CN109517050A - 猫血清淀粉样蛋白a及其单克隆抗体的制备方法和应用 - Google Patents

猫血清淀粉样蛋白a及其单克隆抗体的制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，本发明涉及一种重组蛋白，该重组蛋白包含猫血清淀粉样蛋白A的两个优势抗原表位，为提高该重组蛋白在原核表达系统中的产量，采用大肠杆菌偏爱密码子将该重组蛋白氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列，化学合成该核苷酸序列并构建重组表达载体。本发明还涉及该重组蛋白单克隆抗体的制备，经过免疫、细胞融合及多轮筛选后得到杂交瘤细胞株，纯化单克隆抗体并分别标记铕离子(Eu3+)，通过正交实验确定最佳单抗配对组合，可用于猫感染性炎症的早期诊断。

Description

猫血清淀粉样蛋白A及其单克隆抗体的制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域。具体来说，本发明涉及一种新的重组蛋白，通过基因工程技术编码合成该重组蛋白的核苷酸序列，构建含有上述核苷酸序列的质粒载体，转化有上述质粒载体的大肠杆菌菌株，表达重组猫血清淀粉样蛋白A；使用上述重组蛋白制备猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体，并应用于猫感染性疾病早期炎症的诊断。
背景技术
感染性疾病由细菌、病毒、真菌、寄生虫等病原体引起，是常见病、多发病，严重威胁机体健康，因此寻找利于早期诊疗的感染性标志物具有重要意义。血清淀粉样蛋白A(SAA)是存在于许多物种中的一种主要的急相蛋白，包括人、犬、猫和马。一旦机体受到感染、创伤及外科手术等引起的炎症刺激后，SAA浓度水平会在数小时内迅速升高。由于SAA半衰期非常短，随着炎症源的清除，SAA的浓度水平又会迅速下降。国内外已有研究表明，在细菌、病毒感染、急性炎症、慢性炎症急性发作等急性时相反应性疾病中均可检测到血清SAA升高。与传统感染标志物CRP和WBC 相比，其优势在于病毒感染时也明显升高，且改变高于传统指标。鉴于其以上特性， SAA可作为敏感的感染性疾病标志物用于诊疗，成为继WBC和CRP之后，感染性疾病早期辅助诊断的又一个新指标。因此，在猫感染性疾病炎症诊断中，测定猫血清淀粉样蛋白A(fSAA)可用于诊断亚临床炎症、监控猫炎症和感染的治疗效果。
目前，市场上关于猫感染性疾病早期炎症的诊断主要是对猫血液细胞进行检测分析，如测WBC(白细胞总数)、GR(中性粒细胞数)等，该方法操作繁琐而且成本高，不适合快速诊断，易耽误治疗。
以免疫学为基础的血清学检测，操作简便，结果判定简单，是目前的主流方向。时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)是目前最灵敏的微量分析技术，灵敏度可达 10-12g/mL，其利用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效排除非特异荧光干扰，极大提高了分析灵敏度。通过制备重组猫血清淀粉样蛋白A并免疫小鼠得到相应单克隆抗体，结合时间分辨荧光免疫分析平台筛选最佳单克隆抗体配对，从而实现对猫血清淀粉样蛋白A的快速、高效、特异性检测。
发明内容
设计目的：通过设计一种重组蛋白并制备其单克隆抗体，从而实现猫血清淀粉样蛋白A(fSAA)的特异性识别检测，既增强了检测灵敏度，又不会导致检测结果失真。
设计方案：为了实现上述设计目的。本申请：(1)以猫血清淀粉样蛋白A(fSAA) 为靶抗原，分析并选择该抗原的两个特异性优势抗原表位，序列比对结果显示所选择的两个抗原表位与其它蛋白序列无明显同源性。(2)为了促进所选择优势抗原表位对 Balb/c小鼠免疫系统的刺激，增强免疫效果，将所选择的两个优势抗原表位序列通过柔性片段(连续四个甘氨酸)连接后再重复四次，形成重组蛋白氨基酸序列。(3)采用大肠杆菌偏爱密码子，将重组蛋白氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列，以利于重组蛋白在大肠杆菌中的高效表达。(4)化学合成上一步骤得到的核苷酸序列，并通过酶切连接，将合成得到的核苷酸片段插入原核表达载体pET-28a(+)，构建重组蛋白表达载体。(5)重组蛋白表达载体转化大肠杆菌ER2566感受态细胞，加卡那青霉素抗性筛选培养基筛选得到重组蛋白表达菌株。(6)重组蛋白表达菌株大规模培养后，超声破菌并低温离心，取溶液上清通过镍琼脂糖亲和层析柱亲和层析，洗脱得到纯化重组蛋白。(7)纯化的重组蛋白多次免疫Balb/c小鼠后，取其脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，经多轮筛选并最终得到杂交瘤细胞株。(8)将杂交瘤细胞株分别制备Balb/c 小鼠腹水，使用辛酸-硫酸铵沉淀法及Protein A亲和层析分两步纯化单克隆抗体，并分别标记铕离子(Eu3+)。(9)正交实验筛选显示7G5单抗包被与1A1-Eu标记单抗配对检测猫血清淀粉样蛋白A为最佳组合。
本申请与背景技术相比，一是通过分子生物学技术，实现了猫血清淀粉样蛋白A两个优势抗原表位的串联及重复表达，增强了目的抗原表位对小鼠免疫系统的刺激，排除了无关序列可能带来的干扰；二是采用大肠杆菌偏爱密码子优化重组蛋白对应的核苷酸序列，从而大大提高了重组蛋白在大肠杆菌中的表达水平；三是作为免疫原的重组蛋白仅含有猫血清淀粉样蛋白A优势抗原表位，保证了最终得到的单克隆抗体仅特异性识别猫血清淀粉样蛋白A，并筛选得到了最优单克隆抗体配对组合，提高了检测灵敏度。
具体实施方式
以下实施例虽然对本发明的设计思路作了比较详细的文字描述，但是这些文字描述，只是对本发明设计思路的简单文字描述，而不是对本发明设计思路的限制，任何不超出本发明设计思路的组合、增加或修改，均落入到本发明的保护范围内。
实施例1：猫血清淀粉样蛋白A优势抗原表位选择
以猫血清淀粉样蛋白A为靶抗原，利用生物软件DNAssist2.0分析其抗原表位序列的亲水性及抗原性，选择A优势抗原表位(SEQ ID No:2)和B优势抗原表位(SEQ ID No:3)。同时，序列比较结果表明所选择的A、B两个优势抗原表位序列特异性高，与其它蛋白序列无明显同源性。
实施例2：猫血清淀粉样蛋白A优势抗原表位串联
为增强所选择抗原表位对小鼠免疫系统的刺激以利于后续实验的进行，将猫血清淀粉样蛋白A的A、B两个优势抗原表位序列通过柔性片段(连续四个甘氨酸)连接后再重复四次，得到重组蛋白氨基酸序列，其具体序列如序列表SEQ ID No:1所示。
实施例3：优化编码重组蛋白的核苷酸序列
为提高重组蛋白在大肠杆菌中的表达量，在重组蛋白氨基酸序列不变的前提下，根据大肠杆菌偏爱密码子将编码重组蛋白的氨基酸序列转化为对应的核苷酸序列，具体序列如序列表SEQ ID No:4所示，并在其上下游分别添加酶切位点BamHI和EcoRI 对应的核苷酸序列，由杭州贤至生物科技有限公司合成。合成后的目的基因克隆于 pMD19-T载体(宝生物工程大连有限公司)中。
实施例4：构建重组蛋白表达载体
用限制性内切酶BamHI和EcoRI(宝生物工程大连有限公司)于37℃分别双酶切含目的基因的pMD19-T载体和pET-28a(+)载体(德国Novagen公司)12小时，酶切产物分别行1％琼脂糖凝胶电泳，并分别切胶回收目的基因和pET-28a(+)载体(本发明所使用的胶回收试剂盒均购自宁波中鼎生物技术有限公司)。使用T4连接酶(宝生物工程大连有限公司)将回收的目的基因和pET-28a(+)载体按一定比例于25℃连接 3小时后，连接产物转化DH5α感受态细胞(杭州贤至生物科技有限公司)，并涂布于含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板上，于37℃恒温培养12小时后，于平板上挑取单克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基，37℃恒温摇床培养12小时后，采用质粒纯化试剂盒(本发明所使用的质粒纯化试剂盒均购自于宁波中鼎生物技术有限公司)提取质粒，经BamHI和EcoRI双酶切鉴定后得到正确的重组表达载体。
实施例5：构建重组蛋白表达菌株
将构建好的重组表达载体转化E.coli ER2566感受态细胞，并涂布于含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板上，于37℃过夜培养。次日挑取平板上单克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基，37℃恒温摇床培养8小时后，取1mL 保存，剩余加诱导剂IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)(终浓度为1.0mmol/L)诱导表达4小时后制备蛋白电泳样品。14％聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明重组蛋白成功表达，得到重组蛋白表达菌株。
实施例6：纯化重组猫血清淀粉样蛋白A
接种重组蛋白表达菌株至LB液体培养基，加卡那青霉素至终浓度为50μg/mL， 37℃恒温摇床培养8小时后，用含50μg/mL卡那青霉素的LB液体培养基将该菌按1： 100比例稀释后，分装至细菌培养瓶，置37℃恒温摇床培养至OD600＝0.8，加诱导剂 IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)至终浓度为1.0mmol/L，继续培养诱导4小时。离心收集菌体后，低温超声破菌，低温离心后取上清通过镍琼脂糖亲和层析柱，经洗涤、洗脱最终得到纯化重组蛋白。
实施例7：杂交瘤细胞株的获得
取4-6周龄雌性Balb/c小鼠，基础免疫每只小鼠皮下多点注射弗氏完全佐剂乳化的100μg重组蛋白。15天后进行加强免疫，方法为取相同量的重组蛋白用弗氏不完全佐剂乳化后，皮下多点注射。30天后，取15μg重组蛋白尾静脉加强注射，并于72 小时后眼眶取血，并处死小鼠，取其脾脏制备细胞悬液，细胞计数，按1/5于脾细胞的数量取生长状态良好的sp2/0小鼠骨髓瘤细胞，混和离心后，加入聚乙二醇(PEG-4000)使二者融合。此外再加入等体积的饲养细胞，混匀后分置于96孔细胞板(200μL/孔)，于5％二氧化碳培养箱培养。5天后，半保留换液，10天后采用间接酶联免疫吸附法检测96孔细胞培养板中的杂交瘤细胞培养上清。具体方法如下：
重组蛋白经包被液稀释后(终浓度为1μg/mL)，以100μL/孔加入酶标板(无锡国盛生物工程有限公司)，4℃包被12小时后通过DEM-3型洗板机(中山大学达安基因股份有限公司)用洗涤液洗涤2次；加入封闭液，150μL/孔，37℃封闭1小时，洗板机洗板1次；加待检细胞培养上清、阳性对照血清及阴性对照样本，100μL/孔，37℃孵育30分钟后，洗涤液洗涤5次；加HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗鼠IgG，100 μL/孔，37℃孵育30分钟后，洗涤液洗涤5次；每孔加显色液A和显色液B各50μL，37℃避光显色10分钟后，加终止液终止反应，50μL/孔，酶标仪450nm波长空白孔校零后读取OD值。以免疫小鼠血清作为阳性对照，相关溶液配方如下：
包被液：Na2CO31.5g，NaHCO3 2.9g，加双蒸水定容至1000mL(pH9.6)。
封闭液：Na2HPO4.12H2O 2.68g，NaH2PO4.2H2O 0.39g，NaCl 8.5g，20g牛血清白蛋白，加双蒸水定容至1000mL(pH7.4)。
洗涤液：Na2HPO4.12H2O 2.68g，NaH2PO4.2H2O 0.39g，NaCl 8.5g，Tween-200.5mL，加双蒸水定容至1000mL(pH7.4)。
显色液A：200mg TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)溶于100mL无水乙醇，加双蒸水定容至1000mL。
显色液B：柠檬酸2.1g，Na2HPO4.12H2O 71g，加双蒸水定容至1000mL。
使用时：1mL显色液A+1mL显色液B+0.4μL 30％H2O2
终止液：2M H2SO4，21.7mL浓H2SO4加双蒸水定容至1000mL。
对于检测阳性的杂交瘤细胞，再使用有限稀释法进行亚克隆。经过三次亚克隆，共筛选得到7株杂交瘤细胞株(1A1、1F7、2B7、4D8、5E6、7F1、7G5)。
实施例8：单克隆抗体的大量制备及纯化
取6-8周龄的健康Balb/c小鼠，腹腔注射液体石蜡，每只500μL，5天后腹腔注射杂交瘤细胞(约1×106个/只)，15天后，小鼠腹部鼓起，收集腹水，12000rpm离心2分钟，收集上清，按1：2.5的比例加入60mmol/L pH4.5的醋酸钠缓冲液，以每毫升腹水上清加入25μL正辛酸的比例，在磁力搅拌器搅拌条件下缓慢加入正辛酸，在室温条件下继续搅拌30分钟后，4℃5000rpm离心30分钟，弃沉淀。上清4℃预冷，以1mL体积上清加入0.227g硫酸铵的比例，缓慢加入硫酸铵粉末，边加边搅拌，室温条件下继续搅拌30min后，5000rpm离心15分钟，沉淀溶于体积1/10量的10 mmol/L PBS(pH7.4)缓冲液中，10KDa透析袋置于10mmol/L PBS(pH7.4)缓冲液中透析至无硫酸铵。将透析后的单抗用Protein A亲和层析树脂纯化，洗涤后收集洗脱峰，即得到纯化后的单抗。
实施例9：Eu3+标记单抗的制备
取1mg纯化后的单克隆抗体于0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)中4℃透析3 次，加入1mg DTPA(二乙基三胺五乙酸)立即混匀，室温反应1h，加入200μL Eucl3 (33mmol/L)，室温反应1h后用10m mol/L PBS(pH7.4)于4℃过夜透析。以上述方法分别对1A1、1F7、2B7、4D8、5E6、7F1、7G5单抗进行Eu3+标记。相关溶液配方如下：
碳酸盐缓冲液(pH9.6)：Na2CO3 1.5g，NaHCO3 2.9g，加双蒸水定容至1000mL。
PBS缓冲液(pH7.4)：KH2PO4 0.29g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaCl 8.2g，加双蒸水定容到1000mL。
实施例10：配对单抗筛选
7株单克隆抗体(1A1、1F7、2B7、4D8、5E6、7F1、7G5)分别经包被液稀释后 (终浓度为1μg/mL)，以100μL/孔加入酶标板(无锡国盛生物工程有限公司)，4℃包被12小时后通过DEM-3型洗板机(中山大学达安基因股份有限公司)用洗涤液洗涤2次；加入封闭液，150μL/孔，37℃封闭1小时，洗板机洗板1次；加猫炎症阳性血清样本及正常猫血清标本，100μL/孔，室温震荡孵育30分钟后，洗涤液洗涤5次；加实施例9制备得到的Eu3+标记单抗，100μL/孔，室温震荡孵育30分钟后，洗涤液洗涤5次；增强液100uL/孔，室温震荡5分钟，置于时间分辨检测仪(上海新波生物技术有限公司)读值。相关溶液配方如下：
包被液：Na2CO31.5g，NaHCO3 2.9g，加双蒸水定容至1000mL(pH9.6)。
封闭液：Na2HPO4.12H2O 2.68g，NaH2PO4.2H2O 0.39g，NaCl 8.5g，20g牛血清白蛋白，加双蒸水定容至1000mL(pH7.4)。
洗涤液：Na2HPO4.12H2O 2.68g，NaH2PO4.2H2O 0.39g，NaCl 8.5g，Tween-200.5mL，加双蒸水定容至1000mL(pH7.4)。
增强液：冰醋酸6mL，Triton X-100 1mL，TOPO(Tri-Octyl Phosphine Oxide正三辛基氧膦)50umol，β-NTA(N(CH2COOH)3氨三乙酸)15umol，用0.1mol/L的邻苯二钾酸氢钾调pH至3.2，加双蒸水定容至1000mL。
以上述方法正交检测各包被单抗与铕标单抗配对，求P/N值(阳性标本检测均值与阴性标本检测均值比值)，见表1。
表1各单抗与铕标单抗P/N值统计
通过上表可知，7G5单抗包被与1A1-Eu配对检测猫血清淀粉样蛋白A为最佳组合。
SEQ ID NO1：重组蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID NO2：猫血清淀粉样蛋白A优势抗原表位A的氨基酸序列；
SEQ ID NO3：猫血清淀粉样蛋白A优势抗原表位B的氨基酸序列；
SEQ ID NO4：编码重组蛋白的核苷酸序列。

Claims (6)

1.一种重组蛋白，其特征在于该重组蛋白具有如序列表SEQ ID No:1所示的氨基酸序列。
2.一种重组蛋白，其特征在于该重组蛋白包含如序列表SEQ ID No:2和SEQ ID No:3所示的氨基酸序列。
3.一种核苷酸序列，其特征在于该核苷酸序列如序列表SEQ ID No:4所示，可编码权利要求1-2所述的重组蛋白。
4.一种质粒载体，其特征在于该质粒载体含有权利要求3所述的核苷酸序列。
5.一种采用权利要求4所述质粒载体转化的菌株。
6.根据权利要求1-2所述的重组蛋白，其特征在于可用于猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的制备，包括：
(a)合成权利要求3所述的核苷酸序列，并连接质粒载体，构建重组猫血清淀粉样蛋白A表达载体；
(b)将步骤(a)中的重组猫血清淀粉样蛋白A表达载体转化大肠杆菌，筛选得到重组猫血清淀粉样蛋白A表达菌株；
(c)大规模培养重组猫血清淀粉样蛋白A表达菌株后，经纯化获取重组猫血清淀粉样蛋白A；
(d)重组猫血清淀粉样蛋白A多次免疫Balb/c小鼠后，取其脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，经过多轮筛选得到杂交瘤细胞株；
(e)纯化单抗并分别标记铕离子(Eu3+)，通过正交实验确定最佳单抗配对组合。
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