CN109400684A - 一种pedv s-rbd线性b细胞表位及两株特异性识别单克隆抗体和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种PEDV S‑RBD线性B细胞表位及两株特异性识别单克隆抗体和应用，所述B细胞表位的氨基酸序列为：TIDLFGYP。本发明利用纯化后PEDV S‑RBD重组蛋白免疫BALB/c小鼠，获得单克隆抗体；利用IPMA鉴定其中两株单克隆抗体4D8F10和6F3E3可特异性识别PEDV；利用真核细胞HEK‑293T重组表达PEDV S‑RBD重组蛋白不同片段，通过Dot‑blot鉴定获得的两株单克隆抗体特异性识别PEDV S‑RBD C端区域，序列为TSLLASACTIDLFGYP；利用ELISA进一步鉴定PEDV S‑RBD C端区域合成多肽，鉴定获得的两株单克隆抗体特异性识别序列为TIDLFGYP的线性B细胞表位。本发明鉴定的PEDV S‑RBD线性B细胞表位丰富了PEDV S‑RBD免疫学功能，为后续研究S蛋白抗原漂移提供参考，可应用于抗病毒药物研发。
Description
技术领域
本发明涉及病毒学、分子生物学和免疫学领域，特别是涉及猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)纤突糖蛋白(spike glycoprotein，S)受体结合区(receptor-binding domain，RBD)线性B细胞表位及两株特异性识别单克隆抗体和应用。
背景技术
猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDvirus，PEDV)引起的一种高度接触性猪肠道传染病，以发病猪呕吐、水样腹泻、脱水为主要特征。PED对各年龄阶段的猪都会造成影响，尤其对7日龄以内的哺乳仔猪具有高致死性，病死率高达100％。PED造成了我国养猪业巨大的经济损失，已成为制约我国养猪业健康发展的传染病之一。PEDV是一种具有囊膜的单股正链RNA病毒，属于套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)α-型冠状病毒属(Alphacoronavirus)，具有冠状病毒特征性的囊膜“纤突”(spike)结构。其中，PEDV纤突糖蛋白(spike glycoprotein，S)第505位氨基酸至第629位氨基酸为该病毒受体结合区(receptor binding domain，RBD)，参与病毒结合宿主细胞表面受体进而入侵宿主细胞等关键过程，发挥着重要的致病和免疫学功能。然而，对于PEDV S-RBD抗原表位鉴定及其免疫识别等问题尚有待全面解决。
发明内容
针对现有研究的不足，本发明的目的是提供一种PEDV S-RBD线性B细胞表位，并提供特异性识别该表位的单克隆抗体。为鉴定本发明线性B细胞表位和两株单克隆抗体具有免疫学功能，利用所述单克隆抗体分别对含有该线性B细胞表位的多肽、蛋白、PEDV进行识别，结果表明所述PEDV S-RBD线性B细胞表位可被特异性识别。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种PEDV S-RBD线性B细胞表位，其氨基酸序列为：TIDLFGYP。
特异性识别PEDV S-RBD线性B细胞表位的两株单克隆抗体4D8F10和6F3E3，其特征在于，特异性识别含有PEDV S-RBD线性B细胞表位序列的多肽、蛋白及PEDV。
一种PEDV S-RBD线性B细胞表位在制备PED及PEDV诊断试剂或药物中的应用。
编码PEDV S-RBD线性B细胞表位的核苷酸序列。
所述核苷酸序列为ACCATAGATCTTTTTGGTTACCCT。
任何对所述核苷酸序列的优化。
本发明利用果蝇胚胎S2细胞表达系统表达PEDV S-RBD重组蛋白，经金属镍亲和层析和凝胶过滤层析两步纯化步骤获得高纯度，具有生物学活性和免疫原性的目的蛋白用于后续研究。
本发明利用纯化后PEDV S-RBD重组蛋白免疫BALB/c小鼠，获得单克隆抗体；利用免疫过氧化物酶单层细胞试验(immunoperoxidase monolayer assay，IPMA)鉴定其中两株单克隆抗体4D8F10和6F3E3可特异性识别PEDV；利用真核细胞HEK-293T重组表达PEDV S-RBD重组蛋白不同片段，通过Dot-blot鉴定获得的两株单克隆抗体特异性识别PEDV S-RBDC端区域，序列为TSLLASACTIDLFGYP；利用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked
immunosorbent assay，ELISA)进一步鉴定PEDV S-RBD C端区域合成多肽，鉴定获得的两株单克隆抗体特异性识别序列为TIDLFGYP的线性B细胞表位。
本发明有益效果：
1、本发明综合利用病毒学、分子生物学和免疫学等技术，鉴定了一种PEDV S-RBD的全新线性B细胞表位，利用本发明制备的两株单克隆抗体对含有PEDV S-RBD线性B细胞表位的多肽、蛋白、PEDV进行识别，表明该PEDV S-RBD线性B细胞表位可被特异性识别；
2、本发明鉴定的PEDV S-RBD线性B细胞表位丰富了PEDV S-RBD免疫学功能，为后续研究S蛋白抗原漂移提供参考，可应用于抗病毒药物研发；
3、本发明制备的两株单克隆抗体可特异识别PEDV，可为PED及PEDV鉴别诊断提供新的工具。
附图说明
图1是PEDV S-RBD PCR产物及鉴定结果。
图中，A：1：PCR产物，M：DL 2000DNA marker；B：1-3：PCR鉴定产物，4：空载质粒对照，M：DL 2000DNA marker。
图2是PEDV S-RBD重组表达Western blot鉴定结果。
图中，M：蛋白marker，1：PEDV S-RBD。
图3是PEDV S-RBD重组蛋白纯化及鉴定结果。
图中，280nm吸光度下17.8mL洗脱峰为目的蛋白；M：蛋白marker，1：非还原条件下PEDV S-RBD重组蛋白，2：还原条件下PEDV S-RBD重组蛋白，3：经去糖基化后PEDV S-RBD重组蛋白。
图4是PEDV免疫阳性血清鉴定PEDV S-RBD重组蛋白。
图中，M：蛋白marker，1：PEDV免疫阳性血清鉴定PEDV S-RBD重组蛋白。
图5是IMPA鉴定制备的PEDV S-RBD单克隆抗体。
图中，A：单克隆抗体4D8F10杂交瘤细胞上清，B：单克隆抗体6F3E3杂交瘤细胞上清，C：PEDV免疫阳性血清，D：阴性杂交瘤细胞上清。
图6是Dot-blot鉴定制备的PEDV S-RBD单克隆抗体识别的PEDV S-RBD片段。
图7是ELISA鉴定制备的PEDV S-RBD单克隆抗体识别的PEDV S-RBD线性B细胞表位。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1.PEDV S-RBD重组蛋白构建、表达、纯化与鉴定
1.1PEDV S-RBD真核表达载体构建
将PEDV CH/HNXC毒株S-RBD基因序列交由生工生物工程(上海)股份有限公司进行密码子优化合成作为PCR模板，以S505-629F(上游引物)：5’-GGAAGATCTCCATCGTTCAACGATCACAGCT-3’(SEQ ID NO.1)、S505-629R(下游引物)：5’-CGACGCGTGGTGATCAGCTCTCCCTTTGTG-3’(SEQ ID NO.2)为引物PCR扩增S-RBD cDNA，在PCR产物两端分别引入Bgl II和Mlu I酶切位点(下划线为酶切位点)。PCR反应体系为50μL：5×HF缓冲液10μL，S505-629F、S505-629R各2.5μL(10μM)，2.5mM dNTPs 4μL，Phusion DNA聚合酶1μL(2U/μL)，模板0.5μL(50ng)，加ddH2O至50μL。PCR反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸2min 30s，35个循环；72℃再延伸10min，16℃5min结束反应。PCR目的产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，如图1A结果显示，表明扩增出了与预期大小相同的特异性核酸条带。经Bgl II和Mlu I双酶切获得的目的片段插入表达载体pMT/BiP/V5-His A(美国Invitrogen公司)相应酶切位点，将重组pMT/BiP/S-RBD-His表达载体转化大肠杆菌克隆菌株Trans5α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，挑取单克隆经PCR鉴定阳性后交由生工生物工程(上海)股份有限公司鉴定。如图1B结果显示扩增出了与预期大小相同的条带，表明PEDV S-RBD基因已定向插入到表达载体中，获得重组了表达质粒pMT/BiP/S-RBD-His。
1.2 PEDV S-RBD重组蛋白表达及Western blot检测
将鉴定正确的pMT/BiP/S-RBD-His重组表达载体与pCoBlast筛选载体按操作说明使用II Reagent阳离子脂质体转染试剂共转染果蝇胚胎Drosophila Schneider2(S2)细胞(美国Invitrogen公司)，经25μg/mL杀稻瘟菌素(blasticidin，美国Invitrogen公司)筛选获得稳定转染细胞株。使用无血清昆虫细胞培养基(serum-free medium，SFM)Sf-900II(美国Invitrogen公司)扩大培养稳定转染的S2细胞株，待细胞密度达到3～6×106个/mL时加入终浓度0.75mM的CuSO4溶液进行诱导表达。诱导5d后离心(4℃，2000rpm，10min；4℃，10000rpm，30min)收取诱导表达上清液。取部分上清液经15％SDS-PAGE后，将电泳分离的蛋白转到聚偏二氟乙烯膜(PVDF，美国Millipore公司)，依次加入小鼠抗组氨酸标签抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体(武汉三鹰生物技术有限公司)进行孵育，使用超敏化学发光(ECL)试剂(北京索莱宝科技有限公司)显色检测目的蛋白。因目的蛋白融合有组氨酸标签，取诱导表达产物经抗组氨酸标签Western blot检测，在与预期大小相同15kDa左右处出现一条明显的特征蛋白质表达带，表明目的蛋白表达(图2)。
1.3 PEDV S-RBD重组蛋白纯化及鉴定
取1L诱导表达上清液，使用0.22μm滤膜(美国Millipore公司)过滤后，依次使用美国GE公司HisTrap excel预装柱、Superdex 200increase 10/300GL预装柱对诱导表达上清液进行金属镍亲和层析和凝胶过滤层析纯化。以20mM Tris-HCl(pH 7.6)，150mM NaCl为纯化洗脱液，收集的纯化蛋白分别在还原(加β-巯基乙醇)和非还原(不加β-巯基乙醇)条件下进行15％SDS-PAGE检测；同时取部分纯化蛋白使用去糖基化酶(PNGase F，美国NewEngland Biolabs公司)进行处理，进行15％SDS-PAGE检测目的蛋白糖基化情况。另取纯化蛋白上清液经15％SDS-PAGE后，将电泳分离的蛋白转到PVDF膜，依次加入PEDV免疫小鼠阳性血清和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体进行孵育，使用ECL试剂显色检测目的蛋白。
结果表明，经纯化后PEDV S-RBD目的蛋白在凝胶过滤层析的洗脱峰(17.8mL)单一，纯度高达99％；SDS-PAGE显示目的蛋白在非还原和还原条件下及经去糖基化处理后条带发生变化，表明目的蛋白含有二硫键和糖基化修饰，与预期相符(图3)。使用PEDV免疫阳性血清检测，PEDV S-RBD重组蛋白可被特异性识别(图4)，证明重组蛋白具有与PEDV相当的免疫原性。
实施例2.PEDV S-RBD重组蛋白单克隆抗体制备与鉴定
2.1 PEDV S-RBD重组蛋白单克隆抗体制备
选取5只无特定病原体(SPF)级6-8周龄BALB/c雌性小鼠，首次免疫时按50μg PEDVS-RBD重组蛋白(添加有美国Sigma公司弗氏完全佐剂)/100μL·只小鼠进行免疫。间隔3周后，添加弗氏不完全佐剂(美国Sigma公司)按首次免疫剂量免疫。间隔3周后，进行第三次免疫，步骤同第二次免疫。间隔两周后，进行第四次免疫，步骤同第三次免疫。超级免疫在细胞融合前3-4d进行，超级免疫时直接进行腹腔注射，按100μg PEDV S-RBD重组蛋白/100μL·只免疫(不添加佐剂)。取超级免疫后小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞按照1:5混合在一起，添加50％PEG1500(美国Sigma公司)进行融合。细胞融合10d后，融合的杂交瘤细胞形成克隆并且占据一定面积的细胞培养孔。经免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)初步鉴定后，将阳性杂交瘤细胞克隆转移到24孔细胞培养板中，通过有限稀释法进行单克隆化，确保获得稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经IPMA鉴定单克隆阳性孔、收集细胞上清并将有效的阳性单克隆进行小鼠腹水制备，备用。
2.2免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)鉴定PEDV S-RBD单克隆抗体
以200TCID50PEDV CH/hubei/2016毒株接种非洲绿猴肾上皮Vero易感细胞单层覆盖的96孔细胞板，当细胞出现明显病变时用含3％(v/v)H2O2的甲醇固定细胞制备IPMA反应板。将杂交瘤细胞上清液按50μL/孔加至IPMA反应板，以PEDV免疫阳性血清和阴性杂交瘤细胞上清液作对照，再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体作为二抗，3-氨基-9-乙基咔唑(AEC，北京索莱宝科技有限公司)为显色底物，倒置显微镜下观察分析细胞染色情况。
经IPMA鉴定，如图5A和图5B制备的单克隆抗体4D8F10和6F3E3对感染有PEDV的细胞有清晰细胞质染色，这与PEDV免疫阳性血清染色情况类似(图5C)，而阴性杂交瘤细胞上清不能染色(图5D)，表明这两株单克隆抗体可特异识别PEDV CH/hubei/2016毒株。
实施例3.Dot-blot鉴定单克隆抗体识别PEDV S-RBD区域
3.1 PEDV S-RBD片段重组表达载体构建
表1.PEDV S-RBD截短片段引物序列
注：下划线表示引入的限制性内切酶切割位点。
以PEDV CH/HNXC毒株S-RBD cDNA作为PCR模板，以表1中引物PCR扩增PEDV S-RBD不同片段基因，在PCR产物两端分别引入EcoR I和Nco I酶切位点。PCR目的产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，经双酶切获得的目的片段插入表达载体pFuse-hIgG1-Fc2载体(美国InvivoGen公司)相应酶切位点，将重组表达载体转化大肠杆菌克隆菌株JM109感受态细胞(TaKaRa公司)，挑取单克隆经PCR鉴定阳性后交由生工生物工程(上海)股份有限公司鉴定。
3.2 PEDV S-RBD片段重组表达
将鉴定正确的重组表达载体转染人胚肾上皮细胞293T(HEK-293T)。扩大培养转染细胞，转染48h后离心收取细胞上清液。上清液经Protein A亲和层析纯化后，在硝酸纤维素膜(美国Millipore公司)上点印重组表达的不同PEDV S-RBD片段，以人源IgG1型抗体的Fc区段为对照，依次加入兔抗人源IgG Fc抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体进行孵育，使用ECL试剂显色检测目的蛋白。
如图6结果显示，同人源IgG1型抗体的Fc区段(hFc)阳性对照一样，PEDV S-RBD不同片段均有表达(呈现黑色颜色反应阳性点)。
3.3 Dot-blot鉴定PEDV S-RBD单克隆抗体识别区域
确认目的蛋白表达后，在硝酸纤维素膜上点印重组表达的不同PEDV S-RBD片段。自然干燥后，将印迹膜37℃封闭1h；依次加入制备的PEDV S-RBD单克隆抗体4D8F10和6F3E3、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体进行孵育。使用ECL试剂显色判定，以阳性点呈现黑色颜色反应，阴性点不出现颜色反应进行判定。
如图6结果显示，序列为TSLLASACTIDLFGYP的C-C1区域可被制备的单克隆抗体4D8F10和6F3E3特异性识别。
实施例4.酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴定PEDV S-RBD单克隆抗体识别的线性B细胞表位
根据上一步鉴定的区域，分别通过N端截短和C端截短合成图7中多肽。合成多肽经鉴定序列正确，纯度均可达到95％以上。使用DMSO溶解合成多肽，加入0.01M盐酸将pH值调至4-5；加入含1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC，购自美国Thermo公司)反应液，室温反应15min；稀释牛血清白蛋白(BSA)，逐滴加入到合成多肽反应液中，混匀后室温反应2h，形成BSA-多肽备用。以5mg/mL浓度将BSA-多肽按100μL/孔包被96孔酶标板，4℃孵育过夜后，加入含5％(w/v)脱脂奶粉封闭液封闭。加入制备的PEDV S-RBD单克隆抗体4D8F10和6F3E3的杂交瘤细胞上清液(1:100稀释，每孔加100μL)，37℃孵育1h，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体和3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB，美国Sigma公司)室温避光反应5min，使用2M浓硫酸终止反应，并读取450nm的吸光值，检测PEDV S-RBD单克隆抗体4D8F10和6F3E3与酶标板上BSA-多肽的结合；同时以不结合小鼠IgG的BSA为阴性对照。样品OD450值与阴性对照OD450值的比值大于或等于2.2时可判定为阳性，其它则为阴性。
经ELISA鉴定，单克隆抗体4D8F10和6F3E3与N端截短片段结合OD450值与阴性对照OD450值的比值均大于2.2，表明单克隆抗体4D8F10和6F3E3均可以和N端截短至T8P(TIDLFGYP)的片段结合；而单克隆抗体4D8F10和6F3E3仅与C端截短片段中T16P和T15Y结合OD450值与阴性对照OD450值的比值大于2.2，表明单克隆抗体4D8F10和6F3E3仅能与C端截短片段中T16P和T15Y结合，说明这两株单克隆抗体结合的位点位于T16P的C端。综上所述，制备的2株单克隆抗体4D8F10和6F3E3识别的B细胞表位序列为TIDLFGYP(SEQ ID NO.24)，为线性表位(图7，图7为三次重复实验结果的平均值)，其编码序列为ACCATAGATCTTTTTGGTTACCCT(SEQ ID NO.25)。
以上所述仅为本发明较佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 河南省农业科学院
<120> 一种PEDV S-RBD线性B细胞表位及两株特异性识别单克隆抗体和应用
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cgacgcgtgg tgatcagctc tccctttgtg 30
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
ccggaattcg ccctccttca acgaccat 28
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
catgccatgg catcctggga cttgctcac 29
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
ccggaattcg gtgagcaagt cccaggat 28
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
catgccatgg ctgtaatgag ctcccccttt 30
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
ccggaattcg ccctccttca acgaccat 28
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
catgccatgg ccacgcaaaa ggaagagaa 29
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
ccggaattcg atcaacggat tctcttcc 28
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
catgccatgg catcctggga cttgctcac 29
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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ccggaattcg gtgagcaagt cccaggat 28
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<400> 12
catgccatgg ctgtgcaggc gctggccag 29
<210> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
ccggaattcg actagcctgc tggccagc 28
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 14
catgccatgg ctgtaatgag ctcccccttt 30
<210> 15
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 15
aattcgacta gcctgctggc cagcgcctgc acaattgacc tgttcggcta ccctgc 56
<210> 16
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 16
catggcaggg tagccgaaca ggtcaattgt gcaggcgctg gccagcaggc tagtcg 56
<210> 17
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 17
aattcgttcg gctaccctga gttcgggtcc ggagtgaagt ttaccagcct ctacgc 56
<210> 18
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 18
catggcgtag aggctggtaa acttcactcc ggacccgaac tcagggtagc cgaacg 56
<210> 19
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 19
aattcgacca gcctctactt ccagtttaca aagggggagc tcattacagc 50
<210> 20
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 20
catggctgta atgagctccc cctttgtaaa ctggaagtag aggctggtcg 50
<210> 21
<211> 16
<212> PRT
<213> 猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus)
<400> 21
Thr Ser Leu Leu Ala Ser Ala Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro
1 5 10 15
<210> 22
<211> 16
<212> PRT
<213> 猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus)
<400> 22
Phe Gly Tyr Pro Glu Phe Gly Ser Gly Val Lys Phe Thr Ser Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 23
<211> 14
<212> PRT
<213> 猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus)
<400> 23
Thr Ser Leu Tyr Phe Gln Phe Thr Lys Gly Glu Leu Ile Thr
1 5 10
<210> 24
<211> 8
<212> PRT
<213> 猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus)
<400> 24
Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro
1 5
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 25
accatagatc tttttggtta ccct 24
Claims (6)
1.一种PEDV S-RBD线性B细胞表位，其特征在于，其氨基酸序列为：TIDLFGYP。
2.特异性识别PEDV S-RBD线性B细胞表位的两株单克隆抗体4D8F10和6F3E3，其特征在于，特异性识别含有权利要求1所述PEDV S-RBD线性B细胞表位序列的多肽、蛋白及PEDV。
3.一种权利要求1所述的PEDV S-RBD线性B细胞表位在制备PED及PEDV诊断试剂或药物中的应用。
4.编码如权利要求1所述PEDV S-RBD线性B细胞表位的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的编码PEDV S-RBD线性B细胞表位的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列为ACCATAGATCTTTTTGGTTACCCT。
6.根据权利要求5所述的编码PEDV S-RBD线性B细胞表位的核苷酸序列，其特征在于，任何对所述核苷酸序列的优化。
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