KR20180002872A - 신규한 배큘로바이러스 벡터 및 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

엔벨로프 상에 융합 단백질을 나타내는 재조합 배큘로바이러스가 기술된다. 융합 단백질은 이종 항원, 및 길이가 적어도 100 아미노산 잔기를 가지고, GP64 단백질의 중앙 염기성 영역 내에 위치된 B12D5 결합 에피토프가 결여된 배큘로바이러스 엔벨로프 GP64 단백질의 C-말단 영역을 포함한다. 재조합 배큘로바이러스의 게놈은 신호 펩타이드, 이종 항원, 및 배큘로바이러스 엔벨로프 GP64 단백질의 C-말단 영역을 포함하는 융합 단백질을 엔코딩하는 형질도입 유전자를 포함하며, 여기서, 항원은 신호 펩타이드와 GP64 단백질의 C-말단 영역 사이에 위치된다. 재조합 배큘로바이러스는 이를 필요로 하는 피검체에서 항원-특이적 면역원성 반응을 유도하는데 사용하기 위한 것이다.

Description

신규한 배큘로바이러스 벡터 및 사용 방법
본 발명은 일반적으로 재조합 배큘로바이러스(recombinant baculovirus)에 관한 것이다.
배큘로바이러스는 곤충을 감염시키고 인간에 대해서 비-병원성이지만, 광범위한 포유류 세포 및 조류 세포를 형질도입할 수 있다. 형질도입된 세포에서의 생체안정성(biosafety), 큰 클로닝 능력, 낮은 세포독성 및 비-복제 특성뿐만 아니라, 조작 및 생산의 용이성 덕분에, 배큘로바이러스는 매우 다양한 적용, 예를 들어, 항바이러스 치료법, 암 치료법, 재생 의학 및 백신을 위한 유전자 전달 벡터로서 폭발적인 인기를 얻고 있다.
미국 특허 제7,527,967호에는 이를 필요로 하는 피검체에서 이종 단백질 또는 바이러스에 대한 항체 또는 면역 반응을 생성시키는데 사용하기 위한, 배큘로바이러스의 표면 상에 융합 이종 폴리펩타이드를 나타내는 재조합 배큘로바이러스가 기재되어 있다. 여기에서 융합 이종 폴리펩타이드는 이종 항원을 배큘로바이러스 GP64 단백질의 227에서 529의 카복실 말단 아미노산과 융합시킴으로써 제조된다(도 2c). 여기서 작제물(construct)은 B12D5 결합 사이트를 포함하는 GP64의 세포외 도메인의 실질적인 부분을 함유한다. 이러한 것이 면역접종(immunization)에서 사용될 때, GP64의 세포외 도메인은 면역 반응을 유도하고, 의도되지 않은 항체, 예를 들어, 쓸모없는 항-GP64 B12D5 항체를 생성시킬 수 있다[Zhou et al. Virology 2006; 352(2): 427-437]. GP64 B12D5 항체는 고려되는 외래 항원 대신에 배큘로바이러스 자체에 대한 중화 항체이다. 또한, 배큘로바이러스는 돼지에 대해 약간 면역원성이다.
대만 특허 제I368656호에는 항원을 나타내기 위해 신호 펩타이드, 막관통 도메인 및 GP64로부터의 세포질 형질도입 도메인을 사용하는 방법이 기재되어 있다. 여기서 작제물은 GP64의 세포외 도메인 없이 단지 막관통 도메인 및 세포질 형질도입 도메인만을 함유한다(도 2d). 이는 보다 적은 외래 항원 발현을 가지고, 비활성화 시약에 대해 민감하다[Premanand et al. PLoS ONE 2013; 8(2): e55536].
이에 따라, 당해 분야에서, 특히, 비활성화 시약에 대해 민감하지 않고 개선된 면역원성을 갖는 배큘로바이러스 벡터와 관련하여, 전술한 결점 및 부적합성에 대처하기 위한 이제까지의 미해결 요구가 존재한다.
일 양태에서, 본 발명은 융합 단백질을 엔코딩하는 형질도입 유전자를 포함하는 벡터로서, 융합 단백질이 (a) 융합 단백질의 N-말단에 위치된 신호 펩타이드; (b) 이종 항원; 및 (c) 길이가 적어도 100개의 아미노산 잔기를 가지고 GP64 단백질의 중앙 염기성 영역 내에 위치된 B12D5 결합 에피토프가 결여된, 배큘로바이러스 엔벨로프 GP64 단백질의 C-말단 영역을 포함하며, 여기서, 이종 항원은 신호 펩타이드와 GP64 단백질의 C-말단 영역 사이에 위치되어 있는 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 벡터는 재조합 배큘로바이러스이다.
다른 양태에서, 본 발명은 이의 엔벨로프 상에 융합 단백질을 나타내는 재조합 배큘로바이러스로서, 융합 단백질이 (i) 이종 항원; 및 (ii) 길이가 적어도 100개의 아미노산 잔기를 가지고 GP64 단백질의 중앙 염기성 영역 내에 위치된 B12D5 결합 에피토프가 결여된, 배큘로바이러스 엔벨로프 GP64 단백질의 C-말단 영역을 포함하는, 재조합 배큘로바이러스에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예에서, 재조합 배큘로바이러스의 게놈은 (a) 신호 펩타이드; (b) 이종 항원; 및 (c) 배큘로바이러스 엔벨로프 GP64 단백질의 C-말단 영역을 포함하는 융합 단백질을 엔코딩하는 형질도입 유전자를 포함하며, 여기서, 항원은 신호 펩타이드와 GP64 단백질의 C-말단 영역 사이에 위치된다.
본 발명의 다른 구현예에서, 형질도입 유전자는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
본 발명의 다른 구현예에서, 프로모터는 폴리헤드린(polyhedrin)이다.
본 발명의 다른 구현예에서, GP64 단백질의 C-말단 영역은 길이에 있어서 186개 내지 220개의 아미노산을 갖는다.
본 발명의 다른 구현예에서, GP64 단백질의 C-말단 영역에는 서열번호 2, 3, 또는 4의 아미노산 서열이 결여되어 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, GP64 단백질의 C-말단 영역은 서열번호 1의 293에서 512의 아미노산을 포함한다.
본 발명의 다른 구현예에서, GP64 단백질의 C-말단 영역은 서열번호 1의 327에서 512의 아미노산을 포함한다.
본 발명의 다른 구현예에서, GP64 단백질의 C-말단 영역은 서열번호 1의 아미노산 잔기 292와 328 사이에 N-말단을 갖는다.
본 발명의 다른 구현예에서, 신호 펩타이드는 서열번호 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 및 12로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
추가로, 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 벡터 또는 재조합 배큘로바이러스가 형질도입된 곤충 세포 또는 세포에 관한 것이다.
본 발명의 다른 구현예에서, 항원은 병원체 단백질, 암세포 단백질, 및 면역 체크포인트 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나이다.
병원체는 인간 유두종바이러스, 돼지 생식 및 호흡기 증후군 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스-1, 뎅기열 바이러스, C형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, 돼지 써코바이러스 2, 돼지 열병 바이러스(classical swine fever virus), 구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus), 뉴캣슬병 바이러스(Newcastle disease virus), 전염성 위장염 바이러스(transmissible gastroenteritis virus), 돼지 유행성 설사증 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 가성광견병 바이러스(pseudorabies virus), 파보바이러스(parvovirus), 돼지 수포병 바이러스(swine vesicular disease virus), 수두바이러스(poxvirus), 로타바이러스(rotavirus), 마이코플라스마 폐렴(Mycoplasma pneumonia), 헤르페스 바이러스(herpes virus), 전염성 기관지염(infectious bronchitis), 전염성 윤활낭병 바이러스(infectious bursal disease virus)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 암은 비-소세포 폐암, 유방 암종, 흑색종, 림프종, 결장 암종, 간세포 암종, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 면역 체크포인트는 PD-1, PD-L1, PD-L2, 및 CTLA-4로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 항원은 돼지 열병 바이러스 엔벨로프 당단백질 E2, 돼지 유행성 설사증 바이러스 S1 단백질, 예정 세포사 단백질 1, 및 종양-관련 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 본 발명의 벡터 또는 재조합 배큘로바이러스를 항원-특이적 면역원성 반응의 유도를 필요로 하는 피검체에 투여하는 것을 포함하여, 이를 필요로 하는 피검체에서 항원-특이적 면역원성 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 이를 필요로 하는 피검체에서 항원-특이적 면역원성 반응을 유도하기 위한 약제의 제조에서의 본 발명에 따른 벡터 또는 재조합 배큘로바이러스의 용도에 관한 것이다. 대안적으로, 본 발명은 이를 필요로 하는 피검체에서 항원-특이적 면역원성 반응을 유도하는데 사용하기 위한 본 발명에 따른 벡터 또는 재조합 배큘로바이러스에 관한 것이다.
이러한 양태 및 다른 양태는 하기 도면과 관련하여 얻어진 바람직한 구현예의 하기 설명으로부터 명백해질 것이며, 본 발명의 신규한 개념의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 이의 변형 및 수정이 일어날 수 있다.
첨부된 도면은 본 발명의 하나 이상의 구현예를 예시하고, 기술된 설명과 함께, 본 발명의 원리를 설명하기 위해 제공된다. 가능한 한, 동일한 참조 숫자는 도면 전반에 걸쳐, 구현예의 동일하거나 유사한 구성요소를 언급하기 위해 사용된다.
도 1a는 본 발명의 일 구현예에 따른 배큘로바이러스 벡터 플랫폼 디자인을 예시한 개략적 도면이다.
도 1b는 외래 항원 또는 외래 유전자가 바이러스 엔벨로프(virus envelope) 상에 고정될 수 있을 뿐만 아니라, gBac 표면 디스플레이 플랫폼에 의해 곤충 세포의 막 부분에서 발현될 수 있음을 예시한 개략적 도면이다. 직사각형은 바이러스를 나타내는 것이다.
도 2a는 전장 GP64 단백질을 도시한 개략적 도면이다. GP64 최소(GP64327-482), GP64 막관통 도메인(TM)(GP64483-505); 세포질 형질도입 도메인(CTD)(GP64506-512).
도 2b는 본 발명의 일 구현예에 따른 배큘로바이러스 벡터를 도시한 개략적 도면이다. SP: 신호 펩타이드; TM: 막관통 도메인, CTD: 세포질 형질도입 도메인.
도 2c는 미국 특허 제7527967호에 기술된 배큘로바이러스 벡터 디자인을 도시한 개략적 도면이다.
도 2d는 대만 특허 제I368656호에 기술된 배큘로바이러스 벡터 디자인을 도시한 개략적 도면이다.
도 3은 백신접종후 마우스에서 배큘로바이러스 벡터에 의해 유도된 면역 반응(좌측 패널), 및 마우스에서 E2-gBac 서브유닛 백신의 중화 혈청(SN) 역가 측정(우측 패널)을 도시한 그래프이다. 도시된 각 ELISA 값은 5마리의 마우스로부터의 평균값이다. gBac와 Bac 그룹 간의 차이는 통계학적으로 유의미하다, P≤0.05. 사용되는 배큘로바이러스의 균주는 AcNPV이다. 용어 "SN"은 중화 혈청을 나타낸다. 용어 "E2-gBac"는 도 2b의 백터 디자인에 따른 "배큘로바이러스 벡터 CSFV E2-gBac"를 나타낸다. 용어 "E2-gBac(비활성화됨)"는 면역접종(immunization)을 위해 사용되기 전에 배큘로바이러스가 비활성화됨을 의미한다. 용어 "E2-Bac"는 도 2d의 벡터 디자인에 따른 "배큘로바이러스 벡터 CSFV E2-Bac"를 나타낸다.
도 4는 백신접종후 돼지에서 배큘로바이러스 벡터에 의해 유도된 면역 반응을 도시한 그래프이다. 도시된 각 ELISA 값은 3마리의 돼지로부터의 평균값이다. gBac와 gp64 그룹 간의 차이는 통계학적으로 유의미하다, P≤0.05. 용어 "E2-gp64"는 도 2c의 벡터 디자인에 따른 "배큘로바이러스 벡터 CSFV E2-gp64"를 나타낸다.
도 5는 배큘로바이러스 벡터 PEDV S1-gBac로의 백신접종 후 3마리의 특정 병원체-부재(SPF; specific pathogen-free) 돼지에서 돼지 유행성 설사증 바이러스(PEDV)에 대한 항체 역가를 도시한 그래프이다. 3마리의 SPF 돼지는 각각 73, 74 및 75의 번호로 라벨링되었다. 용어 "IFA"는 면역형광 항체를 나타낸다. 결과는, 백신접종된 돼지로부터의 혈청이 PED 바이러스에 의해 인식될 수 있음을 나타내었다.
도 6a 및 도 6b는 Sf9 세포 샘플로부터의 CSFV E2-gBac의 항원 E2(도 6a) 및 PEDV S1-gBac의 항원 S1(도 6b)이 검출되었음을 도시한 웨스턴 블롯의 사진이다.
도 6c 및 도 6d는 샘플에서 hPD-1-gBac의 항원이 항-gp64 mAb(좌측 패널) 및 인간 PD-1 항체(우측 패널) 각각에 의해 인식되고 검출되었음을 도시한 웨스턴 블롯의 사진이다.
본 발명은 보다 특히, 이의 다수의 변경 및 변형이 당업자에게 명백하기 때문에 단지 예시적인 것으로서 의도되는 하기 실시예에 기술된다. 본 발명의 다양한 구현예는 하기에서 상세히 기술된다. 도면을 참조하면, 유사한 숫자는 도면 전반에 걸쳐 유사한 구성요소를 지시한다. 본원의 설명에 그리고 하기 청구범위 전반에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 단수 형태의 의미는 문맥이 달리 명확하게 기술하지 않는 한, 복수의 대상물을 포함한다. 또한, 본원의 설명에 그리고 하기 청구범위 전반에 걸쳐 사용되는 바와 같이, "안(in)"의 의미는 문맥이 달리 명확하게 기술하지 않는 한, "안(in)" 및 "상(on)"의 의미를 포함한다. 또한, 표제(title) 또는 부제(subtitle)는 독자의 편의를 위해 명세서에서 사용될 수 있으며, 이는 본 발명의 범위에 영향을 미치지 않을 것이다. 추가적으로, 본 명세서에서 사용되는 몇몇 용어들은 하기에서 보다 상세하게 규정된다.
정의
본 명세서에서 사용되는 용어는 일반적으로, 본 발명의 문맥 내에서, 그리고, 각 용어가 사용되는 특정 문맥에서, 당해 분야에서의 이의 일반적인 의미를 갖는다. 본 발명을 기술하기 위해 사용되는 특정 용어는 본 발명의 설명과 관련한 전문가(practitioner)에게 추가적인 안내(guidance)를 제공하기 위해, 하기에서 또는 명세서의 다른 곳에서 논의된다. 편의를 위하여, 특정 용어는, 예를 들어, 이탤릭체 및/또는 인용 부호를 사용하여 강조될 수 있다. 이러한 강조 표시의 사용은 용어의 범위 및 의미에 영향을 미치지 않는다. 용어의 범위 및 의미는 동일한 문맥에서, 강조 표시가 있던지 없던지 간에, 동일하다. 동일한 것이 하나 이상의 방식으로 말할 수 있다는 것이 인식될 것이다. 결과적으로, 대안적인 언어 및 동의어는 본원에서 논의된 용어들 중 임의의 하나 이상을 위해 사용될 수 있고, 용어가 본원에 더 자세히 설명되거나 논의되든지 또는 그렇지 않던지 간에 임의의 특별한 의의를 갖는다. 특정 용어에 대한 동의어가 제공된다. 하나 이상의 동의어의 설명은 다른 동의어의 사용을 배제하지 않는다. 본원에서 논의된 임의의 용어의 예를 포함하는 본 명세서의 임의의 곳에서의 예의 사용은 단지 예시적인 것이고, 본 발명 또는 임의의 예시된 용어의 범위 및 의미를 어떠한 방식으로도 제한하지 않는다. 마찬가지로, 본 발명은 본 명세서에서 제공된 다양한 구현예로 제한되지 않는다.
달리 규정하지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 관련된 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 충돌하는 경우에, 정의를 포함하는 본 문헌이 통제할 것이다.
벡터는 표적 세포로 유전 물질을 전달하기 위해 사용되는 비히클(vehicle)이다. 바이러스 벡터는 세포로 외래 유전 물질을 전달하기 위해 개질된 바이러스이다.
용어 "유전자 형질도입(gene transduction)", " 형질도입하다(transduce)", 또는 "형질도입(transduction)"은 외래 DNA가 바이러스 벡터를 통해 다른 세포에 도입되는 공정이다.
신호 서열 또는 신호 펩타이드(때때로, 신호 서열, 표적화 서열, 국소화 신호, 국소화 서열, 전이 펩타이드(transit peptide), 선도 서열 또는 선도 펩타이드로서 지칭됨)는 분비 경로 쪽으로 예정된 대부분의 새로이 합성된 단백질의 N-말단에 존재하는 짧은(5 내지 30개의 아미노산 길이) 펩타이드이다. 이러한 단백질은 특정 세포소기관(소포체, 골지(golgi) 또는 엔도솜) 내측에 잔류하거나, 세포로부터 분비되거나, 대부분의 세포 막에 삽입된, 단백질을 포함한다.
용어 "B12D5"는 gp64에 대한 단클론성 항체를 지칭한다. B12D5는 gp64의 277 내지 287에서의 KKRPPTWRHNV(서열번호 3), 또는 잔기 271 내지 292(서열번호 4)의 gp64의 중심 영역 내에 위치된 HRVKKRPPTW(서열번호 2)의 결합 에피토프를 갖는다[문헌[Zhou et al. (2006) Supra; Wu et al (2012) "A pH-Sensitive Heparin-Binding Sequence from Baculovirus gp64 Protein Is Important for Binding to Mammalian Cells but Not to Sf9 Insect Cells" Journal of Virology, Vol. 86 (1) 484-491] 참조].
PD-1 및 CD279(분화 클러스터 279)로서도 알려진, 예정 세포사 단백질 1은 인간에서 PDCD1 유전자에 의해 엔코딩된 단백질이다. PD-1은 면역글로불린 수퍼패밀리(immunoglobulin superfamily)에 속하고 T 세포 및 프로-B 세포 상에서 발현되는, 세포 표면 수용체이다. PD-1은 두 개의 리간드, 즉 PD-L1 및 PD-L2를 결합시킨다. 면역 체크포인트로서 기능하는 PD-1은 T-세포의 활성화를 방지함으로써 면역계를 하향 조절하는데 중요한 역할을 하고, 이는 또한, 자가면역을 감소시키고, 자가-내성(self-tolerance)을 증진시킨다. PD-1의 억제 효과는 조절 T 세포(억제 T 세포)에서 아폽토시스를 감소시키면서 동시에, 림프절에서의 항원 특이적 T-세포에서 아폽토시스(예정 세포사)를 증진시키는 이중 메카니즘을 통해 달성된다. PD-1을 차단하는 새로운 부류의 약물, 즉 PD-1 억제제는 종양을 공격하기 위해 면역계를 활성화시키고, 이에 따라, 몇몇 타입의 암을 치료하기 위해 다양한 성공을 거두며 사용된다.
항원은 병원체에 의해 야기되는 질병의 원인이 되거나 병원체에 의해 감염된 숙주에서 면역학적 반응을 유도할 수 있는 병원성 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드, 또는 종양 세포에서 특이적으로 발현되는 폴리펩타이드인 종양-관련 항원(TAA)일 수 있다. 항원은 인간 유두종바이러스(HPV), 돼지 생식 및 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV), 인간 면역결핍 바이러스-1(HIV-1), 뎅기열 바이러스, C형 간염 바이러스(HCV), B형 간염 바이러스(HBV), 돼지 써코바이러스 2(PCV2), 돼지 열병 바이러스(CSFV), 구제역 바이러스(FMDV), 뉴캣슬병 바이러스(NDV), 전염성 위장염 바이러스(TGEV), 돼지 유행성 설사증 바이러스(PEDV), 인플루엔자 바이러스, 가성광견병 바이러스, 파보바이러스, 가성광견병 바이러스, 돼지 수포병 바이러스(SVDV), 수두바이러스, 로타바이러스, 마이코플라스마 폐렴, 헤르페스 바이러스, 전염성 기관지염, 또는 전염성 윤활낭병 바이러스, 비-소세포 폐암, 유방 암종, 흑색종, 림프종, 결장 암종, 간세포 암종 및 이들의 임의의 조합을 포함하지만, 이로 제한되지 않는, 병원체 또는 암세포로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, HPV E7 단백질(E7), HCV 코어 단백질(HCV 코어), HBV X 단백질(HBx)은 백신 개발을 위한 항원으로서 선택된다. 항원은 하나 이상의 병원성 단백질로부터 선택된 둘 이상의 항원의 융합으로부터의 융합 항원일 수 있다. 예를 들어, PRRSV ORF6 및 ORF5 단편의 융합 항원, 또는 PRRSV 및 PCV2 병원체로부터의 항원의 융합.
대안적으로, 항원은 억제 면역 체크포인트 단백질, 예를 들어, PD-1, PD-L1, PD-L2 및 CTLA-4 등일 수 있다.
용어 "면역 체크포인트 단백질" 및 "면역 체크포인트"는 교대로 사용 가능하다. 면역 체크포인트는 면역계 기능화에 영향을 미친다. 면역 체크포인트는 자극성 또는 억제성일 수 있다. 종양은 면역계 공격으로부터 그 자체를 보호하기 위해 이러한 체크포인트를 사용할 수 있다. 체크포인트 치료법은 억제 체크포인트를 차단하여, 면역계 기능을 복원할 수 있다. 조사 중에 있는 하나의 리간드-수용체 상호작용은 막관통 예정 세포사 1 단백질(PDCD1, PD-1; CD279로서도 공지됨)과 이의 리간드, PD-1 리간드 1(PD-L1, CD274) 간의 상호작용이다. 세포 표면 상의 PD-L1은 면역 세포 표면 상의 PD1에 결합하며, 이는 면역 세포 활성을 억제한다. PD-L1 기능 중에는 T 세포 활성에 대해 중요한 조절 역할이 있다. 세포 표면 상의 PD-L1의 (암-매개된) 상향조절이 그렇지 않은 경우 공격할 수 있는 T 세포를 억제할 수 있는 것으로 나타난다. PD-1 또는 PD-L1 중 어느 하나에 결합하고 이에 따라 상호작용을 차단하는 항체는 T-세포가 종양을 공격할 수 있게 한다. 이필리무맙(Ipilimumab)은 FDA에 의해 승인된 첫번째 체크포인트 항체이다. 이는 억제 면역 체크포인트 CTLA-4를 차단한다.
용어 "치료하는" 또는 "치료"는 질병, 이의 증상, 또는 이러한 질병에 대한 소인(predisposition)을 치료하거나, 완화시키거나, 경감시키거나, 교정하거나(remody), 개선시키거나, 예방할 목적과 함께, 암 또는 감염증, 또는 증상 또는 이러한 질병에 대한 소인을 갖는, 융합 단백질을 필요로 하는 피검체에 유효량의 융합 단백질의 투여를 지칭한다. 이러한 피검체는 임의의 적합한 진단 방법으로부터의 결과를 기초로 하여 건강관리 전문가에 의해 확인될 수 있다.
용어 "유효량"은 치료될 피검체에 대해 치료 효과를 부여하기 위해 요구되는 활성 화합물의 양을 지칭한다. 유효 용량은 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 투여 경로, 부형제 사용, 및 다른 치료학적 치료와의 동시-사용 가능성에 따라, 달라질 것이다.
실시예
본 발명의 범위를 제한하려는 의도 없이, 본 발명의 구현예에 따른 예시적인 기기, 장치, 방법, 및 이의 관련된 결과는 하기에 제공된다. 표제 또는 부제가 독자의 편의를 위해 실시예에서 사용될 수 있다는 것이 주지되며, 이러한 실시예는 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하지 않아야 한다. 또한, 특정 이론은 본원에서 제시되고 개시되지만, 어떠한 방식으로도, 이러한 것이 옳거나 틀리든지 간에, 본 발명이 임의의 특정 이론 또는 작용 방식(scheme of action)을 고려하지 않고 본 발명에 따라 실행되는 한, 본 발명의 범위를 제한하지 않아야 한다.
실시예 1
벡터의 구조화, 및 재조합 배큘로바이러스, 바이러스-유사 입자, 및 단백질의 생성
도 1a는 gBac 플랫폼을 도시한 것이다. 외래 유전자(예를 들어, 최적화된 돼지 열병 바이러스(CSFV) E2 또는 돼지 유행성 설사증 바이러스(PEDV) 돌기 유전자)는 PCR 합성에 의해 획득될 수 있고, 이후에, IN-FUSION® 클로닝 키트(Clontech)를 이용하여 제한 효소 사이트(예를 들어, SacI/ NotI)를 통해 gBac 벡터에 클로닝될 수 있다. gBac 벡터는 배큘로바이러스 전달 벡터 pBACPAK8™(GENBANK™ 가입번호 U02446)로부터 유도된다. 도 1a의 gBac 표면 디스플레이 플랫폼을 사용하여, 외래 항원 또는 외래 유전자는 바이러스 엔벨로프 상에 고정되고 또한 곤충 세포의 막 부분에서 발현될 수 있다(도 1b).
도 2a는 전장 GP64를 도시한 것이다. 배큘로바이러스 GP64 엔벨로프 융합 단백질(GP64 EFP)은 몇몇, 그러나 전체가 아닌, 배큘로바이러스에서 주요 엔벨로프 융합 당단백질이다. 이는 감염된 세포 및 발아된 비리온(budded virion) 둘 모두의 표면 상에서 호모트라이머(homotrimer)로서 발견된다. 배큘로바이러스는 엔도시토시스(endocytosis)에 의해, 이후에, 엔도조말 막(endosomal membrane)과 바이러스 엔벨로프의 저-pH 유도 융합에 의해 이의 숙주 세포에 진입시켜, 세포 세포질로의 바이러스 진입을 가능하게 한다. 이러한 막 융합, 및 또한, 감염된 세포로부터의 비리온의 효율적인 발아(budding)는 GP64에 의존적이다.
도 2b 내지 도 2d는 세 가지 벡터, 즉 gBac(또는 Reber-gBac), 항원-gp64(또는 US 7527967호에 개시된 "gp64"로서 약칭됨), 및 항원-Bac(또는 TW I368656호에 개시된 "Bac"로서 약칭됨)의 비교를 도시한 것이다. gBac 벡터는 아미노산 327 내지 513으로부터의 GP64의 SP 및 C-말단 영역을 사용하여 작제화되었다. gp64 벡터는 아미노산 227 내지 513으로부터의 GP64의 SP 및 C-말단 영역을 사용하여 작제화되었다. Bac 벡터는 GP64의 곤충 신호 펩타이드(SP), GTM(막관통 도메인) 및 CTD(세포질 형질도입 도메인)를 포함하고, GP64 세포외 도메인 아미노산을 포함하지 않는다. SP 앞의 기호 삼각형은 폴리헤드린 프로모터를 나타내는 것으로서, 이는 삽입 유전자의 출발 코돈의 -1 사이트가 위치된 것이다.
SP를 엔코딩하는 DNA 단편은 각각 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머인, 5'-GAGCTCATGGTAAGC-3'(SEQE ID NO: 19) 및 5'-AGGCAGAATGCG-3'(서열번호 20)과 함께 PCR에 의해 생성되고 증폭되었다. gp64 유전자의 C-말단 부분(aa 327에서 aa 513까지의 GP64를 엔코딩함)은 각각 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머인, 5'-GCGTGTCTGCTCA-3'(서열번호 21) 및 5'-TTAATATTGTCTA-3'(서열번호 22)을 사용하여 PCR에 의해 생성되고 증폭되었다. gp64의 C-말단 부분(aa 227에서 aa 513까지의 GP64를 엔코딩함)은 각각 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머인 5'-ATCAACAAGCTAA-3'(서열번호 23) 및 5'-TTAATATTGTCTA-3'(서열번호 24)을 사용하여 PCR에 의해 생성되고 증폭되었다. 상기 외래 유전자는 각각 pBACPAK8™ 전달 벡터에 클로닝되었다.
2B(또는 도 1a)의 gBac 플랫폼을 사용하여, 본 발명자는 두 개의 배큘로바이러스 벡터, 즉, 배큘로바이러스 벡터 CSFV E2-gBac 및 배큘로바이러스 벡터 PEDV S1-gBac(도 2b 디자인)를 생성하였다. 전자(former)는 돼지 열병 바이러스(CSFV) 엔벨로프 당단백질 E2를 엔코딩하는 유전자를 형질도입한 것이며, 후자는 돼지 유행성 설사증 바이러스 S1 단백질을 엔코딩하는 유전자를 형질도입한 것이다.
병렬 비교를 위하여, 본 발명자는 또한, 도 2c 및 도 2d의 벡터를 사용하였고, 항원 CSFV E2를 엔코딩하는 외래 유전자를 형질도입시키기 위한 두 개의 별개의 배큘로바이러스 벡터, 즉, 배큘로바이러스 벡터 CSFV E2-gp64(도 2c 디자인), 및 배큘로바이러스 벡터 CSFV E2-Bac(도 2d 디자인)를 생성시켰다.
gBac, gp64, 및 Bac 벡터(각각 도 2b 내지 도 2d 디자인)에서의 융합 유전자는 이의 동일성(identity)을 확인하게 위해 서열화되었다. 전달 벡터 골격 없이 재조합 GP64 유전자를 함유한 재조합 배큘로바이러스 바이러스는 상동 재조합(homologous recombination)에 의해 생성되었다. 이러한 구조화 및 재조합을 위한 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 재조합 바이러스는 항원을 제조하기 위해 사용되었다. 변형된 GP64 유전자는 PCR에 의해 폴리헤드론 프로모터(polyhedron promoter) 하에서 배큘로바이러스 전달 벡터에 삽입되어 gBac 벡터를 생성하였다. gBac 벡터가 두 개의 상동 재조합 사이트를 갖기 때문에, 야생형 배큘로바이러스의 본래 폴리헤드론 자리(polyhedron locus)는, gBac 플라스미드 및 야생형 배큘로바이러스로 동시-트랜스펙션할 때, gBac 서열에 의해 대체된다.
실시예 2
단백질 발현 및 항원의 정제
Sf9 세포는 재조합 배큘로바이러스의 전파 및 감염을 위해 사용되었다. 배큘로바이러스는 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) Sf-9 세포주에서 전파되고 무혈청 배지 중에서 26℃에서 성장되었다. 재조합 배큘로바이러스는, Sf-9 세포를 5 내지 10의 MOI에서 감염시킴으로써 생성되었고, 감염하고 3일 후에 수확하였다. 배큘로바이러스를 대규모로 생성하기 위하여, 세포는 배양되고 생물반응기(bioreactor)에서 감염될 수 있다. 배큘로바이러스 단편은 감염된 세포의 배양물 상청액으로부터 단리되었다. 배큘로바이러스 입자는 적합한 단백질 컷-오프 막 및 0.45 ㎛ 멸균 막을 사용하여 접선 유동 여과(TFF; Tangential Flow Filtration)에 의해 수집되었다.
항원의 생성을 시험하기 위해, 일부 정제된 배큘로바이러스 또는 감염된 세포 용해물은 8 내지 10% 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 처리되고, 니트로셀룰로오스 막으로 전달되었다. 외래 항원은 1차 항체로서 마우스 항-gp64 mAb(상업적 공급처로부터 입수 가능하고, 1:5,000 희석비로 사용됨)에 의해 검출되었다. 2차 항체는 알칼리 포스파타아제와 컨쥬게이션된 항-토끼 또는 염소 항-마우스 mAb이다(1:5,000 희석비). 단백질 밴드는 ECL PLUS™ Western Blotting Detection Reagents(GE Healthcare)에 의해 시각화되었다. 배큘로바이러스 표면 디스플레이 시스템에서, 외래 항원은 먼저 곤충 세포 막 상에서 발현되고, 이후에, 발아 배큘로바이러스는 일부 세포막에서 취하여 이의 엔벨로프를 형성시킬 수 있다. 결과적으로, 배큘로바이러스 디스플레이 항원은 감염된 세포 용해물(막 단편) 및 바이러스 표면으로부터 수확될 수 있다.
실시예 3
재조합 바이러스에 의한 항원의 발현
gBac 백신으로의 면역접종 전에, 융합 단백질 CSFV E2-gBac 또는 PEDV S1-gBac가 배큘로바이러스 엔벨로프 상에서 성공적으로 나타났는 지의 여부를 확인하기 위하여, 재조합 배큘로바이러스는 원심분리 및 TFF에 의해 수집되었다. 재조합 배큘로바이러스는 PBS 중에 p.f.u/㎕의 상이한 농도로 재-현탁되었다. 배큘로바이러스 입자에 재조합 단백질의 도입은 항-gp64 mAb(eBioscience)를 사용하여 웨스턴 블롯팅(Western blotting)에 의해 분석되었다. 융합 단백질 CSFV E2-gBac는 약 80 kDa의 분자량으로 검출되었으며, 융합 단백질 PEDV S1-gBac는 130 kDa의 분자량으로 검출되었다.
실시예 4
백신 제조 및 면역접종
항원을 나타내는 재조합 배큘로바이러스는 백신 제조를 위해 수중유중수(w/o/w) 애주번트(adjuvant)(MONTANIDE ISA 206 VG, SEPPIC.)와 혼합되었다. National Experimental Animal Center(대만, R.O.C.)로부터 구매한 4주령의 암컷 BALB/c 마우스는 그룹 당 5마리로, 4개의 그룹으로 나누었다. 마우스는 0일째에 그리고 14일째에 107 p.f.u. 재조합 배큘로바이러스를 함유한 200 ㎕의 용액으로 피하로 면역접종되었다(도 3). CSFV 엔벨로프 당단백질 E2를 함유한 E2-gBac, E2-gp64, 및 E2-Bac의 바이러스(도 2b 내지 도 2d)는 비활성화되고 백신으로서 제형화되었다. 음성 대조군으로서, 마우스는 야생형 배큘로바이러스(107 p.f.u.) 또는 PBS로 주사되었다. 혈액 샘플은 6주째에 꼬리(caudal)로부터 수집되었다. 이원성 에틸렌이민(BEI; Binary ethylenimine)은 배큘로바이러스를 비활성화하기 위해 사용되었다. 이는, 37℃에서 1시간 동안 0.2N NaOH 중에 0.1M 2-브로모에틸아민 히드로브로마이드(BEA)를 용해시킴으로써 제조되었다. 배큘로바이러스를 비활성화히기 위하여, 바이러스 배지에 4 mM BEI가 첨가되었으며, 바이러스는 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션되었다. 비활성화 후에, 비활성화를 중지시키기 위해 소듐 티오설페이트(Na2S2O3)는 배지에 최종 BEI 농도의 10배의 최종 농도로 첨가되었다.
실시예 5
재조합 바이러스에 의해 생성된 항원의 면역원성
면역접종 후에, 돼지 열병 바이러스(CSFV) 항체를 검출하기 위해, 마우스의 혈청을 IDEXX CSFV Ab 시험 키트(IDEXX)를 이용하여 항-CSFV E2 항체에 대해 분석하였다. 혈청 중 CSFV E2-특이적 항체의 정도(degree)를, 차단 백분율이 40%를 초과하였을 때 포지티브(positive)로서 계산하였다(도 3). 결과는, 배큘로바이러스 벡터가 융합 단백질 CSFV E2-Bac을 나타내었음을 지시한단다. 도 3은, 배큘로바이러스가 비활성화되거나 그렇지 않았던지 간에, 배큘로바이러스 벡터 CSFV E2-gBac가 마우스에서 배큘로바이러스 벡터 CSFV E2-Bac보다 훨씬 더 높은 항-CSFV E2 항체 역가를 유도하였음을 나타낸다.
본 발명자는 또한, 돼지에서 면역원성 반응을 유도하는데 있어서 세 가지 배큘로바이러스 벡터의 효과를 비교하였다. 세 가지 SPF(특정 병원체 부재) 돼지를 근육내 경로를 통해 각각 108 pfu의 재조합 배큘로바이러스 벡터 E2-gBac, E2-gp64, E2-Bac, 및 PBS로 2회(6주령 및 9주령) 면역접종하였다. 면역접종 후에, 새끼 돼지의 혈청을 IDEXX CSFV Ab 시험 키트(IDEXX)를 이용하여 CSFV E2 항체의 존재에 대해 분석하였다. 혈청 중 CSFV E2 특이적 중화 항체의 정도는 포지티브로서 계산되었고, 차단 백분율이 43%를 초과하였을 때, 효율적이었다.
도 4에 도시된 바와 같이, E2-gBac로 면역접종된 돼지는 CSFV 도전(challenge)에서 생존할 수 있었다. 이는, 컴피던트(competent) 중화 항체가 돼지에서 유도되었음을 지시한다(SN 역가 ≥16, IDEXX 차단 비율 ≥ 43%). 이는 gBac 플랫폼이 백신 플랫폼임을 입중하다. 도 4는, 배큘로바이러스 벡터 CSFV E2-gBac가 돼지에서 배큘로바이러스 벡터 CSFV E2-Bac 및 CSFV E2-gp64 보다 훨씬 더 높은 항-CSFV E2 항체 역가를 유도하였음을 나타낸다. 결과는, 본 발명의 gBac 표면 디스플레이 플랫폼이 종래 기술의 배큘로바이러스 벡터 보다 더욱 강력한 면역력을 유도할 수 있음을 지시한다.
본 발명자들은 또한, 돼지 유행성 설사증 바이러스 S1 단백질(PEDV S1)을 백신접종 적용을 위한 세포에 형질도입하기 위한 배큘로바이러스 벡터를 생성하였다. 본 발명자는 면역원성 반응을 유도하는데 이의 효과를 시험하였다. 간단하게, 세 가지의 9주령 SPF 돼지(각각 숫자 73, 74 및 75로서 표지됨)를 각각 근육내 경로를 통해 108 pfu의 재조합 배큘로바이러스 벡터 PEDV S1-gBac 또는 PBS로 2회 면역접종하였다. 면역접종 후에, 돼지의 혈청(백신접종 후 1 내지 4주로부터)을 PED 바이러스의 ELISA 검정을 이용하여 항-PEDV 항체의 존재에 대해 분석하였다. 도 5는 배큘로바이러스 벡터 PEDV S1-gBac가 모두 3마리의 돼지에서 돼지 유행성 설사증 바이러스에 대한 항체 역가를 유도하였음을 나타낸다.
도 6a 및 도 6b는 Sf9 세포 샘플로부터의 CSFV E2-gBac의 항원 E2(도 6a) 및 PEDV S1-gBac의 S1(도 6b)이 검출되었음을 나타내는 웨스턴 블롯의 사진이다. 세포 용해물 및 수집된 바이러스를 상이한 세포수 및 바이러스 역가에 의해 로딩하였다. 본 발명자는 또한, 배큘로바이러스 벡터 인간 예정 세포사 단백질 1(hPD-1gBac)-gBac(hPD-1gBac)를 구조화하였다. 항원의 생성을 시험하기 위하여, 재조합 배큘로바이러스 또는 감염된 세포 용해물을 8 내지 10% 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 처리하고, 니트로셀룰로오스 막으로 이동시켰다. 외래 항원을 1차 항체로서 마우스 항-gp64 mAb(도 6c) 및 항-PDCD-1 항체(도 6d)(Santa Cruz Biotechnology, 캘리포니아주 산타크루즈 소재)에 의해 검출하였다. 단백질 밴드를 ECL PLUS™ 웨스턴 블로팅 검출 시약(Western Blotting Detection Reagents)(GE Healthcare)에 의해 시각화하였다. 도 6d는, 배큘로바이러스가 엔벨로프 상에 인간 PD-1 항원을 나타내었고, 나타낸 PD-1 항원이 상업적 항-PDCD-1 항체(Santa Cruz Biotechnology, 캘리포니아주 산타크루즈 소재)에 의해 인식될 수 있음을 나타낸다.
요약하면, 본 발명의 벡터는 비활성화 시약에 대해 민감하지 않고(도 3), 보다 높은 면역원성을 나타낸다(도 4). 표 1은 펩타이드 서열 및 SEQ ID NO를 나타낸다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
* 전장 GP64: GP64 신호 펩타이드(SP)(GP641-20)는 밑줄쳐 있고 이탤릭체로 표현된다. GP64 최소(minimum)(GP64327-482)는 이탤릭체 없이 밑줄쳐 있다. GP64 막관통 도메인(TM)(GP64483-505)은 단지 진하게 표현된다. GP64 세포질 형질도입 도메인(CTD)(GP64506-512)은 단지 이탤릭체로 표현된다.
E2-gBac 단백질(SP-E2-GP64 mini-TM/CTD): GP64 신호 펩타이드(SP)(GP641-20)는 밑줄쳐 있고 이탤릭체로 표현된다. GP64 최소(GP64327-482)는 이탤릭체 없이 밑줄쳐 있다. GP64 막관통 도메인(TM)(GP64483-505)은 단지 진하게 표현된다. GP64 세포질 형질도입 도메인(CTD)(GP64506-512)은 단지 이탤릭체로 표현된다.
S1-gBac 단백질(SP-S1-GP64 mini-TM/CTD): GP64 신호 펩타이드(SP)(GP641-20)는 밑줄쳐 있고 이탤릭체로 표현된다. GP64 최소(GP64327-482)는 이탤릭체 없이 밑줄쳐 있다. GP64 막관통 도메인(TM)(GP64483-505)은 단지 진하게 표현된다. GP64 세포질 형질도입 도메인(CTD)(GP64506-512)은 단지 이탤릭체로 표현된다.
hPD1-gBac 단백질(SP-hPD1-GP64 mini-TM/CTD): GP64 신호 펩타이드(SP)(GP641-20)는 밑줄쳐 있고 이탤릭체로 표현된다. GP64 최소(GP64327-482)는 이탤릭체 없이 밑줄쳐 있다. GP64 막관통 도메인(TM)(GP64483-505)은 단지 진하게 표현된다. GP64 세포질 형질도입 도메인(CTD)(GP64506-512)은 단지 이탤릭체로 표현된다.
본 발명의 구현예가 예시되고 기술되어 있지만, 다양한 변형 및 개선은 당업자에 의해 이루어질 수 있다. 본 발명이 예시된 바와 같이 특정 형태로 제한되지 않으며, 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않는 모든 개질이 첨부된 청구범위에서 규정된 바와 같은 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 구현예 및 실시예는, 고려되는 특정 용도에 대해 적합한 바와 같이 다양한 개질과 함께, 당업자가 본 발명 및 다양한 구현예를 사용할 수 있도록, 본 발명의 원리 및 이의 실제 적용을 설명하기 위해 선택되고 기술되었다. 대안적인 구현예는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 본 발명이 속하는 당업자에게 명백하게 될 것이다. 이에 따라, 본 발명의 범위는 상기 설명 및 여기에 기술된 예시적인 구현예 보다 오히려 첨부된 청구범위에 의해 규정된다.
특허, 특허출원 및 다양한 공개문을 포함할 수 있는, 몇몇 참고문헌은 본 발명의 설명에서 인용되고 논의된다. 이러한 참조문헌의 인용 및/또는 논의는 단지 본 발명의 설명을 명확하게 하기 위해 제공되고, 그러한 참조문헌이 본원에 기술된 발명에 대한 "종래 기술(prior art)"이라는 것을 인정하는 것은 아니다. 본 명세서에서 인용되고 논의된 모든 참조문헌은 그 전문으로 및 각각의 참조 문헌이 개별적으로 참고로 포함되는 것과 동일한 정도로, 본원에 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Reber Genetics Co., Ltd. <120> NOVEL BACULOVIRUS DISPLAY VECTORS AND USES THEREOF <130> WO 2016/187027 <140> PCT/US2016/032421 <141> 2016-05-13 <150> US 62/162,139 <151> 2015-05-15 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 512 <212> PRT <213> Autographa californica nucleopolyhedrovirus <400> 1 Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala Ala His 1 5 10 15 Ser Ala Phe Ala Ala Glu His Cys Asn Ala Gln Met Lys Thr Gly Pro 20 25 30 Tyr Lys Ile Lys Asn Leu Asp Ile Thr Pro Pro Lys Glu Thr Leu Gln 35 40 45 Lys Asp Val Glu Ile Thr Ile Val Glu Thr Asp Tyr Asn Glu Asn Val 50 55 60 Ile Ile Gly Tyr Lys Gly Tyr Tyr Gln Ala Tyr Ala Tyr Asn Gly Gly 65 70 75 80 Ser Leu Asp Pro Asn Thr Arg Val Glu Glu Thr Met Lys Thr Leu Asn 85 90 95 Val Gly Lys Glu Asp Leu Leu Met Trp Ser Ile Arg Gln Gln Cys Glu 100 105 110 Val Gly Glu Glu Leu Ile Asp Arg Trp Gly Ser Asp Ser Asp Asp Cys 115 120 125 Phe Arg Asp Asn Glu Gly Arg Gly Gln Trp Val Lys Gly Lys Glu Leu 130 135 140 Val 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Glu Gly Glu His Glu Cys Leu Ile Gly Asn Thr Thr Val 290 295 300 Lys Val His Ala Leu Asp Gly Arg Leu Ala Pro Met Pro Cys Arg Pro 305 310 315 320 Lys Glu Ile Val Ser Ser Ala Gly Pro Val Arg Lys Thr Ser Cys Thr 325 330 335 Phe Asn Tyr Thr Lys Thr Leu Arg Asn Lys Tyr Tyr Glu Pro Arg Asp 340 345 350 Ser Tyr Phe Gln Gln Tyr Met Leu Lys Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe 355 360 365 Asp Leu Asp Val Thr Asp His His Thr Asp Tyr Phe Ala Glu Phe Ile 370 375 380 Asn Lys Leu Asn Asn Met Leu His Asp Leu Ile Val Ser Val Ala Lys 385 390 395 400 Val Asp Glu Arg Leu Ile Gly Asn Leu Met Asn Asn Ser Val Ser Ser 405 410 415 Thr Phe Leu Ser Asp Asp Thr Phe Leu Leu Met Pro Cys Thr Asn Pro 420 425 430 Pro Ala His Thr Ser Asn Cys Tyr Asn Asn Ser Ile Tyr Lys Glu Gly 435 440 445 Arg Trp Val Ala Asn Thr Asp Ser Ser Gln Cys Ile Asp Phe Ser Asn 450 455 460 Tyr Lys Glu Leu Ala Ile Asp Asp Asp Val Glu Phe Trp Ile Pro Thr 465 470 475 480 Ile Gly Asn Thr Thr Tyr His Asp Ser Trp Lys Asp Ala Ser Gly Trp 485 490 495 Ser Phe Ile Ala Gln Gln Lys Ser Asn Leu Ile Thr Thr Met Glu Asn 500 505 510 Thr Lys Phe Gly Gly Val Gly Thr Ser Leu Ser Asp Ile Thr Ser Met 515 520 525 Ala Glu Gly Glu Leu Ala Ala Lys Leu Thr Ser Phe Met Phe Gly His 530 535 540 Val Val Asn Phe Val Ile Ile Leu Ile Val Ile Leu Phe Leu Tyr Cys 545 550 555 560 Met Ile Arg Asn Arg Asn Arg Gln Tyr 565 <210> 17 <211> 914 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S1-gBac protein <400> 17 Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala Ala His 1 5 10 15 Ser Ala Phe Ala Cys Ser Ala Asn Thr Asn Phe Arg Arg Phe Phe Ser 20 25 30 Lys Phe Asn Val Gln Ala Pro Ala Val Val Val Leu Gly Gly Tyr Leu 35 40 45 Pro Ile Gly Glu Asn Gln Gly Val Asn Ser Thr Trp Tyr Cys Ala Gly 50 55 60 Gln His Pro Thr Ala Ser Gly Val His Gly Ile Phe Val Ser His Ile 65 70 75 80 Arg Gly Gly His Gly Phe Glu Ile Gly Ile Ser Gln Glu Pro Phe Asp 85 90 95 Pro Ser Gly Tyr Gln Leu Tyr Leu His Lys Ala Thr Asn Gly Asn Thr 100 105 110 Asn Ala Thr Ala Arg Leu Arg Ile Cys Gln Phe Pro Ser Ile Lys Thr 115 120 125 Leu Gly Pro Thr Ala Asn Asn Asp Val Thr Thr Gly Arg Asn Cys Leu 130 135 140 Phe Asn Lys Ala Ile Pro Ala His Met Ser Glu His Ser Val Val Gly 145 150 155 160 Ile Thr Trp Asp Asn Asp Arg Val Thr Val Phe Ser Asp Lys Ile Tyr 165 170 175 Tyr Phe Tyr Phe Lys Asn Asp Trp Ser Arg Val Ala Thr Lys Cys Tyr 180 185 190 Asn Ser Gly Gly Cys Ala Met Gln Tyr Val Tyr Glu Pro Thr Tyr Tyr 195 200 205 Met Leu Asn Val Thr Ser Ala Gly Glu Asp Gly Ile Ser Tyr Gln Pro 210 215 220 Cys Thr Ala Asn Cys Ile Gly Tyr Ala Ala Asn Val Phe Ala Thr Glu 225 230 235 240 Pro Asn Gly His Ile Pro Glu Gly Phe Ser Phe Asn Asn Trp Phe Leu 245 250 255 Leu Ser Asn Asp Ser Thr Leu Val His Gly Lys Val Val Ser Asn Gln 260 265 270 Pro Leu Leu Val Asn Cys Leu Leu Ala Ile Pro Lys Ile Tyr Gly Leu 275 280 285 Gly Gln Phe Phe Ser Phe Asn Gln Thr Ile Asp Gly Val Cys Asn Gly 290 295 300 Ala Ala Val Gln Arg Ala Pro Glu Ala Leu Arg Phe Asn Ile Asn Asp 305 310 315 320 Thr Ser Val Ile Leu Ala Glu Gly Ser Ile Val Leu His Thr Ala Leu 325 330 335 Gly Thr Asn Phe Ser Phe Val Cys Ser Asn Ser Ser Asn Pro His Leu 340 345 350 Ala Thr Phe Ala Ile Pro Leu Gly Ala Thr Gln Val Pro Tyr Tyr Cys 355 360 365 Phe Phe Lys Val Asp Thr Tyr Asn Ser Thr Val Tyr Lys Phe Leu Ala 370 375 380 Val Leu Pro Pro Thr Val Arg Glu Ile Val Ile Thr Lys Tyr Gly Asp 385 390 395 400 Val Tyr Val Asn Gly Phe Gly Tyr Leu His Leu Gly Leu Leu Asp Ala 405 410 415 Val Thr Ile Asn Phe Thr Gly His Gly Thr Asp Asp Asp Val Ser Gly 420 425 430 Phe Trp Thr Ile Ala Ser Thr Asn Phe Val Asp Ala Leu Ile Glu Val 435 440 445 Gln Gly Thr Ala Ile Gln Arg Ile Leu Tyr Cys Asp Asp Pro Val Ser 450 455 460 Gln Leu Lys Cys Ser Gln Val Ala Phe Asp Leu Asp Asp Gly Phe Tyr 465 470 475 480 Pro Ile Ser Ser Arg Asn Leu Leu Ser His Glu Gln Pro Ile Ser Phe 485 490 495 Val Thr Leu Pro Ser Phe Asn Asp His Ser Phe Val Asn Ile Thr Val 500 505 510 Ser Ala Ser Phe Gly Gly His Ser Gly Ala Asn Leu Ile Ala Ser Asp 515 520 525 Thr Thr Ile Asn Gly Phe Ser Ser Phe Cys Val Asp Thr Arg Gln Phe 530 535 540 Thr Ile Ser Leu Phe Tyr Asn Val Thr Asn Ser Tyr Gly Tyr Val Ser 545 550 555 560 Lys Ser Gln Asp Ser Asn Cys Pro Phe Thr Leu Gln Ser Val Asn Asp 565 570 575 Tyr Leu Ser Phe Ser Lys Phe Cys Val Ser Thr Ser Leu Leu Ala Ser 580 585 590 Ala Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro Glu Phe Gly Ser Gly Val 595 600 605 Lys Phe Thr Ser Leu Tyr Phe Gln Phe Thr Lys Gly Glu Leu Ile Thr 610 615 620 Gly Thr Pro Lys Pro Leu Glu Gly Val Thr Asp Val Ser Phe Met Thr 625 630 635 640 Leu Asp Val Cys Thr Lys Tyr Thr Ile Tyr Gly Phe Lys Gly Glu Gly 645 650 655 Ile Ile Thr Leu Thr Asn Ser Ser Phe Leu Ala Gly Val Tyr Tyr Thr 660 665 670 Ser Asp Ser Gly Gln Leu Leu Ala Phe Lys Asn Val Thr Ser Gly Ala 675 680 685 Val Tyr Ser Val Thr Pro Cys Ser Phe Ser Glu Gln Ala Ala Tyr Val 690 695 700 Asp Asp Asp Ile Val Gly Val Ile Ser Ser Leu Ser Ser Ser Thr Phe 705 710 715 720 Asn Ser Thr Arg Glu Leu Pro Gly Ile Asn Lys Leu Asn Asn Met Leu 725 730 735 His Asp Leu Ile Val Ser Val Ala Lys Val Asp Glu Arg Leu Ile Gly 740 745 750 Asn Leu Met Asn Asn Ser Val Ser Ser Thr Phe Leu Ser Asp Asp Thr 755 760 765 Phe Leu Leu Met Pro Cys Thr Asn Pro Pro Ala His Thr Ser Asn Cys 770 775 780 Tyr Asn Asn Ser Ile Tyr Lys Glu Gly Arg Trp Val Ala Asn Thr Asp 785 790 795 800 Ser Ser Gln Cys Ile Asp Phe Ser Asn Tyr Lys Glu Leu Ala Ile Asp 805 810 815 Asp Asp Val Glu Phe Trp Ile Pro Thr Ile Gly Asn Thr Thr Tyr His 820 825 830 Asp Ser Trp Lys Asp Ala Ser Gly Trp Ser Phe Ile Ala Gln Gln Lys 835 840 845 Ser Asn Leu Ile Thr Thr Met Glu Asn Thr Lys Phe Gly Gly Val Gly 850 855 860 Thr Ser Leu Ser Asp Ile Thr Ser Met Ala Glu Gly Glu Leu Ala Ala 865 870 875 880 Lys Leu Thr Ser Phe Met Phe Gly His Val Val Asn Phe Val Ile Ile 885 890 895 Leu Ile Val Ile Leu Phe Leu Tyr Cys Met Ile Arg Asn Arg Asn Arg 900 905 910 Gln Tyr <210> 18 <211> 376 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hPD1-gBac protein <400> 18 Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala Ala His 1 5 10 15 Ser Ala Phe Ala Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala 20 25 30 Val Leu Gln Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp 35 40 45 Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Phe Pro Ala Leu Leu Val Val Thr 50 55 60 Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu 65 70 75 80 Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp 85 90 95 Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys 100 105 110 Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser 115 120 125 Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala 130 135 140 Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu 145 150 155 160 Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser 165 170 175 Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Asp Ile Tyr Ile Asn 180 185 190 Lys Leu Asn Asn Met Leu His Asp Leu Ile Val Ser Val Ala Lys Val 195 200 205 Asp Glu Arg Leu Ile Gly Asn Leu Met Asn Asn Ser Val Ser Ser Thr 210 215 220 Phe Leu Ser Asp Asp Thr Phe Leu Leu Met Pro Cys Thr Asn Pro Pro 225 230 235 240 Ala His Thr Ser Asn Cys Tyr Asn Asn Ser Ile Tyr Lys Glu Gly Arg 245 250 255 Trp Val Ala Asn Thr Asp Ser Ser Gln Cys Ile Asp Phe Ser Asn Tyr 260 265 270 Lys Glu Leu Ala Ile Asp Asp Asp Val Glu Phe Trp Ile Pro Thr Ile 275 280 285 Gly Asn Thr Thr Tyr His Asp Ser Trp Lys Asp Ala Ser Gly Trp Ser 290 295 300 Phe Ile Ala Gln Gln Lys Ser Asn Leu Ile Thr Thr Met Glu Asn Thr 305 310 315 320 Lys Phe Gly Gly Val Gly Thr Ser Leu Ser Asp Ile Thr Ser Met Ala 325 330 335 Glu Gly Glu Leu Ala Ala Lys Leu Thr Ser Phe Met Phe Gly His Val 340 345 350 Val Asn Phe Val Ile Ile Leu Ile Val Ile Leu Phe Leu Tyr Cys Met 355 360 365 Ile Arg Asn Arg Asn Arg Gln Tyr 370 375 <210> 19 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SP forward primer <400> 19 gagctcatgg taagc 15 <210> 20 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SP reverse pirmer <400> 20 aggcagaatg cg 12 <210> 21 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gp64 forward primer <400> 21 gcgtgtctgc tca 13 <210> 22 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gp64 reverse pirmer <400> 22 ttaatattgt cta 13 <210> 23 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gp64 forward pirmer <400> 23 atcaacaagc taa 13 <210> 24 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gp64 reverse pirmer <400> 24 ttaatattgt cta 13

Claims (15)

  1. 배큘로바이러스의 엔벨로프(envelop) 상에 융합 단백질(fusion protein)을 나타내는 재조합 배큘로바이러스(recombinant baculovirus)로서,
    상기 융합 단백질이
    (i) 이종 항원; 및
    (ii) 길이가 적어도 100개의 아미노산 잔기를 가지고 GP64 단백질의 중앙 염기성 영역(central basic region) 내에 위치된 B12D5 결합 에피토프가 결여된, 배큘로바이러스 엔벨로프 GP64 단백질의 C-말단 영역을 포함하는, 재조합 배큘로바이러스.
  2. 제1항에 있어서, 게놈이,
    (a) 신호 펩타이드;
    (b) 상기 이종 항원; 및
    (c) 상기 배큘로바이러스 엔벨로프 GP64 단백질의 C-말단 영역을 포함하는 융합 단백질을 엔코딩하는 형질도입 유전자(transgene)를 포함하며,
    상기 항원이 상기 신호 펩타이드와 상기 GP64 단백질의 C-말단 영역 사이에 위치되어 있는, 재조합 배큘로바이러스.
  3. 융합 단백질을 엔코딩하는 형질도입 유전자를 포함하는 벡터(vector)로서,
    상기 융합 단백질이,
    (a) 상기 융합 단백질의 N-말단에 위치된 신호 펩타이드;
    (b) 이종 항원; 및
    (c) 길이가 적어도 100개의 아미노산 잔기를 가지고 GP64 단백질의 중앙 염기성 영역 내에 위치된 B12D5 결합 에피토프가 결여된, 배큘로바이러스 엔벨로프 GP64 단백질의 C-말단 영역을 포함하며,
    상기 이종 항원이 상기 신호 펩타이드와 상기 GP64 단백질의 C-말단 영역 사이에 위치되어 있는, 벡터.
  4. 제3항에 있어서, 재조합 배큘로바이러스인 벡터.
  5. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 형질도입 유전자가 프로모터(promoter)에 작동 가능하게 연결되어 있는, 재조합 배큘로바이러스 또는 벡터.
  6. 제1항에 있어서, 상기 GP64 단백질의 C-말단 영역에 서열번호 2, 3, 또는 4의 아미노산 서열이 결여되어 있는, 재조합 배큘로바이러스.
  7. 제1항에 있어서, 상기 GP64 단백질의 C-말단 영역이 서열번호 1의 327 내지 512의 아미노산을 포함하는, 재조합 배큘로바이러스.
  8. 제1항에 있어서, 상기 GP64 단백질의 C-말단 영역이 서열번호 1의 아미노산 잔기 292와 328 사이에 N-말단을 갖는, 재조합 배큘로바이러스.
  9. 제1항에 있어서, 상기 신호 펩타이드가 서열번호 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 및 12로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 배큘로바이러스.
  10. 제1항의 재조합 배큘로바이러스가 형질도입된 곤충 세포(insect cell).
  11. 제1항에 있어서, 상기 항원이 병원체 단백질, 암세포 단백질 및 면역 체크포인트 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나인, 재조합 배큘로바이러스.
  12. 제11항에 있어서,
    (i) 상기 병원체가 인간 유두종바이러스, 돼지 생식 및 호흡기 증후군 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스-1, 뎅기열 바이러스, C형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, 돼지 써코바이러스 2, 돼지 열병 바이러스, 구제역 바이러스, 뉴캣슬병 바이러스, 전염성 위장염 바이러스, 돼지 유행성 설사증 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 가성광견병 바이러스, 파보바이러스, 돼지 수포병 바이러스, 수두바이러스, 로타바이러스, 마이코플라스마 폐렴, 헤르페스 바이러스, 전염성 기관지염, 전염성 윤활낭병 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나이고;
    (ii) 상기 암이 비-소세포 폐암, 유방 암종, 흑색종, 림프종, 결장 암종, 간세포 암종, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나이며;
    (iii) 상기 면역 체크포인트가 PD-1, PD-L1, PD-L2, 및 CTLA-4로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나인, 재조합 배큘로바이러스.
  13. 제1항에 있어서, 상기 항원이 돼지 열병 바이러스 엔벨로프 당단백질 E2, 돼지 유행성 설사증 바이러스 S1 단백질, 예정 세포사 단백질 1, 및 종양-관련 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나인, 재조합 배큘로바이러스.
  14. 제3항에 있어서, 상기 항원이 병원체 단백질, 암세포 단백질, 및 면역 체크포인트 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나인, 벡터.
  15. 약제를 필요로 하는 피검체에서 항원-특이적 면역원성 반응을 유도하기 위한 약제의 제조에서의, 제3항의 벡터의 용도 또는 제1항의 재조합 배큘로바이러스의 용도.
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