CN105198987B

CN105198987B - 一种抗化脓隐秘杆菌plo蛋白单克隆抗体及其识别的抗原表位和应用

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Publication number: CN105198987B
Application number: CN201510616098.8A
Authority: CN
Inventors: 王君伟; 闫明慧; 张文龙
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2015-09-24
Filing date: 2015-09-24
Publication date: 2019-04-09
Anticipated expiration: 2035-09-24
Also published as: CN105198987A

Abstract

本发明公开了一种抗化脓隐秘杆菌PLO蛋白单克隆抗体及其识别的抗原表位和应用。本发明的一种抗化脓隐秘杆菌PLO蛋白单克隆抗体，由保藏编号为CGMCC NO.11188的杂交瘤细胞株或保藏编号为CGMCC NO.11189的杂交瘤细胞株分泌产生，该单克隆抗体对化脓隐秘杆菌PLO蛋白具有反应特异性，是针对化脓隐秘杆菌PLO蛋白的特异性的两株抗体。本发明还提供了与所述单克隆抗体特异性结合的抗原表位多肽。本发明的技术方案对PLO生物活性的研究及相关疫苗和治疗手段的开发具有重要意义。

Description

一种抗化脓隐秘杆菌PLO蛋白单克隆抗体及其识别的抗原表位和应用

技术领域

本发明涉及一种单克隆抗体及其识别的抗原表位和应用，具体涉及一种抗化脓隐秘杆菌PLO蛋白(溶血素蛋白)单克隆抗体、产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，本发明还涉及上述单克隆抗体所识别的抗原表位多肽。本发明属于生物技术领域。

背景技术

化脓隐秘杆菌原称化脓棒状杆菌(Corynebacteriumpyogenes)、化脓放线菌(Actinomycespyogenes)，1997年定名为化脓隐秘杆菌(Arcanobacteriumpyogenes)，后更名为Trueperellapyogenes。化脓隐秘杆菌(T.pyogenes)是经济型家畜(牛、羊、猪等)黏膜上的一种共生菌，主要寄生于动物呼吸道、消化道和泌尿生殖道中，为正常菌群的组成部分。同时，化脓隐秘杆菌也是一种条件性致病菌，是其所在菌属中毒力最强的细菌，可经皮肤、黏膜破损处入侵引起临近的组织、器官感染，也可由于吸入肺部引起肺和胸部隐秘杆菌病，表现为肺炎、子宫内膜炎、乳腺炎、心内膜炎、关节炎、皮下脓肿等。溶血素(Pyolysin，PLO)蛋白由化脓隐秘杆菌(T.pyogenes)表达，是T.pyogenes分泌的唯一一种溶血素，是T.pyogenes主要毒力因子之一。1997年，Billington等从野生型菌株中克隆得到了plo基因，获得其全基因序列。据了解plo基因由1602个核苷酸编码534个氨基酸(前27个氨基酸构成信号肽)，PLO蛋白成熟体分子量为57.9kDa，共分为4个结构域(D1～4)。氨基酸序列分析表明，PLO属于胆固醇依赖性溶细胞素(Cholesterol dpendentcytolysin，CDC)家族成员，该家族其他成员还包括单核增生李斯特氏菌溶血素(listeriolysin，LLO)、肺炎链球菌溶血素(pneumolysin，PLY)、中间链球菌溶血素(intermedilysin，ILY)、猪链球菌溶血素(suilysin，SLY)、链球菌溶血素O(streptolysin O，SLO)和产气荚膜梭菌溶素O(perfringolysin O，PFO)等，家族成员的分子结构具有很高的相似性。该家族成员可以通过与细胞膜上胆固醇结合(ILY与人细胞膜上CD59结合)，在真核细胞的细胞膜上形成穿膜孔道，产生广泛性的溶细胞效应。PLO能够裂解多种动物的免疫细胞和红细胞，将其编码基因(plo)敲除或将其替换为编码无溶血活性PLO突变体的编码基因，导致T.pyogenes毒力的显著降低，而且T.pyogenes感染对小鼠的致死率与PLO分泌水平呈正相关。因此，研究PLO蛋白的功能对开发化脓隐秘杆菌防控手段具有重要价值。特异性单抗是研究蛋白质功能的重要工具之一，本专利旨在提供一种抗化脓隐秘杆菌PLO蛋白单克隆抗体、产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并申请保护。本发明通过原核表达系统获得重组PLO蛋白，接着应用杂交瘤技术生产单抗，并采用基因截短技术以及Wesren-Blot方法确定特异性单抗的抗原表位。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种抗化脓隐秘杆菌PLO蛋白单克隆抗体，所述的单克隆抗体由保藏编号为CGMCC NO.11188的杂交瘤细胞株或保藏编号为CGMCC NO.11189的杂交瘤细胞株分泌产生；

本发明的目的之二是提供产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

本发明的目的之三是提供与所述单克隆抗体特异性结合的抗原表位多肽；

本发明的目的之四是提供所述单克隆抗体以及与单克隆抗体特异性结合的抗原表位多肽的用途。

为了达到以上目的，本发明所采用的技术方案为：

一种抗化脓隐秘杆菌PLO蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体由保藏编号为CGMCC NO.11188的杂交瘤细胞株分泌产生。

一种抗化脓隐秘杆菌PLO蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体由保藏编号为CGMCC NO.11189杂交瘤细胞株分泌产生。

一株抗化脓隐秘杆菌PLO蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为AP-1A3，分类命名为抗溶血素(PLO)单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号CGMCC NO.11188，保藏日期为：2015年8月10日。

一株抗化脓隐秘杆菌PLO蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为AP-4F12，分类命名为抗溶血素(PLO)单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号CGMCC NO.11189，保藏日期为：2015年8月10日。

上述杂交瘤细胞株通过以下途径制备得到：

将重组质粒pET-30a(+)-plo转化大肠杆菌，IPTG诱导下获得可溶性表达的重组溶血素蛋白His-PLO，对该蛋白进行纯化；将纯化的His-PLO蛋白作为免疫原，腹腔接种5周龄BALB/c小鼠。按照常规杂交瘤细胞融合技术将免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。用纯化的His-PLO蛋白为筛选抗原，建立间接ELISA方法，最终筛选出2株持续分泌抗化脓隐秘杆菌PLO蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株AP-1A3和AP-4F12。本发明进一步从杂交瘤细胞上清液中或从注射杂交瘤细胞的动物腹水中，获得抗化脓隐秘杆菌PLO蛋白的单克隆抗体。

具体的，所述单克隆抗体由如下方法制备得到：

(1)免疫原的制备：将重组质粒pET-30a(+)-plo转化至E.coli Rosetta(DE3)^TM感受态细胞，在IPTG诱导下，重组溶血素蛋白His-PLO以可溶性表达的方式存在。采用Ni-NTAPurification System纯化重组蛋白，对收集的纯化蛋白进行透析和浓缩，并以纯化过的蛋白作为抗原免疫小鼠；

(2)动物免疫：用上述纯化过的His-PLO蛋白免疫BALB/c小鼠。每只小鼠以50μg/只的量进行颈背部皮下注射，每两周一次共三次，第四次加强免疫一次，3天后待融合，获得免疫小鼠。

(3)杂交瘤细胞系的建立：取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。待融合细胞长至孔底1/2或1/3时，通过间接ELISA筛选出阳性杂交瘤细胞株，再利用有限稀释法连续克隆2～3次。至阳性率为100％后进行扩大培养，冻存于液氮中。

(4)单克隆抗体的制备与纯化：将筛选得到的杂交瘤细胞进行扩大培养后，腹腔注射BLAB/C小鼠，诱生腹水。诱生的腹水用亲和层析法获得纯化的单克隆抗体。

单克隆抗体的反应特异性试验结果表明，本发明制备的单克隆抗体是针对化脓隐秘杆菌PLO蛋白，对化脓隐秘杆菌PLO蛋白具有反应特异性。经鉴定，单克隆抗体AP-1A3的Ig亚类为IgG1，单克隆抗体AP-4F12的Ig亚类为IgG3。

本发明采用基因截短技术以及Wesren-Blot方法确定上述特异性单抗的抗原表位，AP-1A3mAb所针对的抗原表位为第64-79个氨基酸即V P V T K D Q L K D G T Y T VF(SEQ ID NO:1所示)，编码所述的抗原表位多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；AP-4F12mAb所针对的抗原表位为第58-75个氨基酸即G E S I E N V P V T K D Q L K D G T(SEQ ID NO:3所示)，编码所述的抗原表位多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

此外，本发明还提供了所述的单克隆抗体在制备检测或诊断化脓隐秘杆菌PLO蛋白试剂或药物中的应用。以及所述的抗原表位多肽在制备检测抗化脓隐秘杆菌PLO蛋白的抗体试剂中的应用。

综上所述，本发明提供一种抗化脓隐秘杆菌PLO蛋白单克隆抗体及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，本发明还提供了与所述单克隆抗体特异性结合PLO蛋白的抗原表位多肽。本发明的技术方案对PLO生物活性的研究及相关疫苗和治疗手段的开发具有重要意义。

附图说明

图1为AP-1A3mAb(单克隆抗体)反应性及针对抗原表位的Western Blot鉴定结果图；

图2为AP-4F12mAb(单克隆抗体)反应性及针对抗原表位的Western Blot鉴定结果图。

具体实施方式

下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

实施例1重组溶血素蛋白His-PLO的制备

重组质粒pET-30a(+)-plo由王君伟实验室提供，具体构建方法参照文献(化脓隐秘杆菌溶血素蛋白的原核表达及其溶血活性鉴定，孟祥莉，母晓宁，刘晓丹，徐凝，王璞，高明春，张文龙，王君伟.中国预防兽医学报.2013，35(6):477-480。)

重组蛋白的诱导表达

(1)重组质粒pET-30a(+)-plo的转化

1)取0.2μL重组质粒转化至E.coli Rosetta(DE3)^TM感受态细胞。

2)随机挑取1个转化子接种至LB培养基(含卡那霉素30μg/mL)中，37℃振荡培养。

(2)重组蛋白的诱导表达

1)按3％剂量接种阳性菌至10mL的LB(含卡那霉素30μg/mL)中，37℃，220r/min培养2-3h。

2)培养至OD600nm达0.4-0.6，加入IPTG(终浓度0.8mmol/L)诱导表达4～6h。

3)收集菌体并超声破碎，离心后分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE，确定目的蛋白的表达情况。

最终得到上清表达的PLO蛋白。

实施例2重组溶血素蛋白His-PLO的纯化

溶液配制：

1)LE Buffer

50mM NaH₂PO₄·H₂O，300mM NaCl，去离子水1L(调节pH至8.0)。

2)10mM/mL咪唑

10mM咪唑，1L LE Buffer(调节pH至8.0)。

3)80mM/mL咪唑

80mM咪唑，1L LE Buffer(调节pH至8.0)。

4)PBS

NaCl 8.0g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.24g，去离子水1L。

具体步骤如下：

参照实施例1的方法确定蛋白为可溶性表达，对重组蛋白进行大量诱导表达，以3％接入50mL LB培养基(含卡那霉素30μg/mL)，其他步骤同实施例1。

采用Ni-NTA Purification System纯化重组蛋白，按照说明书进行可溶蛋白的纯化。

LE Buffer对亲和至Ni-NTA Purification His-PLO进行洗涤3次，10mM/mL咪唑洗涤5次，80mM/mL咪唑为最佳洗脱浓度。以上述洗涤洗脱浓度进行PLO蛋白纯化。

收集纯化蛋白至透析袋，将纯化的蛋白以2L PBS+5％甘油进行透析，每12h换液一次，连续透析4d。

采用PEG6000将透析完毕的蛋白溶液进行浓缩，碧云天蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。

得到纯净的浓度为0.2-0.5mg/mL的PLO蛋白。

实施例3ELISA方法的确定

试剂配制：

1)包被液(PH9.6的碳酸盐缓冲液)

无水Na₂CO₃ 0.1696g，NaHCO₃ 0.2856g，去离子水100mL，完全溶解至4℃,一周内使用。

2)PBST配方

NaCl 8.0g，Na₂HPO₄.·12H₂O 2.9g，KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.24g，Tween 20 0.5mL，去离子水1L。

3)终止液

浓硫酸:去离子水＝1:8(体积比)，浓硫酸缓慢加入到无菌水中，并搅拌散热。

具体步骤如下：

(1)包被

以pH9.6碳酸盐缓冲液作为包被液，将His-PLO蛋白100ng/mL每孔100μL包被ELISA板，37℃包被1h或者4℃过夜。

(2)洗涤

包被结束后弃掉包被液，用PBST进行洗涤，方法为PBST加满每孔，静置5-10min，弃掉洗液，重新加满，重复洗涤3-5次，最后拍干ELISA板等待下一步封闭。

(3)封闭

取步骤(2)的ELISA板加PBST(内含1％冷水鱼明胶+0.5％PVA)作为封闭液，每孔300μL，37℃2h或者4℃过夜。

(4)洗涤

封闭结束的ELISA板进行洗涤，方法同步骤(2)。最后拍干等待加入一抗(单抗杂交瘤株培养细胞上清或小鼠腹水纯化单抗)。

(5)加入一抗

一抗样品先用PBST稀释后加入到相应孔中，37℃孵育1h。

(6)洗涤

具体同步骤(4)。

(7)加入HRP-标记的商品化二抗

加相应的商品化HRP-标记的二抗，参考二抗说明书，将二抗用封闭液稀释至适当倍数。将稀释好的二抗加入各孔，37℃反应1-1.5h。

(8)洗涤

具体同步骤(4)。

(9)显色

待步骤(8)完成后取100μL TMB底物显色液分加至ELISA各孔中，然后将ELISA板置于37℃反应约10min。

(10)终止

将ELISA板取出，每孔加终止液(1mol/L硫酸溶液)终止反应，立即到酶标仪上读数，TMB为底物时波长为450nm。

实施例4单克隆抗体的制备

4.1免疫动物

将纯化的重组溶血素蛋白His-PLO蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合，乳化后对小鼠(50μg/只)进行颈背部皮下注射。两周后，将纯化的His-PLO蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混合，乳化后对小鼠进行加强免疫。再间隔两周，用二免同样的方法进行第三次免疫。三免后14d，用纯化的His-PLO蛋白(100μg/只)对小鼠进行腹腔注射，3d后，取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。

4.2阳性杂交瘤细胞株的建立

取上述免疫鼠的脾制成细胞悬液与处于对数生长期的SP2/0细胞以8:1的比例进行融合。待融合细胞长至孔底1/2或1/3时，通过间接ELISA(实施例3)筛选出阳性杂交瘤细胞株，再利用有限稀释法连续克隆2～3次。至阳性率为100％后进行扩大培养，冻存于液氮中。最终获得两株杂交瘤细胞株，其中一株命名为AP-1A3，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC NO.11188，保藏日期为2015年8月10日；另外一株命名为AP-4F12，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC NO.11189，保藏日期为2015年8月10日。

4.3单克隆抗体的制备

将筛选得到的杂交瘤细胞进行扩大培养后，以5×10⁶/0.5mL杂交瘤细胞腹腔注射BLAB/C小鼠1ml，14d后待小鼠腹围增大后用注射器收集腹水，1000r/min离心10min，上清以0.45μm滤器过滤后即为腹水mAb粗制品。用饱和硫酸铵沉淀法将腹水进行初步提纯，之后用Protein A亲和层析法将其进一步纯化。

实施例5抗溶血素蛋白Pyolysin(PLO)特异性单克隆抗体的鉴定

(1)单抗亚类鉴定

本实验采用洛阳塞尔维公司生产的小鼠单抗Ig类\亚类鉴定用酶(HRP)标抗体套装进行亚类鉴定，具体操作步骤见说明书。

(2)SDS-PAGE

将纯化后His-PLO，pET-30a(+)-空载体，天然PLO蛋白样品与等体积SDS-PAGE上样缓冲液混合后，120℃煮沸10min，取10μL进行12％SDS-PAGE分析。

(3)Western blot鉴定

1)各蛋白样品经SDS-PAGE后，转印到硝酸纤维素膜上。

2)5％脱脂乳4℃封闭过夜。

3)用PBST洗三次，5min/次，分别以AP-1A3；AP-4F12杂交瘤细胞培养上清以及腹水进行相应稀释，37℃孵育1h。

4)用PBST洗三次，5min/次，洗涤后加入HRP标记的山羊抗鼠IgG(1:5000)，37℃孵育1h。

5)用PBST洗三次，5min/次，洗涤后用4-氯-1-奈酚(4-Chloro-1-Naphthol，4-CN)显色(0.006g 4-CN+2mL甲醇+10mLPBS+200μL 30％双氧水)。

实施例6抗溶血素蛋白Pyolysin(PLO)特异性单克隆抗体所针对抗原表位的确定

(一)plo基因片段的RT-PCR/PCR扩增与表达载体的构建

核酸序列及氨基酸序列的生物信息学分析采用DNAMAN，软件操作参照DNAMAN说明书进行；引物设计采用Primer5.0，软件操作参照Primer5.0说明书进行。

表1引物序列

plo基因片段plo-D123(82-1260)，plo-D4(1261-1602)由王君伟实验室提供；plo基因片段第82-693，649-1260；82-411，364-693；82-264，232-411；232-321，274-381，319-411片段分别以pET-30a(+)-plo重组质粒为模板进行PCR扩增，将这82-693，649-1260；82-411，364-693多肽链构建到表达载体pET30a(+)上,82-264，232-411；232-321，274-381，319-411多肽链构建到表达载体pET32a(+)上，具体实验操作请见《分子克隆技术手册》。应用大肠杆菌E.coli表达系统表达蛋白，具体步骤同实施例1。

(二)plo基因片段的人工合成及表达载体构建

表2直接合成带黏性末端的片段序列及位置列表

对于小于60bp的片段，通过PCR方法获得后回收处理较为困难，因此采用人工合成的方法，将232-279片段(51-66个氨基酸)；238-285片段(53-68个氨基酸)；244-291片段(55-70个氨基酸)；250-297(57-72个氨基酸)；256-303(59-74个氨基酸)；259-306片段(60-75个氨基酸)；262-309片段(61-76个氨基酸)；265-312片段(62-77个氨基酸)；268-315片段(63-78个氨基酸)；271-318(64-79个氨基酸)；250-303片段(57-74个氨基酸)；253-306片段(58-75个氨基酸)；256-309片段(59-76个氨基酸)连接完成后进行表达载体pET32a(+)的构建，具体实验操作请见《分子克隆技术手册》。应用大肠杆菌E.coli表达系统表达蛋白，具体步骤同实施例1。

(三)单抗所针对抗原表位蛋白的Western blot鉴定

将pET30a(+)-plo-D123(82-1260)，pET30a(+)-plo-D4(1261-1602)，pET30a(+)-plo-D123-82-693，pET30a(+)-plo-D123-649-1260；pET30a(+)-plo-D123-82-411，pET30a(+)-plo-D123-364-693，pET32a(+)-plo-D123-82-264，pET32a(+)-plo-D123-233-411；pET32a(+)-plo-D123-232-321，pET32a(+)-plo-D123-274-381，pET32a(+)-plo-D123-319-411，pET32a(+)-plo-D123-232-279，pET32a(+)-plo-D123-238-285，pET32a(+)-plo-D123-244-291，pET32a(+)-plo-D123-250-297，pET32a(+)-plo-D123-256-303，pET32a(+)-plo-D123-259-306，pET32a(+)-plo-D123-262-309，pET32a(+)-plo-D123-265-312，pET32a(+)-plo-D123-268-315，pET32a(+)-plo-D123-271-318，pET-32a(+)-plo-250-303，pET-32a(+)-plo-253-306，pET-32a(+)-plo-256-309所表达蛋白进行SDS-PAGE，具体步骤同实施例5中的步骤(2)。

然后分别以单抗腹水作为一抗，进行Western blot鉴定，具体步骤同实施例4中的步骤(3)。

最后我们获得数据如图1所示。结果显示其中2株单抗都能特异性地结合PLO蛋白，其中AP-1A3mAb为IgG1，AP-4F12mAb为IgG3。如图2所示AP-1A3mAb所针对的抗原表位为第64-79个氨基酸即V P V T K D Q L K D G T Y T V F(SEQ ID NO:1所示)，AP-4F12mAb所针对的抗原表位为第58-75个氨基酸即G E S I E N V P V T K D Q L K D G T(SEQ IDNO:3所示)。所以应用本发明的方法能够高效率的获的针对PLO蛋白的特异性单抗，并且可以筛选出其所针对PLO的抗原表位，可应用于后续研究。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims

1.一种抗化脓隐秘杆菌PLO蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体由保藏编号为CGMCC NO.11188的杂交瘤细胞株分泌产生。

2.一种抗化脓隐秘杆菌PLO蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体由保藏编号为CGMCC NO.11189杂交瘤细胞株分泌产生。

3.一株分泌抗化脓隐秘杆菌PLO蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为AP-1A3，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC NO.11188。

4.一株分泌抗化脓隐秘杆菌PLO蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为AP-4F12，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCCNO.11189。

5.一种化脓隐秘杆菌PLO蛋白的抗原表位多肽，其特征在于，所述的表位多肽与权利要求1所述的单克隆抗体特异性结合，所述的表位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

6.编码权利要求5所述的抗原表位多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。

7.一种化脓隐秘杆菌PLO蛋白的抗原表位多肽，其特征在于，所述的表位多肽与权利要求2所述的单克隆抗体特异性结合，所述的表位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

8.编码权利要求7所述的抗原表位多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示。

9.权利要求1或2所述的单克隆抗体在制备检测或诊断化脓隐秘杆菌PLO蛋白试剂或药物中的应用。

10.权利要求5或7所述的抗原表位多肽在制备检测抗化脓隐秘杆菌PLO蛋白的抗体试剂中的应用。