CN111925447B

CN111925447B - 一种人鼠卵透明带融合蛋白及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111925447B
Application number: CN202010753245.7A
Authority: CN
Inventors: 曹佐武
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2020-07-30
Filing date: 2020-07-30
Publication date: 2022-12-13
Anticipated expiration: 2040-07-30
Also published as: CN111925447A

Abstract

本发明提供了一种人鼠卵透明带融合蛋白及其制备方法和应用。所述人鼠卵透明带融合蛋白，由人类卵透明带肽段和小鼠卵透明带肽段组成，兼有两个物种的卵透明带蛋白，可以表达产生人透明带和小鼠透明带的融合蛋白，可以一次性表达、一次性免疫、一次性分离制备抗人透明带和小鼠透明带的两种抗体，用于人类和小鼠两类常用材料的实验，节省人力物力，又不影响实验效果。

Description

一种人鼠卵透明带融合蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体地，涉及一种人鼠卵透明带融合蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

透明带是卵细胞外的一层细胞外壳，在卵子发育和受精中有重要作用，是受精研究的重要靶标分子，是发展避孕疫苗的候选抗原。因此抗透明带抗体是受精和发育研究中的重要工具。但由于天然来源很有限，传统制备抗透明带抗体的方法受到很大的制约，现在制备抗体主要通过基因表达获得透明带抗原，由于透明带分子结构的特殊性，给透明带的制备带来一些实际困难，因此目前市场上的抗透明带抗体较昂贵。透明带是高度特异的蛋白质，既有组织特异性，分布于卵巢组织中，又有种族特异性，不同种动物的透明带有免疫特异性。因此要分别制备各自的抗体，然而目前抗体造价较高。

由于人类透明带和小鼠透明带是当今实验研究使用很多的实验材料，不同物种间的卵透明带有明显的种族特异性。实际上，不同动物的研究在不同体系中进行，用于不同动物的抗透明带抗体在不同的研究体系不存在干扰现象，而实验研究中，往往不会几物种材料同时做实验，尤其是人源实验材料不会与其它动物来源的实验材料同时安排在一个实验体系里，不涉及不同物种间的抗透明带抗体的交叉干扰。但是目前，关于人类透明带和小鼠透明带抗体的制备均是先各自分别制备不同的透明带抗原，再免疫分别制备各自的抗体，例如：乜春城等(2011)制备了小鼠ZP2肽(乜春城，禹艳红，谢妍，曹佐武.小鼠ZP2肽的基因克隆和原核表达载体的构建.暨南大学学报(医学版)2011,32(4):374～378))，曹佐武等(2013)制备了人ZP3肽(曹佐武，徐放，谢琪璇，乜春城，姚冠颖。人ZP3的N端肽的体外表达.暨南大学学报(医学版)2013，34(6)：583-587)；不仅费时费力，且成本较高。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种人鼠卵透明带融合蛋白。

本发明的另一目的在于提供所述人鼠卵透明带融合蛋白的制备方法。

本发明的再一目的在于提供所述人鼠卵透明带融合蛋白的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种人鼠卵透明带融合蛋白，由人卵透明带蛋白成分和小鼠透明带蛋白成分组成。

本发明设计了一种融合蛋白，由人类的卵透明带蛋白成分和小鼠的透明带蛋白成分组成，兼有两个物种的卵透明带蛋白。由于卵透明带蛋白是多表位的大分子，包含有许多抗原决定簇，许多不同的片段都可以诱发抗体，因此可以选用人类的卵透明带蛋白和小鼠的透明带蛋白中不同的肽段组成融合蛋白，以诱发产生两种不同的特异性抗体。可以一次性表达、一次性免疫、一次性分离制备抗人透明带和小鼠透明带的两种抗体，用于人类和小鼠两类常用材料的实验，节省人力物力，又不影响实验效果。

具体地，所述人鼠卵透明带融合蛋白由人卵透明带蛋白中具有抗原表位的肽段和小鼠透明带蛋白中具有抗原表位的肽段。本发明对融合蛋白中的人或鼠的卵透明带肽段的序列不做任何限定，任何可以诱发动物机体产生抗体的人或鼠的卵透明带蛋白中的肽段均在本发明保护范围内。

透明带有ZP1，ZP2，ZP3三种成分组成，其中ZP2和ZP3是较重要的成分。优选地，本发明提供一种人鼠卵透明带融合蛋白，包含hZP3 23～231肽段和mZP2 192～505肽段，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。由人透明带3肽成分和小鼠透明带2肽成分组成，是由hZP3+mZP2，两种不同物种和不同类型透明带蛋白搭配的融合蛋白。

优选地，编码SEQ ID NO：1所示融合蛋白的融合基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。可以表达产生人透明带和小鼠透明带的融合蛋白，可以通过基因重组技术制备编码人卵透明带肽段和小鼠卵透明带肽段的DNA序列或人工合成。

优选地，所述融合蛋白的C端连接有6×His标签肽，用于纯化融合蛋白。

本发明还提供所述融合蛋白的制备方法，先构建体外表达所述融合蛋白的表达载体，再转化宿主菌，诱导表达产生融合蛋白；或直接人工合成目标融合蛋白序列。

优选地，所述包含hZP3 23～231肽段和mZP2 192～505肽段的融合蛋白是将pGEM-hZP3载体上的编码人ZP3的23～231肽段的DNA插入到pET-mZP2表达载体多克隆位点N端的BamHI和EcoRI位点之间，构建表达hZP3 23～231肽和mZP2 192～505融合蛋白的表达载体，再转化宿主菌，诱导表达产生融合蛋白。

进一优选地，所述表达载体为pET原核表达载体。

进一优选地，所述宿主菌为大肠杆菌。

进一优选地，所述诱导表达为将宿主菌于35～37℃培养至OD600达0.4～0.6时，加入IPTG至终浓度0.8～1.2mmol/L，诱导表达6～10h。

本发明还提供所述人鼠卵透明带融合蛋白在制备抗人卵透明带抗体和/或抗小鼠卵透明带的抗体中的应用。

具体地，所述应用为将所述融合蛋白与免疫佐剂混合后免疫动物机体，取血分离血清。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明设计了同时含有人透明带成分和小鼠透明带成分的融合蛋白，可以表达产生人透明带和小鼠透明带的融合蛋白，可以一次性表达、一次性免疫、一次性分离制备抗人透明带和小鼠透明带的两种抗体，用于人类和小鼠两类常用材料的实验，节省人力物力，又不影响实验效果。

附图说明

图1为pET-hZP3mZP2重组质粒的图谱。

图2为表达产物的SDS-PAGE电泳图。

图3为抗血清与小鼠卵巢切片反应，右图表示Cy3荧光标记抗体与小鼠卵透明带特异结合(红色箭头所指)，左图为白光照片，说明血清含有抗小鼠透明带抗体。

图4为用抗血清与人卵进行免疫细胞化学实验，FITC荧光标记抗体能与卵细胞外的透明带特异结合(左图)，说明抗血清含有抗人透明带抗体。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

大肠杆菌E.coliDH5α、Rosetta-gami(DE3)pLysS菌株、载体pET21b

实施例1 hZP3和mZP2融合蛋白的制备

1、制备hZP3和mZP2嵌合肽的重组基因

(1)制备pET-mZP2质粒

该质粒是pET改造的mZP2的表达载体(见参考文献1：乜春城，禹艳红，谢妍，曹佐武.小鼠ZP2肽的基因克隆和原核表达载体的构建.暨南大学学报(医学版)2011,32(4):374～378)。

mZP2肽段为小鼠ZP2编码DNA的604～1545片段，插入在多克隆位点的EcoRI和XhoI位点之间，可编码mZP2中段的192～505肽，后带有6X His标签肽的DNA序列，上游备有一个BamHI位点。

----BamH I-EcoR I-

-Xho I-

---

DNA序列如下：

ATGGGTCGGGATCCGAATTCACCCTTGAAGGATGCCATAGTACAAGGATTTAATCTTCTGATTGACAGCCAGAAAGTAACTCTCCACGTGCCAGCCAATGCTACTGGAATAGTTCACTATGTGCAAGAGAGCAGCTATCTCTATACTGTGCAGCTGGAGCTCTTGTTCTCAACCACTGGGCAGAAGATCGTCTTCTCATCACACGCTATCTGCGCACCAGATCTTTCTGTGGCTTGTAATGCTACACACATGACTCTCACTATACCAGAATTTCCTGGGAAGCTAGAGTCTGTGGACTTTGGACAATGGAGCATCCCTGAGGACCAATGGCATGCCAATGGAATTGACAAAGAAGCAACAAATGGCTTGAGATTGAATTTCAGAAAATCTCTCCTGAAAACTAAACCCTCTGAAAAATGTCCATTCTACCAGTTCTACCTCTCTTCACTCAAGCTGACCTTCTACTTCCAAGGGAACATGCTATCCACAGTGATAGATCCTGAGTGCCACTGTGAGTCACCAGTCTCTATAGATGAACTGTGTGCACAGGATGGGTTTATGGACTTTGAGGTCTACAGCCACCAAACAAAACCCGCACTGAACCTGGACACCCTCCTGGTGGGAAATTCCTCTTGCCAGCCTATTTTCAAGGTGCAGTCTGTGGGGCTTGCAAGGTTTCACATACCTCTGAATGGATGTGGAACAAGGCAGAAATTTGAAGGTGATAAAGTCATCTATGAGAATGAAATACATGCTCTCTGGGAAAACCCACCCTCCAACATTGTATTCAGAAACAGCGAGTTCAGGATGACAGTAAGATGCTATTACATCAGAGACAGTATGCTACTAAATGCCCATGTCAAAGGACATCCTTCTCCAGAGGCCTTTGTAAAGCCAGGCCCACTGGTGTTGGTCCTACAAACATACCCAGACCAATCCTACCAACGGCCTTACAGGAAGGATCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA

把该质粒导入大肠杆菌E.coliDH5α，扩增后提取载体质粒pET-mZP2。

(2)制备编码hZP3 23～231肽的DNA序列

通过PCR技术从现有的人ZP3基因的表达载体pGEBhZ3.2(参考文献2：曹佐武，徐放，谢琪璇，乜春城，姚冠颖。人ZP3的N端肽的体外表达。暨南大学学报(医学版)2013，34(6)：583-587)制备编码hZP3 23～231肽的DNA序列(76～703)；

设计PCR引物序列如下：

引物F：5’-ATGGATCCCCAACCCCTCTGGCTCTT-3’；

引物R：5’-CGAATTCGTGTGATAAGGGGAGGCATTC-3’。

PCR扩增制备hZP3 23～231肽的DNA序列(76～703)，测序验证得知，获得hZP3 DNA片段76～703，5’带有BamHI位点，3’端含有EcoRI位点。

BamH I—

—EcoR I

ATGGATCCCCAACCCCTCTGGCTCTTGCAGGGTGGAGCCAGCCATCCTGAGACGTCCGTACAGCCCGTACTGGTGGAGTGTCAGGAGGCCACTCTGATGGTCATGGTCAGCAAAGACCTTTTTGGCACCGGGAAGCTCATCAGGGCTGCTGACCTCACCTTGGGCCCAGAGGCCTGTGAGCCTCTGGTCTCCATGGACACAGAAGATGTGGTCAGGTTTGAGGTTGGACTCCACGAGTGTGGCAACAGCATGCAGGTAACTGACGATGCCCTGGTGTACAGCACCTTCCTGCTCCATGACCCCCGCCCCGTGGGAAACCTGTCCATCGTGAGGACTAACCGCGCAGAGATTCCCATCGAGTGCCGCTACCCCAGGCAGGGCAATGTGAGCAGCCAGGCCATCCTGCCCACCTGGTTGCCCTTCAGGACCACGGTGTTCTCAGAGGAGAAGCTGACTTTCTCTCTGCGTCTGATGGAGGAGAACTGGAACGCTGAGAAGAGGTCCCCCACCTTCCACCTGGGAGATGCAGCCCACCTCCAGGCAGAAATCCACACTGGCAGCCACGTGCCACTGCGGTTGTTTGTGGACCACTGCGTGGCCACACCGACACCAGACCAGAATGCCTCCCCTTATCACAC GAATTCACCC

(3)构建hZP3/mZP2嵌合肽基因的表达载体

用BamHI和EcoRI内切酶分别与步骤(2)的hZP3扩增DNA片段和步骤(1)的载体质粒pET-mZP2孵育，37℃酶切3小时，然后琼脂糖胶电泳，分离纯化酶切后的hZP3 DNA片段和pET-mZP2双酶切载体DNA链。

取纯化后的双酶切hZP3 DNA片段和pET-mZP2载体DNA链，按10:1的分子数比混合，用T4 DNA连接酶将hZP3 DNA片段连接到pET-mZP2双酶切载体BamHI和EcoRI位点之间形成环型重组质粒。

用重组质粒连接液转化DH5α菌后挑克隆筛选重组质粒，进一步酶切鉴定，获得hZP3/mZP2嵌合肽的重组质粒pET-hZP3mZP2，即：BamHI-

—EcoRI-

-XhoI-

其质粒图谱如图1所示。

2、利用IPTG诱导表达该嵌合肽基因，获得约60kD的表达产物

将表达载体pET-hZP3mZP2导入Rosetta细菌中，37℃培养至OD600达0.4～0.6时，加入化学诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L，诱导表达8h。诱导表达后，离心收集菌体，经超声波破碎细菌，分离细菌裂解后的上清和沉淀，用尿素溶解沉淀，进行SDS-PAGE分析，结果如图2所示，表明成功获得表达含人透明带成分和小鼠透明带成分的融合蛋白。

实施例2 hZP3和mZP2融合蛋白分离及制备抗血清

1、人鼠透明带嵌合肽表达产物分离

裂解细菌得到的表达产物沉淀用2M的尿素洗涤后再用高浓度的尿素溶解，再通过透析分离到透明带表达产物溶液。SDS-PAGE电泳结果(图2)显示，透明带基因转化菌产生了大量的表达产物(泳道2)，分子量约为60kD。利用C端的6个组氨酸标签肽分离纯化该透明带嵌合肽的表达产物。

2、抗血清制备

分别取该透明带基因表达产物和对照菌裂解液与弗氏佐剂混合后免疫大白兔，共免疫5次后，取血分离血清。

3、抗血清的免疫特异性鉴定

(1)用抗血清与小鼠卵巢切片进行免疫组化实验，检验抗血清与小鼠卵透明带的特异反应，免疫荧光显示卵巢切片的卵透明带发现荧光信号，结果如图3所示，说明血清含有抗小鼠透明带抗体。

(2)用抗血清与人卵透明带反应

取临床IVF剩余的卵细胞，分别用对照兔血清和免疫抗血清与卵细胞进行免疫细胞化学实验，免疫荧光标记显示，抗血清组的人卵透明带有强荧光信号，结果如图4所示，说明抗血清含有抗人透明带抗体。

以上结果说明，制备的抗血清既含有抗人卵透明带抗体，也含有抗小鼠卵透明带抗体。证明表达产物兼有人卵透明带抗原和小鼠卵透明带抗原，可以用于同时制备两种抗体。表明可将人卵透明带蛋白中具有抗原表位的肽段和小鼠透明带蛋白中具有抗原表位的肽段组成融合蛋白，一次性表达、一次性免疫、一次性分离制备抗人透明带和小鼠透明带的两种抗体，用于人类和小鼠两类常用材料的实验，节省人力物力，又不影响实验效果。

序列表

<110> 暨南大学

<120> 一种人鼠卵透明带融合蛋白及其制备方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 524

<212> PRT

<213> 人-鼠(human-mouse)

<400> 1

Gln Pro Leu Trp Leu Leu Gln Gly Gly Ala Ser His Pro Glu Thr Ser

1 5 10 15

Val Gln Pro Val Leu Val Glu Cys Gln Glu Ala Thr Leu Met Val Met

20 25 30

Val Ser Lys Asp Leu Phe Gly Thr Gly Lys Leu Ile Arg Ala Ala Asp

35 40 45

Leu Thr Leu Gly Pro Glu Ala Cys Glu Pro Leu Val Ser Met Asp Thr

50 55 60

Glu Asp Val Val Arg Phe Glu Val Gly Leu His Glu Cys Gly Asn Ser

65 70 75 80

Met Gln Val Thr Asp Asp Ala Leu Val Tyr Ser Thr Phe Leu Leu His

85 90 95

Asp Pro Arg Pro Val Gly Asn Leu Ser Ile Val Arg Thr Asn Arg Ala

100 105 110

Glu Ile Pro Ile Glu Cys Arg Tyr Pro Arg Gln Gly Asn Val Ser Ser

115 120 125

Gln Ala Ile Leu Pro Thr Trp Leu Pro Phe Arg Thr Thr Val Phe Ser

130 135 140

Glu Glu Lys Leu Thr Phe Ser Leu Arg Leu Met Glu Glu Asn Trp Asn

145 150 155 160

Ala Glu Lys Arg Ser Pro Thr Phe His Leu Gly Asp Ala Ala His Leu

165 170 175

Gln Ala Glu Ile His Thr Gly Ser His Val Pro Leu Arg Leu Phe Val

180 185 190

Asp His Cys Val Ala Thr Pro Thr Pro Asp Gln Asn Ala Ser Pro Tyr

195 200 205

His Leu Pro Leu Lys Asp Ala Ile Val Gln Gly Phe Asn Leu Leu Ile

210 215 220

Asp Ser Gln Lys Val Thr Leu His Val Pro Ala Asn Ala Thr Gly Ile

225 230 235 240

Val His Tyr Val Gln Glu Ser Ser Tyr Leu Tyr Thr Val Gln Leu Glu

245 250 255

Leu Leu Phe Ser Thr Thr Gly Gln Lys Ile Val Phe Ser Ser His Ala

260 265 270

Ile Cys Ala Pro Asp Leu Ser Val Ala Cys Asn Ala Thr His Met Thr

275 280 285

Leu Thr Ile Pro Glu Phe Pro Gly Lys Leu Glu Ser Val Asp Phe Gly

290 295 300

Gln Trp Ser Ile Pro Glu Asp Gln Trp His Ala Asn Gly Ile Asp Lys

305 310 315 320

Glu Ala Thr Asn Gly Leu Arg Leu Asn Phe Arg Lys Ser Leu Leu Lys

325 330 335

Thr Lys Pro Ser Glu Lys Cys Pro Phe Tyr Gln Phe Tyr Leu Ser Ser

340 345 350

Leu Lys Leu Thr Phe Tyr Phe Gln Gly Asn Met Leu Ser Thr Val Ile

355 360 365

Asp Pro Glu Cys His Cys Glu Ser Pro Val Ser Ile Asp Glu Leu Cys

370 375 380

Ala Gln Asp Gly Phe Met Asp Phe Glu Val Tyr Ser His Gln Thr Lys

385 390 395 400

Pro Ala Leu Asn Leu Asp Thr Leu Leu Val Gly Asn Ser Ser Cys Gln

405 410 415

Pro Ile Phe Lys Val Gln Ser Val Gly Leu Ala Arg Phe His Ile Pro

420 425 430

Leu Asn Gly Cys Gly Thr Arg Gln Lys Phe Glu Gly Asp Lys Val Ile

435 440 445

Tyr Glu Asn Glu Ile His Ala Leu Trp Glu Asn Pro Pro Ser Asn Ile

450 455 460

Val Phe Arg Asn Ser Glu Phe Arg Met Thr Val Arg Cys Tyr Tyr Ile

465 470 475 480

Arg Asp Ser Met Leu Leu Asn Ala His Val Lys Gly His Pro Ser Pro

485 490 495

Glu Ala Phe Val Lys Pro Gly Pro Leu Val Leu Val Leu Gln Thr Tyr

500 505 510

Pro Asp Gln Ser Tyr Gln Arg Pro Tyr Arg Lys Asp

515 520

<210> 2

<211> 1573

<212> DNA

<213> 人-鼠(human-mouse)

<400> 2

caacccctct ggctcttgca gggtggagcc agccatcctg agacgtccgt acagcccgta 60

ctggtggagt gtcaggaggc cactctgatg gtcatggtca gcaaagacct ttttggcacc 120

gggaagctca tcagggctgc tgacctcacc ttgggcccag aggcctgtga gcctctggtc 180

tccatggaca cagaagatgt ggtcaggttt gaggttggac tccacgagtg tggcaacagc 240

atgcaggtaa ctgacgatgc cctggtgtac agcaccttcc tgctccatga cccccgcccc 300

gtgggaaacc tgtccatcgt gaggactaac cgcgcagaga ttcccatcga gtgccgctac 360

cccaggcagg gcaatgtgag cagccaggcc atcctgccca cctggttgcc cttcaggacc 420

acggtgttct cagaggagaa gctgactttc tctctgcgtc tgatggagga gaactggaac 480

gctgagaaga ggtcccccac cttccacctg ggagatgcag cccacctcca ggcagaaatc 540

cacactggca gccacgtgcc actgcggttg tttgtggacc actgcgtggc cacaccgaca 600

ccagaccaga atgcctcccc ttatcacctg cccttgaagg atgccatagt acaaggattt 660

aatcttctga ttgacagcca gaaagtaact ctccacgtgc cagccaatgc tactggaata 720

gttcactatg tgcaagagag cagctatctc tatactgtgc agctggagct cttgttctca 780

accactgggc agaagatcgt cttctcatca cacgctatct gcgcaccaga tctttctgtg 840

gcttgtaatg ctacacacat gactctcact ataccagaat ttcctgggaa gctagagtct 900

gtggactttg gacaatggag catccctgag gaccaatggc atgccaatgg aattgacaaa 960

gaagcaacaa atggcttgag attgaatttc agaaaatctc tcctgaaaac taaaccctct 1020

gaaaaatgtc cattctacca gttctacctc tcttcactca agctgacctt ctacttccaa 1080

gggaacatgc tatccacagt gatagatcct gagtgccact gtgagtcacc agtctctata 1140

gatgaactgt gtgcacagga tgggtttatg gactttgagg tctacagcca ccaaacaaaa 1200

cccgcactga acctggacac cctcctggtg ggaaattcct cttgccagcc tattttcaag 1260

gtgcagtctg tggggcttgc aaggtttcac atacctctga atggatgtgg aacaaggcag 1320

aaatttgaag gtgataaagt catctatgag aatgaaatac atgctctctg ggaaaaccca 1380

ccctccaaca ttgtattcag aaacagcgag ttcaggatga cagtaagatg ctattacatc 1440

agagacagta tgctactaaa tgcccatgtc aaaggacatc cttctccaga ggcctttgta 1500

aagccaggcc cactggtgtt ggtcctacaa acatacccag accaatccta ccaacggcct 1560

tacaggaagg atg 1573

Claims

1.一种人鼠卵透明带融合蛋白，其特征在于，由人类卵透明带蛋白成分和小鼠的透明带蛋白成分组成；包含hZP3 23～231肽段和mZP2 192～505肽段，其氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示。

2.编码权利要求1所示融合蛋白的融合基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种融合蛋白，其特征在于，在权利要求1所述融合蛋白的C端连接有6× His标签肽。

4.权利要求1所述人鼠卵透明带融合蛋白的制备方法，其特征在于，先构建体外表达所述融合蛋白的表达载体，再转化宿主菌，诱导表达产生融合蛋白。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，将pGEM-hZP3载体上的编码人ZP3的23～231肽段的DNA插入到pET-mZP2表达载体多克隆位点N端的BamHI和EcoRI位点之间，构建表达hZP3 23～231肽和mZP2 192～505融合蛋白的表达载体，再转化宿主菌，诱导表达产生融合蛋白。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述表达载体为pET原核表达载体。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述诱导表达为将宿主菌于35～37℃培养至OD600达0.4～0.6时，加入IPTG至终浓度0.8～1.2mmol/L，诱导表达6～10 h。

8.权利要求1所述的融合蛋白在制备抗人卵透明带抗体和/或抗小鼠卵透明带的抗体中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将所述融合蛋白与免疫佐剂混合后免疫动物机体，取血分离血清。