CN107921115A

CN107921115A - 新颖杆状病毒载体及使用方法

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Publication number: CN107921115A
Application number: CN201680028075.8A
Authority: CN
Inventors: 张家荣; 廖燕秋; 周维宜; 章修纲
Original assignee: Rainbow Gene Ltd By Share Ltd
Current assignee: Rainbow Gene Ltd By Share Ltd
Priority date: 2015-05-15
Filing date: 2016-05-13
Publication date: 2018-04-17
Anticipated expiration: 2036-05-13
Also published as: WO2016187027A1; JP6535133B2; TW201712119A; US10172931B2; TWI605124B; CN107921115B; JP2018515141A; KR20180002872A; EP3294329B1; DK3294329T3; CA2985227A1; US20160331826A1; EP3294329A4; CA2985227C; ES2787261T3; KR102025488B1; EP3294329A1

Abstract

本发明提供一种在其包膜上展现融合蛋白的基因重组杆状病毒。该融合蛋白包含异种抗原以及杆状病毒包膜GP64蛋白的C端区域，其具有至少100个氨基酸残基的长度，且缺乏位于GP64蛋白中央碱性区域内的B12D5结合表位。该基因重组杆状病毒的基因组包含编码融合蛋白的转基因，该融合蛋白包含信号肽、该异种抗原，及该杆状病毒包膜GP64蛋白的C端区域，其中该抗原位于该信号肽与该GP64蛋白C端区域之间。基因重组杆状病毒用于在需要治疗的个体体内诱发抗原特异性免疫原性反应。

Description

新颖杆状病毒载体及使用方法

技术领域

本发明大致关于基因重组杆状病毒。

背景技术

杆状病毒会感染昆虫，且对于人类并无致病性，但可能转导多种哺乳动物细胞及鸟类细胞。由于对生物安全且具有强大复制能力和低细胞毒性，同时在转导的细胞中不会复制，并易于处理和制造，杆状病毒成为广受欢迎的基因转移载体，适合多种应用，例如抗病毒疗法、癌症疗法、再生药物及疫苗。

美国专利第7,527,967号公开一种基因重组杆状病毒，其在杆状病毒的表面展现融合异种多肽，而可用于在需要治疗的个体体内产生对抗异种蛋白或病毒的抗体或免疫反应。其中的融合异种多肽是经由融合异种抗原与杆状病毒GP64蛋白的羧基端第227至529位氨基酸残基(图2C)所产生。其中的架构包含GP64胞外区域(extracellular domain)的大部分，包括B12D5结合位点。当用于免疫接种(immunization)时，GP64的胞外区域可诱发免疫反应，并产生非预期的抗体，例如无用的抗GP64B12D5抗体(Zhou et al.Virology2006；352(2):427–437)。GP64B12D5抗体是对抗杆状病毒本身而非特定外来抗原的中和抗体。此外，杆状病毒对猪仅略具免疫原性。

台湾专利第I368656号公开一种方法，其使用来自GP64的信号肽(signalpeptide,SP)、跨膜区域(transmembrane domain,TM)及细胞质转导区(cytoplasmictransduction domain,CTD)呈现抗原。其中的架构仅含该跨膜区域及细胞质转导区域，而无GP64的胞外区域(图2D)。其较少表达外来抗原，且对灭活剂(inactivation reagent)敏感(Premanand et al.PLoS ONE 2013；8(2):e55536)。

因此，本领域中确实需要一种能够解决上述缺陷及不足的方案，特别是一种对于灭活剂不敏感且具有改善的免疫原性的杆状病毒载体。

发明内容

一方面，本发明提供一种载体，其包含编码融合蛋白的转基因，该融合蛋白包含：(a)信号肽(signal peptide,SP)，其位于该融合蛋白的该N端；(b)异种抗原(heterologousantigen)；以及(c)杆状病毒包膜GP64蛋白的C端区域，其至少具有100个氨基酸残基的长度，且缺乏位于GP64蛋白中央碱性区域内的B12D5结合表位(binding epitope)；其中该异种抗原位于该信号肽与该GP64蛋白C端区域之间。

在本发明一个实施方式中，本发明的载体是基因重组杆状病毒。

另一方面，本发明提供一种基因重组杆状病毒，于其包膜上展现融合蛋白，该融合蛋白包含：(i)异种抗原；以及(ii)杆状病毒包膜GP64蛋白的C端区域，其具有至少100个氨基酸残基的长度，且缺乏位于GP64蛋白中央碱性区域内的B12D5结合表位。

在本发明一个实施方式中，该基因重组杆状病毒的基因组包含编码融合蛋白的转基因(transgene)，该融合蛋白包含：(a)信号肽；(b)该异种抗原；以及(c)杆状病毒包膜GP64蛋白的C端区域；其中该抗原位于该信号肽与该GP64蛋白C端区域之间。

在本发明另一实施方式中，该转基因以可操作的方式连结至启动子。

在本发明另一实施方式中，该启动子为多角体蛋白(polyhedrin)。

在本发明另一实施方式中，该GP64蛋白的C端区域长度为186至220个氨基酸。

在本发明另一实施方式中，该GP64蛋白的C端区域缺乏序列识别号：2、3或4的氨基酸序列。

在本发明另一实施方式中，该GP64蛋白的C端区域包含序列识别号：1的第293至512位氨基酸残基。

在本发明另一实施方式中，该GP64蛋白的C端区域包含序列识别号：1的第327至512位氨基酸残基。

在本发明另一实施方式中，该GP64蛋白的C端区域具有N端，该N端介于序列识别号：1的第292至328位氨基酸残基之间。

在本发明另一实施方式中，该信号肽包含选自以下群组：序列识别号：5、6、7、8、9、10、11及12的氨基酸序列。

另一方面，本发明关于昆虫细胞或以本发明载体或基因重组杆状病毒转导的细胞。

在本发明另一实施方式中，该抗原选自以下群组中的至少一者：病原体蛋白(pathogen protein)、癌细胞蛋白(cancer cell protein)以及免疫检查点蛋白(immunecheckpoint protein)。

该病原体可为选自以下群组中的至少一者：人类乳突病毒(humanpapillomavirus,HPV)、猪生殖与呼吸综合症病毒(porcine reproductive andrespiratory syndrome virus,PRRSV)、人类免疫缺陷病毒-1(human immunodeficiencyvirus-1,HIV-1)、登革热病毒(Dengue virus)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)、猪环状病毒2(porcine circovirus 2,PCV2)、猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、口蹄疫病毒(foot-and-mouth diseasevirus,FMDV)、新城病病毒(Newcastle disease virus,NDA)、传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemicdiarrhea virus,PEDV)、流行性感冒病毒(influenza virus,)、假性狂犬病病毒(pseudorabies virus)、微小病毒(parvovirus)、猪水疱病病毒(swine vesiculardisease virus,SVDV)、痘疮病毒(poxvirus)、轮状病毒(rotavirus)、肺炎霉浆菌(Mycoplasma pneumonia)、单纯疱疹病毒(herpes virus)、传染性支气管炎(infectiousbronchitis)、传染性华氏囊病病毒(infectious bursal disease virus)。癌症可为选自以下群组中的至少一者：非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer)、乳癌(breastcarcinoma)、黑色素瘤(melanoma)、淋巴瘤(lymphomas)、结肠癌(colon carcinoma)、肝细胞癌(hepatocellular carcinoma)，及其任何组合。免疫检查点可为选自以下群组中的至少一者：PD-1、PD-L1、PD-L2及CTLA-4。

在本发明另一实施方式中，该抗原选自以下群组中的至少一者：猪瘟病毒包膜糖蛋白E2(classical swine fever virus envelope glycoprotein E2)、猪流行性腹泻病毒S1蛋白(porcine epidemic diarrhea virus S1protein)、程序性细胞凋亡蛋白1(programmed cell death protein 1)以及肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen,TAA)。

另一方面，本发明提供一种在需要治疗的个体体内诱发抗原特异性免疫原性反应的方法，包含对该需要治疗的个体施予治疗上有效量的本发明载体或该基因重组杆状病毒。本发明还关于所述载体或基因重组杆状病毒在制造药剂中的用途，该药剂可在需要治疗的个体体内诱发抗原特异性免疫原性反应。或者，本发明关于所述载体或基因重组杆状病毒在需要治疗的个体体内诱发抗原特异性免疫原性反应的用途。

上述及其他方面将通过以下优选实施方式的说明参照附图加以说明，然而可在不脱离本发明新颖概念的精神和范畴的情况下进行变化及修改。

附图阐明本发明的一个或多个实施方式，连同书面描述，用以解释本发明的原理。在可能的情况下，所有附图使用相同的附图标记指代实施方式中相同或类似的组件。

附图说明

图1A为一概要图，阐明依据本发明一个实施方式的杆状病毒载体平台设计。

图1B为一概要图，阐明外来抗原或外来基因不仅可锚定于病毒包膜上，亦可通过本发明的gBac表面展示平台表达于昆虫细胞的该细胞膜部分。其中矩形代表病毒。

图2A为一概要图，显示全长GP64蛋白，其包含：GP64最小片段(GP64minimum)(GP64_327-482)，GP64跨膜区域(transmembrane domain,TM)(GP64_483-505)；细胞质转导区(cytoplasmic transduction domain,CTD)(GP64_506-512)。

图2B为一概要图，显示依据本发明一个实施方式的杆状病毒载体。SP：信号肽；TM：跨膜区域，CTD：细胞质转导区。

图2C为一概要图，显示美国专利第7527967号的杆状病毒载体设计。

图2D为一概要图，显示台湾专利第I368656号的杆状病毒载体设计。

图3为一图表，显示接种后小鼠体内由杆状病毒载体引发的免疫反应(左栏)以及小鼠体内的E2-gBac亚单位疫苗中和血清(neutralization serum,SN)滴度(右栏)。显示的各ELISA值为五只小鼠的平均值。E2-gBac与E2-Bac群组的差异为统计上显著，P≦0.05。使用的杆状病毒株为AcNPV。“SN”代表中和血清。“E2-gBac”代表依据图2B载体设计的“杆状病毒载体CSFV E2-gBac”。“E2-gBac(灭活)”代表该杆状病毒在用于免疫接种前先经灭活(inactivated)。“E2-Bac”代表依据图2D载体设计的“杆状病毒载体CSFV E2-Bac”。

图4为一图表，显示接种后猪体内由杆状病毒载体引发的免疫反应。显示的各ELISA值为三头猪的平均值。E2-gBac与E2-gp64群组的差异为统计上显著，P≦0.05。“E2-gp64”代表依据图2C载体设计的“杆状病毒载体CSFV E2-gp64”。

图5为一图表，显示三头特定不带病原体(SPF)并用杆状病毒载体PEDV S1-gBac接种后的猪体内对抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)的抗体滴度。上述三头SPF猪分别标号为73、74及75。“IFA”代表免疫荧光抗体(immunofluorescent antibody)。结果显示PED病毒能够识别自接种猪取得的血清。

图6A-B为免疫印迹图，显示Sf9细胞样本检测到CSFV E2-gBac的E2抗原(图6A)及PEDV S1-gBac的S1抗原(图6B)。

图6C-D为免疫印迹图，显示抗gp64mAb(左栏)及人类PD-1抗体(右栏)分别辨识并检测到样本中hPD-1-gBac的抗原。

具体实施方式

为更详述本发明，在此提供下列实例，其仅属说明性质，且本领域的技术人员应了解可作出诸多修改变化。现在详述本发明的各种实施方式。参照附图，各图中以类似附图标记指代类似的组件。如在本说明书及权利要求书中所使用，除非上下文另有明确的不同指定，否则“一”及“该”的意义包括复数指称。此外，如在本说明书及之后的权利要求书中所使用，除非上下文另有明确的不同指定，否则“在其中”的意义包括“在其中”及“在其上”。再者，说明书中所用的标题或副标为方便读者，不应对本发明的范围构成影响。此外，本说明书中所涉部分术语如下定义。

定义

本说明书中所用术语一般而言具有其在本领域中与本发明语境相关范围及所用处的特定语境范围内通常具有的意义。在此处或本说明书中他处针对用于本发明的特定术语加以陈述，提供额外指引以便阅读本发明的实践者了解。为便于阅读，某些术语可能以强调方式表达，例如使用斜体字和/或引号。强调方式的使用并不对于术语的范围及意义构成影响；在同一语境中，术语不论是否以强调方式表达，其范围及意义相同。应理解为相同事物可以多种方式表述。因此，在此讨论的任一个或多个术语可使用替代语言及同义字，且术语不论是否在此阐述或讨论，均不增减其重要性。在此提供某些术语的同义字。使用一个或多个同义字并不排除其他同义字的使用。在本说明书中任何部分的实例使用如果包括任何在此讨论术语的范例，仅属说明性质，且绝不对本发明或任何例示术语的范围及意义构成限制。同样，本发明并不限于本说明书中所提供的各种实施方式。

除非另有不同定义，在此使用所有技术及科学术语与在本领域中普通技术人员公知的意义相同。若有抵触，应以本文件及其所提供的定义为准。

载体(vector)为媒介物，用于将遗传物质传递至目标细胞。病毒载体(viralvector)为经修饰的病毒，可将外来遗传物质递送至细胞之中。

术语“基因转导(gene transduction)”、“转导(transduce)”或“转导变异(transduction)”是使用病毒载体将外来DNA导入另一细胞的程序。

信号序列(signal sequence)或信号肽(signal peptide,SP)(有时也称为信号序列、导向信号、局部化信号、局部化序列、转运肽、前导序列或前导肽)为短肽(5-30个氨基酸长)，其存在于多数新近合成的用于分泌路径的蛋白的N端。这些蛋白包括位于特定细胞器(内质网、高尔基体或核内体)的内部、由细胞分泌的或被插入大部分细胞膜中的蛋白。

“B12D5”意指抗gp64的单克隆抗体。B12D5具有位于gp64的第277-287位氨基酸残基的结合表位KKRPPTWRHNV(序列识别号：3)，或位于gp64的中央区域从残基271至292(序列识别号：4)内的HRVKKRPPTW(序列识别号：2)。请参阅Zhou et al.(2006)Supra；Wu et al(2012)“A pH-Sensitive Heparin-Binding Sequence from Baculovirus gp64ProteinIs Important for Binding to Mammalian Cells but Not to Sf9 Insect Cells”Journal of Virology,Vol.86(1)484-491。

程序性细胞凋亡蛋白1也称为PD-1及CD279[分化簇(cluster ofdifferentiation)279]，为在人体内由PDCD1基因所编码的蛋白。PD-1为细胞表面受体，属于免疫球蛋白超家族，且表达于T细胞及祖B细胞(pro-B cells)上。PD-1结合两个配体，PD-L1及PD-L2。PD-1的功能为免疫检查点，通过预防T细胞的活化而有助于下调免疫系统，从而降低自身免疫性并促进自体耐受性。PD-1一方面促进淋巴结中抗原特异性T细胞中的细胞凋亡(程序性细胞凋亡)，另一方面减少调节T细胞(regulatory T cells)[抑制性T细胞(suppressor T cells)]的细胞凋亡，以此双重机制达成抑制作用。PD-1抑制剂为一种新类型PD-1阻断药品，可活化免疫系统以攻击肿瘤，因此在治疗某些癌症上具有程度不一的功效。

抗原可为致病蛋白、多肽或肽，其可能造成因病原体产生的疾病，或能够诱发受病原体或肿瘤相关抗原(TAA)感染的宿主体内免疫学反应。所述肿瘤相关抗原(TAA)为特别表达于肿瘤细胞内的多肽，可选自病原体或癌症细胞，包括但不限于，人类乳突病毒(HPV)、猪生殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)、登革热病毒、丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)、猪环状病毒2(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、口蹄疫病毒(FMDV)、新城病病毒(NDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、流行性感冒病毒、假性狂犬病病毒、微小病毒、假性狂犬病病毒、猪水疱病病毒(SVDV)、痘疮病毒、轮状病毒、肺炎霉浆菌、单纯疱疹病毒、传染性支气管炎、或传染性华氏囊病病毒、非小细胞肺癌、乳癌、黑色素瘤、淋巴瘤、结肠癌、肝细胞癌及其任何组合。例如，HPV E7蛋白(E7)、HCV核心蛋白(HCV core)、HBV X蛋白(HBx)即为选定的疫苗开发抗原。抗原可为融合抗原，由选自一种或多种致病蛋白的两种或多种抗原融合而成。例如，PRRSV ORF6片段与ORF5片段的融合抗原，或PRRSV与PCV2病原体抗原的融合。

或者，抗原可为抑制性免疫检查点蛋白，例如PD-1、PD-L1、PD-L2及CTLA-4等等。

术语“免疫检查点蛋白(immune checkpoint protein)”及“免疫检查点(Immunecheckpoint)”可互换使用。免疫检查点会影响免疫系统功能。免疫检查点可为刺激性或抑制性。肿瘤可利用这些检查点保护自身不受免疫系统攻击。检查点疗法的作用为阻断抑制性检查点，恢复免疫系统功能。跨膜程序性细胞凋亡1蛋白(PDCD1，PD-1；也称为CD279)与其PD-1配体1(PD-L1，CD274)之间相互作用为一个正在研究中的配体与受体的相互作用。细胞表面的PD-L1结合至免疫细胞表面上的PD1，其能够抑制免疫细胞的活性。PD-L1的功能包括调节T细胞活动。癌症导致的细胞表面PD-L1的上调(upregulation)可抑制T细胞的攻击。结合至PD-1或PD-L1且因此阻断其相互作用的抗体可允许T细胞攻击肿瘤。Ipilimumab为FDA核准的第一个检查点抗体，可阻断抑制性免疫检查点CTLA-4。

术语“治疗(treating or treatment)”意指对罹有癌症，或受感染，或展现该疾病的症状或倾向，而向需治疗的个体施以有效量的融合蛋白，以期治疗、缓和、减轻、医治、改善或预防疾病、其症状或其倾向。该个体可由医疗保健专业人士基于任何适当诊断方法的结果加以辨识。

术语“有效量(effective amount)”意指活性化合物足以对受治疗个体产生治疗效果的需要量。有效剂量可能依据施药路径、辅药使用及与其他治疗方式共同使用等因素而变化，如本领域的技术人员所知的。

实施例

在不限制本发明范围的前提下，以下提供本发明实施例的范例仪器、装置、方法及其相关结果。标题或副标的使用仅为方便读者，而不应构成对本发明范围的限制。此外，以下提及并公开某些理论。然而，只要本发明可依据本发明实施而不拘于任何特定理论或行动方案，则不论这些理论正确与否，均不应构成对本发明范围的限制。

实施例1

载体的构建与基因重组杆状病毒、病毒样颗粒及蛋白的产生

图1A显示gBac平台。外来基因[例如优化猪瘟病毒(CSFV)E2或猪流行性腹泻病毒(PEDV)纤突基因(spike genes)]的取得方式为先以PCR合成，而后使用IN-克隆试剂盒(Clontech)经由限制酶位点(例如SacI/NotI)复制入gBac载体。该gBac载体取自杆状病毒转移载体pBACPAK8^TM(GENBANK^TM编录号U02446)。使用图1A的gBac表面展示平台，外来抗原或外来基因可锚定于病毒包膜上，且也表达于昆虫细胞的细胞膜部分(图1B)。

图2A显示全长GP64。杆状病毒GP64包膜融合蛋白(GP64 envelope fusionprotein,GP64 EFP)为许多杆状病毒的包膜融合糖蛋白。其在感染细胞及出芽病毒表面上以同三聚体(homotrimer)的方式出现。杆状病毒经入胞作用进入宿主细胞，而后通过低pH所诱导的病毒包膜与内吞体膜(endosomal membrane)的融合，允许病毒进入细胞质。该细胞膜融合，以及感染细胞的病毒粒子有效出芽，均取决于GP64。

图2B-D显示三种载体的对照：gBac(或Reber-gBac)、抗原gp64(US7527967缩写为“gp64”)以及抗原Bac(TW I368656缩写为“Bac”)。gBac载体是由信号肽(SP)以及GP64的C端区域从第327至513位氨基酸残基构建而成。gp64载体是由SP以及GP64的C端区域从第227至513位氨基酸残基构建而成。Bac载体包含昆虫信号肽(SP)、TM(跨膜区域)及GP64的CTD(细胞质转导区)且不包含GP64胞外区域的氨基酸。“SP”前的三角符号代表多角体蛋白启动子(polyhedrin promoter)，位于插入基因起始密码子的-1位点。

编码SP的DNA片段分别由PCR以正向及反向引物5’-GAGCTCATGGTAAGC-3’(序列识别号：19)及5’-AGGCAGAATGCG-3’(序列识别号：20)产生及扩增。gp64基因的C端部分(编码GP64从aa 327至aa 513)分别由PCR以正向及反向引物5’-GCGTGTCTGCTCA-3’(序列识别号：21)及5’-TTAATATTGTCTA-3(序列识别号：22)产生及扩增。gp64基因的C端部分(编码GP64从aa 227至aa 513)分别由PCR以正向及反向引物5’-ATCAACAAGCTAA-3’(序列识别号：23)及5’-TTAATATTGTCTA-3’(序列识别号：24)产生及扩增。上述外来基因分别复制入pBACPAK8^TM转移载体。

使用2B(或图1A)的gBac平台产生两种杆状病毒载体：杆状病毒载体CSFV E2-gBac及杆状病毒载体PEDV S1-gBac(依据图2B设计)。前者转导编码猪瘟病毒(CSFV)包膜糖蛋白E2的基因，后者转导编码猪流行性腹泻病毒S1蛋白的基因。

为提供平行对照，还使用图2C及2D的载体产生另两种杆状病毒载体：杆状病毒载体CSFV E2-gp64(依据图2C设计)，以及杆状病毒载体CSFV E2-Bac(依据图2D设计)，其用以转导编码CSFV E2抗原的外来基因。

gBac、gp64及Bac载体(分别为图2B-D设计)中的融合基因经测序确认其身份。包含有基因重组GP64基因且无转移载体骨架的基因重组杆状病毒通过同源重组而制备。构建及再结合的方法为本领域中所熟知。利用这些基因重组病毒制备抗原。在多角体启动子下，将修饰后的GP64基因以PCR插入杆状病毒转移载体以形成gBac载体。由于gBac载体具有两个同源重组位点，当gBac质体及野生杆状病毒共转染时，野生杆状病毒的原始多角体位置被gBac序列所取代。

实施例2

蛋白表达与抗原的纯化

Sf-9细胞用于重组杆状病毒的繁殖与感染。杆状病毒在草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)Sf-9细胞株中繁殖并置于无血清培养基中以26℃培养。以5-10的MOI感染Sf-9细胞并在感染三天后收获，制得基因重组杆状病毒。为大规模生产杆状病毒，可在生物反应器中培养并感染细胞。从感染细胞的培养上清液中分离出杆状病毒部分。使用适当蛋白截留膜(protein cut-off membrane)及0.45μm无菌膜，以切向流过滤(Tangential FlowFiltration,TFF)技术收集杆状病毒粒子。

为测试抗原的生产，将部分纯化的杆状病毒或感染细胞溶解产物置于8-10％十二烷基硫酸钠–聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中后转移至硝化纤维膜。外来抗原是以小鼠抗gp64 mAb(商业管道购得且以1:5,000比例稀释)作为初级抗体而被检测到。二级抗体为与碱性磷酸酶结合的羊抗兔或羊抗鼠mAb(1:5,000稀释)。使用ECL PLUS^TM免疫印迹检测试剂(GE Healthcare)显现蛋白带。在杆状病毒表面展示系统中，外来抗原可先表达于昆虫细胞膜，而后出芽杆状病毒取用部分细胞膜以形成其包膜。结果，杆状病毒展示抗原可从感染细胞的溶解产物(细胞膜部分)以及病毒表面而被收获。

实施例3

基因重组病毒的抗原表达

用gBac疫苗进行免疫接种之前，为确认融合蛋白CSFV E2-gBac或PEDV S1-gBac是否成功展现于杆状病毒包膜上，先通过离心及TFF收集基因重组杆状病毒。将基因重组杆状病毒悬浮于不同p.f.u/μl浓度的PBS中。以免疫印迹法使用抗gp64 mAb(eBioscience)分析基因重组蛋白并入杆状病毒粒子的情形。测得融合蛋白CSFV E2-gBac的分子量为约80kDa，融合蛋白PEDV S1-gBac的分子量为约130kDa。

实施例4

疫苗制备与免疫接种

将基因重组杆状病毒展示抗原与水包油包水(water-in-oil-in-water,w/o/w)佐剂(MONTANIDE ISA 206 VG,SEPPIC.)混合以制备疫苗。将购自台湾实验研究院动物中心的四周大雌性BALB/c小鼠分为四组，每组5只小鼠。小鼠从第0天至第14天每天两次用200μl含有107p.f.u.基因重组杆状病毒的溶液进行皮下免疫(图3)。将含有CSFV包膜糖蛋白E2的E2-gBac、E2-gp64及E2-Bac病毒(依据图2B-D)灭活并配制成疫苗。作为阴性对照组，小鼠接受野生型杆状病毒(10⁷p.f.u.)或PBS注射。于第六周从尾部静脉收集血液样本。使用二乙酰亚胺(Binary ethylenimine,BEI)使杆状病毒灭活。制备方式为在37℃下溶解0.1M 2-溴乙胺氢溴酸盐(2-bromoethylamine hydrobromide,BEA)于0.2N NaOH中历时1小时。为灭活杆状病毒，在病毒培养基中加入4mM BEI，将病毒在37℃下培养16小时。灭活后，将硫代硫酸钠(Na₂S₂O₃)以为最终BEI浓度的10倍的最终浓度而添加入培养基中以停止灭活。

实施例5

基因重组病毒产生的抗原的免疫原性(Immunogenicity)

免疫接种后，分析小鼠的血清，确认有无抗CSFV E2抗体存在，使用IDEXX CSFV Ab测试试剂盒(IDEXX)检测猪瘟病毒(CSFV)的抗体。计算血清中CSFV E2特定抗体的含量，如果阻断百分比高于40％则为阳性(图3)。结果显示杆状病毒载体展现了融合蛋白CSFV E2-Bac。图3显示不论杆状病毒是否经过灭活，杆状病毒载体CSFV E2-gBac相较于杆状病毒载体CSFV E2-Bac在小鼠体内可诱发更高的抗CSFV E2抗体滴度(antibody titer)。

在此还比较三种杆状病毒载体对诱发猪免疫原性反应的效果。三只SPF(不带特定病原体)猪接受免疫两次(6周龄及9周龄)，采用肌内路径，分别使用10⁸pfu的基因重组杆状病毒载体E2-gBac、E2-gp64、E2-Bac及PBS。免疫接种后，分析猪血清确认有无抗CSFV E2抗体存在，使用IDEXX CSFV Ab测试试剂盒(IDEXX)。计算CSFV E2特定中和抗体在血清中的含量，如果阻断百分比高于43％则判定为阳性且有效。

如图4所示，以E2-gBac免疫的猪能够经受CSFV挑战，显示猪体内诱发适当中和抗体(SN滴度≥16，IDEXX阻断率≥43％)。此结果证明gBac平台为疫苗平台。图4显示杆状病毒载体CSFV E2-gBac相较于杆状病毒载体CSFV E2-Bac及CSFV E2-gp64在猪体内可诱发更高的抗CSFV E2抗体滴度。结果显示本发明的gBac表面展示平台可较现有技术的杆状病毒载体诱发更强的免疫性。

在此还产生杆状病毒载体以将猪流行性腹泻病毒S1蛋白(PEDV S1)转导入细胞以供接种运用，并测试其诱发免疫原性反应的效果。简言之，三头9周龄的SPF猪(分别标号为73、74及75)各经由肌内路径以10⁸pfu的基因重组杆状病毒载体PEDV S1-gBac或PBS免疫接种两次。免疫接种后，使用PED病毒的ELISA检验以分析猪血清(接种后1至4周)，确认有无抗PEDV抗体存在。图5显示三头猪体内杆状病毒载体PEDV S1-gBac诱发的对抗猪流行性腹泻病毒的抗体滴度。

图6A-B为免疫印迹图，显示Sf-9细胞样本检测到CSFV E2-gBac的E2抗原(图6A)及PEDV S1-gBac的S1抗原(图6B)。将细胞溶解产物及收集的病毒加载不同细胞数及病毒滴度。在此还构建杆状病毒载体人类程序性细胞凋亡蛋白1-gBac(hPD-1-gBac)。为测试抗原的生产，将基因重组杆状病毒或感染细胞溶解产物置入8-10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后转移至硝化纤维膜。外来抗原是通过小鼠抗gp64 mAb(图6C)及抗PDCD-1抗体(图6D)(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)作为初级抗体而被检测。使用ECL PLUS^TM免疫印迹检测试剂(GE Healthcare)显示蛋白带。图6D显示杆状病毒在包膜上展现人类PD-1抗原，且展现的PD-1抗原可被商购抗PDCD-1抗体(Santa CruzBiotechnology,Santa Cruz,CA)所辨识。

总之，本发明的载体对灭活剂不敏感(如图3)并展现较高的免疫原性(如图4)。表1显示肽序列及序列识别号。

表1

*全长GP64：GP64信号肽(SP)(GP64_1-20)加下划线并以斜体表示。GP64最小片段(GP64minimum or GP64mini)(GP64_327-482)加下划线且非斜体。GP64跨膜区域(TM)(GP64_483-505)仅以粗体表示。GP64细胞质转导区(CTD)(GP64_506-512)仅以斜体表示。

E2-gBac蛋白(SP-E2-GP64mini-TM/CTD)：GP64信号肽(SP)(GP64_1-20)加下划线并以斜体表示。GP64最小片段(GP64_327-482)加下划线且非斜体。GP64跨膜区域(TM)(GP64_483-505)仅以粗体表示。GP64细胞质转导区(CTD)(GP64_506-512)仅以斜体表示。

S1-gBac蛋白(SP-S1-GP64mini-TM/CTD)：GP64信号肽(SP)(GP64_1-20)加下划线并以斜体表示。GP64最小片段(GP64_327-482)加下划线且非斜体。GP64跨膜区域(TM)(GP64_483-505)以粗体表示。GP64细胞质转导区(CTD)(GP64_506-512)仅以斜体表示。

hPD1-gBac蛋白(SP-hPD1-GP64mini-TM/CTD)：GP64信号肽(SP)(GP64_1-20)加下划线并以斜体表示。GP64最小片段(GP64_327-482)加下划线且非斜体。GP64跨膜区域(TM)(GP64_483-505)以粗体表示。GP64细胞质转导区(CTD)(GP64_506-512)仅以斜体表示。

虽然本发明在此以多项实施例加以阐述说明，本领域的技术人员应可作出各种修改及改良。本发明并不限于所述特定形式，且所有不脱离本发明精神的范畴的修改均应属于所附权利要求书所定义的范畴。实施例及实例的选择与描述为解释本发明的原理及其实务应用，以便于其他本领域的技术人员运用本发明、各种实施例连同各种适合其实务应用的修改。熟悉本发明所属领域的人员应可考虑不脱离本发明精神及范围的替代实施例。据此，本发明的范围是由所附权利要求书界定，而非上述说明及在此描述的示范实施例。

本发明引用及讨论的引用文献可能包括专利、专利申请及各种公开文献。这些引用文献的引用和/或讨论仅为澄清本发明的描述，并非承认任何这些引用文献为本发明的“现有技术”。所有在本说明书中引述及讨论的引用文献均以其参照而整体合并于此，如同各引用文献个别合并于此。

序列表

<110> 瑞宝基因股份有限公司

<120> 新颖杆状病毒载体及使用方法

<130> 10025-00001

<150> 62/162,139

<151> 2015-05-15

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 512

<212> PRT

<213> 苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒

<400> 1

Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala Ala His

1 5 10 15

Ser Ala Phe Ala Ala Glu His Cys Asn Ala Gln Met Lys Thr Gly Pro

20 25 30

Tyr Lys Ile Lys Asn Leu Asp Ile Thr Pro Pro Lys Glu Thr Leu Gln

35 40 45

Lys Asp Val Glu Ile Thr Ile Val Glu Thr Asp Tyr Asn Glu Asn Val

50 55 60

Ile Ile Gly Tyr Lys Gly Tyr Tyr Gln Ala Tyr Ala Tyr Asn Gly Gly

65 70 75 80

Ser Leu Asp Pro Asn Thr Arg Val Glu Glu Thr Met Lys Thr Leu Asn

85 90 95

Val Gly Lys Glu Asp Leu Leu Met Trp Ser Ile Arg Gln Gln Cys Glu

100 105 110

Val Gly Glu Glu Leu Ile Asp Arg Trp Gly Ser Asp Ser Asp Asp Cys

115 120 125

Phe Arg Asp Asn Glu Gly Arg Gly Gln Trp Val Lys Gly Lys Glu Leu

130 135 140

Val Lys Arg Gln Asn Asn Asn His Phe Ala His His Thr Cys Asn Lys

145 150 155 160

Ser Trp Arg Cys Gly Ile Ser Thr Ser Lys Met Tyr Ser Arg Leu Glu

165 170 175

Cys Gln Asp Asp Thr Asp Glu Cys Gln Val Tyr Ile Leu Asp Ala Glu

180 185 190

Gly Asn Pro Ile Asn Val Thr Val Asp Thr Val Leu His Arg Asp Gly

195 200 205

Val Ser Met Ile Leu Lys Gln Lys Ser Thr Phe Thr Thr Arg Gln Ile

210 215 220

Lys Ala Ala Cys Leu Leu Ile Lys Asp Asp Lys Asn Asn Pro Glu Ser

225 230 235 240

Val Thr Arg Glu His Cys Leu Ile Asp Asn Asp Ile Tyr Asp Leu Ser

245 250 255

Lys Asn Thr Trp Asn Cys Lys Phe Asn Arg Cys Ile Lys Arg Lys Val

260 265 270

Glu His Arg Val Lys Lys Arg Pro Pro Thr Trp Arg His Asn Val Arg

275 280 285

Ala Lys Tyr Thr Glu Gly Asp Thr Ala Thr Lys Gly Asp Leu Met His

290 295 300

Ile Gln Glu Glu Leu Met Tyr Glu Asn Asp Leu Leu Lys Met Asn Ile

305 310 315 320

Glu Leu Met His Ala His Ile Asn Lys Leu Asn Asn Met Leu His Asp

325 330 335

Leu Ile Val Ser Val Ala Lys Val Asp Glu Arg Leu Ile Gly Asn Leu

340 345 350

Met Asn Asn Ser Val Ser Ser Thr Phe Leu Ser Asp Asp Thr Phe Leu

355 360 365

Leu Met Pro Cys Thr Asn Pro Pro Ala His Thr Ser Asn Cys Tyr Asn

370 375 380

Asn Ser Ile Tyr Lys Glu Gly Arg Trp Val Ala Asn Thr Asp Ser Ser

385 390 395 400

Gln Cys Ile Asp Phe Ser Asn Tyr Lys Glu Leu Ala Ile Asp Asp Asp

405 410 415

Val Glu Phe Trp Ile Pro Thr Ile Gly Asn Thr Thr Tyr His Asp Ser

420 425 430

Trp Lys Asp Ala Ser Gly Trp Ser Phe Ile Ala Gln Gln Lys Ser Asn

435 440 445

Leu Ile Thr Thr Met Glu Asn Thr Lys Phe Gly Gly Val Gly Thr Ser

450 455 460

Leu Ser Asp Ile Thr Ser Met Ala Glu Gly Glu Leu Ala Ala Lys Leu

465 470 475 480

Thr Ser Phe Met Phe Gly His Val Val Asn Phe Val Ile Ile Leu Ile

485 490 495

Val Ile Leu Phe Leu Tyr Cys Met Ile Arg Asn Arg Asn Arg Gln Tyr

500 505 510

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒

<400> 2

His Arg Val Lys Lys Arg Pro Pro Thr Trp

1 5 10

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒

<400> 3

Lys Lys Arg Pro Pro Thr Trp Arg His Asn Val

1 5 10

<210> 4

<211> 22

<212> PRT

<213> 苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒

<400> 4

Lys Val Glu His Arg Val Lys Lys Arg Pro Pro Thr Trp Arg His Asn

1 5 10 15

Val Arg Ala Lys Tyr Thr

20

<210> 5

<211> 20

<212> PRT

<213> 苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒

<400> 5

Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala Ala His

1 5 10 15

Ser Ala Phe Ala

20

<210> 6

<211> 19

<212> PRT

<213> 家蚕

<400> 6

Met Arg Leu Thr Leu Phe Ala Phe Val Leu Ala Val Cys Ala Leu Ala

1 5 10 15

Ser Asn Ala

<210> 7

<211> 15

<212> PRT

<213> 家蚕

<400> 7

Met Arg Val Leu Val Leu Leu Ala Cys Leu Ala Ala Ala Ser Ala

1 5 10 15

<210> 8

<211> 22

<212> PRT

<213> 家蚕

<400> 8

Met Lys Ser Val Leu Ile Leu Ala Gly Leu Val Ala Val Ala Leu Ser

1 5 10 15

Ser Ala Val Pro Lys Pro

20

<210> 9

<211> 19

<212> PRT

<213> 家蚕

<400> 9

Met Lys Ile Leu Leu Ala Ile Ala Leu Met Leu Ser Thr Val Met Trp

1 5 10 15

Val Ser Thr

<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> 野桑蚕

<400> 10

Met Lys Leu Phe Val Leu Ala Ala Ile Ile Ala Ala Val Ser Ser

1 5 10 15

<210> 11

<211> 20

<212> PRT

<213> 家蚕

<400> 11

Met Arg Ala Ile Phe Ala Thr Leu Ala Val Leu Ala Ser Cys Ala Ala

1 5 10 15

Leu Val Gln Ser

20

<210> 12

<211> 31

<212> PRT

<213> 家蚕

<400> 12

Met Tyr Lys Leu Thr Val Phe Leu Met Phe Ile Ala Phe Val Ile Ile

1 5 10 15

Ala Gly Ala Gln Ser Met Ala Ser Leu Thr Arg Gln Asp Leu Ala

20 25 30

<210> 13

<211> 363

<212> PRT

<213> 猪瘟病毒

<400> 13

Met Leu Arg Gly Gln Val Val Gln Gly Ile Ile Trp Leu Leu Leu Val

1 5 10 15

Thr Gly Ala Gln Gly Arg Leu Ser Cys Lys Glu Asp His Arg Tyr Ala

20 25 30

Ile Ser Ser Thr Asn Glu Ile Gly Pro Leu Gly Ala Glu Gly Leu Thr

35 40 45

Thr Thr Trp Lys Glu Tyr Asn His Gly Leu Gln Leu Asp Asp Gly Thr

50 55 60

Val Arg Ala Ile Cys Ile Ala Gly Ser Phe Lys Val Thr Ala Leu Asn

65 70 75 80

Val Val Ser Arg Arg Tyr Leu Ala Ser Leu His Lys Arg Ala Leu Pro

85 90 95

Thr Ser Val Thr Phe Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr Ser Pro Ala Ile

100 105 110

Glu Glu Met Gly Asp Asp Phe Gly Phe Gly Leu Cys Pro Phe Asp Thr

115 120 125

Thr Pro Val Val Lys Gly Lys Tyr Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Ser

130 135 140

Ala Phe Tyr Leu Val Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Val Ile Glu Cys

145 150 155 160

Thr Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val Val Lys Thr Phe

165 170 175

Lys Arg Glu Lys Pro Phe Pro His Arg Val Asp Cys Val Thr Thr Ile

180 185 190

Val Glu Lys Glu Asp Leu Phe Tyr Cys Lys Leu Gly Gly Asn Trp Thr

195 200 205

Cys Val Lys Gly Asn Pro Val Thr Tyr Thr Gly Gly Gln Val Arg Gln

210 215 220

Cys Arg Trp Cys Gly Phe Asp Phe Lys Glu Pro Asp Gly Leu Pro His

225 230 235 240

Tyr Pro Ile Gly Lys Cys Ile Leu Thr Asn Glu Thr Gly Tyr Arg Val

245 250 255

Val Asp Ser Pro Asp Cys Asn Arg Asp Gly Val Val Ile Ser Thr Glu

260 265 270

Gly Glu His Glu Cys Leu Ile Gly Asn Thr Thr Val Lys Val His Ala

275 280 285

Leu Asp Gly Arg Leu Ala Pro Met Pro Cys Arg Pro Lys Glu Ile Val

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Ser Ser Ala Gly Pro Val Arg Lys Thr Ser Cys Thr Phe Asn Tyr Thr

305 310 315 320

Lys Thr Leu Arg Asn Lys Tyr Tyr Glu Pro Arg Asp Ser Tyr Phe Gln

325 330 335

Gln Tyr Met Leu Lys Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp Leu Asp Val

340 345 350

Thr Asp His His Thr Asp Tyr Phe Ala Glu Phe

355 360

<210> 14

<211> 708

<212> PRT

<213> 猪流行性腹泻病毒

<400> 14

Cys Ser Ala Asn Thr Asn Phe Arg Arg Phe Phe Ser Lys Phe Asn Val

1 5 10 15

Gln Ala Pro Ala Val Val Val Leu Gly Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Glu

20 25 30

Asn Gln Gly Val Asn Ser Thr Trp Tyr Cys Ala Gly Gln His Pro Thr

35 40 45

Ala Ser Gly Val His Gly Ile Phe Val Ser His Ile Arg Gly Gly His

50 55 60

Gly Phe Glu Ile Gly Ile Ser Gln Glu Pro Phe Asp Pro Ser Gly Tyr

65 70 75 80

Gln Leu Tyr Leu His Lys Ala Thr Asn Gly Asn Thr Asn Ala Thr Ala

85 90 95

Arg Leu Arg Ile Cys Gln Phe Pro Ser Ile Lys Thr Leu Gly Pro Thr

100 105 110

Ala Asn Asn Asp Val Thr Thr Gly Arg Asn Cys Leu Phe Asn Lys Ala

115 120 125

Ile Pro Ala His Met Ser Glu His Ser Val Val Gly Ile Thr Trp Asp

130 135 140

Asn Asp Arg Val Thr Val Phe Ser Asp Lys Ile Tyr Tyr Phe Tyr Phe

145 150 155 160

Lys Asn Asp Trp Ser Arg Val Ala Thr Lys Cys Tyr Asn Ser Gly Gly

165 170 175

Cys Ala Met Gln Tyr Val Tyr Glu Pro Thr Tyr Tyr Met Leu Asn Val

180 185 190

Thr Ser Ala Gly Glu Asp Gly Ile Ser Tyr Gln Pro Cys Thr Ala Asn

195 200 205

Cys Ile Gly Tyr Ala Ala Asn Val Phe Ala Thr Glu Pro Asn Gly His

210 215 220

Ile Pro Glu Gly Phe Ser Phe Asn Asn Trp Phe Leu Leu Ser Asn Asp

225 230 235 240

Ser Thr Leu Val His Gly Lys Val Val Ser Asn Gln Pro Leu Leu Val

245 250 255

Asn Cys Leu Leu Ala Ile Pro Lys Ile Tyr Gly Leu Gly Gln Phe Phe

260 265 270

Ser Phe Asn Gln Thr Ile Asp Gly Val Cys Asn Gly Ala Ala Val Gln

275 280 285

Arg Ala Pro Glu Ala Leu Arg Phe Asn Ile Asn Asp Thr Ser Val Ile

290 295 300

Leu Ala Glu Gly Ser Ile Val Leu His Thr Ala Leu Gly Thr Asn Phe

305 310 315 320

Ser Phe Val Cys Ser Asn Ser Ser Asn Pro His Leu Ala Thr Phe Ala

325 330 335

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Asp Thr Tyr Asn Ser Thr Val Tyr Lys Phe Leu Ala Val Leu Pro Pro

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Thr Val Arg Glu Ile Val Ile Thr Lys Tyr Gly Asp Val Tyr Val Asn

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Gly Phe Gly Tyr Leu His Leu Gly Leu Leu Asp Ala Val Thr Ile Asn

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Phe Thr Gly His Gly Thr Asp Asp Asp Val Ser Gly Phe Trp Thr Ile

405 410 415

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420 425 430

Ile Gln Arg Ile Leu Tyr Cys Asp Asp Pro Val Ser Gln Leu Lys Cys

435 440 445

Ser Gln Val Ala Phe Asp Leu Asp Asp Gly Phe Tyr Pro Ile Ser Ser

450 455 460

Arg Asn Leu Leu Ser His Glu Gln Pro Ile Ser Phe Val Thr Leu Pro

465 470 475 480

Ser Phe Asn Asp His Ser Phe Val Asn Ile Thr Val Ser Ala Ser Phe

485 490 495

Gly Gly His Ser Gly Ala Asn Leu Ile Ala Ser Asp Thr Thr Ile Asn

500 505 510

Gly Phe Ser Ser Phe Cys Val Asp Thr Arg Gln Phe Thr Ile Ser Leu

515 520 525

Phe Tyr Asn Val Thr Asn Ser Tyr Gly Tyr Val Ser Lys Ser Gln Asp

530 535 540

Ser Asn Cys Pro Phe Thr Leu Gln Ser Val Asn Asp Tyr Leu Ser Phe

545 550 555 560

Ser Lys Phe Cys Val Ser Thr Ser Leu Leu Ala Ser Ala Cys Thr Ile

565 570 575

Asp Leu Phe Gly Tyr Pro Glu Phe Gly Ser Gly Val Lys Phe Thr Ser

580 585 590

Leu Tyr Phe Gln Phe Thr Lys Gly Glu Leu Ile Thr Gly Thr Pro Lys

595 600 605

Pro Leu Glu Gly Val Thr Asp Val Ser Phe Met Thr Leu Asp Val Cys

610 615 620

Thr Lys Tyr Thr Ile Tyr Gly Phe Lys Gly Glu Gly Ile Ile Thr Leu

625 630 635 640

Thr Asn Ser Ser Phe Leu Ala Gly Val Tyr Tyr Thr Ser Asp Ser Gly

645 650 655

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Thr Pro Cys Ser Phe Ser Glu Gln Ala Ala Tyr Val Asp Asp Asp Ile

675 680 685

Val Gly Val Ile Ser Ser Leu Ser Ser Ser Thr Phe Asn Ser Thr Arg

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Glu Leu Pro Gly

705

<210> 15

<211> 170

<212> PRT

<213> 智人

<400> 15

Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln Leu

1 5 10 15

Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn

20 25 30

Pro Pro Thr Phe Phe Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn

35 40 45

Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu

50 55 60

Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala

65 70 75 80

Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val

85 90 95

Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala

100 105 110

Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala

115 120 125

Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr

130 135 140

Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg

145 150 155 160

Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Asp Ile Tyr

165 170

<210> 16

<211> 569

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CSFV E2-gBac 蛋白

<400> 16

Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala Ala His

1 5 10 15

Ser Ala Phe Ala Met Leu Arg Gly Gln Val Val Gln Gly Ile Ile Trp

20 25 30

Leu Leu Leu Val Thr Gly Ala Gln Gly Arg Leu Ser Cys Lys Glu Asp

35 40 45

His Arg Tyr Ala Ile Ser Ser Thr Asn Glu Ile Gly Pro Leu Gly Ala

50 55 60

Glu Gly Leu Thr Thr Thr Trp Lys Glu Tyr Asn His Gly Leu Gln Leu

65 70 75 80

Asp Asp Gly Thr Val Arg Ala Ile Cys Ile Ala Gly Ser Phe Lys Val

85 90 95

Thr Ala Leu Asn Val Val Ser Arg Arg Tyr Leu Ala Ser Leu His Lys

100 105 110

Arg Ala Leu Pro Thr Ser Val Thr Phe Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr

115 120 125

Ser Pro Ala Ile Glu Glu Met Gly Asp Asp Phe Gly Phe Gly Leu Cys

130 135 140

Pro Phe Asp Thr Thr Pro Val Val Lys Gly Lys Tyr Asn Thr Thr Leu

145 150 155 160

Leu Asn Gly Ser Ala Phe Tyr Leu Val Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly

165 170 175

Val Ile Glu Cys Thr Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val

180 185 190

Val Lys Thr Phe Lys Arg Glu Lys Pro Phe Pro His Arg Val Asp Cys

195 200 205

Val Thr Thr Ile Val Glu Lys Glu Asp Leu Phe Tyr Cys Lys Leu Gly

210 215 220

Gly Asn Trp Thr Cys Val Lys Gly Asn Pro Val Thr Tyr Thr Gly Gly

225 230 235 240

Gln Val Arg Gln Cys Arg Trp Cys Gly Phe Asp Phe Lys Glu Pro Asp

245 250 255

Gly Leu Pro His Tyr Pro Ile Gly Lys Cys Ile Leu Thr Asn Glu Thr

260 265 270

Gly Tyr Arg Val Val Asp Ser Pro Asp Cys Asn Arg Asp Gly Val Val

275 280 285

Ile Ser Thr Glu Gly Glu His Glu Cys Leu Ile Gly Asn Thr Thr Val

290 295 300

Lys Val His Ala Leu Asp Gly Arg Leu Ala Pro Met Pro Cys Arg Pro

305 310 315 320

Lys Glu Ile Val Ser Ser Ala Gly Pro Val Arg Lys Thr Ser Cys Thr

325 330 335

Phe Asn Tyr Thr Lys Thr Leu Arg Asn Lys Tyr Tyr Glu Pro Arg Asp

340 345 350

Ser Tyr Phe Gln Gln Tyr Met Leu Lys Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe

355 360 365

Asp Leu Asp Val Thr Asp His His Thr Asp Tyr Phe Ala Glu Phe Ile

370 375 380

Asn Lys Leu Asn Asn Met Leu His Asp Leu Ile Val Ser Val Ala Lys

385 390 395 400

Val Asp Glu Arg Leu Ile Gly Asn Leu Met Asn Asn Ser Val Ser Ser

405 410 415

Thr Phe Leu Ser Asp Asp Thr Phe Leu Leu Met Pro Cys Thr Asn Pro

420 425 430

Pro Ala His Thr Ser Asn Cys Tyr Asn Asn Ser Ile Tyr Lys Glu Gly

435 440 445

Arg Trp Val Ala Asn Thr Asp Ser Ser Gln Cys Ile Asp Phe Ser Asn

450 455 460

Tyr Lys Glu Leu Ala Ile Asp Asp Asp Val Glu Phe Trp Ile Pro Thr

465 470 475 480

Ile Gly Asn Thr Thr Tyr His Asp Ser Trp Lys Asp Ala Ser Gly Trp

485 490 495

Ser Phe Ile Ala Gln Gln Lys Ser Asn Leu Ile Thr Thr Met Glu Asn

500 505 510

Thr Lys Phe Gly Gly Val Gly Thr Ser Leu Ser Asp Ile Thr Ser Met

515 520 525

Ala Glu Gly Glu Leu Ala Ala Lys Leu Thr Ser Phe Met Phe Gly His

530 535 540

Val Val Asn Phe Val Ile Ile Leu Ile Val Ile Leu Phe Leu Tyr Cys

545 550 555 560

Met Ile Arg Asn Arg Asn Arg Gln Tyr

565

<210> 17

<211> 914

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S1-gBac 蛋白

<400> 17

Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala Ala His

1 5 10 15

Ser Ala Phe Ala Cys Ser Ala Asn Thr Asn Phe Arg Arg Phe Phe Ser

20 25 30

Lys Phe Asn Val Gln Ala Pro Ala Val Val Val Leu Gly Gly Tyr Leu

35 40 45

Pro Ile Gly Glu Asn Gln Gly Val Asn Ser Thr Trp Tyr Cys Ala Gly

50 55 60

Gln His Pro Thr Ala Ser Gly Val His Gly Ile Phe Val Ser His Ile

65 70 75 80

Arg Gly Gly His Gly Phe Glu Ile Gly Ile Ser Gln Glu Pro Phe Asp

85 90 95

Pro Ser Gly Tyr Gln Leu Tyr Leu His Lys Ala Thr Asn Gly Asn Thr

100 105 110

Asn Ala Thr Ala Arg Leu Arg Ile Cys Gln Phe Pro Ser Ile Lys Thr

115 120 125

Leu Gly Pro Thr Ala Asn Asn Asp Val Thr Thr Gly Arg Asn Cys Leu

130 135 140

Phe Asn Lys Ala Ile Pro Ala His Met Ser Glu His Ser Val Val Gly

145 150 155 160

Ile Thr Trp Asp Asn Asp Arg Val Thr Val Phe Ser Asp Lys Ile Tyr

165 170 175

Tyr Phe Tyr Phe Lys Asn Asp Trp Ser Arg Val Ala Thr Lys Cys Tyr

180 185 190

Asn Ser Gly Gly Cys Ala Met Gln Tyr Val Tyr Glu Pro Thr Tyr Tyr

195 200 205

Met Leu Asn Val Thr Ser Ala Gly Glu Asp Gly Ile Ser Tyr Gln Pro

210 215 220

Cys Thr Ala Asn Cys Ile Gly Tyr Ala Ala Asn Val Phe Ala Thr Glu

225 230 235 240

Pro Asn Gly His Ile Pro Glu Gly Phe Ser Phe Asn Asn Trp Phe Leu

245 250 255

Leu Ser Asn Asp Ser Thr Leu Val His Gly Lys Val Val Ser Asn Gln

260 265 270

Pro Leu Leu Val Asn Cys Leu Leu Ala Ile Pro Lys Ile Tyr Gly Leu

275 280 285

Gly Gln Phe Phe Ser Phe Asn Gln Thr Ile Asp Gly Val Cys Asn Gly

290 295 300

Ala Ala Val Gln Arg Ala Pro Glu Ala Leu Arg Phe Asn Ile Asn Asp

305 310 315 320

Thr Ser Val Ile Leu Ala Glu Gly Ser Ile Val Leu His Thr Ala Leu

325 330 335

Gly Thr Asn Phe Ser Phe Val Cys Ser Asn Ser Ser Asn Pro His Leu

340 345 350

Ala Thr Phe Ala Ile Pro Leu Gly Ala Thr Gln Val Pro Tyr Tyr Cys

355 360 365

Phe Phe Lys Val Asp Thr Tyr Asn Ser Thr Val Tyr Lys Phe Leu Ala

370 375 380

Val Leu Pro Pro Thr Val Arg Glu Ile Val Ile Thr Lys Tyr Gly Asp

385 390 395 400

Val Tyr Val Asn Gly Phe Gly Tyr Leu His Leu Gly Leu Leu Asp Ala

405 410 415

Val Thr Ile Asn Phe Thr Gly His Gly Thr Asp Asp Asp Val Ser Gly

420 425 430

Phe Trp Thr Ile Ala Ser Thr Asn Phe Val Asp Ala Leu Ile Glu Val

435 440 445

Gln Gly Thr Ala Ile Gln Arg Ile Leu Tyr Cys Asp Asp Pro Val Ser

450 455 460

Gln Leu Lys Cys Ser Gln Val Ala Phe Asp Leu Asp Asp Gly Phe Tyr

465 470 475 480

Pro Ile Ser Ser Arg Asn Leu Leu Ser His Glu Gln Pro Ile Ser Phe

485 490 495

Val Thr Leu Pro Ser Phe Asn Asp His Ser Phe Val Asn Ile Thr Val

500 505 510

Ser Ala Ser Phe Gly Gly His Ser Gly Ala Asn Leu Ile Ala Ser Asp

515 520 525

Thr Thr Ile Asn Gly Phe Ser Ser Phe Cys Val Asp Thr Arg Gln Phe

530 535 540

Thr Ile Ser Leu Phe Tyr Asn Val Thr Asn Ser Tyr Gly Tyr Val Ser

545 550 555 560

Lys Ser Gln Asp Ser Asn Cys Pro Phe Thr Leu Gln Ser Val Asn Asp

565 570 575

Tyr Leu Ser Phe Ser Lys Phe Cys Val Ser Thr Ser Leu Leu Ala Ser

580 585 590

Ala Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro Glu Phe Gly Ser Gly Val

595 600 605

Lys Phe Thr Ser Leu Tyr Phe Gln Phe Thr Lys Gly Glu Leu Ile Thr

610 615 620

Gly Thr Pro Lys Pro Leu Glu Gly Val Thr Asp Val Ser Phe Met Thr

625 630 635 640

Leu Asp Val Cys Thr Lys Tyr Thr Ile Tyr Gly Phe Lys Gly Glu Gly

645 650 655

Ile Ile Thr Leu Thr Asn Ser Ser Phe Leu Ala Gly Val Tyr Tyr Thr

660 665 670

Ser Asp Ser Gly Gln Leu Leu Ala Phe Lys Asn Val Thr Ser Gly Ala

675 680 685

Val Tyr Ser Val Thr Pro Cys Ser Phe Ser Glu Gln Ala Ala Tyr Val

690 695 700

Asp Asp Asp Ile Val Gly Val Ile Ser Ser Leu Ser Ser Ser Thr Phe

705 710 715 720

Asn Ser Thr Arg Glu Leu Pro Gly Ile Asn Lys Leu Asn Asn Met Leu

725 730 735

His Asp Leu Ile Val Ser Val Ala Lys Val Asp Glu Arg Leu Ile Gly

740 745 750

Asn Leu Met Asn Asn Ser Val Ser Ser Thr Phe Leu Ser Asp Asp Thr

755 760 765

Phe Leu Leu Met Pro Cys Thr Asn Pro Pro Ala His Thr Ser Asn Cys

770 775 780

Tyr Asn Asn Ser Ile Tyr Lys Glu Gly Arg Trp Val Ala Asn Thr Asp

785 790 795 800

Ser Ser Gln Cys Ile Asp Phe Ser Asn Tyr Lys Glu Leu Ala Ile Asp

805 810 815

Asp Asp Val Glu Phe Trp Ile Pro Thr Ile Gly Asn Thr Thr Tyr His

820 825 830

Asp Ser Trp Lys Asp Ala Ser Gly Trp Ser Phe Ile Ala Gln Gln Lys

835 840 845

Ser Asn Leu Ile Thr Thr Met Glu Asn Thr Lys Phe Gly Gly Val Gly

850 855 860

Thr Ser Leu Ser Asp Ile Thr Ser Met Ala Glu Gly Glu Leu Ala Ala

865 870 875 880

Lys Leu Thr Ser Phe Met Phe Gly His Val Val Asn Phe Val Ile Ile

885 890 895

Leu Ile Val Ile Leu Phe Leu Tyr Cys Met Ile Arg Asn Arg Asn Arg

900 905 910

Gln Tyr

<210> 18

<211> 376

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hPD1-gBac 蛋白

<400> 18

Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala Ala His

1 5 10 15

Ser Ala Phe Ala Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala

20 25 30

Val Leu Gln Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp

35 40 45

Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Phe Pro Ala Leu Leu Val Val Thr

50 55 60

Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu

65 70 75 80

Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp

85 90 95

Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys

100 105 110

Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser

115 120 125

Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala

130 135 140

Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu

145 150 155 160

Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser

165 170 175

Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Asp Ile Tyr Ile Asn

180 185 190

Lys Leu Asn Asn Met Leu His Asp Leu Ile Val Ser Val Ala Lys Val

195 200 205

Asp Glu Arg Leu Ile Gly Asn Leu Met Asn Asn Ser Val Ser Ser Thr

210 215 220

Phe Leu Ser Asp Asp Thr Phe Leu Leu Met Pro Cys Thr Asn Pro Pro

225 230 235 240

Ala His Thr Ser Asn Cys Tyr Asn Asn Ser Ile Tyr Lys Glu Gly Arg

245 250 255

Trp Val Ala Asn Thr Asp Ser Ser Gln Cys Ile Asp Phe Ser Asn Tyr

260 265 270

Lys Glu Leu Ala Ile Asp Asp Asp Val Glu Phe Trp Ile Pro Thr Ile

275 280 285

Gly Asn Thr Thr Tyr His Asp Ser Trp Lys Asp Ala Ser Gly Trp Ser

290 295 300

Phe Ile Ala Gln Gln Lys Ser Asn Leu Ile Thr Thr Met Glu Asn Thr

305 310 315 320

Lys Phe Gly Gly Val Gly Thr Ser Leu Ser Asp Ile Thr Ser Met Ala

325 330 335

Glu Gly Glu Leu Ala Ala Lys Leu Thr Ser Phe Met Phe Gly His Val

340 345 350

Val Asn Phe Val Ile Ile Leu Ile Val Ile Leu Phe Leu Tyr Cys Met

355 360 365

Ile Arg Asn Arg Asn Arg Gln Tyr

370 375

<210> 19

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SP 正向引物

<400> 19

gagctcatgg taagc 15

<210> 20

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SP 反向引物

<400> 20

aggcagaatg cg 12

<210> 21

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gp64 正向引物

<400> 21

gcgtgtctgc tca 13

<210> 22

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gp64 反向引物

<400> 22

ttaatattgt cta 13

<210> 23

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gp64 正向引物

<400> 23

atcaacaagc taa 13

<210> 24

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gp64 反向引物

<400> 24

ttaatattgt cta 13

Claims

1.一种基因重组杆状病毒，在其包膜上展现融合蛋白，该融合蛋白包含：

(i)异种抗原；以及

(ii)杆状病毒包膜GP64蛋白的C端区域，其至少为100个氨基酸残基的长度，且缺乏位于GP64蛋白中央碱性区域内的B12D5结合表位。

2.如权利要求1所述的基因重组杆状病毒，其基因组包含编码融合蛋白的转基因，该融合蛋白包含：

(a)信号肽；

(b)该异种抗原；以及

(c)该杆状病毒包膜GP64蛋白的C端区域；

其中该异种抗原位于该信号肽与该GP64蛋白C端区域之间。

3.一种载体，其包含编码融合蛋白的转基因，该融合蛋白包含：

(a)信号肽，位于该融合蛋白的N端；

(b)异种抗原；以及

(c)杆状病毒包膜GP64蛋白的C端区域，其至少为100个氨基酸残基的长度，且缺乏位于GP64蛋白中央碱性区域内的B12D5结合表位；

其中该异种抗原位于该信号肽与该GP64蛋白C端区域之间。

4.如权利要求3所述的载体，其为基因重组杆状病毒。

5.如权利要求3所述的载体或如权利要求2所述的基因重组杆状病毒，其中该转基因以可操作的方式连结至启动子。

6.如权利要求1所述的基因重组杆状病毒，其中该GP64蛋白的C端区域缺乏序列识别号：2、3或4的氨基酸序列。

7.如权利要求1所述的基因重组杆状病毒，其中该GP64蛋白的C端区域包含序列识别号：1的第327至512位氨基酸残基。

8.如权利要求1所述的基因重组杆状病毒，其中该GP64蛋白的该C端区域具有N端，该N端介于序列识别号：1的第292至328位氨基酸残基之间。

9.如权利要求1所述的基因重组杆状病毒，其中该信号肽包含选自以下群组：序列识别号：5、6、7、8、9、10、11及12的氨基酸序列。

10.一种昆虫细胞，其被如权利要求1所述的基因重组杆状病毒所转导。

11.如权利要求1所述的基因重组杆状病毒，其中该异种抗原选自以下群组中的至少一者：病原体蛋白、癌细胞蛋白以及免疫检查点蛋白。

12.如权利要求11所述的基因重组杆状病毒，其中：

(i)该病原体选自以下群组中的至少一者：人类乳突病毒、猪生殖与呼吸综合症病毒、人类免疫缺陷病毒-1、登革热病毒、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、猪环状病毒2、猪瘟病毒、口蹄疫病毒、新城病病毒、传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、流行性感冒病毒、假性狂犬病病毒、微小病毒、猪水疱病病毒、痘疮病毒、轮状病毒、肺炎霉浆菌、单纯疱疹病毒、传染性支气管炎、传染性华氏囊病病毒；

(ii)该癌症选自以下群组中的至少一者：非小细胞肺癌、乳癌、黑色素瘤、淋巴瘤、结肠癌、肝细胞癌及其任何组合；以及

(iii)该免疫检查点选自以下群组中的至少一者：PD-1、PD-L1、PD-L2及CTLA-4。

13.如权利要求1所述的基因重组杆状病毒，其中该异种抗原选自以下群组中的至少一者：猪瘟病毒包膜糖蛋白E2、猪流行性腹泻病毒S1蛋白、程序性细胞凋亡蛋白1以及肿瘤相关抗原。

14.如权利要求3所述的载体，其中该异种抗原选自以下群组中的至少一者：病原体蛋白、癌细胞蛋白以及免疫检查点蛋白。

15.一种如权利要求3所述的载体或如权利要求1所述的基因重组杆状病毒用于制备医药品的用途，该医药品可在需要治疗的个体体内诱发抗原特异性免疫原性反应。