CN107603996A

CN107603996A - 一种重组蛋白的编码序列、重组蛋白及其单克隆抗体的制备方法

Info

Publication number: CN107603996A
Application number: CN201710845833.1A
Authority: CN
Inventors: 李晓照; 冯俊涛; 胡新月; 李昆; 罗丽莎; 胡祥叶; 吴琼杉; 余铭恩; 朱世荣; 唐薇
Original assignee: Xiangya Hospital of Central South University
Current assignee: Xiangya Hospital of Central South University
Priority date: 2017-02-28
Filing date: 2017-09-19
Publication date: 2018-01-19
Also published as: CN106834319A

Abstract

本发明公开了一种重组蛋白的编码序列、重组蛋白及其单克隆抗体的制备方法。该重组蛋白包含6xHis、S Tag、Trx和GST四种标签蛋白表位，并结合大肠杆菌偏爱密码子将该重组氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列，通过分子生物学技术制备重组抗原，免疫小鼠，通过酶联免疫等筛选平台分别获得针对四种标签蛋白的优质单克隆细胞株。

Description

一种重组蛋白的编码序列、重组蛋白及其单克隆抗体的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体而言，本发明涉及一种重组蛋白的编码序列、重组蛋白及其单克隆抗体的制备方法。

背景技术

标签蛋白抗体(Tag-antibody)是一类经过亲和纯化的小鼠单克隆抗体。用于检测各种商品化表达载体上的标签序列（如：MyC、His、GST、HA等），籍以分析检验目的蛋白的表达含量及其功能。其原理是抗原-抗体反应，这些标签抗体可以高度特异地结合对应的标签融合蛋白。标签抗体是开展基因蛋白表达、信号转导和基因功能研究的常用工具。

常规的标签蛋白单克隆抗体制备所使用的免疫原是基因工程技术表达的完整蛋白，但由于碱基密码子的缘故，该蛋白在大肠杆菌中表达困难，表达量极低，导致后续的纯化工作难以开展，严重阻碍其单克隆抗体的制备。另外，标签蛋白种类繁多，每种标签蛋白单独制备，耗时长、成本高，不利于市场的广泛推广和使用。

发明内容

本发明旨在避免背景技术中的不足之处，通过设计一种重组蛋白并制备其单克隆抗体，从而实现同时制备多种标签蛋白单克隆抗体，既增强了检测灵敏度，又可以同时制备多种抗体。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述重组蛋白的编码序列如SEQ ID NO.1所示。

所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述重组蛋白表达载体是含有SEQ ID NO.1所示编码序列的质粒载体。

上述重组蛋白和重组蛋白表达载体可用于制备标签蛋白单克隆抗体。

所述标签蛋白单克隆抗体的制备方法包括如下步骤：

（1）合成SEQ ID NO.1所示的重组蛋白编码序列，并将该重组蛋白编码序列连接质粒载体，进而构建重组蛋白表达载体；

（2）将重组蛋白表达载体转化大肠杆菌，筛选得到重组蛋白表达菌株；

（3）将重组蛋白表达菌株大规模培养后，经纯化获取重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

（4）将重组蛋白多次免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，经过多轮筛选和多指标鉴定分别获得针对重组蛋白所对应的标签蛋白单克隆细胞株，再由标签蛋白单克隆细胞株制得标签蛋白单克隆抗体。

下面对本发明作进一步说明：

本发明首先以4种标签结合蛋白（6xHis、S Tag、Trx和GST）为靶抗原，序列比较结果显示所选择的该抗原表位与其它蛋白序列无明显同源性。

其次，为了促进所选择抗原表位对BALB/c小鼠免疫系统的刺激，增强免疫效果，故分别将所选择的四个优势抗原表位序列重复后通过柔性片段（连续四个甘氨酸）连接，形成重组蛋白氨基酸序列。

第三步，采用大肠杆菌偏爱密码子，将重组蛋白氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列，以利于重组蛋白在大肠杆菌中的表达以提高表达量。

第四步，化学合成上一步骤得到的核苷酸序列，并通过酶切连接，将合成得到的核苷酸片段插入表达载体PET-28a(+),构建重组蛋白表达载体。

第五步，重组蛋白表达载体转化大肠杆菌ER2566感受态细胞，筛选得到重组蛋白表达菌株。

第六步，重组蛋白表达菌株大规模培养后，超声破菌并低温离心后，取溶液上清通过镍琼脂糖亲和层析柱亲和层析，洗脱得到纯化重组蛋白。

第七步，纯化后的重组蛋白多次免疫BALB/c小鼠后，取其脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，经过多轮筛选并最终分别得到杂交瘤细胞株。

第八步，将杂交瘤细胞株分别制备BALB/c小鼠腹水，使用辛酸-硫酸铵法及Protein G分两步纯化单克隆抗体。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

一是通过分子生物学技术，实现了四种标签结合蛋白抗原表位的重复及串联表达，增强目的抗原表位对小鼠免疫系统的刺激，排除了无关序列可能带来的干扰；

二是作为免疫原的重组蛋白仅含有四种标签蛋白抗原表位，保证了最终得到的单克隆抗体仅特异性识别该四种标签蛋白，并筛选同时得到四种标签蛋白，提高了检测的灵敏度，降低实验成本。

三是采用大肠杆菌偏爱密码子优化重组蛋白对应的核苷酸序列，从而大大提高了重组蛋白在大肠杆菌中的表达水平。

具体实施方式

一、4种标签蛋白抗原表位选择

以4种标签蛋白为靶抗原，利用生物软件DNAssist2.0分析其抗原表位序列的亲水性及抗原性，分别选择6xHis、S Tag、Trx和GST抗原表位A、B、C和D。同时，序列比较结果表明所选择的A、B、C和D抗原表位序列特异性高，与其它蛋白序列无明显同源性。

二、4种标签蛋白抗原表位的串联

为增强所选择抗原表位对小鼠免疫系统的刺激以利于后续实验的进行，将标签蛋白A、B、C和D四种抗原表位序列分别通过柔性片段（连续四个甘氨酸）连接，得到重组蛋白氨基酸序列，其具体序列如序列表SEQ ID N0.2所示。

三、优化编码重组蛋白的核苷酸序列

为了提高重组蛋白在大肠杆菌中的表达量，在重组蛋白氨基酸序列不变的前提下,根据大肠杆菌偏爱密码子将编码重组蛋白的氨基酸序列转化为对应的核苷酸序列，具体序列如序列表SEQ ID NO.1所示，并在其上下游分别添加酶切位点BamHI和EcoRI对应的核苷酸序列后，由杭州贤至生物科技有限公司合成。合成后的目的基因克隆于pMD19-T载体(宝生物工程大连有限公司)中。

四、构建重组蛋白表达载体

用限制性内切酶BamHI和EcoRI(宝生物工程大连有限公司)于37℃分别双酶切含目的基因的pMD19-T载体和PET-28a(+)载体（德国Novagen公司）12小时，酶切产物分别行1％琼脂糖凝胶电泳，并分别切胶回收目的基因和PET-28a(+)载体（本发明所使用的胶回收试剂盒均来自宁波中鼎生物技术有限公司）。使用T4连接酶(宝生物工程大连有限公司)将回收的目的基因和PET-28a(+)载体按一定的比例于4℃连接12小时后，连接产物转化DH5α感受态细胞（杭州贤至生物科技有限公司），并涂布于含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板，于37℃恒温培养12小时之后，于平板上挑取单克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基，37℃恒温摇床培养12小时后，采用质粒纯化试剂盒（本发明所使用的质粒纯化试剂盒均来自于宁波中鼎生物技术有限公司）提取质粒，经BamHI和EcoRI双酶切鉴定后得到正确的重组表达载体。

五、构建重组蛋白E表达菌株

将构建好的重组表达载体转化E.coli ER2566感受态细胞，并涂布于含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板，于37℃过夜培养。第二日，挑取平板上单克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基，37℃恒温摇床培养8小时后，加诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（终浓度为1.0mmol/L）诱导表达4个小时后制备蛋白电泳样品。13.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明重组蛋白成功表达，得到重组蛋白表达菌株。

六、纯化重组蛋白F

接种重组蛋白表达菌株至LB液体培养基，加卡那青霉素至终浓度为50μg/mL，37℃恒温摇床培养8小时后，用含50μg/mL卡那青霉素的LB液体培养基将该菌按1：100比例稀释后，分装至细菌培养瓶中，置37℃恒温摇床培养至OD600=0.8，加诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷至终浓度为1.0mmol/L，继续培养诱导4小时。离心收集菌体后，低温超声破菌，低温离心后取上清通过镍琼脂糖亲和层析柱,经洗涤、洗脱最终得到纯化重组蛋白。

七、构建用于检测的偶联蛋白

将标签蛋白A、B两个抗原表位序列分别在N端连接一个半胱氨酸，合成G、H序列多肽，载体蛋白选择BSA（Roche公司），用SPDP（PIERCE公司）连接法将合成的多肽分别与BSA偶联：4.6mg SPDP溶解740ul DMSO,终浓度为20mM。0.1008g BSA溶解于2ml PBS-EDTA溶液中，室温静置1h。HiTrapTM Deaslting column脱盐柱洗脱多余的SPDP。4mg多肽加入偶联好的BSA-SPDP体系中室温过夜，得到产物BSA-G、BSA-H（由杭州贤至生物科技有限公司合成）。将蛋白GST和TRX（购买于杭州毕肯莱博生物科技有限公司）命名为I、L。

八、杂交瘤细胞株的获得

取5-7周龄雌性BALB/c小鼠，基础免疫每只小鼠皮下多点注射福氏完全佐剂乳化的70μg重组蛋白；15天后进行加强免疫，方法为取相同量的重组蛋白用福氏不完全佐剂乳化后，皮下多点注射；第三次加强免疫在15天以后，方法同第二次相同。30天后，取120μg重组蛋白腹腔加强注射，并于腹腔加强注射72小时后，眼眶取血，并处死小鼠，取其脾脏制备细胞悬液，细胞计数，按1/5于脾细胞的数量取生长状态良好的sp2/0小鼠骨髓瘤细胞，混和离心后，加入聚乙二醇（PEG-4000）使二者融合。另外，再加入等体积的饲养细胞，混匀后分置于96孔细胞板（200μL/孔），于5％二氧化碳培养箱培养。5天后，半保留换液，10天后采用间接酶联免疫吸附法检测96孔细胞培养板中的杂交瘤细胞培养上清。

具体方法如下：

蛋白BSA-G、BSA-H、I、L分别通过包被液稀释后（终浓度为1μg/mL），以100μL/孔加入酶标板（深圳金灿华实业有限公司）,4℃包被12小时后用洗涤液洗涤一次并拍干；加入封闭液，150μL/孔，37℃封闭2小时，弃孔内液体，拍干；分别加待检细胞培养上清及对照血清,100μL/孔，37℃孵育1小时后，洗涤液洗涤三次并拍干；加HRP（辣根过氧化物酶）标记的羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃孵育30分钟后，洗涤液洗涤四次并拍干；每孔加显色液A和显色液B各50μL，37℃避光显色10分钟后，加终止液终止反应，50μL/孔，酶标仪450nm波长空白孔校零后读取OD值。以免疫小鼠的血清作为阳性对照，相关溶液配方如下：

包被液：Na₂CO₃ 1.5g，NaHCO₃ 2.9g, 加双蒸水定容至1000mL(pH9.6)。

封闭液：Na₂HPO₄.12H₂O 2.68g, NaH₂PO4.2H₂O 0.39g, NaCl 8.5g，20g牛血清白蛋白，加双蒸水定容至1000mL(pH7.4)。

洗涤液：Na₂HPO₄.12H₂O 2.68g, NaH₂PO₄.2H₂O 0.39g, NaCl 8.5g，Tween-200.5mL，加双蒸水定容至1000mL(pH7.4)。

显色液A: 200mg TMB 溶于100mL无水乙醇，加双蒸水定容至1000mL。

显色液B: 柠檬酸2.1g,Na₂HPO₄.12H₂O 71g,加双蒸水定容至1000mL。

使用时：1mL显色液A＋1mL显色液B+0.4μL 30%H₂O₂

终止液：2M H₂SO₄, 21.7mL浓H₂SO₄加双蒸水定容至1000mL。

对于检测阳性的杂交瘤细胞克隆，再使用有限稀释法进行亚克隆。经过三次亚克隆，分别筛选得到6xHis 3株杂交瘤细胞株（1F4、8B6、3D7、），S Tag 2株杂交瘤细胞株（5D6、2C3）；Trx 5株杂交瘤细胞株（4F4、6B7、3G7、6T5、7H5）；GST3株杂交瘤细胞株（7F4、2C7、6D7）。

最后将杂交瘤细胞株分别制备BALB/c小鼠腹水，使用辛酸-硫酸铵法及Protein G分两步纯化单克隆抗体。

SEQUENCE LISTING

<110> 中南大学湘雅医院

<120> 一种重组蛋白的编码序列、重组蛋白及其单克隆抗体的制备方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1122

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

CATCATCATC ATCATCATGG CGGCGGCGGC GCCGTGCATG 40

TGCTGGCCTT TGAATTTAGC AGCAGCGGCT TTTTTGGCGG 80

CGGCGGCGGC CAGGTGAGCG TGGAAGAACT GTTTCAGCTG 120

ACCTTTCGCC AGTGCACCCA TTTTGGCTGC CGCCATTTTA 160

CCGTGTTTGA ACAGCAGCAG AGCCGCGATA CCACCGATGC 200

CATTTTTCGC CGCAGCGCCC GCGTGCTGAT TGATGTGCAG 240

TTTTGCAACG GCCAGTTTGC CCTGATTTTT GTGAGCGATT 280

TTATTCAGAA CCGCGGCGAT CATTTTGCCC GCACCGCCCC 320

GCTGTGCCCG GAAATTGATG AAGATCGCCC GGTGCGCTTT 360

GAATATATTC GCGTGAAAAC CGTGGTGAGC CAGGTGAACA 400

ACTTTATTGC CCATGGCGGC GGCGGCATGA GCCCGATTCT 440

GGGCTATTGG AAAATTAAAG GCCTGGTGCA GCCGACCCGC 480

CTGCTGCTGG AATATCTGGA AGAAAAATAT GAAGAACATC 520

TGTATGAACG CGATGAAGGC GATAAATGGC GCAACAAAAA 560

ATTTGAACTG GGCCTGGAAT TTCCGAACCT GCCGTATTAT 600

ATTGATGGCG ATGTGAAACT GACCCAGAGC ATGGCCATTA 640

TTCGCTATAT TGCCGATAAA CATAACATGC TGGGCGGCTG 680

CCCGAAAGAA CGCGCCGAAA TTAGCATGCT GGAAGGCGCC 720

GTGCTGGATA TTCGCTATGG CGTGAGCCGC ATTGCCTATA 760

GCAAAGATTT TGAAACCCTG AAAGTGGATT TTCTGAGCAA 800

ACTGCCGGAA ATGCTGAAAA TGTTTGAAGA TCGCCTGTGC 840

CATAAAACCT ATCTGAACGG CGATCATGTG ACCCATCCGG 880

ATTTTATGCT GTATGATGCC CTGGATGTGG TGCTGTATAT 920

GGATCCGATG TGCCTGGATG CCTTTCCGAA ACTGGTGTGC 960

TTTAAAAAAC GCATTGAAGC CATTCCGCAG ATTGATAAAT 1000

ATCTGAAAAG CAGCAAATAT ATTGCCTGGC CGCTGCAGGG 1040

CTGGCAGGCC ACCTTTGGCG GCGGCGATCA TCCGCCGAAA 1080

AGCGATCTGG TGCCGCGCGG CAGCCCGGGC ATTCATCGCG 1120 AT 1122

<210> 2

<211> 374

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

His His His His His His Gly Gly Gly Gly Ala Val His Val

5 10

Leu Ala Phe Glu Phe Ser Ser Ser Gly Phe Phe Gly Gly Gly

15 20 25

Gly Gly Gln Val Ser Val Glu Glu Leu Phe Gln Leu Thr Phe

30 35 40

Arg Gln Cys Thr His Phe Gly Cys Arg His Phe Thr Val Phe

45 50 55

Glu Gln Gln Gln Ser Arg Asp Thr Thr Asp Ala Ile Phe Arg

60 65 70

Arg Ser Ala Arg Val Leu Ile Asp Val Gln Phe Cys Asn Gly

75 80

Gln Phe Ala Leu Ile Phe Val Ser Asp Phe Ile Gln Asn Arg

85 90 95

Gly Asp His Phe Ala Arg Thr Ala Pro Leu Cys Pro Glu Ile

100 105 110

Asp Glu Asp Arg Pro Val Arg Phe Glu Tyr Ile Arg Val Lys

115 120 125

Thr Val Val Ser Gln Val Asn Asn Phe Ile Ala His Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly

145 150

Leu Val Gln Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu

155 160 165

Lys Tyr Glu Glu His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys

170 175 180

Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn

185 190 195

Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys Leu Thr Gln Ser

200 205 210

Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn Met Leu

215 220

Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

225 230 235

Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala

240 245 250

Tyr Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser

255 260 265

Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys

270 275 280

His Lys Thr Tyr Leu Asn Gly Asp His Val Thr His Pro Asp

285 290

Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp Val Val Leu Tyr Met Asp

295 300 305

Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys

310 315 320

Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr Leu Lys

325 330 335

Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala

340 345 350

Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val

355 360

Pro Arg Gly Ser Pro Gly Ile His Arg Asp

365 370

Claims

1.一种重组蛋白的编码序列，其特征在于，所述编码序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述编码序列编码的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组蛋白表达载体，其特征在于，所述重组蛋白表达载体是含有SEQ ID NO.1所示编码序列的质粒载体。

4.如权利要求2所述重组蛋白在制备标签蛋白单克隆抗体中的应用。

5.如权利要求3所述重组蛋白表达载体在制备标签蛋白单克隆抗体中的应用。

6.一种标签蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)合成SEQ ID NO.1所示的重组蛋白编码序列，并将该重组蛋白编码序列连接质粒载体，进而构建重组蛋白表达载体；

(2)将重组蛋白表达载体转化大肠杆菌，筛选得到重组蛋白表达菌株；

(3)将重组蛋白表达菌株大规模培养后，经纯化获取重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(4)将重组蛋白多次免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，经过多轮筛选和多指标鉴定分别获得针对重组蛋白所对应的标签蛋白单克隆细胞株，再由标签蛋白单克隆细胞株制得标签蛋白单克隆抗体。