KR101675185B1 - 디자이너(designer) 펩티드-기반 pcv2 백신 - Google Patents

Abstract

PCV2 캡시드 단백질로부터 유도된 펩티드 항원을 포함하는 돼지 써코바이러스 (PCV2) 백신 조성물을 기재한다. 다양한 실시양태에서, 펩티드 항원은 캡시드 단백질의 약 아미노산 47 내지 약 아미노산 202의 아미노산을 함유한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 항원은 인공 T 헬퍼 에피토프에 임의로 연결되었고/되었거나 PCV2의 ORF1 및 ORF3 단백질로부터 유도된 T 헬퍼 에피토프와 혼합된다. PCV2 백신 조성물의 사용 방법이 또한 기재된다. 다양한 실시양태에서, 백신 조성물은 동물에서 PCV2 감염의 예방을 위해 사용된다. 다른 실시양태에서, PCV2 백신 조성물은 PCV2 감염을 진단하기 위한 항원으로서 사용된다.

Description

디자이너(DESIGNER) 펩티드-기반 PCV2 백신{DESIGNER PEPTIDE-BASED PCV2 VACCINE}

본 발명의 분야

본 개시는 돼지 써코바이러스 유형 2 (PCV2)에 대한 펩티드-기반 백신, 및 수명은 짧지만, PCV2에 대한 모체 유도된 항체의 상대적으로 높은 역가에도 불구하고 PCV2 감염에 대해 새끼 돼지를 보호하기 위한 상기 백신의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 다양한 실시양태에 따른 백신 제제는 그의 B 세포 면역원성을 증대시키기 위해 인공 T 헬퍼 에피토프에 임의로 연결된 오픈 리딩 프레임 2 (ORF2)-코딩된 캡시드 단백질로부터 유도된 펩티드를 함유하며, 상기 T 헬퍼 에피토프는 수의학적으로 허용되는 전달 시스템에서 백신 제제로서 제조된 PCV2 T 헬퍼 에피토프의 군집을 함유하는 PCV2 ORF1 및 ORF3로부터 유도된 펩티드의 혼합물로 임의로 보충될 수 있다.

본 발명의 배경

돼지 써코바이러스 (PCV)는 1974년에 돼지 신장 조직 배양 세포주 (PK15)의 피코르나바이러스-유사 오염물질로서 확인되었다 (1). 1998년에, 인공적으로 및 유전적으로 구별되는 PCV를 돼지 조직으로부터 단리하고, 돼지 써코바이러스 유형 2 (PCV2)로 명명하였다; PCV2는 돼지에서의 임상적 질환과 연관된다 (2).

돼지에서의 부상하고 있고, 경제적으로 중요한 질환인 이유 후 다조직 소모성 증후군 (PMWS)은 PCV2에 의해 야기된다. 그러나, 증거는 PMWS의 징후의 현상은 병원체, 예를 들면 돼지 파르보바이러스 (PPV) 또는 유사한 면역 자극제, 스트레스, 또는 보조인자로의 공동-감염을 요구한다는 것을 제시한다. 이 증후군은 7 내지 15주령의 돼지를, 소모, 호흡 곤란, 비대 림프절, 설사, 창백, 및 황달로 약화시킨다. 또한, 육안적 및 조직학적 병변은 다발 기관 시스템에 영향을 줄 수 있으며, 간질 폐렴, 림프절병증, 간염, 신장염, 심근염, 장염, 피부염, 및 췌장염에 연관된다 (1,3).

PCV2에 대해 특이적인 항체는 소급적으로 돼지 혈청에서 1973년도까지 거슬러 올라가 검출되었다 (4). PMWS의 진단은 영향받은 조직에서의 병변과 연관된 PCV2-특이적 핵산 또는 항원 중 하나의 검출에 의존한다. 바이러스는 심장, 폐, 간, 신장, 비장, 침샘, 림프절, 갑상샘, 흉선, 위장관, 대변, 췌장, 고환, 및 뇌로부터 단리되었다 (1,5).

전파의 주된 경로는 알려지지 않았지만, 증거는 PCV2는 수평적 및 수직적 둘 다로 전파될 수 있다는 것을 제시한다. 이는 자연적으로 감염된 돼지로부터의 안구, 비강, 및 대변 샘플에서 검출되었다. 유산된 돼지 태아 조직으로부터의 PCV2의 단리는 수직적 전파를 제시한다. 자연적으로 및 실험적으로 감염된 야생돼지의 정액에서의 PCV2 핵산의 검출은 야생돼지에서 PCV2-나이브(naive) 어린 암퇘지 및 그들의 한 배에서 난 새끼들로의 전파를 제시한다 (5).

돼지 써코바이러스 유형 2 (PCV2)는 원형 외가닥 DNA (ssDNA) 게놈을 갖는 작은 외피비보유 바이러스이다. 게놈은 추정되는 단백질을 코딩하는 6개의 오픈 리딩 프레임 (ORF)과 (2) 비병원성 돼지 써코바이러스 유형 1 (PCV1) (6)로부터의 유사한 ORF와 유의한 상동성을 공유하는 4개의 ORF를 포함한다. ORF1, ORF2, 및 ORF3에 의해 코딩되는 단백질만이 PCV2-감염된 세포에서 검출되었다. ORF1은 312개의 아미노산 레플리카제 단백질을 코딩하고, 또한 168개의 아미노산 스플라이싱된 변이체를 야기하며, 이들 둘 다는 PCV2 복제를 위해 필수적이다 (7). 구조적 캡시드 단백질은 ORF2에 의해 코딩되며 (8); ORF3은 복제를 위해 필수적이지는 않지만, PCV2-유도된 아팝토시스 및 병원성에서 중요한 역할을 하는 고도로 보존된 단백질을 코딩한다 (9).

표면-노출된 PCV2 ORF2-코딩된 캡시드 단백질만이 숙주의 면역 시스템의 B 세포에 의한 보호적 항체 반응을 야기할 수 있다 (10). 그 관찰과 일관되어, PEPSCAN 지도화 연구는 PCV2에 대한 특이성을 갖는 면역우세 B 세포 에피토프의 군집을 주로 PCV2 캡시드 단백질 상의 부위로, 잔기 65-87, 113-139, 169-183, 및 193-207에 국소화시켰다 (11). B 세포 에피토프에 추가로, T 헬퍼 세포 에피토프를 비롯한 면역우세 T 세포 에피토프는, 바이러스의 항원성에 영향을 주는 또다른 중요한 요인이다. T 헬퍼 세포 에피토프는 B 세포가 항체를 생성하도록 신호하는 보호적 T 헬퍼 세포 (Th) 반응을 야기한다. 캡시드 단백질에의 B 세포 에피토프의 국소화와 대조하여 (11), 20머(20mer) 펩티드로의 PCV2의 T 세포 에피토프 지도화 및 림프구 증식 검정은 면역우세 Th 반응은 가장 지속적으로 ORF1 및 ORF3의 비구조적 단백질 상의 에피토프에 국소화되며, 면역우세를 나타낸 ORF2에 의해 코딩된 선형 Th 에피토프는 없었다는 것을 나타냈다 (12).

합성 펩티드에 의한 면역 시스템에의 Th 결정자의 제시는 합성 펩티드의 면역원성을 조절하는 중요한 요인이다. 면역우세이고, 뒤섞인 Th 에피토프는 상이한 MHC 유형의 집단에서 고도로 및 넓게 반응성이다 (13). 따라서, 캡시드 단백질 상의 면역우세 Th 부위의 결핍은 PCV2에 대한 소단위 캡시드 백신의 제한된 면역원성을 설명하는데 서열을 준다. 펩티드 소단위 면역원의 면역원성은 유전적 반응성이 복합 화학을 통해 비대된 뒤섞인 Th 에피토프를 비롯한 선택된 외래 뒤섞인 Th 부위에의 표적된 B 세포 에피토프의 공유 연결에 의해 강화될 수 있다 (14, 15, 16). 추가로, 돼지에서의 백신의 면역역가 및 백신에 의해 제공된 바이러스성 감염으로부터의 돼지의 보호는 바이러스의 다발 Th 에피토프에 의해 영향받을 수 있으며, 이들은 여러 단백질로부터의 B 세포 에피토프와 조합되어 교차-보호적일 수 있다 (17).

새끼 돼지를 PCV2-관련된 질환, 예를 들면 PMWS에 대해 보호하는 저 비용의 고도로 특이적인 백신에 대한 필요성이 있다. 돼지에 대한 통상적인 백신은 불활성화된 전 PCV2 바이러스를 기반으로 한다. 그러나, PCV2는 세포 배양에서 높은 역가로 복제하지 않아, 통상적인 백신을 비싸고, 낮은 효능으로 만든다. 대안 백신은 재조합 PCV2 ORF2 항원을 기반으로 한다. PCV2 ORF2 캡시드 소단위는 곤충 세포에서의 바큘로바이러스 발현 시스템을 비롯한 다양한 발현 시스템에서 발현되었다 (3,10). 대부분의 적용에서, 재조합 PCV2 캡시드 단백질을 생성하는 곤충 세포는 용혈되고, 새끼 돼지를 예방 접종시키는데 사용되는 백신으로 제제화된다. 상기 재조합 항원은 종종 숙주 세포 및 벡터-코딩된 항원을 함유하며, 따라서 백신을 비특이적으로 만들며, 과민증을 비롯한 심한 유해 면역 반응을 야기할 수 있다.

재조합 바이러스 용균물 또는 정제된 단백질 중 하나로서의 불활성화된 바이러스 PCV2 백신, 및 소단위 캡시드 백신의 또다른 문제는, 보통 필드 새끼 돼지에서 사용된 경우 그들의 상대적으로 낮은 효능이다. 필드의 새끼 돼지는 종종 모성-유도된 항체 (MDA)를 갖기 때문에, 그들은 일반적으로 특이적 무-병원체 (SPF) 새끼 돼지 또는 제왕절개-유도된 초유 궁핍 (CDCD) 새끼 돼지에서 시험된다. 이들 모성 항체는, 보호를 제공하기 위해 전형적으로 역가가 너무 낮고, 기간이 너무 짧지만, 예방접종을 간섭하는데는 여전히 충분히 높다. MDA에 의한 이 간섭은 높은 투여량의 재조합 ORF2 캡시드 항원의 투여에 의해 부분적으로 극복될 수 있다 (18). 재조합 전장 ORF2 항원은 배지에 US2009/0022749A1에 개시된 바큘로바이러스 발현 시스템에 의해 분비되었다 (19). 이 시스템은 부분적으로 낮은 수율 및 순도의 문제를 경감시키지만; 이 시스템 및 다른 생물학적 발현 시스템은 전장 PVC2 항원 제제의 본질적으로 제한된 면역원성으로부터 고통을 받으며, 이들은 비-재현성, 낮은 수율, 및 복잡한 품질 관리 프로토콜로부터 기인하는 손실이 큰 문제를 견딘다. 따라서, 면역원성 펩티드가 고안되고 합성되는 합리적인 고안의 절차를 통한 PCV2 백신을 개발하는 것이 바람직하다. 상기 펩티드-기반 백신은 다른 PCV2 단백질로부터 유도된 캡시드-특이적 B 세포 에피토프, 강력한 외래 Th 에피토프 및 PCV2 Th 에피토프를 함유하도록 고안될 수 있으며, 조합되어 백신 제제화의 주요 성분으로서 사용되어, 새끼 돼지에서 PCV2 감염과 정확히 맞서는 항-캡시드 항체 반응을 야기할 수 있다.

바이러스 백신에 대한 면역원성 펩티드의 합리적인 고안은 에피토프 지도화에 의한 면역우세 에피토프의 식별로 시작된다. 에피토프 지도화는 표적된 바이러스 단백질 상의 관심의 영역에 상응하는 중복 펩티드의 시리즈를 사용하여, 면역 시스템과의 상호작용에서의 면역원성 결정자로서 참여하는 부위를 식별한다. 가장 흔히, 에피토프 지도화는 선형 결정자를 정확히 검출하기 위해 상대적으로 짧은 길이의 펩티드를 사용한다. "PEPSCAN"으로 알려진 에피토프 지도화의 빠른 방법은 고체 지지체에 커플링된 수백개의 중복 펩티드의 동시 합성을 기반으로 한다. 커플링된 펩티드는 항체를 결합하거나 또는 T 세포 증식을 자극하는 그들의 능력에 대해 시험된다. 이 접근법은 선형 B 및 T 세포 결정자를 국소화시키는데 효과적이지만; 백신 개발을 위해 필수적인 표적된 바이러스 또는 단백질의 면역우세 B 세포 에피토프는 일반적으로 PEPSCAN 방법에 의해 정의되기 어려운 긴 고 친화도 불연속 에피토프이다 (20).

조절되고, 재생가능한 고체-상 펩티드 합성에 의해 화학적으로 밀리그램 내지 킬로그램 양으로 합성될 수 있는 긴 불연속 에피토프를 갖는 면역원성 PCV2 펩티드의 식별에 대한 필요성이 있다. PCV2 캡시드 면역원의 합성에 대한 이 조절된 상업적 규모 절차는 상기 펩티드 생성물을 특징화하기 위한 간단한 수단과 함께, PCV 백신 제제의 낮은 비용의 상업적 규모 제조 및 품질 관리를 위한 틀을 제공할 것이다 (21).

본 발명의 간단한 설명

본 개시는 펩티드 또는 펩티드 조성물을 포함하는 돼지 써코바이러스 유형 2 (PCV2) 백신에 관한 것이며, 여기서 펩티드 또는 펩티드 조성물은 혈청학적 반응성에 대한 중복 짧은 PCV2 캡시드 펩티드 및 긴 PCV2 캡시드 펩티드를 스크리닝함으로써 최적화된다. 이러한 실증적인 결과는 진뱅크 등록 번호(GenBank Accession Number) AAN62766에 의해 예시된 바와 같이 PCV2 캡시드 단백질 내에 면역우세 B 세포 에피토프의 군집을 검출하였다. 구체적으로, 면역우세 B 세포 에피토프의 군집은 PCV2 캡시드 단백질의 154개 아미노산 길이의 펩티드 상에서 발견되었다 (펩티드 Cap1, 서열 1, 또한 표 1에 나타냄). 이 펩티드는 펩티드-기반 백신 내에 주요 면역원으로서 PCV2 감염에 대한 보호적 항체 및 세포-매개된 면역 반응을 야기하기 위해 혼입되었으며, 추가의 외래 및 PCV2-유도된 T 세포 에피토프에 의해 증가되었다. 상기 펩티드 면역원은 PCV2에 대한 백신의 제제화를 위해 유용하다.

본 발명의 다양한 실시양태는 새끼 돼지를 PCV2 감염에 대해 보호할 수 있는 면역 반응의 야기를 위한, 그리고 PCV2 감염의 검출을 위한 진단적 키트의 제조를 위한 상기 펩티드, 펩티드 조성물의 제조 방법 및 백신으로서의 제약적 제제화에 관련된다.

본 발명의 다양한 실시양태는 ORF2 캡시드 단백질로부터 유도된 고안된 PCV2 Cap1 펩티드 (서열 1), 및 그의 상동체 및 동족체를 함유하는 백신 제제에 관련된다. 이들 제제에서의 PCV2 Cap1 펩티드는 바람직하게는, 그러나 임의로, 그의 B 세포 면역원성을 증대시키기 위해 인공 복합 T 헬퍼 에피토프 (서열 2, 또한 표 1에 나타냄)에 연결된다. PCV2 Cap1 펩티드는 또한 PCV2 Th 에피토프의 군집 (또한 표 1에 나타냄)을 함유하는 PCV2 ORF1 (서열 3 및 4) 및 ORF3 (서열 5) 펩티드의 혼합물에 임의로 혼합될 수 있다. 상기 펩티드-기반 PCV2 백신 제제는 예방접종에 간섭할 수 있는 모체 유도된 항체 (MDA)를 가질 수 있는 항체 반응을 비롯한 새끼 돼지에서 PCV2 감염에 대해 보호하는 PCV2-특이적 항체 반응을 야기한다. 상기 고안된 펩티드-기반 백신은 산업적 적용을 위해, 그리고 쉽게 품질 관리될 수 있도록 밀리그램 내지 킬로그램 규모로 화학적으로 합성될 수 있는 면역원으로서 펩티드 조성물을 함유한다.

또한 본 발명의 다양한 실시양태에 의해 백신 제제와 일상적으로 혼입된 아쥬반트 및/또는 전달 비히클 및 다른 성분이 제공된다.

도면의 간단한 설명

도 1a는 본 발명의 실시양태에 따라 면역형광법에 의해 공동-형질감염된 HTK 세포주 세포의 핵 내의 캡시드에 결합된 PCV2 캡시드 단백질에 대한 항체를 검출하는 기전을 나타내는 삽화이다. 삽화는 T7 폴리머라제 재조합 우두 바이러스 (T7/vac) (22)로 감염된 HTK 세포 및 리포펙타민(lipofectamine)^TM(Invitrogen)에 의해 pCR-orf2 플라스미드로 공동-형질감염된 HTK 세포를 나타낸다. 재조합 캡시드 단백질은 번역된 후 핵에 운반된다 (23). 본 발명의 한 실시양태에 따라, 항-캡시드 항체는 형질감염된 HTK 숙주 세포의 핵에 결합되며, 이들은 표지된 2차 항체의 면역형광법에 의해 검출된다. 이 방법은 원핵 T7 프로모터에 의해 매개된 전장 PCV2 캡시드 단백질의 HTK 세포에서의 일과성 진핵 발현을 통한 높은 특이성을 갖는 PCV2 캡시드 단백질이 진짜임을 입증하기 위해 항체의 검출을 제공한다.

도 1b는 도 1a에 기재된 기전에 따라 수행된 면역형광법 검정 (IFA)이다. 핵 내의 캡시드에 결합된 PCV2 캡시드 단백질에 대한 항체를 갖는 공동-형질감염된 HTK 세포주 세포가 검출되었다.

도 2는 지역성 PCV2 감염이 있는 일반적인 농장에서 사육한 표 5에 기재된 바와 같이 8개의 Cap1 펩티드-기반 PCV2 백신 제제 및 투여량으로 면역화된 새끼 돼지의 면역원성을 보고하는 그래프이다. 면역원성은 PCV2 Cap1 펩티드-기반 ELISA (역가는 Log₁₀임)에 의해 평가되었다.

도 3a는 PCV2에 의해 감염된 예방접종되지 않은 돼지의 신장의 사진이다. 병변은 괄호로 표시되어 있다 (*).

도 3b는 하나는 절개되었고 (좌측), 하나는 무손상 (우측) 감염되지 않은 예방접종된 돼지로부터의 신장의 사진이다. 플래시로부터의 빛 반사는 괄호로 표시되어 있다 (**).

본 발명의 상세한 설명

펩티드 항원은 면역학적 반응을 검출할 수 있으며, 특정 펩티드 항원은 또한 면역학적 반응을 자극할 수 있다. 많은 펩티드 항원은 면역 반응의 민감적 및 특이적 검출을 위해 사용될 수 있으나, 가장 종종 이들은 이들 자체로는 면역원으로서 작용하지 않는다. 펩티드 면역원은 면역 반응을 자극하고, 그들을 검출하는데 사용될 수 있는 펩티드 항원의 특별한 클래스이다. 본 발명의 하나의 실시양태에 따라, PCV2 백신에서의 펩티드 항원은 보호적 면역 반응의 생성을 자극하기 위해 함께 작용하고, 추가로 PCV2 감염에 대한 면역 반응을 검출하는 것이 가능한 B 세포 및 T 헬퍼 세포 (Th) 에피토프 둘 다를 갖는 펩티드 면역원이다.

B 세포 에피토프의 식별을 위한 하나의 방법은 전형적으로 20개 내지 60개의 잔기의 범위를 갖거나 또는 길이가 더 긴 다중 길이의 네스티드(nested) 및 중복 펩티드의 세트에 의존한다. 이들 더 긴 펩티드는 빠르고, 동시적인 PEPSCAN 합성 보다는, 어려운 시리즈의 독립적인 고체-상 펩티드 합성에 의해 합성된다. 생성된 네스티드 및 중복 펩티드의 세트는 이어서 불연속 입체형태적 B 세포 에피토프를 비롯한 면역우세 결정자를 가장 잘 제시하는 긴 펩티드를 식별하기 위해 항체 결합 연구 및 실험적 면역화에서 사용될 수 있다. 이 방법은 HIV의 gp120 글리코단백질에 의한 결합을 차단하기 위한 백신에서 사용된 CD4에 대한 비-선형 결정자의 선택을 위해 (24), 그리고 발입 질환 바이러스의 VP1 단백질의 G-H 루프 도메인으로부터의 강력한 펩티드 항원의 고안을 위해 이용되어 왔다 (25).

본 발명의 하나의 실시양태는 최적의 항체 인식을 위한 B 세포 에피토프의 군집을 갖는 154머(154mer) 아미노산 서열 (서열 1, 또한 표 1에 나타냄)을 포함하는 PCV2 ORF2-코딩된 캡시드 펩티드를 제공한다. 이들 항원성 펩티드는 실증적으로 식별되었고, PCV2-감염된 새끼 돼지 및 ELISA 면역검정 포맷으로부터의 혈청 샘플을 사용하여 최적화되었다. 펩티드 항원, 예를 들면, ELISA를 비롯한 항체 포획 상에 조정될 수 있는 임의의 면역검정 포맷은 PCV2-감염된 돼지로부터의 혈액, 혈청, 또는 혈장 샘플에서의 PCV2 캡시드 단백질의 특정 단편에 결합하는 항체를 검출하고, 정량하기 위해 사용될 수 있다.

특정 실시양태에서, 아미노산 잔기 47-202의 전장 PCV2 단백질에 상응하는 약 154개 아미노산 (서열 1)의 최적화된 PCV2 항원성 펩티드는 예방접종에 의한 보호적 항체의 생성 및 ELISA에 의한 진단을 위한 항체의 검출 둘 다를 위해 가장 유용한 PCV2 캡시드의 면역원성 및 항원성 부위를 제시한다. 이 고도로 항원성 및 면역원성 캡시드 펩티드는 고안되고, 합성되고, 감염된 새끼 돼지로부터의 PCV2 양성 혈청의 패널에 대한 반응성에 대해 시험된 20개 내지 170개의 잔기의 길이를 갖는 50개 초과의 중복 펩티드의 수집 중에서 확인되었다. 50개 초과의 시험된 후보 펩티드 항원 중, PCV2 Cap1 항원성 펩티드 (서열 1)는 면역우세 B 세포 에피토프의 군집을 갖는 것으로 밝혀졌으며, PCV2 양성 혈청 패널에 대해 가장 유의하고 일관된 항원성을 가졌다. Cap1 펩티드는 또한 이 펩티드 서열을 포함하는 백신의 시험에서 시험된 경우 높은 면역원성인 것으로 입증되었다. PCV2 Cap1 항원성/면역원성 펩티드 (예를 들면, 서열 1)를 포함하는 백신의 생성 및 사용은 본 발명의 다양한 예시적인 실시양태의 범주 내에 있다.

PCV2 Cap1 면역원성/항원성 펩티드 발명의 특정 실시양태는 PCV2의 돌연변이체 및 변이체 균주로부터의 상응하는 서열 및 형태적 요소를 갖는 서열 1의 면역학적으로 기능성인 상동체인 것으로 추가 정의된다. 상동성 PCV2 Cap1 항원성 펩티드는 발생 변이체 PCV2 균주의 캡시드 단백질 위치 47-202와 대략적으로 상관관계가 있는 아미노산 잔기를 갖는다. 이러한 상동체는 서열 정렬 프로그램, 예컨대 클러스탈W(ClustalW) (독일 소재의 유럽 분자 생물학 실험실의 줄리 디. 톰슨(Julie D. Thompson), 토비 깁슨(Toby Gibson) 및 영국 캠브리지 소재의 유럽 생물정보 위원회의 데스몬드 히긴스(Desmond Higgins)에 의해 제조됨. 알고리즘)을 통해 용이하게 입증된다. 표 2는 진뱅크 등록 번호에 의해 식별되는 PCV2의 다양한 균주로부터 취한 11개의 Cap1 항원 서열의 클러스탈W에 의한 정렬을 나타낸다. 표 2에 정렬된 Cap1 상동체의 발생 PCV 균주는 유전자형 2a, 2b, 2d, 1/2a의 바이러스를 포함하고, 이들 다양한 균주는 타이완, 중국, 미국, 캐나다, 브라질, 스페인, 독일 및 덴마크의 동물로부터 단리되었다. 표 2는 또한 상동체를, 가변 위치에 배정된 아미노산이 상기 위치에 대해 가장 빈번하게 적용되는 아미노산인 컨센서스 Cap1 서열인 것으로 예시하고 있다. 한 실시양태에서, 상동체는 PCV2 캡시드 단백질의 대략 아미노산 위치 47 내지 대략 아미노산 위치 202의 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 상동체는 서열 1에 대한 동일성이 80％ 이상인 것으로 추가 정의된다. 한 실시양태에서, 변이체 균주 상동체는 서열 1에 대한 동일성이 85％ 이상이다. 또다른 실시양태에서, 변이체 균주 상동체는 서열 1에 대한 동일성이 90％ 이상이다. 또다른 실시양태에서, 변이체 균주 상동체는 서열 1에 대한 동일성이 95％ 이상이다.

본 발명의 다른 실시양태는 PCV2 Cap1 항원성 펩티드의 면역학적으로 기능성인 유사체를 제공한다. Cap1 펩티드의 면역학적으로 기능성인 유사체는 서열 1의 변이체 및 본래 항원성 펩티드와 실질적으로 동일한 항원성 및 면역원성을 보유하는 상동체를 포함한다. 예를 들어, 서열 1의 기능적 유사체인 변이체 또는 상동체는 아미노산 위치에서의 보존적 치환; 전체 전하의 변화; 또다른 모이어티에의 공유 결합; 또는 소량의 부가, 삽입, 결실 또는 보존적 치환 및/또는 이들의 임의의 조합을 가질 수 있다. 따라서, PCV2 Cap1 항원성 펩티드 (예를 들어, 서열 1)에 결합하는 항체는 또한 실질적으로 유사한 효능을 갖는 PCV2 Cap1 항원성 펩티드의 면역학적으로 기능성인 유사체에 결합할 것이다. 한 실시양태에서, 기능적 유사체는 서열 1 또는 상동체에 대한 동일성이 50％ 이상이다. 또다른 실시양태에서, 기능적 유사체는 서열 1 또는 상동체에 대한 동일성이 80％ 이상이다. 또다른 실시양태에서, 기능적 유사체는 서열 1 또는 상동체에 대한 상동성이 85％ 이상이다. 또다른 실시양태에서, 기능적 유사체는 서열 1 또는 상동체에 대한 상동성이 90％ 이상이다.

한 실시양태에서, PCV2 Cap1 항원성 펩티드의 면역학적으로 기능성인 유사체는 보존적 치환 및 삽입 또는 결실에 의해 변형된 PCV2 Cap1 항원성 펩티드 버젼을 포함한다. 이 실시양태에서, 면역학적으로 기능성인 유사체는 서열 1 또는 서열 1의 상동체로부터 보존적인 치환에 의해 변형될 수 있다.

보존적 치환은 1개의 아미노산 잔기가 유사한 화학적 성질을 갖는 또다른 아미노산 잔기로 치환되는 경우이다. 예를 들어, 비극성 (소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함하고; 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함하고; 양전하 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함하고; 음전하 (산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다.

또다른 실시양태에서, 면역학적으로 기능성인 유사체는 펩티드의 N-말단, C-말단에의 아미노산 부가, 및/또는 펩티드의 중앙 내로의 삽입에 의해 변형될 수 있다. 본 발명의 다양한 실시양태에서, 부가는 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 대한 것이다. 부가는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 아미노산 잔기일 수 있다. 이러한 부가는, PCV2 캡시드에 존재하지 않으며 펩티드의 PCV2 캡시드 부분의 면역원성을 변경하지 않는 아미노산 서열을 구성할 수 있다. PCV2 캡시드에 존재하지 않는 부가는 소량의 하전된 서열 (예를 들어, 리신-리신-리신), 분지형 구조의 형성을 가능하게 하는 아미노산 (예를 들어, εN-리신) 또는 환형 구조의 형성을 가능하게 하는 아미노산 (예를 들어, 시스테인)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 실시양태에서, PCV2 Cap1에 존재하지 않는 아미노산 서열의 부가는 5개 이하의 아미노산이다. 아미노산 부가는 표준 또는 비-표준 아미노산 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

또다른 특정 실시양태에서, 면역학적으로 기능성인 유사체는 펩티드의 N-말단, C-말단 및/또는 중앙에 대한 아미노산 결실에 의해 변형될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 결실은 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 대한 것이다. 결실은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 아미노산 잔기일 수 있다. 특정 실시양태에서, 아미노산 서열의 결실은 10개 이하의 아미노산이다.

또다른 실시양태에서, PCV2 Cap1 항원성 펩티드의 면역학적으로 기능성인 유사체는 전하의 변경에 의해 변형된 PCV2 cap 항원성 펩티드를 포함한다. 이러한 전하의 변경은 아미노산 치환, 부가 또는 결실, 또는 하전된 분자의 공유 결합의 결과일 수 있다. 전하의 변경은 펩디드를 비변형 펩티드에 비해 보다 염기성으로 만들거나, 보다 산성으로 만들거나, 보다 중성으로 만들 수 있다. 특정 실시양태에서, 펩티드는 N-말단 또는 C-말단에 1 내지 5개의 리신 잔기를 부가함으로써 보다 염기성이 된다. 보다 특정의 실시양태에서, 펩티드는 N-말단에 대한 3개의 리신 잔기 부가에 의해 보다 염기성이 된다.

비-제한적인 예를 통해, 본 발명 펩티드의 면역학적으로 기능성인 유사체는 1 내지 약 5개의 추가 아미노산 (표준 및 비-표준)이 말단 아미노산에 부가될 수 있다. 예를 들어, 서열 Lys-Lys-Lys은 전하의 변화를 위해 본 PCV2 Cap1 펩티드의 아미노 말단에 부가될 수 있다.

펩티드는 표준 기술, 예컨대 메리필드(Merrifield) 고상 합성 방법 및 그 방법에 대한 무수히 이용가능한 개선을 사용하여 용이하게 합성될 수 있다. 펩티드는 또한 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 따라서, PCV2 Cap1 항원성 펩티드 및 PCV2 Cap1 항원성 펩티드의 면역학적으로 기능성인 유사체 및 이들의 보체를 코딩하는 핵산 분자는 본 발명의 다양한 예시적 실시양태에 포함된다. 또한, 벡터, 특히 PCV2 Cap1 항원성 펩티드 및 면역학적으로 기능성인 유사체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터는 본 발명의 다양한 예시적 실시양태에 포함된다. 또한, 벡터를 함유하는 숙주 세포는 본 발명의 다양한 예시적 실시양태에 포함된다.

본 발명의 다양한 예시적 실시양태는 또한 PCV2 Cap1 항원성 펩티드 및 PCV2 Cap1 항원성 펩티드의 면역학적으로 기능성인 유사체를 제조하는 방법을 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 PCV2 Cap1 항원성 펩티드 및/또는 PCV2 Cap1 항원성 펩티드의 면역학적으로 기능성인 유사체를 발현시키는 조건 하에서 PCV2 Cap1 항원성 펩티드 및/또는 PCV2 Cap1 항원성 펩티드의 면역학적으로 기능성인 유사체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포를 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 이러한 실시양태는 상기 세포의 용해물 또는 분비물로부터 유도된 제어되고 잘 정의된 면역원을 사용할 수 있다.

본 발명의 한 양태는 고상 합성에 의해 제조된 펩티드 조성물을 제공한다. 이러한 실시양태의 화학 방법에 의해 제조된 항원의 질은 제어되고 정의되며, 그 결과 항원성, 면역원성 및 수율의 재현성이 보장될 수 있다. 또한, 펩티드 항원의 제조에 생물학적 유해 물질이 사용되지 않으며, 비싼 생물학적 오염에 대한 위험을 감소시키고 그에 대한 필요성을 제거한다. 선택된 에피토프의 높은 몰 농도를 제시하는 부위-특이적 면역원은 PCV2 Cap1 항원성 펩티드 조성물을 이용하는 백신의 안전성 및 면역효능 모두를 보장한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 펩티드는 합성된다. 정의된 Cap1 합성 펩티드의 사용은, 새끼 돼지에서의 항체 검출 및 진단을 위한 항원으로서 사용되는 경우, 위양성(false positive) 결과를 최소화한다. 면역원으로서 공지의 B 세포 및 Th 에피토프를 갖는 정의된 합성 펩티드의 사용은, 백신의 면역원성 성분으로서 사용되는 경우, PCV2-감염된 또는 재조합 바이러스-감염된 숙주 세포 및 PCV2 바이러스 및/또는 재조합 단백질과 공동-정제될 수 있는 재조합 단백질 발현계로부터 발생한 항원성 물질의 존재에 의해 야기된 목적하지 않은 비-PCV2-특이적 면역 반응을 제거한다. 예를 들어, 돼지로부터의 혈청은 숙주 세포에 대한 항체 또는 재조합 에쉐리히아 콜리, 효모 또는 배큘로바이러스에 대한 항체를 가질 수 있으며, 상기 항체는 이후 생물학적으로 유도된 항원을 기준으로 한 진단 시험에서 사용된 항원성 물질과 교차반응하고, 성분으로서 이들 외인성 면역원을 갖는 백신에 의해 생성된 상기 면역 반응은 비-보호적일 것이다. 대조적으로, 본 발명의 PCV2 Cap1 펩티드 백신을 수여받은 돼지는, 부적합한 항체를 피하는 집중된 면역 반응, 및 숙주 세포 또는 발현 벡터로부터 발생한 단백질, 예를 들어 생물학적으로 유도된 PCV2 항원과 공동-정제된 재조합 에쉐리히아 콜리, 효모 또는 배큘로바이러스로부터의 단백질에 대한 다른 면역 반응을 생성할 것이다.

이러한 합성 펩티드의 실시양태는 또한 제조 동안 생성된 불순물로부터의 간섭을 최소화한다. 긴 합성과 함께, 커플링 효율의 엄격한 제어에도 불구하고, 아미노산 삽입, 결실, 치환 및 조기 종결을 포함한 신장 주기 동안의 사건으로 인해 펩티드 유사체가 또한 생성되고, 그 결과 표적 펩티드 합성과 함께 다수의 펩티드 유사체가 생성된다. 그럼에도 불구하고, 상기 펩티드 유사체는 면역진단의 목적을 위한 고상 항원으로서 또는 백신처리의 목적을 위한 면역원으로서 면역학적 용도에 사용되는 경우 항원성 및 면역원성에 대한 기여자로서 펩티드 제제에 여전히 적합하다.

합성 펩티드의 면역학적 용도에서의 25년의 경험 동안, 본 발명자들은 의도된 면역학적 활성을 보유하게 하는 구조적 가변성의 범위가 소분자 약물에 의한 특이적 약물 활성 또는 생물학적으로 유도된 약물과 공동-생성되는 대분자에서 발견된 목적하는 활성 및 목적하지 않은 독성을 보유하게 하는 구조적 가변성의 범위보다 훨씬 더 융통성이 있음을 발견하였다. 이는 의도된 펩티드와 유사한 크로마토그래피 및 면역학적 성질을 갖는 결실 서열 부산물의 혼합물로서 의도적으로 고안되거나 합성 과정의 오류에 의해 불가피하게 생성된 펩티드 유사체가 종종 목적하는 펩티드의 정제된 제제로서 효과적인 이유이다. 고안된 유사체 및 의도되지 않은 유사체 혼합물은, 분별 QC 절차가 개발되어 제조 과정 및 생성물 평가 과정 모두를 모니터링함으로써 상기 펩티드를 이용하여 최종 생성물의 재현성 및 효능을 보장하는 한 효과적이다.

본 발명의 다른 실시양태에서, Th 펩티드는 백신 조성물에 포함된다. Th 펩티드의 존재는 PCV2 Cap1 펩티드 백신의 면역원성을 개선시킬 수 있다. PCV2 Cap1 펩티드 (상기 기재된 상동체 및 유사체 포함)는 Th 에피토프에 공유 결합되고/거나 그와 혼합될 수 있다.

한 실시양태에서, 서열 3 내지 5로서 기재되며 (표 1에 또한 나타냄) Cap1 면역원에 연결되지 않은 ORF 1 및 ORF 3으로부터의 면역우성 PCV2 Th 에피토프의 클러스터를 갖는 Th 펩티드는, PCV2 Cap1 펩티드 백신의 면역원성을 보충하는데 사용될 수 있다. 공유 결합 없이 유리 펩티드로서 서열 3 내지 5를 포함하는 것은 백신 제형의 면역원성을 개선시킬 수 있다.

또다른 실시양태에서, PCV2 Cap1 펩티드 (상기 기재된 상동체 및 유사체 포함)는, 스페이서와 함께 또는 스페이서 없이, Th 에피토프를 함유하는 것으로 알려진 서열을 함유하는 펩티드에 공유 결합될 수 있다. 이러한 실시양태는 공유 결합된 Th 에피토프없이 동등한 Cap1 면역원에 대해 증강된 면역원성을 제공할 수 있다. 특정 실시양태에서, Th 에피토프를 함유하는 펩티드는 PCV2 펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단에 공유 결합된다. 또다른 특정 실시양태에서, 스페이서는 표 1에 또한 나타낸 서열 Lys-Lys-Lys-εNLys (서열 7)이다. 한 실시양태에서, Th 에피토프를 함유하는 펩티드는 PCV2 Cap1 펩티드의 아미노 말단에 공유 결합된다. 특정 실시양태에서, Th 에피토프를 함유하는 펩티드는 Lys-Lys-Lys-εNLys 스페이서를 통해 아미노 말단에 연결된 인공 조합 Th 펩티드 서열 2 (표 1에 나타냄)이고, 서열 6 (표 1에 또한 나타냄)으로 제시된다.

본 발명의 다양한 실시양태는 PCV2에 대해 돼지를 보호하기 위한 백신 조성물에 관한 것이다. 예시적 실시양태에서, 백신은 면역원성 펩티드 항원 및 허용되는 전달 비히클 또는 아쥬반트를 포함한다. 다양한 실시양태에서, PCV2 백신 조성물은 펩티드 항원 및 수의학적으로 허용되는 전달 비히클 또는 아쥬반트를 포함하며, 여기서 펩티드 항원은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다:

a) PCV2 캡시드 단백질의 대략 아미노산 위치 47 내지 대략 아미노산 위치 202;

b) 서열 1;

c) (b)의 상동체;

d) (a), (b) 또는 (c)의 항원적 및 면역학적으로 기능성인 유사체;

e) 하나 이상의 보존적 아미노산 치환, 아미노산 부가 및/또는 아미노산 결실을 갖는 (a), (b), (c) 또는 (d); 및

f) (a) 내지 (e)의 임의의 조합.

PCV2 백신의 실시양태에서, 펩티드 항원의 전하는 1개 내지 5개의 아미노산을 부가하거나 결실시킴으로써 변경된다. PCV2 백신의 또다른 실시양태에서, 항원적 및 면역학적으로 기능성인 상동체 또는 유사체는 PCV2 캡시드 단백질의 대략 위치 47 내지 202인 아미노산 서열의 항원에 대해 80％ 이상의 동일성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 펩티드 항원은 서열 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다.

PCV2 백신의 또다른 실시양태에서, 펩티드 항원은 펩티드 항원의 N-말단 또는 C-말단에 공유 결합된 T 헬퍼 에피토프를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, T 헬퍼 에피토프는 펩티드 항원의 아미노 말단에 공유 결합된다. 또다른 특정 실시양태에서, T 헬퍼 에피토프는 하나 이상의 아미노산을 갖는 스페이서를 통해 펩티드 항원에 공유 결합된다. 특정 실시양태에서, T 헬퍼 에피토프는 서열 2이다. 또다른 특정 실시양태에서, 스페이서는 서열 7이다. 특정 실시양태에서, 펩티드 항원은 서열 1 또는 서열 6이다.

다양한 예시적 실시양태에서, 면역원성 펩티드 항원의 임의의 양이 동물에서 면역 반응을 유도하는데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 펩티드 항원의 양은 약 0.1 μg 내지 약 100 mg이다. 또다른 특정 실시양태에서, 펩티드 항원의 양은 약 1 μg 내지 약 10 mg이다. 또다른 실시양태에서, 펩티드 항원의 양은 약 10 μg 내지 약 1 mg이다.

PCV2 백신 조성물의 다양한 실시양태에서, 조성물은 서열 3, 4, 및 5의 3개의 PCV2 T 헬퍼 에피토프 펩티드의 등몰 혼합물을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 서열 3, 4, 및 5의 등몰 혼합물의 양은 약 0.1 μg 내지 약 1 mg이다. 보다 특정한 실시양태에서, 서열 3, 4, 및 5의 등몰 혼합물의 양은 약 1 μg 내지 약 100 μg이다.

다양한 예시적 실시양태에서, 전달 비히클 또는 아쥬반트의 임의의 유형 또는 양이 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 전달 비히클 및 아쥬반트는 몬타니드(Montanide)^TM ISA 50V2 (유중수형 에멀젼의 제조를 위한 미네랄 오일 및 만니드 올레에이트로 구성된 오일 백신 아쥬반트 조성물), 트윈(Tween)® 80 (또한 폴리소르베이트 80 또는 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트로 알려짐), CpG 올리고뉴클레오티드 및/또는 이들의 임의의 조합물이다.

특정 실시양태에서, PCV2 백신 조성물은 서열 6의 펩티드 항원 및 수의학적으로 허용되는 전달 비히클 또는 아쥬반트를 포함하며, 여기서 펩티드 항원의 양은 약 10 μg 내지 약 1 mg이다.

본 발명의 또다른 실시양태는 상기 기재된 임의의 예시적 실시양태에 포함된 백신을 투여하는 것을 포함하는, PCV2 감염에 대해 PCV2 MDA 양성이거나 또는 양성이 아닌 새끼 돼지를 보호하는 방법에 관한 것이다.

본 개시에 따라 제조된 PCV2 Cap1 펩티드는 또한 면역검정의 포획 단계에서, 예를 들어 ELISA 시험 키트의 고상 면역흡수에서 항원적으로 유효한 양의 펩티드를 사용함으로써 PCV2 항체를 검출하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 실시양태에 따라, 임의의 상용성 면역검정 포맷이 대상 펩티드와 함께 사용될 수 있다. 이러한 포맷은 당업자에게 잘 알려져 있으며 다수의 표준 면역학 안내서 및 교과서에 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Harlow et al.1988 (26)] 참조). 이들은, 다른 잘 알려진 면역검정 포맷 중에서도, 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA), 효소 면역도트 검정, 응집 검정, 항체-펩티드-항체 샌드위치 검정, 펩티드-항체-펩티드 샌드위치 검정을 포함한다. 한 실시양태에서, 면역검정은 PCV2 Cap1 펩티드 조성물로 코팅된 고체 상을 사용하는 ELISA이다.

본 발명의 한 실시양태에 따라, 펩티드는 스크리닝 ELISA에 의해 PCV2 감염에 대해, 모계 유래된 항-PCV2 항체의 수준에 대해 예비-백신처리된 새끼 돼지로부터의 혈청을 평가하기 위해, 및 PCV2 Cap1 항원성 펩티드, 전장 캡시드 단백질 또는 불활성화된 PCV2 비리온을 이용하는 백신으로 백신처리된 새끼 돼지에서의 면역 반응의 수준을 결정하기 위해, 암돼지 및 어린 암돼지, 숫돼지(boars and barrows) 및 새끼 돼지로부터의 혈청을 시험할 수 있다.

특정 실시양태에서, 하기 단계를 포함하는 ELISA 면역검정을 사용하여 항-PCV2 항체의 존재에 대해 돼지 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플을 시험할 수 있다:

i. PCV2 Cap1 펩티드를 고체 지지체에 부착하는 단계,

ii. 상기 고체 지지체에 부착된 상기 펩티드를 항체가 펩티드에 결합하는데 서열이 되는 조건하에 항체를 함유하는 돼지 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플에 노출시키는 단계, 및

iii. 상기 고체 지지체에 부착된 상기 펩티드에 결합된 항체의 존재를 검출하는 단계.

대상 ELISA 키트의 예시화된 사용에 있어서, 시험될 돼지 혈청 샘플을 샘플 희석제에 희석시킨 다음, 임의의 항체 (존재하는 경우)가 펩티드-민감화 고체 상에 결합하는 시간 동안 및 조건하에 상기 기재된 하나 이상의 PCV2 Cap1 펩티드와 접촉시킨다. 비결합 물질의 제거 후 (예를 들어, 포스페이트 완충 염수에 의해 세척함), 2차 복합체를 돼지-특이적 IgG에 대해 표지된 항체 또는 표지된 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 A/G와 접촉시킨다. 이들 항체 또는 단백질 A, G 또는 A/G는 2차 복합체에 결합하여 3차 복합체를 형성하고, 2차 항체 또는 단백질 A, 또는 G 또는 A/G는 리포터 분자로 표지되기 때문에, 검출 수단에 제공되는 경우, 3차 복합체가 검출된다. 리포터 분자는 표소, 방사성동위원소, 형광물질, 생물발광 분자, 화학발광 분자, 비오틴, 아비딘, 스트렙타비딘 등일 수 있다. ELISA의 경우, 리포터 분자는 바람직하게는 효소이다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하는데 사용되며 본 발명의 범위를 제한하는데 사용되지 않는다.

<표 1>

<표 2>

실시예 1

PCV2 에 대한 항체를 검출하기 위한, 공동-형질감염된 HTK 세포의 핵 내부 캡시드 단백질을 이용한 면역형광 검정

PCV2에 대해 지정된 항체를 PCV2 캡시드 단백질로 공동-형질감염된 HTK 세포를 이용한 면역형광으로 검출할 수 있다. 본 방법은 HTK 세포에서 전장 PCV2 캡시드 항원의 일시적인 발현을 제공한다. 또한, 상기 면역검정 방법은 합성 및 성숙 단계 동안 천연 캡시드 단백질 형태를 보존하면서 재조합 바이러스 감염을 통한 캡시드 단백질 발현을 제공함으로써, 특이도 및 민감도가 높은 항체 검출을 위한 조건을 제공한다.

도 1a에 도시한 메커니즘에 따라, HTK 세포주 세포를 T7 폴리머라제 재조합 백시니아 바이러스 (T7/vac)로 감염시키고 (22), 리포펙타민(lipofectamine)™ (인비트로겐(Invitrogen))을 이용하여 pCR-orf2 플라스미드로 공동-형질감염시켰다 (23). 구체적으로, T7 폴리머라제 프로모터에 의해 매개되는 천연 PCV2 캡시드 단백질의 발현을 위한 pCR-orf2 플라스미드의 구축은 다음과 같이 수행되었다: 전장의 PCV2 ORF2 유전자 (타이완(Taiwan) PCV2 균주 Cyc08로부터 입수; 위치 77에서 N→S 돌연변이를 갖는 허가 번호 AAN62766)를 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)으로 증폭시키고, pCR®2.1-TOPO® 플라스미드 벡터 (인비트로겐)로 클로닝하였다. pCR-orf2 플라스미드의 발현 능력을 시퀀싱으로 확인하였고, 이는 PCV2 균주 Cyc08로부터의 ORF2에 대한 전체 뉴클레오티드 서열을 나타내었다 (23).

HTK 세포를 96-웰 플레이트에서 80％ 전면성장시키고, T7 폴리머라제 재조합 백시니아 바이러스 (T7/vac)로 감염시킨 후 (22), 리포펙타민™ (인비트로겐)을 이용하여 pCR-orf2 플라스미드로 공동-형질감염시켰다. pCR-orf2 플라스미드로 공동-형질감염된 세포는 HSK 세포의 핵 내부에서 PCV 캡시드 항원을 확실히 발현시키는 것으로 확인되었고, 따라서 이는 면역형광 검정 (IFA)을 통한 PCV2 캡시드 단백질에 대한 항체의 포획 및 검출에 이용하기에 적합하였다.

면역형광 검정 ( IFA )에 의한 PCV2 항체의 적정.

항원으로서 천연 PCV2 캡시드 단백질을 갖는 플레이트를 형질감염된 HTK 세포로 코팅하여 일괄 준비하고, -80℃에서 보관하였다. 항원 코팅된 플레이트를 매회 100개씩 일괄 준비하여 품질 관리를 실시하였다. 혈청 샘플을 PBS에서 최초 50배 희석한 후, 2배 연속 희석하였다. 각 시험 실행에 대해, PCV2-감염된 SPF 돼지로부터의 양성 대조군 혈청 및 감염되지 않은 SPF 돼지로부터의 음성 대조군 혈청을 모두 포함시켜, HSK 세포의 핵 내부에서의 pCR-orf2 플라스미드에 의한 캡시드 단백질의 발현을 확인하였다. 1:50 초과 희석물에서 핵에 국소화된 형광 신호를 제공하는 혈청 샘플 (도 1b에 도시된 바와 같음)을 IFA 적정값 >50을 갖는 것으로 스코어링하였고; 이러한 적정값은 PCV2로 감염된 동물 또는 백신접종의 결과로서 발현된 항-PCV 항체를 갖는 동물을 나타내었다. 또한, IFA에 의한 관찰은 특이적 핵-국소화 항-캡시드 항체 결합을 비-특이적 단백질 결합과 구분함으로써 진양성(true positive) 항체 신호와 위양성 신호의 구별을 용이하게 할 수 있다.

자연 감염된 돼지 또는 PCV2 Cap1 펩티드-기재 백신을 제공받은 돼지로부터 수집된 혈청 샘플의 모든 시험을 코드 하에 수행하였다.

실시예 2

자연 PCV2 -감염된 돼지 및 CAP1 펩티드-기재 PCV2 백신을 제공받은 돼지를 확인하기 위한, 혈청 항체의 ELISA 검출 방법

96-웰 플레이트의 웰을 각각 PCV2 캡시드 펩티드, 예를 들어 서열 1의 펩티드 (PCV2 Cap1 펩티드) (달리 나타내지 않는 한, 10 mM NaHCO₃ 완충액 (pH 9.5) 중 2 μg/mL) 100 μL로 37℃에서 1시간 동안 개별 코팅하였다.

펩티드-코팅된 웰을 PBS 중 3 중량％의 젤라틴 250 μL와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하여 비-특이적 단백질 결합 부위를 차단한 후, 0.05 부피％의 트윈(TWEEN)® 20을 함유한 PBS로 3회 세척하고, 건조하였다. IFA 결과 PCV2 항체에 양성인 돼지 혈청 및 음성 대조군 혈청을 달리 나타내지 않는 한 20 부피％의 정상 염소 혈청, 1 중량％의 젤라틴 및 0.05 부피％의 트윈® 20을 함유한 PBS로 1:20 희석시켰다. 희석시킨 표본 100 μL를 각각의 웰에 첨가하여 37℃에서 60분 동안 반응시켰다.

이어서, 웰을 PBS 중 0.05 부피％의 트윈® 20으로 6회 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하였다. 양성 웰에서 형성된 항체/펩티드 항원 복합체와 결합하는 표지 추적자로서 호스래디쉬 퍼옥시다제-접합된 염소 항-돼지 IgG를 사용하였다. 미리-적정된 최적의 희석 농도의, PBS 중 0.05 부피％의 트윈® 20과 함께 1 부피％의 정상 염소 혈청 중의 퍼옥시다제-표지된 염소 항-돼지 IgG 100 μL를 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 또 다른 30분 동안 인큐베이션하였다. 상기 웰을 PBS 중 0.05 부피％의 트윈® 20으로 6회 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하고, 시트르산나트륨 완충액 중 0.04 중량％의 3',3',5',5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 및 0.12 부피％의 과산화수소를 함유한 기질 혼합물 100 μL와 또 다른 15분 동안 반응시켰다. 상기 기질 혼합물을 사용하여 착색된 생성물을 형성함으로써 퍼옥시다제 표지를 검출하였다. 1.0 M H₂SO₄ 100 μL를 첨가하여 반응을 중지시키고, 450 nm에서의 흡광도 (A₄₅₀)를 측정하였다.

동물 혈청에서 PCV2 항체를 검출하기 위한 목적에 따라 혈청 희석을 수행하였다: (a) 가능한 자연 감염의 확인을 위해서, 1:20의 희석물을 이용하고, A₄₅₀ 판독값을 기록하며, 컷오프 계산을 위해 고유의 본질적인 음성 대조군을 이용하거나; 또는 (b) 펩티드-기재 PCV2 백신 제형을 수여받은 돼지의 항체 적정값을 측정하기 위해서, 1:10에서 1:10,000까지의 혈청의 10-배 연속 희속물을 시험하고, 시험된 혈청의 적정값 (Log₁₀으로 표현)을 A₄₅₀의 선형 회귀 분석으로 계산하였다.

PCV2 감염의 검출을 위한 Cap1-기재 ELISA의 혈청학적 유효성은 ELISA의 결과와 매우 특이적인 천연 캡시드-기재 IFA (실시예 1)의 결과 사이의 높은 상관 계수 (표 3에 나타난 0.782)로 확인되었다.

실시예 3

백신 및 진단 용도 둘 다에서 사용하기 위한, 최적의 PCV2 캡시드 펩티드를 확인하는 부위-특이적 혈청 검사

PCV2 단리물 1010-Stoon의 이미 공개된 서열 (2)로부터의 PCV2의 게놈 서열 및 타이완 균주 Cyc08로부터의 PCV2의 게놈 서열을 이용하여 오픈 리딩 프레임으로부터 단백질 서열을 추정하고, 2개의 ORF2 서열로부터 얻은 데이터를 이용하여 면역학적 시험을 위한 후보 펩티드 항원을 고안하였다. PCV2 감염과 연관된 B 및 T 세포 인식 표적인 항원 펩티드를 확인하는 것을 목적으로 한 혈청학적 검증을 위해, 약 20개 내지 170개 초과의 아미노산 길이의 오버래핑 서열을 갖는 70개 초과의 캡시드 펩티드를 고안 및 합성하였다. 이어서, 최적의 B 세포 에피토프를 갖는 캡시드 펩티드를 혈청학적 검증의 절차로 확인하였다. 장쇄 및 단쇄 펩티드를 이용한 상기 에피토프 매핑 방법은 선형 에피토프 뿐만 아니라 불연속 형태의 에피토프를 확인하였다 (24, 25). 실시예 1에 기재된 IFA 시험으로 항-PCV2 캡시드 단백질 반응성에 대해 특성화된 24개의 혈청 패널을 펩티드의 혈청학적 검증에 이용하였다. 상기 혈청을 이용하여, 항체-매개된 보호 면역원성의 진단 및 예측에 유용할 수 있는 강하고 일관된 항원성에 대해 오버래핑 PCV2 캡시드 펩티드를 스크리닝하였다. 상기 PCV2 반응성 패널을 구축하는 데 사용되는 혈청은 자연 감염을 가진 것으로 밝혀진 필드의 돼지로부터 또는 PCV2 감염되지 않은 것으로 알려진 정상 및 SPF 돼지로부터 수집하였고, 이들 각각은 표 3에 나타낸 바와 같이 IFA에 의해 적정된 항-PCV2 캡시드 단백질 반응성을 가졌다.

<표 3>

캡시드 IFA 적정값과의 상관관계에 의한 Cap1 펩티드 ELISA의 혈청학적 검증에 사용되는, PCV2 감염을 갖거나 갖지 않은 새끼 돼지로부터의 혈청

12개의 PCV2 IFA 양성 (IFA 적정값 > 1:50) 돼지 혈청 및 12개의 PCV2 IFA 음성 (적정값 < 1:50) 돼지 혈청을 포함한 패널을 PCV2 Cap1 (서열 1) 펩티드-기재 ELISA의 혈청학적 검증에 사용하였다. ELISA 시험을 위해 혈청을 1:21로 희석하였다. IFA 적정값과 펩티드-기재 ELISA로부터의 A₄₅₀ 판독값 사이에 0.782의 상관 계수가 나타났다.

오버래핑 펩티드 중 약 20개의 아미노산을 포함한 단쇄 펩티드를 어플라이드 바이오시스템스 인크.(Applied BioSystems Inc., 미국 켄터키주 렉싱턴 소재)의 자동화 펩티드 합성기 모델 433으로 합성하고; 약 25개 내지 최대 약 170개의 아미노산을 포함한 장쇄 폴리펩티드를 어플라이드 바이오시스템스 펩티드 합성기 모델 430A, 431 및 433을 이용하여 Fmoc 화학법으로 합성하였다.

3관능성 아미노산의 말단 및 측쇄 보호기에 대한 Fmoc 보호를 이용하여 고체상 지지체 상에서의 독립적인 합성으로 각각의 펩티드를 생성하였다. 완성된 펩티드를 고체 지지체로부터 절단하고, 측쇄 보호기를 90％ 트리플루오로아세트산으로 제거하였다. 합성 펩티드 제조물은 매트릭스-보조 레이저 탈착 타임-오브-플라이트(Matrix-Assisted Laser Desorption Time-Of-Flight, MALDTOF) 질량 분광기에 의한 정확한 조성과 역상 HPLC에 의한 합성 프로파일, 함량 및 농도를 포함한 내용물로 특성화되었다. 장기 합성시, 커플링 효율의 엄격한 제어에도 불구하고, 아미노산 삽입, 결실, 치환 및 조기 말단화를 비롯한 연장 주기 동안의 사건으로 인해 펩티드 유사체가 또한 생성되었고, 이에 따라 표적화된 펩티드 합성과 함께 다수의 펩티드 유사체의 생성이 야기되었다. 그럼에도 불구하고, 이러한 펩티드 유사체는 면역학적 용도에서 면역진단의 목적을 위한 고체상 항원으로서 또는 백신화의 목적을 위한 면역원으로서 사용시 항원성 및 면역원성에 대한 기여자로서 펩티드 제조물에서 여전히 적합하였다. 통상, 부산물의 혼합물로서 합성 과정을 통해 계획적으로 고안되거나 생성된 이러한 펩티드 유사체는 종종, 이들 펩티드를 이용한 최종 생성물의 재현성 및 효능을 보증하기 위한 제조 과정 및 생성물 평가 과정 둘 다를 모니터링하는 식별력 있는 QC 절차가 개발되는 한, 목적하는 펩티드의 정제된 제조물만큼 효과적이다.

다양한 길이의 합성 펩티드의 항원성을 혈청 패널을 이용하여 최초 반응성 프로파일에 대해 시험하였다. 자연 감염된 돼지로부터의 혈청 패널에 존재하는 항체는 길이가 증가할수록 PCV2 캡시드 펩티드에 대한 반응성이 증가하는 경향을 따랐다. 표 3의 하부 패널의 혈청을 사용하여 얻어진 대규모 혈청학적 스크리닝 데이터의 결과로서, 154개의 아미노산 길이의 "Cap1" (서열 1)로 명시된 장쇄 캡시드 펩티드는 매우 민감한 ELISA를 제공하였다. 또한, Cap1 펩티드는 IFA-검증된 음성 돼지 혈청과의 낮은 반응성에 의해 표 3의 상부 패널에 나타낸 바와 같이 이러한 ELISA에 대해 높은 특이도를 제공하였다. 사실상, PCV-감염된 돼지의 우세한 혈청학적 반응성은 오직 Cap1 154mer 펩티드 (서열 1)와 관련되어 있었다. 따라서, PCV2-감염된 돼지에 존재하는 혈청학적 반응성의 대부분은 장쇄 펩티드 상에만 존재하는 B 세포 에피토프의 군집을 인식하는 항체로 인한 것임을 추정하는 것이 합리적이다. 또한, 154mer의 예상치 못한 면역우세 항원성은, 긴 연속 및 불연속 에피토프의 행렬을 제공하는 캡시드 단백질 상의 크게 노출된 표면을 나타내는 장쇄 펩티드와 일치하였다. 이들 에피토프는 B 세포 항체 반응의 자극에 필요한 T 헬퍼 세포 (Th) 에피토프와 연결된 B 세포 에피토프를 포함한다.

실시예 4

최초 면역원성 평가를 위한 PCV2 CAP1 펩티드를 갖는 백신 제제로의 기니 피그의 면역화, 및 CAP1 펩티드-계 ELISA 및 천연 캡시드 -계 IFA 에 의한 백신 접종 대상에서의 항체 역가의 상관관계

기니 피그 면역화.

본 발명의 백신의 예시된 용도에서, 면역원으로서 외래 Th 에피토프에 연결되지 않은 Cap1 항원 펩티드 (예를 들어, 서열 1) 또는 아미노 말단 및 Lys-Lys-Lys-εNLys (서열 7) 스페이서를 통해 외래 T 헬퍼 에피토프, 예컨대 UBITh®3 (서열 2)에 공유결합적 연결된 Cap1 항원 펩티드, 예를 들어 서열 6을 포함하는 펩티드를 갖는 백신을 시판되는 오일 백신 전달 비히클인 몬타니드 ISA 50V2를 사용하여 유중수 에멀션 중에서 제제화하였다. 두 그룹의 기니 피그를 하기 표 4에서 나타낸 것과 같이 펩티드-계 백신으로 면역화시켰다.

이는, 일련의 항체 반응을 갖는 혈청 패널을 얻기 위해 일반적으로 사용되는 유중수 에멀션 제제 중에서 외래 T 헬퍼 부위인 UBITh®3 (서열 2)에 공유결합적 연결된 Cap1 펩티드 및 연결되지 않은 Cap1 펩티드 (서열 1)의 면역원성을 평가하기 위해 소형 동물에서 수행된 최초 연구였다. 연결되지 않은 Cap1 펩티드는 서열 1로 나타내었다 (표 1). 아미노 말단 상에서 스페이서를 통해 외래 T 헬퍼 부위에 연결된 Cap1 펩티드는 서열 6으로 나타내었다 (표 1). 하기 표 4에서 나타낸 것과 같이, 3마리 던칸 하틀리(Duncan Hartley) 기니 피그 (암컷, 9주령, 450 gm, 무-바이러스)의 2개 실험 군 각각을 상기 PCV2 Cap1 백신 제제의 면역원성 연구에서 사용하였다.

<표 4>

Cap1 펩티드 ELISA (역가 Log₁₀) 및 항-캡시드 단백질 IFA에 의해 측정된 항-캡시드 항체 역가의 비교에 의한 숙주에서의 Cap1 PCV2 백신의 면역원성 평가

각 동물을 근육내 면역화시켰다. 그룹 A에 대하여, 펩티드 PCV2 Cap1 (서열 1)을 면역원으로서 사용하였으며, 이는 동일한 부피의 PBS 중의 수성상 펩티드 용액으로 에멀션화된, 돼지 백신에 대해 통상적으로 사용되는 만니드 올레에이트 및 미네랄 오일의 오일성 아쥬만트 조성물인 몬타니드™ ISA 50V2 (셉픽(Seppic; 프랑스 파리(Paris France) 소재)를 갖는 유중수 에멀션 중에서 제제화되었다. 그룹 B로 주어진 백신에 대하여, Cap1 펩티드는 아미노 말단에서 서열 Lys-Lys-Lys-εNLys의 스페이서 (서열 7)를 통해 인공 조합 UBITh®3 T 헬퍼 에피토프 (서열 2)에 공유결합적 연결되어 표적화된 PCV Cap1 B 세포 에피토프 및 UBITh®3 T 세포 에피토프를 가교하여, 서열 6으로 나타내는 펩티드 면역원을 유발하며 (표 1), 그룹 A에 대해 사용되는 것과 같은 유중수 에멀션으로 제제화되었다. 그룹 A 및 B의 기니 피그는 0주차 (최초) 및 2주차 (증가)에서 근육내 경로에 의해 25 μg 용량을 투여받았다. ELISA 및 IFA 둘 다에 의한 혈청의 면역원성 시험을 위해 최초 면역화 후 0 및 4주 (wpi)에 기니 피그에서 채혈하였다. 하기 논의되는 바와 같이, 공유결합적 연결된 스페이서 및 인공 UBITh®3이 없는 펩티드 면역원 (서열 1)을 갖는 백신은 항-Cap1 항체 반응을 유도하였으며, 서열 6에서와 같이 연결된 UBITh®3 T 헬퍼 에피토프의 사용은 검정 방법 중 하나에 의해 평가되는 것과 같이 개선된 면역원성의 증거로 보다 강한 항-캡시드 역가를 유발하였다 (표 4).

면역원성 평가.

고안된 PCV2 Cap1 펩티드 백신 제제의 면역원성 시험을 웰 당 100 μL 중 2 μg/mL로 웰에 코팅된 고체상 항원으로서 PCV2 펩티드 Cap1 (서열 1)을 사용하여 표적 펩티드-계 ELISA에 의해 수행하였다. 1:10으로부터 1:10,000으로 연속 희석된 실험 동물 혈청을 시험하고, 양성 역가를 상호 희석의 Log₁₀으로 표현하였다. 혈청반응 양성인 샘플을 그룹별로 풀링하고, 풀에 대한 면역원성 결과를 Cap1 ELISA 및 IFA 방법 (면역형광 검정)에 의해 측정하였다. 이 방법에 의해, Cap1 펩티드에의 반응성에 의해 평가된 ELISA 면역원성을 HTK 세포주 세포 내부에서 발현되는 전장 자연 배열된 PCV2 캡시드 단백질에의 반응성에 의해 평가된 IFA 역가와 비교하였다 (도 1a 및 1b).

결과

그룹 A에 대한 결과는 유중수 에멀션 중의 PCV2 Cap1 펩티드 (서열 1)가 25 μg 용량에서 인공 Th 에피토프 (서열 2)에 연결되지 않고 스스로 면역원성이었음을 나타낸다. 다중-리신 스페이서를 통한 인공 조합 Th 에피토프의 추가는 ELISA에 의해 검출된 것과 같이 어림잡아 5배 (4.268 - 3.578 = 0.69 역가 중 Log₁₀) 면역원성이 강화되었다. 비록 덜 정확한 면역형광 검정은 키메라 서열 6 면역원에 대하여 오직 4배 개선 (100 대 400)만을 나타내었지만, Cap1 ELISA를 입증하는 기능을 하는 Cap1-계 ELISA 결과와의 양의 상관관계에서 그룹 A 및 B에 대한 면역원성을 측정하기 위한 천연 캡시드-계 IFA 방법 또한 Cap1 펩티드 단독 (서열 1)에 비해 인공 Th 에피토프-연결된 PCV2 펩티드 (서열 6)에 대한 개선된 반응을 나타내었다. 유사하게, UBITh®3 T 헬퍼 에피토프 (서열 2)에 연결되지 않은 Cap1 펩티드 (서열 1) 또는 연결된 Cap1 펩티드 (서열 6) 중 하나로 면역화된 새끼 돼지 또한 서열 2의 T 헬퍼 에피토프에의 연결에 의해 유의하게 개선된 반응을 갖는 강한 항-Cap1 항체 반응을 나타낸다 (실시예 5, 표 5).

이후, 보다 면역원성인 서열 6 키메라 펩티드를 추가의 아쥬반트를 갖는 보다 높은 투여량으로의 투여에 의해 그의 상위 범위의 면역원성에 대하여 기니 피그에서 시험하였다. 400 μg의 최초 용량 (여기서, 펩티드 면역원은 하기 표 5에 기재된 양으로 CpG 올리고뉴클레오티드 아쥬반트 (서열 8) (27)과 복합체화됨)을 주사하고, 이어서 2 wpi에서 CpG-강화된 면역원 100 μg의 증가 용량을 주사하였다. 상기 보다 많은 투여량의 CpG-강화된 백신접종 프로토콜에 의해 나타나는 면역원성은 ELISA에 의한 면역원성에서 예상치 못한 10배 향상을 수득하였으며, ELISA 역가에서의 증가와 부합하여, IFA에 의한 16배 향상이 있었다. 즉, 표 4에서 나타낸 400의 풀링된 그룹 B IFA 역가와 비교하여, 보다 많은 투여량의 CpG-강화된 백신 프로토콜에 의해 면역화된 기니 피그 그룹은 1600의 강한 IFA 역가에 도달하였다.

실시예 5

일반 농장에서 사육한 새끼 돼지에서의 다양한 용량의 PVC2 CAP1 펩티드 백신 제제의 면역원성 평가

새끼 돼지 면역화.

표 5에 나타낸 바와 같이, 특정 병원균-부재성 (SPF)이 아닌 일반 농장에서의 4주령의 80마리 새끼 돼지를 8개 군 (각 군 당 10마리 새끼 돼지)으로 나누었다. 이들 군을 0주 및 4주에, 50 μg의 펩티드 Cap1 (서열 1) 및 트윈® 80; 또는 UBITh®3 인공 Th 에피토프에 연결된 50 내지 400 μg의 펩티드 Cap1 (서열 6)을 함유하는 1:1 (v/v) 유중수 에멀젼으로서의, 몬타니드 ISA 50V2로 균질화된 백신을 사용하여 근육내로 면역화시켰다. 다양한 용량의 서열 6 면역원을 CpG 올리고뉴클레오티드 (서열 7)와 복합화하거나 (27) 또는 복합화하지 않은 후에, 트윈® 80의 존재 또는 부재하에 유중수 에멀젼으로 제제화하였다 (표 5).

ELISA 분석을 위한 혈액 샘플을 제1 백신접종의 시기에 그리고 4 및 6 wpi에 수집하였다. 개별 혈청을 준비하여, 실시예 2 및 3에 기재된 바와 같은 ELISA에 의해 PCV2 항체에 대해 조사하였다. 각 군으로부터의 혈청을 모으고, 추가의 ELISA 시험에 노출시켰다.

결과

혈청 집단(pool)에 대한 ELISA에 의한 면역원성 결과는 표 5 및 도 2의 군에 의해 나타내었다. 모든 백신 제제는 50 μg의 저용량에서도 면역성을 가졌다. 각 군에서의 모든 새끼 돼지는 군 집단에 대해, 4 및 6주까지 1:1,000 또는 그 초과의 ELISA 역가로 그리고 6주까지는 1:10,000 초과의 ELISA 역가 (비향상된 면역원 Cap1 펩티드 (서열 1)를 프라임(prime) 및 부스트(boost) 둘 모두에 대해 50 μg의 저용량으로 제공받은 제8 군의 새끼 돼지는 제외함)로 각각의 면역 반응을 나타냈다.

<표 5>

PCV2 Cap1 펩티드 백신의 면역원성 평가. T 헬퍼 에피토프, 펩티드 용량 및 아쥬반트 제제에 의해 다양화된 백신을 일반 농장에서 사육한 새끼 돼지에게 투여하고, Cap1 ELISA에 의해 평가함

^# 각 군에 대해 사용된 집단화된 혈청

^* 서열 6

^† 서열 1

^§ 모든 백신은, 수성상으로서 PBS 중에 용해된 펩티드 또는 PBS 중에 현탁화된 펩티드/CpG 복합체를 포함하며 유상으로서 몬타니드™ ISA 50V2를 포함하고 1차 아쥬반트 및 명시된 추가의 아쥬반트를 포함하는 1:1 v/v 유중수 에멀젼임.

^‡ 양이온성 펩티드:음이온성 올리고뉴클레오티드의 전하 비.

0, 4, 6 및 10주로부터의 개별 돼지로부터의 혈청을 또한 실시예 1에 기재된 바와 같은 IFA에 의해 항-캡시드 항체에 대해 평가하였다. IFA 역가는 10주까지 동물 대부분에서 400 내지 1600의 범위인 것으로 밝혀졌으며, 제3 군으로부터의 약간의 혈청은 2개 용량의 백신을 투여받은 후 6,400만큼의 예상치 못한 높은 IFA 역가를 가졌다. 이러한 돼지 중 어떠한 돼지에서도 허용한계 수준의 반응성(reactogenicity)의 주사 부위는 발견되지 않았다.

80마리의 면역화된 새끼 돼지 중에서, 8마리는 표 6에 나타낸 바와 같이, 0주에서 제1 면역화 전에 IFA에 의해 검출하였을 때 모계 유래 항체 (MDA)를 갖는 것으로 밝혀졌다. MDA는 전형적으로 타이완의 일반 농장에서 사육된 새끼 돼지에 존재하며, 이들은 전형적으로 항-PCV 캡시드 반응을 억제하도록 작용한다. MDA를 갖는 8마리의 모든 새끼 돼지에서, 주어진 용량 및 제제에 관계없이 4 및 6주 사이에, 증가하는 역가의 항-Cap1 항체가 ELISA에 의해 검출되었다 (표 6). 따라서, MDA를 갖는 8마리의 모든 동물이 모계-유래 항체의 존재에 의한 방해에도 불구하고, PCV2 Cap1 백신 제제에 대해 성공적으로 백신을 수용하였다. 이는 본 발명의 백신에 대한 반응의 중점적인 성질에 대한 증거로서 작용한다.

초기 면역화 후 10주에 MDA-양성 동물 26, 27, 86 및 87로부터 수집한 면역 혈청에 대한 IFA 역가는 각각 6400, 3200, 3200 및 3200의 전례 없는 IFA 역가를 가졌다. MDA를 갖는 비교가능한 새끼 돼지들이, PCV2에 대한 백신인 포트 닷지(Ft. Dodge)/와이어스(Wyeth) (현재는 화이자 애니멀 헬스(Pfizer Animal Health))의 수백신(Suvaxyn)®, 비활성화된 바이러스 백신, 및 뵈링거 잉겔하임(Boehringer Ingleheim)의 인겔백(Ingelvac)® 써코플렉스(CircoFLEX)® 백신, 재조합 전장 PCV2 ORF2 캡시드 단백질 백신을 이용하는 PCV2 백신 연구를 위해 포함되었다. 새끼 돼지들은, 50 내지 100의 보통 범위를 초과하여 진행하지는 않는 IFA 역가 (5 내지 10%만이 400까지의 IFA 역가에 도달함)로 상기 백신에 반응하였다. 따라서, 고안된 PCV2 Cap1 펩티드 면역원에 대한 반응의 "중점적인" 성질은 이미 이용가능한 유형의 PCV2 백신으로부터의 펩티드-기재 백신을 차별화시킨다.

<표 6>

PCV2 Cap1 펩티드-기재 백신에 의한 면역화 전에 모체 유래 항체 (MDA)를 갖는 새끼 돼지에서의, 다양한 용량에서의 백신 수용.

연구 기간 전체에 걸쳐, 2개 용량의 다양한 펩티드 Cap1 PCV2 백신으로 백신접종된 80마리 돼지 중의 생존율은 93%인 반면, 상기 일반 농장 내 동일한 곳간에서 사육된 400마리의 백신 비접종된 돼지의 생존율은 82%였다. 백신의 경우의 93%의 생존율은 상기 일반 농장의 다른 사육 시설에서 사육된 5000마리 돼지의 경우의 80%의 평균 생존율을 초과하는 큰 향상이다. 본 면역원성 연구에 대한 의도치 않은 결과인, 예상한 손실량에서의 이러한 주목할 만한 감소는 Cap1 펩티드-기재 PCV2 백신의 효능을 추가로 입증하였다.

요약하면, Cap1 펩티드 PCV2 백신은 4주에서의 ELISA 역가에 의해 나타낸 바와 같이 단 1개의 용량으로부터 유의한 면역원성을 나타냈으며, 2개의 용량 후 6주까지 우수한 면역원성을 나타냈다 (IFA 역가는 제3 군으로부터의 동물에서 6400만큼 높이 도달함). 이전의 모체 유래 항체를 갖는 것으로 밝혀진 8마리 동물 모두는, 이들이 투여받은 용량 및 제제에 관계없이 Cap1 백신에 대한 면역원성 반응을 가졌다. 고안된 펩티드-기재 PCV2 백신은, 동일한 건물에서 사육된 400마리의 백신 비접종된 새끼 돼지의 경우의 82%의 생존율 및 상기 일반 농장의 다른 시설에서 사육된 또다른 5000마리 돼지의 경우의 80%의 생존율과 비교하였을 때, 백신접종된 일반 (비-SPF) 새끼 돼지 중에서의 생존율 93%를 제공하였으며, 이에 따라 이는 유의한 경제적 이점에 대한 증거를 제공한다.

실시예 6

PCV2 의 ORF1 및 ORF3 단백질로부터의 군집형 T 헬퍼 세포 펩티드를 제제에 첨가함으로써 1개 용량의 보호에 대해 향상된, CAP1 펩티드 PCV2 백신

ORF 1 및 ORF 3에 의해 코딩되며 표 1에 나타낸 PCV2 T 세포 에피토프 펩티드를 혼입함으로써, Cap1 펩티드 PCV2 백신의 면역원성은 추가로 향상되었다. 이러한 에피토프는 초기에 스티븐슨(Stevenson) 등 (12)에 의해, 돼지에서의 T 세포 증식에 대한 이들의 유도에 대해 시험되었다. 1:1에서 1:0.1 내지 1:0.05까지의 몰농도 비의 3개의 짧은 PCV2 Th 펩티드 (서열 3, 4 및 5)의 등몰 조합과 혼합된 PCV2 Cap1 펩티드 (예를 들어, 서열 1 또는 6)를 수상 중에서 제제화한 후에 에멀젼을 제조하였다. 이러한 면역우성 PCV2 Th 에피토프로에 의해 보충된 PCV2 Cap1 백신 제제를 단일 용량의 백신 투여 후에 새끼 돼지 상에서 시험하여, PCV2-관련 T 세포 반응의 자극 (사이토카인 생성 포함)을 통한 면역 반응에 대한 효과를 결정하였다.

결과

표 7에 나타낸 바와 같이, 유의하게 향상된 IFA 역가가, 보충의 PCV2 Th 펩티드를 포함하는 보다 저용량의 PCV2 Cap1 백신 제제를 투여받은 새끼 돼지에서 관찰되었다. 3개의 PCV2 T 헬퍼 펩티드 면역원 (서열 3, 4, 5) 20 μg과 혼합된, 연결된 UBITh®3 (서열 6)을 포함하는 Cap1 펩티드 면역원 50 μg을 갖는 단일 용량의 백신을 투여받은 제10군 새끼 돼지에서는, 3개의 추가 PCV2 Th 펩티드 면역원이 없는 서열 6 Cap1 면역원 200 μg을 갖는 단일 용량의 백신을 투여받은 4주에서의 제9 군 새끼 돼지에서 보여진 <50 내지 50의 IFA 역가와 비교하였을 때, 4주까지 50 내지 400의 IFA 역가가 발생되었다.

따라서, 대부분 B 세포 에피토프-군집된 PCV2 캡시드 펩티드 (서열 6)를 다른 PCV2 단백질 (서열 3, 4 및 5)로부터의 면역우성 Th 펩티드의 등몰 혼합물과 조합하여 함유하는 백신 제제는, 균형잡힌 B 세포 항체 반응 및 T 세포 반응을 유지하면서 보다 저용량의 총 면역원 함량을 가능하게 함으로써 면역원 절약을 제공하며, 이에 따라 보다 저용량의 펩티드 면역원을 사용하여 감염에 대한 효과적인 보호 면역 반응을 가할 수 있다. 연결된 UBITh®3이 없는 Cap1 면역원 (서열 1)이 표적 B 세포 면역원성 펩티드인 경우, 보충의 Th 면역원을 포함하는 필적할 만한 백신 제제 및 이를 포함하지 않는 필적할 만한 백신 제제에서, 3개의 보충 PCV Th 펩티드에 의한 유의한 면역원-절약 결과를 또한 얻었다 (표 8). 이러한 결과에서, 50 μg의 서열 1을 10 μg의 보충 Th 펩티드와 함께 포함하는 용량은 3개의 보충 Th 펩티드가 없는 100 및 200 μg 용량의 서열 1보다 더 효과적이었다. 이러한 조합 Cap1 백신 제제는 응급 사용의 목적인 저렴한 저용량의 1개 용량 백신으로서 공급되는 경우에 특히 효과적이어야 한다.

<표 7>

PCV2 ORF1 및 ORF3 Th 에피토프 펩티드를 포함하지 않거나 또는 포함하는 Cap1 펩티드 백신을 사용한 새끼 돼지의 단일 면역화 후의 PCV2 캡시드에 대한 IFA 항체 역가의 유도

실시예 7

PCV2 -감염된 돼지에 대한 노출에 의해 야기된 바이러스 전염 및 병원성으로부터 새끼 돼지에 대한 보호를 제공하는 능력에 대해 시험된 CAP1 펩티드 PCV2 백신

다양한 용량 및 제제에서 보호 면역을 유발하는 Cap1 펩티드 PCV2 백신의 능력을 평가하기 위해 필드 시험을 고안하였다. 그외의 PCV2 감염을 운반하는 병원체-무함유 새끼 돼지와 함께 수용되어 PCV2에 노출된 SPF (특정 병원체-무함유) 새끼 돼지를 Cap1 백신으로 백신접종시켰다. PCV2의 자연적인 전염에 의한 감염에 대해 특별히 수용된 트랜스제닉 돼지의 취약성을 시험하기 위해 고안된 이러한 조건은, PCV2 백신에 의해 제공된 보호 면역을 평가하는데 이상적으로 적합하였다.

PCV2 -감염된 동물 및 무균 동물을 위한 수용 조건

필드 시험을 위해 사용된 시설은 대만 북부에 소재한 샹 힐 랜츠(Xiang Hill Ranch)의 "트랜스제닉 동물 시험 스테이션" (TATS)이었다. 필드로의 의도적인 방출 전에 격리하에 유지된 트랜스제닉 돼지의 보호 시험을 위해 TATS를 사용하였다. 이것은 대만의 동물 기술원 (ATIT)의 동물 의료 부서(23)에 의해 관리되었다. 래보러토리스, 동물 수용, 및 동물 관리 실무는 ISO/IEC 17025:2005 및 ISO9001 (SGS TW07/03565)의 가이드라인을 준수하였다. 돼지 열병, 과성광견병 바이러스, 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스, 돼지 콜레라 바이러스, 위축성비염, 마이코플라즈마성 폐렴, 구제역 바이러스, 돼지 적리, 옴, 톡소혈장 및 흉막폐렴에 대한 관찰 및 정기 시험에 의해, SPF 상태에 대해 가축 트랜스제닉 돼지를 정기적으로 모니터링하였다. 정기적인 모니터링은 이러한 감염 질환 및 작용제의 존재에 대한 어떠한 증거도 밝혀내지 않았다.

게다가, 최근 개발된 실시예 1에 기재된 IFA 시험에 의한 PCV2 감염에 대한 시험이 지난 2년간 사용되어 왔고, 이러한 돼지 집단은 광범위한 PCV2 감염을 갖는 것으로 밝혀졌다. 혈청학적 감시에 의해 측정된 이러한 가축의 PCV2 양성 비율은 89.4％ (47/52)에 도달하였다. 상기 그외의 SPF 동물은 유일하게 순환하는 병원체로서 PCV2를 가졌다.

PCV2 백신접종 및 노출에 대한 조건

PCV2 IFA 역가에 의해, 처음에는 혈청에서 및 나중에는 초유에서 PCV2 항체에 대해 음성인 추정 암퇘지를 확인하여, 상기 "유일한 PCV2" 환경으로부터 무균 새끼 돼지의 선택을 시작하였다. 혈청 및 초유 둘 다에서 음성인 암퇘지로부터의 새끼 돼지를 약 4주의 나이에서 시험에 등록하였다. 이때, 무균 새끼 돼지를 무작위로 5개의 군 (백신군 11-13에 대해 1군당 5마리의 새끼 돼지, 백신군 14에 대해 15마리의 새끼 돼지, 및 대조군 15에 대해 6마리의 새끼 돼지)으로 나누었다. 이어서, 표 8에 기재된 초회량의 PCV2 Cap1 백신 (서열 1의 100 또는 200 μg, 또는 서열 1의 50 μg + 동등한 중량으로 서열 3, 4 및 5의 50 μg 또는 서열 1의 50 μg + 동등한 중량으로 서열 3, 4 및 5의 10 μg)을 근육내 주사 (i.m.)에 의해 백신군에게 투여하였다. 초기 면역화 후 (wpi) 4주에서, 동일한 백신의 추가 용량을 상기 군에게 제공하였다. 2, 6 및 10 wpi에서 IFA로 항체 반응을 모니터링하였다. 표 8에 제시된 IFA 역가는 2 wpi에서 모든 군에 대해 베이스라인 수준이었다. 면역원성이 6 및 10 wpi에서 백신접종된 군에 대해 다양하였지만, 6주까지 모든 백신접종된 군에 대해 높은 항체 반응성을 달성하였다. 대조군의 역가는 혈청학적 시험 기간 전체에 걸쳐 베이스라인에서 유지되었다.

백신접종된 군 및 대조군 둘 다에서, 무균 새끼 돼지를 PCV2의 전염의 위험에 놓아둔 채, "유일한 PCV2" 트랜스제닉 돼지의 일반 집단과 함께 무균 새끼 돼지를 약 2달 동안 곳간에서 수용하였다. 이 기간의 말미에서, 모든 실험 돼지의 중량이 대략 120 kg 생체중에 도달하였을 때 (5 - 6 개월 나이에서), 동물을 희생시키고, 검시에 의해 PCV2 감염의 증거에 대해 조사하였다.

PCV2 감염의 신호는 미미하였고, 2개월의 노출 기간 동안에 PCV2 감염 중에 나타난 많은 병리학적 병변이 회복 후에 나타나지 않았다. 따라서, 검시 절차 (전달된 병원체에 의한 감염의 신호를 위한 백신/시험 연구 또는 필드 시험의 백신접종된 동물을 조사하기 위해 사용된 통상의 더 직접적인 방법보다 더 민감한 진단을 제공함)를 백신접종된/노출된 동물에서의 감염을 검출하기 위한 방법으로 사용하였다. 검시 검사는 림프절, 폐 및 신장의 관찰을 포함하였다. 대조군 동물의 신장에서의 병변의 신호를 제외하고는 감염의 증거가 거의 나타나지 않았다. 병변의 기록을 표시하는 신호가 도 3b (도 3b에 보여진 흐릿한 백색 줄무늬는 반사된 빛임 (**))에 제시된 바와 같이 병변이 없는 것으로 점수화된 백신접종된 돼지의 신장으로부터 존재하지 않는 한편, 도 3a (*)에 제시된 바와 같이 백신접종되지 않은 감염된 동물의 신장의 표면상에 섬유증의 신호로서 백색 반점과 줄무늬를 보유하였다.

감염 전의 두드러진 징후인 신장 캡슐 상의 백색 반점을 이용하여, 표 9에 제시된 실험 돼지에 대한 검시로부터 점수화된 병리상태의 결과를 수득하였다. 코드하에 PCV2 펩티드 백신 제제를 사용하여 이러한 시험을 수행하였다.

결과 및 결론

대조군 및 백신 시험군 둘 다의 PCV2 IFA에 의한 PCV2 항체 역가의 결과 (표 8)는 10 wpi까지 더 높은 반응성을 가진 백신접종된 동물에서 시간에 걸쳐 항체 반응을 증가시키는 것을 나타내었다. Cap1 펩티드-기반 PCV2 백신 제제의 면역원성은 다양하였고, 가장 대규모의 군인 14군에게 제공된 제제가 가장 면역성이 있었다.

대조군에서의 6마리의 돼지 중 3마리 (50％)가, 대조군 돼지 중 1마리는 경미한 병변을 갖고, 2마리는 중등도의 병변을 갖으면서, PCV2 감염의 기록을 표시하는 전형적인 병변으로서 신장 캡슐 상의 백색 반점을 갖는 것으로 밝혀졌다 (도 3a). 대조적으로, 30마리의 백신접종된 돼지 중 2마리 (6.7％)만이 병리학적 변화를 나타내었고, 이들은 모두 신장 병리상태의 경미한 증거를 갖는 것으로 점수화되었다 (표 9). 이들 2마리는 백신접종된 돼지의 가장 대규모의 군인, 15마리의 돼지를 갖는 14군 사이에서만 발견되었다. 백신이 투여된 2마리에 대해 경미한 신장 병변만이 관찰된 채, 백신접종된 돼지에서 림프절 및 폐에 대해 어떠한 병리학적 변화도 전혀 관찰되지 않았다. 따라서, 상기 개시내용의 펩티드-기반 PCV2 백신의 다수의 제제 및 용량에 대해 보호 효능을 나타내었다.

명세서에서, 본 발명자는 모든 가능한 변화를 철저하게 열거하는 것을 시도하지 않았다. 대체 실시양태가 본 발명의 특정 부분에 대해 나타내지 않았을 수 있고, 기재된 부분의 상이한 조합으로부터 생길 수 있다는 점, 또는 기재되지 않은 다른 대체 실시양태가 일부분에 이용가능할 수 있다는 점은, 상기 대체 실시양태의 부인으로 간주되지 않아야 한다. 상기 기재되지 않은 실시양태 중 다수가 하기 청구항의 문자적인 범주 내에 있고, 다른 것은 동등하다는 것이 이해될 것이다. 게다가, 본 명세서 전체에 언급된 모든 참고문헌, 공보, 미국 특허 및 미국 특허 출원 공보는, 본 명세서에서 충분히 제시된 바와 같이, 본원에 참조로 포함된다.

<표 8>

PCV2 ORF1 및 ORF2 T 에피토프 펩티드로, 또는 없이, Cap1 펩티드 백신을 사용한 면역화 후의 각 돼지 군에 대한 IFA에 의한 기하 평균 항체 역가

* 모든 제제는 아쥬반트로서의 몬타니드^TM ISA 50V2를 가진 1:1 v/v의 유중수 에멀젼이었다.

† 0 wpi에서 제공된 초회량 및 4 wpi에서 제공된 추가 용량으로 2회의 근육내 주사로 제공된 백신.

<표 9>

실험 돼지에서의 PCV2 병리상태의 관찰

*표 8에 기재된 바와 같은 동등한 2회 용량의 백신접종.

†점수: 0 = 병변 없음, 1 = 경미, 2 = 중등도, 3 = 중증

SEQUENCE LISTING <110> United Biomedical Inc Wang, Chang Yi Wen-Jiun, Peng <120> Designer Peptide-Based PCV2 Vaccine <130> 1004263.204WO (2029-WO) <140> PCT/US2010/041406 <141> 2010-07-08 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 154 <212> PRT <213> Porcine circovirus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(154) <223> Type 2 strain Cyc08 from Taiwan <400> 1 Thr Arg Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val 1 5 10 15 Arg Thr Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Ser Asp 20 25 30 Phe Val Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Ile Ser Ile Pro Phe Glu 35 40 45 Tyr Tyr Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro 50 55 60 Ile Thr Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp 65 70 75 80 Asp Asn Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val 85 90 95 Asn Tyr Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser 100 105 110 Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe 115 120 125 Gln Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp 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Leu Gln Thr Ser 130 135 140 Ala Asn Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr 145 150

Claims (16)

1. a) 서열 1; 또는
   b) 스페이서 또는 T 헬퍼 에피토프 또는 이들 둘 다에 공유 결합된 서열 1
   인 펩티드 항원 및 수의학적으로 허용되는 전달 비히클 또는 아쥬반트를 포함하는, 돼지 써코바이러스 유형 2 (PCV2) 백신 조성물.
2. 제1항에 있어서, T 헬퍼 에피토프가 서열 1의 아미노 말단에 공유 결합된 것인 PCV2 백신 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, T 헬퍼 에피토프가 스페이서를 통해 서열 1의 아미노 말단에 공유 결합되고, 스페이서가 하나 이상의 아미노산을 갖는 것인 PCV2 백신 조성물.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, T 헬퍼 에피토프가 서열 2인 PCV2 백신 조성물.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 스페이서가 서열 7인 PCV2 백신 조성물.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 3, 4, 및 5의 3개의 PCV2 T 헬퍼 에피토프 펩티드의 등몰 혼합물을 추가로 포함하는 PCV2 백신 조성물.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 펩티드 항원의 총량이 10 μg 내지 1 mg인 PCV2 백신 조성물.
8. 제6항에 있어서, 서열 3, 4, 및 5의 등몰 혼합물의 총량이 1 μg 내지 100 μg인 PCV2 백신 조성물.
9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 전달 비히클 및 아쥬반트가 몬타니드(Montanide) ISA 50V2, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트, 및 CpG 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 PCV2 백신 조성물.
10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 펩티드 항원이 서열 1 또는 서열 6인 PCV2 백신 조성물.
11. 서열 6의 펩티드 항원 및 수의학적으로 허용되는 전달 비히클 또는 아쥬반트를 포함하며, 여기서 펩티드 항원의 양이 10 μg 내지 1 mg인 PCV2 백신 조성물.
12. 제1항 또는 제2항에 따른 백신 조성물을 투여하는 것을 포함하는, PCV2 감염에 대해 PCV2 MDA 양성이거나 또는 양성이 아닌 새끼 돼지를 보호하는 방법.
13. a) i) 서열 1; 또는
    ii) 스페이서 또는 T 헬퍼 에피토프 또는 이들 둘 다에 공유 결합된 서열 1
    인 펩티드 항원을 고체 지지체에 부착시키는 단계;
    b) 상기 고체 지지체에 부착된 상기 펩티드를, 펩티드에의 항체의 결합에 도움이 되는 조건하에 항체를 함유하는 돼지 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플에 노출시키는 단계, 및
    c) 상기 고체 지지체에 부착된 상기 펩티드에 결합된 항체의 존재를 검출하는 단계
    를 포함하는, PCV2 감염을 진단하는 방법.
14. 삭제
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