因，经体外表达获得重组蛋白，将为建立动物和人肉孢子虫病特异性抗体的ELISA检测试剂盒提供理想的检测抗原。
已有文献报道，神经肉孢子虫的表面抗原SAG3/4基因在子孢子和裂殖子等入侵阶段高水平表达，属于阶段特异性蛋白，在虫体入侵过程中发挥关键作用。然而目前米氏肉孢子虫和枯氏肉孢子虫的表面抗原SAG3/4基因序列克隆、表达和应用开发尚未见研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种灵敏度高、特异性强的检测肉孢子虫抗体的融合抗原。
本发明还提供一种编码上述融合抗原的基因。
本发明还提供一种包含上述基因的重组表达载体。
本发明还提供一种将上述重组表达载体转入大肠杆菌工程菌中得到的重组菌。
本发明还提供一种由上述重组菌表达的可溶性抗原。
本发明还提供一种包含上述融合抗原或可溶性抗原的间接ELISA抗体检测试剂盒。
本发明还提供一种上述融合抗原、可溶性抗原或间接ELISA抗体检测试剂盒在检测动物或人体肉孢子虫感染方面的应用。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
一种肉孢子虫融合抗原，包含以下三个部分：
1)源于米氏肉孢子虫的表面抗原SAG3的肽段一；
2)源于枯氏肉孢子虫的表面抗原SAG4的肽段二；
3)用于连接肽段一与肽段二的柔性肽段。
在上述肉孢子虫融合抗原中，米氏肉孢子虫的表面抗原SAG3与神经肉孢子虫等其他肉孢子虫的氨基酸序列相似性为90.1％-95.4％，枯氏肉孢子虫的表面抗原SAG4与神经肉孢子虫等其他肉孢子虫的氨基酸序列相似性为95.1％-96.5％，说明这两种蛋白抗原在肉孢子虫属内具有较高的保守性。另外，米氏肉孢子虫的表面抗原SAG3、枯氏肉孢子虫的表面抗原SAG4与弓形虫和新孢子虫相关的表面抗原的氨基酸序列相似性在40％以下，说明肉孢子虫的SAG3和SAG4作为检测抗原，与弓形虫和新孢子虫抗体发生交叉免疫反应的几率比较低。因此，这两种蛋白抗原可作为肉孢子虫属特异的检测抗原，用于检测动物或人肉孢子虫感染的特异抗体。
所述肽段一为米氏肉孢子虫的表面抗原SAG3的部分氨基酸序列，来自首次通过RT-PCR和分子克隆技术从米氏肉孢子虫孢子囊中克隆得到的米氏肉孢子虫完整的SAG3表面抗原基因，开放阅读框序列长度为849bp，编码282个氨基酸(氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示)。优选的，根据生物信息学分析结果，选取抗原指数高、亲水性强的肽段区域从第37-118位(如图1所示)，适用于体外表达获得重组蛋白，作为融合抗原的一部分。具体的，所述肽段一具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
所述肽段二为枯氏肉孢子虫的表面抗原SAG4的部分氨基酸序列，来自首次从枯氏肉孢子虫孢子囊中克隆得到的枯氏肉孢子虫完整的SAG4表面抗原基因，开放阅读框序列长度为864bp，编码287个氨基酸(氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示)。优选的，根据生物信息学分析结果，选取抗原指数高、亲水性强的肽段区域从第165-264位(如图2所示)，适用于体外表达获得重组蛋白，作为融合抗原的另一部分。具体的，所述肽段二具有如SEQID NO.2所示的氨基酸序列。
所述柔性肽段可以为常用的柔性肽段，用于连接米氏肉孢子虫的表面抗原SAG3的第37-118位肽段(如SEQ ID NO.1所示)和枯氏肉孢子虫的表面抗原SAG4的第165-264位肽段(如SEQ ID NO.2所示)，使被连接的两个蛋白肽段在折叠形成高级结构时不相互影响，保持较强的抗原性。具体的，所述柔性肽段为15个氨基酸的柔性肽(GGGGS)3(如SEQ ID NO.3所示)。
本发明的肉孢子虫融合抗原(即融合抗原AG3-4)由米氏肉孢子虫的表面抗原SAG3的部分氨基酸序列(第37-118位)、15个氨基酸的柔性肽和枯氏肉孢子虫的表面抗原SAG4的部分氨基酸序列(第165-264位)构成，为特异性检测肉孢子虫抗体的二价重组融合抗原。具体的，肽段连接的顺序依次是米氏肉孢子虫的表面抗原SAG3的第37-118位肽段、15个氨基酸的柔性肽和枯氏肉孢子虫的表面抗原SAG4的第165-264位肽段，融合抗原长度共198aa，具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
编码基因，为编码上述肉孢子虫融合抗原的基因；参考Escherichia coli密码子使用频率表，利用密码子优化工具得到融合抗原的编码区为597bp；由生物公司人工合成二价融合抗原SAG3-4编码区，具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。
重组表达载体，为包含有上述编码肉孢子虫融合抗原的基因的重组表达载体。所述重组表达载体的制备方法为：将编码上述融合抗原的基因(即融合抗原SAG3-4编码区)克隆到原核表达载体(如原核表达载体pET28a)中构建得到。
重组菌，为将上述重组表达载体转入大肠杆菌工程菌中得到的重组菌。所述重组菌的制备方法为：将克隆有编码上述融合抗原的基因(即融合抗原SAG3-4编码区)的重组表达载体导入宿主细菌(如BL21大肠杆菌工程菌)中得到。
可溶性抗原，为由上述重组菌诱导表达得到的可溶性抗原。所述可溶性抗原的制备方法为：诱导上述重组菌原核表达，(纯化)得到可溶性抗原。
具体的，所述可溶性抗原的制备方法包括以下步骤：将融合抗原SAG3-4编码区克隆到原核表达载体pET28a中，得到重组表达载体pET28a-SAG3-4；然后导入BL21大肠杆菌工程菌中，进行体外诱导高效表达，得到可溶性抗原rSAG3-4，分子量约为20kDa。
本发明通过试验证明，将由上述重组表达载体构建得到的重组菌进行体外诱导表达，然后将表达纯化的可溶性抗原rSAG3-4包被96孔板，分别与米氏肉孢子虫阳性血清、枯氏肉孢子虫阳性血清、弓形虫和新孢子虫阳性血清进行间接ELISA抗体检测，发现可溶性抗原rSAG3-4与米氏肉孢子虫、枯氏肉孢子虫阳性血清均呈阳性反应，而与弓形虫和新孢子虫阳性血清呈阴性反应，说明肉孢子虫二价融合抗原rSAG3-4(即可溶性抗原rSAG3-4)作为检测抗原，具有良好的特异性和灵敏性，是一种理想的肉孢子虫检测抗原。
试剂盒，为包含上述肉孢子虫融合抗原或可溶性抗原的间接ELISA抗体检测试剂盒。
所述试剂盒中肉孢子虫融合抗原或可溶性抗原包被在固相载体上形成检测抗原；试剂盒中还包含阳性对照血清(重组抗原rSAG3-4加强免疫兔血清作为阳性血清)、阴性对照血清(SPF兔血清)、酶标二抗(HRP-羊抗兔二抗)、稀释液(PBST溶液)等。
上述融合抗原、可溶性抗原或间接ELISA抗体检测试剂盒在检测动物或人体肉孢子虫感染方面的应用，该检测结果具有辅助性参考价值，还需要通过病理组织切片或PCR扩增等分子手段检测肉孢子虫病原或虫体DNA方可确定病因。
本发明的融合抗原(或可溶性抗原)具有很强的抗原性和特异性，作为检测抗原能与米氏肉孢子虫和枯氏肉孢子虫抗体发生有效的抗原抗体反应，而不能与刚地弓形虫和犬新孢子虫阳性血清产生交叉免疫反应，说明该融合抗原(或可溶性抗原)是检测米氏肉孢子虫和枯氏肉孢子虫抗体理想的检测抗原，可制备成间接ELISA抗体检测试剂盒，具有良好的应用前景。
由于该融合抗原(或可溶性抗原)在肉孢子虫属内不同种间具有较高的保守性，有望用于肉孢子虫其它虫种的抗体检测。因此，利用该肉孢子虫重组二价融合抗原作为检测抗原，可以开发出间接ELISA、间接血凝、间接乳胶凝集等方法来检测动物和人的肉孢子虫抗体，作为生前检测的主要手段。
附图说明
图1为试验例中米氏肉孢子虫的表面抗原SAG3的抗原特性分析；
图2为试验例中枯氏肉孢子虫的表面抗原SAG4的抗原特性分析；
图3为试验例中肉孢子虫融合抗原编码区的PCR鉴定结果；
图4为试验例中肉孢子虫重组融合抗原rSAG3-4的SDS-PAGE电泳分析结果；
图5为试验例中肉孢子虫重组融合抗原rSAG3-4的免疫印迹分析结果。
具体实施方式
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。除特殊说明之外，各实施例及试验例中所用设备和试剂均可从商业途径购买得到。
实施例1
本实施例中肉孢子虫融合抗原，由以下三部分组成：
1)源于米氏肉孢子虫的表面抗原SAG3的肽段一；
2)源于枯氏肉孢子虫的表面抗原SAG4的肽段二；
3)用于连接肽段一与肽段二的柔性肽段；
所述米氏肉孢子虫的表面抗原SAG3的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；
所述枯氏肉孢子虫的表面抗原SAG4的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；
所述柔性肽段的氨基酸序列为：GGGGSGGGGSGGGGS，柔性肽段使被连接的两个蛋白肽段在折叠形成高级结构时不相互影响，保持较强的抗原性。
实施例2
本实施例中肉孢子虫融合抗原的氨基酸序列为：
Figure BDA0002322632160000051
Figure BDA0002322632160000052
(如SEQ ID NO.4所示)。
在该序列中，斜体部分为米氏肉孢子虫SAG3部分氨基酸序列(序列SEQ ID NO.10中第37-118位肽段)，下划线部分为柔性肽，加粗部分为枯氏肉孢子虫SAG4部分氨基酸序列(序列SEQ ID NO.11中第165-264位肽段)。
实施例3
本实施例中编码肉孢子虫融合抗原(如SEQ ID NO.4所示)的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。该序列参考Escherichia coli密码子使用频率表，利用密码子优化工具得到，融合抗原的编码区为597bp，由生物公司人工合成二价融合抗原SAG3-4编码区。
实施例4
本实施例的重组表达载体包含有实施例3中编码肉孢子虫融合抗原的基因。重组表达载体的制备方法为：将编码肉孢子虫融合抗原的基因(如SEQ ID NO.5所示)克隆到原核表达载体pET28a上，构建重组表达载体pET28a-SAG3-4，具体操作参见试验例4。
实施例5
本实施例的重组菌由实施例4中重组表达载体转化到大肠杆菌工程菌中得到，构建方法为：将克隆有编码肉孢子虫融合抗原的基因(如SEQ ID NO.5所示)的重组表达载体pET28a-SAG3-4导入BL21大肠杆菌工程菌中，得到重组菌，具体操作参见试验例4。
实施例6
本实施例的可溶性抗原由实施例5中重组菌诱导表达后纯化得到，制备方法为：将融合抗原SAG3-4编码区(如SEQ ID NO.5所示)克隆到原核表达载体pET28a中，得到重组表达载体pET28a-SAG3-4；然后导入BL21大肠杆菌工程菌中，进行体外诱导高效表达，得到可溶性抗原rSAG3-4，具体操作参见试验例4。
实施例7
本实施例中间接ELISA抗体检测试剂盒包含实施例2的肉孢子虫融合抗原，融合抗原被包被在固相载体上。
实施例8
本实施例中间接ELISA抗体检测试剂盒包含实施例5的可溶性抗原，可溶性抗原被包被在聚苯乙烯96孔板U形孔底部，试剂盒中还包含阳性对照血清(重组抗原rSAG3-4加强免疫兔血清作为阳性血清)、阴性对照血清(SPF兔血清)、酶标二抗(HRP-羊抗兔二抗)、稀释液(PBST溶液)等。
实施例9
本实施例中可溶性抗原(参见实施例6)或间接ELISA抗体检测试剂盒(参见实施例8)在检测动物或人体肉孢子虫感染方面的应用，具体操作参见试验例6。
试验例
1、米氏肉孢子虫SAG3基因的克隆
用米氏肉孢子虫包囊阳性新鲜猪肉饲喂无肉孢子虫犬，然后用饱和蔗糖溶液漂浮法收集犬粪便米氏肉孢子虫卵囊或孢子囊。用北京全式金生物技术有限公司的TransZolUp Plus RNA kit(ER501-01)提取肉孢子虫卵囊/孢子囊的总RNA，用反转录酶(AT301-02，北京全式金生物技术有限公司)合成第一条cDNA链；然后用已发表的神经肉孢子虫扩增SAG3的保守引物，进行PCR扩增，PCR产物经连接、转化和菌落PCR鉴定，克隆到pEASY-T1克隆载体(CT101-01，北京全式金生物技术有限公司)上，进行双向测序。最后成功克隆到米氏肉孢子虫的SAG3基因编码区序列，米氏肉孢子虫的SAG3开放阅读框序列长度为849bp，蛋白质序列长度为282个氨基酸(如图1所示)。扩增SAG3的保守引物序列为：
SnSAG3Fext：5’-TCAAGGACGTTTTTCCTGT-3’(如SEQ ID NO.6所示)；
SnSAG3Rext：5’-CTCTGCATGCTGCAATGAAT-3’(如SEQ ID NO.7所示)。
上述引物位于SAG3编码区上、下游转录表达调控区，不位于编码区。
2、枯氏肉孢子虫的SAG4基因的克隆
用枯氏肉孢子虫包囊阳性新鲜牛肉饲喂无肉孢子虫犬，然后用饱和蔗糖溶液漂浮法收集犬粪便枯氏肉孢子虫卵囊或孢子囊。然后按照上述方法克隆枯氏肉孢子虫SAG4基因编码区序列，枯氏肉孢子虫的SAG4开放阅读框序列长度为864bp，蛋白质序列长度为287个氨基酸(如图2所示)。扩增SAG4的保守引物序列为：
SnSAG4F：5’-AATACCATACCTCGGCGTCA-3’(如SEQ ID NO.8所示)；
SnSAG4R：5’-TCAAATGGCTGTCTCCACAA-3’(如SEQ ID NO.9所示)。
上述引物位于SAG4编码区上、下游转录表达调控区，不位于编码区。
3、肉孢子虫二价融合抗原SAG3-4的设计与基因合成
由于米氏肉孢子虫的表面抗原SAG3与神经肉孢子虫等其他肉孢子虫的氨基酸序列相似性为90.1％-95.4％，枯氏肉孢子虫的表面抗原SAG4与神经肉孢子虫等其他肉孢子虫的氨基酸序列相似性为95.1％-96.5％，说明这两种蛋白抗原在肉孢子虫属内具有较高的保守性，如果作为检测抗原，可用于检测米氏肉孢子虫、枯氏肉孢子虫和其他肉孢子虫的抗体。另外，米氏肉孢子虫的表面抗原SAG3、枯氏肉孢子虫的表面抗原SAG4与弓形虫和新孢子虫相关的表面抗原的氨基酸序列相似性在40％以下，说明肉孢子虫的SAG3和SAG4作为检测抗原，与弓形虫和新孢子虫抗体发生交叉免疫反应的几率比较低，可以提高检测的特异性。
生物信息学分析结果显示，米氏肉孢子虫的表面抗原SAG3的第37-118位肽段和枯氏肉孢子虫的表面抗原SAG4的第165-264位肽段亲水性强，抗原表位指数高(如图1和图2所示)，这些区域适用于体外表达获得重组蛋白。
基于上述分析数据，设计含米氏肉孢子虫SAG3第37-118位氨基酸的肽段(如图1)和枯氏肉孢子虫SAG4第165-264位肽段(如图2)的融合抗原，二者用15个氨基酸的柔性肽(GGGGS)3连接起来，形成198aa的融合抗原SAG3-4(如SEQ ID NO.4所示)。参考Escherichiacoli密码子使用频率表，利用密码子优化工具得到融合抗原编码区为597bp(如SEQ IDNO.5所示)，委托生物公司人工合成该融合抗原SAG3-4编码区序列，克隆到T载体pUCm-T上，形成pUCm-SAG3-4。
4、肉孢子虫二价融合抗原SAG3-4基因的克隆与表达
首先用PCR和测序验证合成融合抗原SAG3-4编码区序列的正确性(如图3所示，图中1-2：融合抗原SAG3-4基因；M：DL2000 plus marker)；通过引物设计将BamH I和Not I酶切位点加到融合抗原SAG3-4编码区序列两端，然后用BamH I和Not I(R0136V，R0189V，NEB(北京)有限公司)酶切含酶切位点的SAG3-4编码区序列和原核表达载体pET28a，切胶回收后通过连接、转化、菌落PCR和双酶切鉴定，获得重组表达载体pET28-SAG3-4。
热激法将pET28-SAG3-4转化到感受态细胞大肠杆菌工程菌BL21菌株中，1mmol/LIPTG诱导表达该融合抗原，收集菌液，超声破碎菌体离心后，收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE电泳分析。结果显示，二价融合重组抗原rSAG3-4主要以可溶性蛋白形式表达，蛋白分子量大小约为20kDa(如图4所示，图中1-2：裂解重组菌上清样品2个重复；M：
Figure BDA0002322632160000081
I)。
5、Western blotting检测重组融合抗原rSAG3-4抗原性
利用Ni2+-NTA层析柱(DP101-01，北京全式金生物技术有限公司)对可溶性重组融合抗原rSAG3-4进行过柱纯化，洗脱获得纯化的重组抗原；用紫外分光光度计检测260/280nm的OD值，计算蛋白质浓度；纯化后的重组抗原rSAG3-4加弗氏不完全佐剂乳化后，皮下接种实验兔2次，间隔2周，心脏采血，10000g离心30min，分离制备rSAG3-4兔多克隆阳性血清。用不接种的SPF实验兔血清作为阴性血清。
重组菌蛋白(即肉孢子重组融合抗原rSAG3-4)SDS-PAGE电泳后，用半干湿法将凝胶上的蛋白电转移至NC膜(DP151-06，北京全式金生物技术有限公司)上，加脱脂奶粉封闭液室温封闭2h，TBST缓冲液洗膜后，加兔多克隆阳性血清室温孵育1h，用TBST缓冲液洗膜，然后加HRP标记的羊抗兔二抗室温孵育1h，TBST缓冲液振荡洗膜，最后用DAB显色法检测抗原抗体反应。结果显示，原核表达的重组融合抗原rSAG3-4能被兔多克隆阳性血清特异性识别(如图5所示，图中1：兔阳性血清；2：正常兔血清；M：
Figure BDA0002322632160000082
I)，不能与不接种兔血清发生抗原抗体反应，说明重组融合抗原rSAG3-4具有良好的免疫原性和免疫反应性即抗原性，适合作为检测抗原。
6、以重组融合抗原rSAG3-4为包被抗原建立肉孢子虫间接ELISA抗体检测试剂盒及其效果评价
(1)确定重组融合抗原rSAG3-4包被浓度、待检血清浓度、HRP-羊抗兔二抗的工作浓度
用试验例5中表达纯化的重组融合抗原rSAG3-4包被96孔板，用重组融合抗原rSAG3-4免疫兔的多克隆血清作为待检血清样品，用不接种的SPF实验兔血清作为阴性对照血清，根据P/N值优化和确定包被抗原的包被浓度、待检血清浓度、HRP-羊抗兔二抗工作浓度。结果显示，重组融合抗原rSAG3-4作为包被抗原的包被浓度为2μg/mL，血清稀释倍数为1:50，二抗工作浓度为1:200。
(2)建立肉孢子虫间接ELISA阴阳性判定标准
用重组融合抗原rSAG3-4免疫兔的多克隆血清为阳性对照血清，共10份；不接种的SPF实验兔血清作为阴性对照血清，共10份，检测450nm/630nm波长处的OD值。结果显示，阴性对照血清的平均OD值为0.125，阳性对照血清的平均OD值为2.208(如下表1所示)。当阴性对照的OD值＜0.2，阳性对照的OD值＞1.0，检测数据才是有效的，否则重新检测。根据公式S/P＝(样本OD值-阴性对照OD值)/(阳性对照OD值-阴性对照OD值)，当S/P≥0.15时，样品为阳性；当0.1≤S/P＜0.15时，样品判定为可疑，需要二次检测；当S/P＜0.1时，样品为阴性。
表1间接ELISA检测兔血清结果
Figure BDA0002322632160000091
(3)间接ELISA抗体检测试剂盒特异性检测
除了重组融合抗原rSAG3-4免疫兔的多克隆血清为阳性对照血清和不接种的SPF实验兔血清作为阴性对照血清外，用米氏肉孢子虫和枯氏肉孢子虫孢子囊破碎抗原二次皮下接种SPF实验兔，分别制备米氏肉孢子虫阳性血清和枯氏肉孢子虫阳性血清；另外，用刚地弓形虫和犬新孢子虫速殖子破碎抗原二次皮下接种SPF实验兔，分别制备弓形虫和犬新孢子虫阳性血清。上述血清用来评价肉孢子虫间接ELISA抗体检测试剂盒的特异性，按照优化的条件和浓度进行间接ELISA抗体检测实验操作。结果显示，米氏肉孢子虫和枯氏肉孢子虫孢子囊阳性血清均为阳性，而刚地弓形虫和犬新孢子虫速殖子阳性血清均为阴性(如下表2所示)，说明重组融合抗原rSAG3-4作为检测抗原，检测肉孢子虫抗体具有很好的特异性。
表2间接ELISA抗体检测试剂盒的特异性检测结果
Figure BDA0002322632160000101
通过试验例1-6的研究结果表明，本发明的肉孢子虫重组二价融合抗原rSAG3-4具有很强的抗原性和特异性，作为检测抗原能与米氏肉孢子虫和枯氏肉孢子虫抗体发生有效的抗原抗体反应，而不能与刚地弓形虫和犬新孢子虫阳性血清产生交叉免疫反应，说明该融合抗原是检测米氏肉孢子虫和枯氏肉孢子虫抗体理想的检测抗原。
由于该融合抗原SAG3-4在肉孢子虫属内不同种间具有较高的保守性，有望用于肉孢子虫其它虫种的抗体检测。因此，利用该肉孢子虫重组二价融合抗原rSAG3-4作为检测抗原，可以开发出间接ELISA、间接血凝、间接乳胶凝集等方法来检测动物和人的肉孢子虫病抗体，作为生前检测的主要手段。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110> 河南科技大学
<120> 一种肉孢子虫融合抗原、编码基因、间接ELISA抗体检测试剂盒及其应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<211> 82
<212> PRT
<213> 米氏肉孢子虫
<221> 肽段一
<400> 1
SQTQTYQLAS IGQVRITCPG GTTLANRGAE QADDGPTAEV YSEANAGKNV ALNTLLIGGT 60
YVRADANDDL TVSQLPTNAV TV 82
<211> 100
<212> PRT
<213> 枯氏肉孢子虫
<221> 肽段二
<400> 2
VQFKAGASNA TVQFSCGNAA ALQPQQATKI FDQTCQQELD LDTVTPGATC QRPAAGGMVT 60
VTFPRLPPQN RKLCFVCTRG QENCKVIIDV AADPAGGAAV 100
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 柔性肽段
<400> 3
GGGGSGGGGS GGGGS 15
<211> 198
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 肉孢子虫融合抗原
<400> 4
MSQTQTYQLA SIGQVRITCP GGTTLANRGA EQADDGPTAE VYSEANAGKN VALNTLLIGG 60
TYVRADANDD LTVSQLPTNA VTVGGGGSGG GGSGGGGSVQ FKAGASNATV QFSCGNAAAL 120
QPQQATKIFD QTCQQELDLD TVTPGATCQR PAAGGMVTVT FPRLPPQNRK LCFVCTRGQE 180
NCKVIIDVAA DPAGGAAV 198
<211> 597
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 编码肉孢子虫融合抗原的基因
<400> 5
atgtctcaga cccagaccta ccagctggct tctatcggtc aggttcgtat cacctgcccg 60
ggtggtacca ccctggctaa ccgtggtgct gaacaggctg acgacggtcc gaccgctgaa 120
gtttactctg aagctaacgc tggtaaaaac gttgctctga acaccctgct gatcggtggt 180
acctacgttc gtgctgacgc taacgacgac ctgaccgttt ctcagctgcc gaccaacgct 240
gttaccgttg gtggtggtgg ttctggtggt ggtggttctg gtggtggtgg ttctgttcag 300
ttcaaagctg gtgcttctaa cgctaccgtt cagttctctt gcggtaacgc tgctgctctg 360
cagccgcagc aggctaccaa aatcttcgac cagacctgcc agcaggaact ggacctggac 420
accgttaccc cgggtgctac ctgccagcgt ccggctgctg gtggtatggt taccgttacc 480
ttcccgcgtc tgccgccgca gaaccgtaaa ctgtgcttcg tttgcacccg tggtcaggaa 540
aactgcaaag ttatcatcga cgttgctgct gacccggctg gtggtgctgc tgtttaa 597
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物SnSAG3Fext
<400> 6
tcaaggacgt ttttcctgt 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物SnSAG3Rext
<400> 7
ctctgcatgc tgcaatgaat 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物SnSAG4F
<400> 8
aataccatac ctcggcgtca 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物SnSAG4R
<400> 9
tcaaatggct gtctccacaa 20
<211> 282
<212> PRT
<213> 米氏肉孢子虫
<221> 米氏肉孢子虫的表面抗原SAG3
<400> 10
MMNNSFLSLA VACLVWAPVH CIAADPPVAT CVSRDDSQTQ TYQLASIGQV RITCPGGTTL 60
ANRGAEQADD GPTAEVYSEA NAGKNVALNT LLIGGTYVRA DANDDLTVSQ LPTNAVTVYF 120
LCNKTGGGGG VGCWIGVQVA AQPPLGPQGC TVGGSEVTLT VTAANATAQF ACAATKNVFP 180
EGTNVYNSDC STETPLSTAL PGATLTRGDM NALRIPTLPA AAKNLCFVCA TNAGDGADQK 240
CSVKINVSGS PGESPNGSVG LTARAASALG IFMLGAALVR NV 282
<211> 287
<212> PRT
<213> 枯氏肉孢子虫
<221> 枯氏肉孢子虫的的表面抗原SAG4
<400> 11
MLRATVLRAT LVATAVIYLA GRLQYVVARN PEQATCVLGQ ATAVTEFETF GGLNIVCPQG 60
SALQQVPPAP GAAGGAQGAG YVFSTDQANP QGVVLEQVVP GAIFAVGQNN QPNVLNVAQL 120
PSAPQSIYFL CRPQENEQQT CFIRVNIPAS PPLGPNACVV HNTEVQFKAG ASNATVQFSC 180
GNAAALQPQQ ATKIFDQTCQ QELDLDTVTP GATCQRPAAG GMVTVTFPRL PPQNRKLCFV 240
CTRGQENCKV IIDVAADPAG GAAVGITART ASALGIVVVA AGLLGVY 287

Claims (6)

1.一种肉孢子虫融合抗原，其特征在于：所述融合抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.编码基因，其特征在于：编码如权利要求1所述的肉孢子虫融合抗原的基因。
3.重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体包含有如权利要求2中所述的编码基因。
4.重组菌，其特征在于：所述重组菌由权利要求3中所述的重组表达载体转入大肠杆菌工程菌中得到。
5.间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含有如权利要求1所述的肉孢子虫融合抗原。
6.如权利要求1所述的肉孢子虫融合抗原在制备检测动物或人体肉孢子虫感染试剂中的应用。
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