CN116490204A - 催化失活血管紧张素转换酶2(ace2)变体及其用途 - Google Patents

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Abstract

血管紧张素转化酶2（ACE2）作为几种β基团冠状病毒的特异性受体，包括严重呼吸综合征（SARS）冠状病毒（SARS‑CoV‑1），以及最近引起世界大流行的CoVID‑19、SARS‑CoV‑2和HCoV‑NL63的低致病性冠状病毒的致病剂，是α‑冠状病毒组中的成员。确认病毒包膜的病毒刺突蛋白(S)以结合ACE2作为病毒受体以启动病毒复制周期。本发明提供ACE2及其突变体或变体、其病毒或非病毒载体，还提供了通过使用此类突变体或变体治疗人类受试者的病毒感染的方法。

Description

催化失活血管紧张素转换酶2(ACE2)变体及其用途
背景技术
人血管紧张素转化酶2 (ACE2)广泛表达于各种组织的细胞表面，在消化组织如小肠、结肠、十二指肠、胆囊、心肌、气道、肺中检测到的水平最高，在其它组织中检测到的水平较低。ACE2是一种肽酶，其催化将血管紧张素II的C-末端氨基残基(Phe8)去除到血管紧张素1-7中，以维持血管紧张素II和血管紧张素1-7的平衡，其具有围绕其几种类型的功能的多种和复杂的生理作用：肾素-血管紧张素系统的负调节剂和氨基酸转运促进剂。
ACE2的另一生物学作用已经被证实为若干β组冠状病毒的特异性受体，所述β组冠状病毒包括严重呼吸综合征(SARS)冠状病毒(SARS-CoV-1) (Hofman等人,2004,TRENDS inMicrobiology, 12 (10), 2004；Jia HP等人,2005, J. Virol. 79(23), 14614-14621；Wang等人, 2008, Cell Research, 18:290-301)，以及一种低致病性冠状病毒HCoV-NL63，是一种冠状病毒组的成员(Hofman等人, 2005, PNAS, 102, 7988-7993)。最近，人ACE2已被确定为世界大流行病的病原体CoVID-19、SARS-CoV-2的特异性受体(Wang等人，2020,Cell, 181, 894-904；Zhao等人, 2020, Cell Host & Microbe, 28, 1-16)。病毒包膜的病毒刺突蛋白(S)与病毒受体ACE2的结合，启动病毒复制周期，引起宿主细胞损伤和病毒传播。SARS-CoV-2引起全世界数百万患者的严重感染和死亡。控制病毒与其受体的结合是终止COVID-19流行的非常重要的策略。
SARS-CoV 1和2病毒通过病毒包膜刺突蛋白（SI）结合宿主细胞ACE2外结构域的受体。随后进入胞质溶胶是通过组织蛋白酶、TMPRRS2或其它蛋白酶对S蛋白的酸依赖性蛋白水解切割，随后是病毒和细胞膜的融合。
病毒基因组RNA（gRNA）从核衣壳中释放。使用gRNA模板合成复制酶。这是复制酶催化基因组和亚基因组RNA片段合成的一个非常重要的步骤。亚基因组RNA（sgRNA）用于合成与gRNA模板包装在一起的结构蛋白，gRNA模板使用中间的负链RNA（-RNA）复制。病毒gRNA复制后，结构蛋白S、E和M被翻译并转移到内质网（ER）中的内质网高尔基体中间室（ERGIC）中，在那里形成成熟的病毒体。新形成的病毒颗粒在成熟完成后释放。在整个过程中，血管紧张素转换酶2（ACE2）分别在SARS-CoV-1、SARS-CoV-2和HCoV-NL63的复制周期中发挥关键作用。循环ACE可溶性受体野生型或变异突变体，无论是否融合，都能阻断SARS-CoV-1和SARS-CoV-2与其宿主细胞表面受体的结合，从而可以预防和治疗病毒感染和疾病。此外，ACE2对调节多种组织/器官的正常生物学功能很重要。它被证实对心血管疾病、肠道疾病、炎症、肺部疾病、糖尿病心血管并发症和肾脏疾病至关重要。在综述中可以发现ACE2的更多信息[Gheblawi等, 2020, Circulation Research, 126: 1457-1475]。
在控制COVID-19时，所采用的几种方法包括：a.开发使用灭活病毒颗粒的疫苗(灭活疫苗)，b.重组刺突蛋白或信使RNA (mRNA)，c.重组病毒刺突蛋白的刺突蛋白受体结合结构域(RBD)，d.重组人抗体鸡尾酒等。上述方法的挑战在于，当病毒尖峰突变在流行期自然发生时，即人与人、人与动物之间的传播或vs时，保护性低或无保护性。
自从发现ACE2为SARS-CoV受体以来，没有检测到病毒结合的突变，这表明病毒疾病呈现和治疗的稳定和特异性靶点。初步尝试将其用作COIVD-19的病毒诱饵受体。然而，一旦将ACE2作为病毒受体阻滞剂直接给受试者服用，ACE2的其他功能也被引入，因此可能导致与肾素-血管紧张素系统（RAS）相关的不必要的活动。
发明内容
本发明提供一种血管紧张素转换酶2（ACE2）的分离的胞外结构域（ECD）多肽，其具有一种或多种突变，所述突变导致ACE2催化活性（本文称为ACE2-vECD）的丧失，同时保持与病毒刺突蛋白的结合活性，其中所述病毒蛋白是冠状病毒的刺突蛋白。在一些实施例中，本发明提供使用野生型ACE2（本文称为ACE2-ECD）。
在一个实施方案中，导致ACE2酶活性丧失的突变位于覆盖361-410的氨基酸序列的N末端区域附近，其中所述区域具有催化中心。
在一个实施方案中，N-末端催化中心包含HEXH......E的基序；位置范围为H374E375XXH378......E402。
催化区包含一个或多个突变，其停止酶催化活性。
本发明的突变体继续与病毒蛋白连接，包括但不限于选自SARS-CoV1、SARS-Cov2、MERS-CoV-1和HCoV-NL63的蛋白。
本发明提供一种分离的血管紧张素转换酶2（ACE2）的胞外结构域多肽，其具有导致ACE2酶催化活性丧失的一个或多个突变，其中酶活性的丧失是由与二价金属离子的结合活性丧失引起的。二价金属离子选自Zn2+、Co2+和Mn2+。
在一个实施方案中，突变选自位置H374、E375、H378、E402及其一个或多个组合。所述氨基酸残基构成ACE2的催化中心。突变将导致ACE2失去与二价金属离子（即Zn2+、Co2+和Mn2+）的结合活性。金属离子结合活性的丧失使ACE2成为脱辅酶并失去其催化活性。
在另一个实施方案中，位于ACE2胞外结构域N端半部分的R273、H345、H505、H515、P346氨基酸残基中的突变也可能导致酶活性损失，但保留与冠状病毒刺突蛋白的结合能力。
本发明提供ACE-vECD突变或变体，其增强ACE2-vECD与病毒S1蛋白的结合亲和力。
在一个实施方案中，ACE2-ECD或ACE2-vECD变体连接到人IgG1-Fc区。因此，ACE2-ECD和ACE2-vECD变体变为ACE2-ECD-Fc或ACE2-vECD-Fc变体。本发明提供催化区域外的至少一种或多种突变以及催化区域内的突变。本领域技术人员可以通过一个或多个突变来决定达到使ACE2-vECD变体/突变体的酶活性失活同时增强所述酶与S1蛋白的结合亲和力的结果。肽的实例包括但不限于表1中的序列。
在另一个实施方案中，ACE2-ECD包含SEQ ID NO：1, 2, 29或ACE2-vECD包含选自SEQ ID NO：3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21, 22, 23, 24, 25, 26, 27和28的多肽。
在一个实施方案中，ACE2-vECD-Fc或其融合蛋白结合天然受体不是ACE2的病毒。
所述病毒包括但不限于SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS-CoV-11和NL63。
本发明提供包含分离的突变ACE2多肽的融合蛋白，其与突变多肽的N或C末端的肽或多核苷酸或小分子融合以形成融合蛋白，其中所述肽或多核苷酸或小分子能够与免疫系统相关细胞如淋巴细胞、巨噬细胞等的受体结合。
在另一个实施方案中，所述突变位点用于筛选激动剂或拮抗剂。
在一个实施方案中，所述多核苷酸是DNA或RNA。
在另一个实施方案中，其作为药物筛选系统，针对催化结构域或突变蛋白筛选小分子。
在另一个实施方案中，所述肽是与免疫细胞如淋巴细胞上的Fc结合受体（FcγR）结合的配体。所述淋巴细胞选自T细胞、B细胞、自然杀伤细胞。
在一个实施方案中，所述肽是人IgG抗体（Fcϒ）的Fc结构域。
在另一个实施方案中，与野生型ACE2或存在于受试者中的ACE2相比，具有一个或多个突变的ACE2多肽可导致ACE2酶活性丧失，同时保持与病毒蛋白相同或更高的结合亲和力，其中所述的受试者可以是人。所述突变可以在ACE2多肽的催化区内或催化区外。突变可以是多肽上的两个、三个、四个或五个突变。
本发明提供了一种编码野生型ACE2、ACE2-ECD、突变ACE2或ACE-vECD的分离的多核苷酸。
在一个实施方案中，野生型ACE2-ECD包含SEQ ID NO：1, 2, 29。
在另一个实施方案中，ACE2-vECD变体或突变体包含选自SEQ ID NO：3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,27, 28及其组合的多肽，或与其他所选氨基酸突变体的组合。
本发明提供了编码野生型、突变或突变融合蛋白ACE2的分离的多核苷酸，并且ACE2-vECD与Fc融合。
本发明提供了一种分离的编码野生型ACE2-ECD的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：1,2或29。
本发明提供了一种分离的编码突变ACE2-vECD的多核苷酸，其包含选自SEQ IDNO：3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,23, 24, 25, 26, 27和28。
本发明进一步提供了一种分离的野生型ACE2-ECD多核苷酸，其包含SEQ ID No：65和71。
本发明进一步提供一种分离的突变ACE2-vECD多核苷酸，其包含SEQ ID No：64,66, 67, 68, 69, 70, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80或81。
在一个实施方案中，野生型ACE2-ECD多核苷酸编码包含SEQ ID NO：1,2或29的多肽。
在另一个实施方案中，突变的ACE2-vECD多核苷酸编码多肽，所述多肽包含 SEQID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO: 18, SEQ IDNO: 19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28。
本发明提供一种分离的血管紧张素转换酶2（ACE2）多肽，其具有使ACE2酶活性丧失的一个或多个突变，其与野生型ACE2相比，所述的ACE2多肽对其结合伴侣保持相同或更高的结合亲和力。
在一个实施方案中，增加/增强的结合亲和力是由ACE2的催化区域中的突变引起的。在另一个实施方式中，突变位于催化区域之外的区域中。
在另一个实施方案中，突变选自位于K26、T27、L79、N330、H374、E375、H378、A386、A387、E402、G466、L795位点处及其任意两个、三个、四个、五个、六个、七个或更多个突变的组合。
在另一个实施方案中，突变选自位于K26R、T27Y、L79S、N330F、H374A、E375Q、H378R、A386V、A387L、E402Q、G466D、L795H位点处及其两个、三个、四个、五个、六个、七个或更多个突变的组合。
所述多肽相对于野生型ACE2，其对结合伴侣保持相同或更高的结合亲和力。
所述多肽相对于野生型ACE2，其对结合伴侣保持相同或更高的结合亲和力，并且其序列可进一步融合到突变多肽的N或C末端肽或多核苷酸或小分子以形成融合蛋白，其中所述肽能够结合到免疫系统相关细胞的受体。
在另一个实施方案中，ACE2-vECD突变体或变体对MERS的结合亲和力高于野生型ACE2或野生型ACE2-ECD的亲和力。其亲和性可以比其野生型的亲和性高150%、200%、300%、400%、500%、600%或700%。
在一个实施方案中，表达载体的递送包括多核苷酸编码野生型ACE2、ACE2-ECD、ACE2突变体、ACE-vECD或其融合蛋白。
在一个实施方案中，所述载体选自病毒载体或非病毒载体。
病毒载体可以包括AAV、腺病毒、慢病毒、HSV（使用昆虫系统、哺乳动物系统生产病毒载体），其中所述AAV载体可以是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12中的一种或多种及其任意组合。
非病毒载体可以包括质粒、纳米颗粒、脂质体、PEI衍生的或胶体金颗粒。
本发明还提供了一种宿主细胞，其包含本文所述的突变ACE2或ACE2-vECD或其融合蛋白的表达载体。
在一个实施方案中，宿主细胞可以选自原核细胞或真核细胞。原核细胞可以是细菌细胞，真核细胞可以选自哺乳动物和非哺乳动物细胞系。哺乳动物来源的细胞的实例可包括CHO、NS0、BHK-21。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，其包含本文所述的多肽、融合蛋白、载体/表达载体或宿主细胞。
在一个实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含如本文所述的多肽、融合蛋白、载体/表达载体或宿主细胞以及药学上可接受的载体。
在一个实施方案中，所述药物组合物的给药是通过鼻、口服、气道、耳道、皮下、肌肉内、静脉内或鞘内的方式给药。
本发明还提供一种疫苗组合物，其包含ACE2、野生型或ACE2突变体或ACE2-vECD或ACE2-vECD-Fc的表达载体，其作为蛋白质治疗剂或载体介导的颗粒、病毒或非病毒载体。
本发明提供一种制备突变多肽的方法，其通过合成或在宿主细胞中表达来进行制备。
在一个实施方案中，所述组合物或药物组合物用于治疗病毒感染，例如冠状病毒感染，包括但不限于α或β冠状病毒感染、SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS-CoV-1和NL63。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种预防病毒感染或对健康受试者预防性治疗的方法，其通过注射所述的野生型ACE2、ACE2突变体/ACE2-vECD或其融合蛋白的药物组合物，包括但不限于ACE2-vECD-Fc。
本发明提供了一种化合物的筛选方法，包括a）在高通量筛选中将一定量的具有突变基因的转染细胞群与多种测试试剂接触一段时间，并在适当条件下使测试试剂影响ACE2酶活性；和b）如果与接触前水平相比，测试试剂使ACE2酶活性和结合亲和力水平呈现统计学上地显著增加或减少，则选择该测试试剂，所述测试试剂可以是ACE2的激动剂或拮抗剂。
在一个实施方案中，所述的接触是在体外或体内进行的。
附图说明
图1为人ACE2结构图，其为具有805个氨基酸的I型整合膜羧基肽酶，包含一个HEXHE锌结合共有序列。
图2为ACE2生物活性图。
图3为人血管紧张素转换酶2氨基酸序列。
图4为ACE2-ECD-Fc（野生型）序列。
图5A和5B为本申请的多肽的氨基酸组成（野生型）的概要。
图6为突变锌离子结合位点使ACE2酶活性丧失的阐释图。
图7为ACE2-vECD-Fc结合病毒颗粒的示意图。
图8为可溶性ACE2-vECD-Fc与病毒颗粒结合示意图。
图9为使用完全取代的ECD作为查询序列的ACE2变体胞外域（ACE2-vECD）的BLAST检索。
图10为ACE2-vECD-Fc的序列（ECD上有突变）。
图11为病毒载体化ACE2-vECD-Fc（AAV-ACE2-vECD-Fc）的结构。
图12为ACE2-Fc变体/突变体的Western Blot结果。
图13为本申请实施方案中的ACE2-Fc变体制剂的亲和层析和SDS-PAGE实验。
图14为本申请一些多肽的测定结果。
图15A和15B为本申请一些多肽的测定结果，表明ACE2-vECD-Fc变体的ACE2活性完全耗尽。
图16A为ELRLA测定结果，表明ACE2-Fc变体与β冠状病毒的S1蛋白结合。
图16B为ELRLA实验得到的结合曲线，表明ACE2-Fc变体与SARS-CoV-2 B117（N501Y）S1蛋白受体结合域（RBD）结合。
图17A和17B为ELISA实验得到的结合曲线，表明ACE2-Fc和vACE2-Fc与三种S1蛋白结合。
图18为使用BiaCore 3000对本申请一些多肽的亲和性分析结果。
图19为荧光显微镜图像和分析，表明SARS-COV-2的S1蛋白填充GFP假病毒颗粒的中和。
图20为SARS-COV-2的S1蛋白填充GFP-假病毒颗粒的中和。
图21为本申请实施方案中ACE-Fc融合蛋白变体对SARS-COV-2野生型病毒（USA-WA1/2020）的中和。
图22为一些AAV载体的染色测定。
图23为HEK293细胞培养上清液的AAV5-ACE2-Fc及其变体的SDS-PAGE和WesternBlot。
具体实施方式
定义
腺相关病毒（AAV）：一种小型、复制缺陷、无包膜的病毒，感染人类和其他灵长类动物。AAV并不已知会导致疾病，且会引发非常轻微的免疫反应。使用AAV的基因治疗载体可以感染分裂细胞和静止细胞，并且可以在不整合到宿主细胞基因组的情况下保持在染色体外状态。所述特征使AAV成为基因治疗的一种有吸引力的病毒载体。目前有11种公认的AAV血清型（AAV1-11）。
给药/给药：通过任何有效途径向受试者提供或给予药物，如治疗剂（如重组AAV）。示例性给药途径包括但不限于注射（例如皮下、肌肉内、皮内、腹腔内和静脉内）、口服、导管内、舌下、直肠、经皮、鼻内、阴道和吸入途径。
结合亲和力：指单个生物分子（如蛋白质或DNA）与其配体/结合伴侣（如药物或抑制剂）之间的结合相互作用强度。结合亲和力通常通过平衡解离常数（KD）来测量和报告，平衡解离常数用于评估和排序双分子相互作用的强度。KD值越小，配体对其靶的结合亲和力越大。KD值越大，靶分子和配体相互吸引和结合的能力越弱。
结合区/结合中心：活性位点是底物分子结合并发生化学反应的酶区域。活性位点由与底物形成临时键的氨基酸残基（结合位点）和催化该底物反应的残基（催化位点）组成。
催化活性：在特定测定条件下，酶或其他催化剂引起的特定化学反应速率的增加。
催化区或催化中心：一般来说，这是酶上催化底物转化为产物的位点。转化为酶反应。在ACE2中，催化中心由几个氨基酸残基和二价离子形成，例如Zn2+、Co2+和Mn2+。
本文所述的有效量是指在时间段内提高ACE2水平所需的有效剂量。
Fc结合受体A Fc受体是一种存在于某些细胞表面的蛋白质，其包括B淋巴细胞、滤泡树突状细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、碱性粒细胞、人血小板和肥大细胞，它们有助于免疫系统的保护功能。
分离的：一种“分离的”生物成分（如核酸分子、蛋白质、病毒或细胞）已从生物体的细胞或组织或生物体本身的其他生物成分中基本上分离或纯化，该成分自然存在于其中，如其他染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白质和细胞。已“分离”的核酸分子和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化得到的。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸分子和蛋白质，以及化学合成的核酸分子与蛋白质。
修饰：在本申请的上下文中，“修饰”的ACE2多核苷酸或多肽序列，其与野生型序列相比包含至少一个核酸或氨基酸取代、缺失或插入（例如ACE2野生型与ACE2突变型相比）。
可操作地连接：当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列可操作地与第二核苷酸序列连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作地连接。通常，可操作连接的DNA序列是连续的，并且在需要连接两个蛋白质编码区时，密码子是优化的：“密码子优化”核酸是指已经改变的核酸序列，使得密码子在特定系统（例如特定物种或物种组）中的表达是最佳的。例如，可以优化核酸序列以在哺乳动物细胞或特定哺乳动物物种（例如人类细胞）中表达。密码子优化不会改变编码蛋白的氨基酸序列。
增强子：通过增加启动子的活性来提高转录速率的核酸序列。
倒置末端重复（ITR）：腺相关病毒基因组中的对称核酸序列，需要有效复制。ITR序列位于AAV DNA基因组的每一端。ITR是病毒DNA合成的复制来源，是产生AAV整合载体的必要顺式成分。
药学上可接受的载体：在本申请中有用的药学上可接受的载体（介质）是常规的。Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co.,Easton, Pa., 15th Edition (1975) 描述了适用于一种或多种治疗化合物、分子或药剂的药物递送的组合物和制剂。
预防、治疗或改善疾病：“预防”疾病（病毒感染）是指抑制疾病的全面发展。“治疗”是指在疾病或病理状况开始发展后，改善其症状或体征的治疗干预。“改善”是指减少疾病症状或体征的数量或严重程度。
纯化：术语“纯化”不要求绝对纯度；相反，它是作为一个相对术语。因此，例如，纯化的肽、蛋白质、病毒或其他活性化合物是从天然相关的蛋白质和其他污染物中全部或部分分离出来的。在某些实施方案中，术语“基本纯化”是指从细胞、细胞培养基或其他粗制剂中分离并进行分馏以去除初始制剂的各种成分（例如蛋白质、细胞碎片和其他成分）的肽、蛋白质、病毒或其他活性化合物。
重组：重组核酸分子是一种具有非天然存在的序列的分子，或具有由两个分离的序列片段人工组合而成的序列。所述人工组合可以通过化学合成或通过人工操作核酸分子的分离片段来实现，例如通过基因工程技术。类似地，重组病毒是包含非天然存在的序列（例如基因组序列）的病毒，或由至少两个不同来源的序列的人工组合制成的病毒。术语“重组”还包括仅通过添加、替换或删除一部分天然核酸分子、蛋白质或病毒而改变的核酸、蛋白质和病毒。如本文所用，“重组AAV”是指其中包装了重组核酸分子（例如编码突变ACE2的重组核酸分子）的AAV颗粒。
序列同一性：两个或多个核酸序列，或两个或更多氨基酸序列之间的同一性或相似性，以序列之间的相同性或相似程度表示。序列同一性可以用同一性百分比来衡量；百分比越高，序列越相同。序列相似性可以用相似性百分比来衡量（这考虑了保守的氨基酸取代）；百分比越高，序列越相似。当使用标准方法比对时，核酸或氨基酸序列的同源物或同源物具有相对较高的序列同一性/相似性。当同源蛋白质或cDNA来源于亲缘关系较近的物种（如人类和小鼠序列）时，与亲缘关系较远的物种（例如人类和秀丽隐杆线虫序列）相比，所述同源性更为显著。
用于比较的序列对齐方法在本领域中是众所周知的。各种程序和对齐算法描述于：Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981；Needleman & Wunsch, J. Mol.Biol. 48:443, 1970；Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444,1988；Higgins & Sharp, Gene, 73:237-44, 1988；Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-3,1989；Corpet等人, Nuc. Acids Res. 16:10881-90, 1988；Huang等人, Computer Appls.in the Biosciences 8, 155-65, 1992；和Pearson等人, Meth. Mol. Bio. 24:307-31,1994. Altschul等人, J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990，详细考量了序列比对方法和同源性计算。
NCBI基本局部比对搜索工具（BLAST）(Altschul等人, J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990) 可从多个来源获得，包括国家生物信息中心（NCBI）和互联网，用于序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx。有关更多信息，请访问NCBI网站。
血清型：一组密切相关的微生物（如病毒），以一组独特的抗原为特征。
受试者：活的多细胞脊椎动物，包括人类和非人类哺乳动物。合成的：在实验室中通过人工方法生产的，例如合成核酸可以在实验室中化学合成。
治疗或疗法：如本文所用，指获得有益或期望结果的方法，包括临床结果。有益的或期望的临床结果可包括但不限于减轻或改善一种或多种症状或病症、减轻疾病程度、稳定（即不恶化）疾病状态、防止疾病扩散、延缓或减缓疾病进展、改善或减轻疾病状态和缓解（无论是部分还是全部），无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还意味着与未接受治疗的预期生存期相比，延长生存期。
疫苗：是一种组合物，可预防病原性感染（例如原生动物、病毒或细菌感染）、癌症或其他疾病，或治疗病原性感染、癌症或其它疾病。对致病性感染、癌症或其他疾病的保护将完全防止感染或肿瘤或其他疾病，或者如果随后感染或患有该疾病，将减少感染、肿瘤或其他病症的严重程度或持续时间。治疗将使得一种或多种症状的改善或严重程度或持续时间的减少。如本文所述，疫苗是通过注射（伴随地、依次地或同时地）由本文方法产生的抗原和物质组合物而起效的。如本文所用，通过施用特定组合物来改善特定病症的症状是指可归因于或与施用本文所述的物质组合物相关的任何减轻，无论是永久性的还是暂时性的、持续性的或短暂性的。
疫苗接种方案是指一种治疗方案，其中将抗原和/或本文所述的任何基因治疗载体（单独或组合）的疫苗作为佐剂，同时以单独或组合的制剂，或以分钟、小时或天为间隔的不同时间，以组合的方式给受试者施用，但以某种方式共同作用来获得理想的增强免疫反应，相比于未使用本发明组合物的受试者的免疫应答。
载体：载体是一种核酸分子，允许插入外来核酸而不破坏载体在宿主细胞中复制和/或整合的能力。载体可以包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制源。载体还可以包括一个或多个可选标记基因和其他遗传元件。表达载体是含有必要的调控序列的载体，以允许插入基因的转录和翻译。在本文的一些实施例中，所述载体是AAV载体。
多肽及其突变及其融合蛋白
ACE2是一种I型完整膜羧基肽酶，具有805个氨基酸残基，及其前导序列，其成熟蛋白具有788个氨基酸残基，包含725个氨基酸残基的胞外结构域、跨膜结构域21个氨基酸残基的短片段和44个氨基酸残基的细胞内结构域。在胞外域内，一个“HE-XX-H-E”金属离子结合共有序列，一个H374E375XXH378…E402的基序被确认为催化基本序列（图1）。表1列出了具体的序列示例。
表1 - ACE2催化中心金属离子结合基序的突变汇总
361 -------------------HExxH--------------------------------E----------410
SEQ ID NO: 2 ctkvtmddfl tahhemghiq ydmayaaqpf llrnganegf heavgeimsl
SEQ ID NO: 3 ctkvtmddfl tahhemghiq ydmayaaqpf llrnganegf hQavgeimsl
SEQ ID NO: 4 ctkvtmddfl tahAemghiq ydmayaaqpf llrnganegf hQavgeimsl
SEQ ID NO: 5 ctkvtmddfl tahhemgAiq ydmayaaqpf llrnganegf hQavgeimsl
SEQ ID NO: 6 ctkvtmddfl tahAemghiq ydmayaaqpf llrnganegf heavgeimsl
SEQ ID NO: 7 ctkvtmddfl tahhemgAiq ydmayaaqpf llrnganegf heavgeimsl
SEQ ID NO: 8 ctkvtmddfl tahAemgAiq ydmayaaqpf llrnganegf heavgeimsl
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SEQ ID NO: 11 ctkvtmddfl tahhQmgAiq ydmayaaqpf llrnganegf hQavgeimsl
SEQ ID NO: 12 ctkvtmddfl tahAQmgAiq ydmayaaqpf llrnganegf hQavgeimsl
SEQ ID NO: 13 ctkvtmddfl tahAQmghiq ydmayaaqpf llrnganegf heavgeimsl
SEQ ID NO: 14 ctkvtmddfl tahhQmgAiq ydmayaaqpf llrnganegf heavgeimsl
SEQ ID NO: 15 ctkvtmddfl tahAQmgAiq ydmayaaqpf llrnganegf heavgeimsl
本发明是突变（取代）H374E375XXH378…E402金属离子结合基序中的至少一个或多个氨基酸残基，H，E，ACE2胞外域中唯一的一个金属离子结合基序，确切意义上的ACE2-vECD。
与野生型相比，金属离子结合基序的突变完全耗尽了内肽酶活性ACE2，但保持了其对冠状病毒结合的特异性和亲和力。
人ACE2胞外结构域从N端的总序列包含725个氨基酸残基（18-742 a.a.）（图3，表2），预测分子量为83596 Da，消光系数为16140 M-1CM-1。预计的pI为5.26。所述的人“ACE2”是一种糖蛋白，分子量将在一定程度上随糖基化状态而变化。人ACE2氨基酸序列的胞外结构域（ECD）如SEQ ID NO:1所示。
在另一个实施方案中，ACE2多肽上的突变包括位于K26、T27、L79、N330、H374、E375、H378、A386、A387、E402、G466、L795位点处及其任意两个、三个、四个、五个、六个、七个或更多个突变的组合。突变选自位于K26R、T27Y、L79S、N330F、H374A、E375Q、H378R、A386V、A387L、E402Q、G466D、L795H处、二、三、四、五、六、七及其更多组合。
表2 - 人野生型-ACE2（18-742）的氨基酸组成汇总。
ACE2分子每摩尔蛋白质含有一个g-原子的锌。锌离子是酶的辅因子，对ACE和ACE2的催化活性至关重要。ACE2是肾素-血管紧张素系统的关键成员，对调节心脏功能和血压稳态至关重要。使用螯合剂，如EDTA，通过从催化中心去除锌离子，形成无锌脱辅酶，使酶完全失活。用Zn2+、Co2+或Mn2+加入无金属脱辅酶溶液可恢复金属酶活性。金属酶的活性遵循Zn2+大于Co2+或大于Mn2+的顺序。然而，添加金属离子Fe2+、Ni2+、Cu2+、Cd2+和Hg2+不能恢复活性。其蛋白比Co2+或Mn2+更牢固地结合Zn2+。
人ACE2有6个预测的N-连接糖基化位点，它们是位于N53、N90、N104、N332、N432和N546位置的天冬酰胺（N）残基。在哺乳动物和人类细胞中，膜蛋白的碳水化合物被唾液酸化。糖基化天冬酰胺残基的至少一个唾液酸部分有助于冠状病毒的结合。ACE2的天然底物是血管紧张素II，一种短肽分子。晶体结构研究表明，所述残基不参与血管紧张素II转化为血管紧张素1-7的催化作用（Wang, Q.H.等人，2020）。
人血管紧张素I（Ang I）I是一种由10个氨基酸残基组成的短肽，即H-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-OH（单字母为DRVYIHPFHL）。Ang I通过血管紧张素转换酶（ACE）或非血管紧张素转化酶依赖的Ang I转化为Ang II而被清除。人类糜蛋白酶通过分裂Ang I中的Phe8-His9键，将10聚体Ang I有效转化为8聚体激素Ang II，成为H-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-（或DRVYIHPF）。Ang II被羧基肽酶（胞外肽酶）进一步清除，以去除C端Phe（F）残基，成为Ang1-7。Ang I、Ang II和Ang1-7的生化反应和生物学功能如图2所示。在正常条件下，ACE2的活性通过生理和生化调节得到很好的平衡。平衡的变化会导致疾病。在SARS-COV-2或SARS-COV-1感染的情况下，宿主细胞表面ACE2分子被病毒颗粒耗尽。ACE2耗竭现象表现出来。
当使用野生型ACE2诱饵受体治疗SARS-COV-2感染时，高剂量的ACE2蛋白制剂可能导致催化Ang II转化为Ang 1-7的酶的显著增加，并可能导致Ang II的耗竭。由于Ang II的显著降低，可能会产生不良影响。
在特定实施例中，表3中总结了突变ACE2序列包括的序列：
表3 - 突变体及其Fc融合蛋白汇总
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根据ACE2催化中心的特征，至少一个或多个突变、取代、缺失或丙氨酸取代可能导致其活性完全或严重耗尽。这是本发明中使用全长酶分子进行结合而不具有催化活性的基本理论。所述用途可以但不限于结合病毒，如SARS-CoV1、SARS-CoV-2、MERS-CoV或新出现的冠状病毒等。
除了金属离子结合基序，还有几个关键氨基酸残基对酶活性有贡献。ACE2的关键残余精氨酸273（R273）通过盐桥和氢键有助于底物识别。去除此Arg273可消除酶活性。ACE2的残余组氨酸345（H345）稳定了底物酶中间体，组氨酸505也有显著贡献，去除His505导致酶活性降低300倍。其他残基对酶活性也很重要，如脯氨酸346（P346）和组氨酸515（H515）。基于上述突变金属离子结合基序中的残基的描述，通过突变ACE2分子中的一个和/或多个所述残基R273、H345、P346、H505、H515，可以实现酶活性的完全消除。（Nicola E.Clarke等人，《蛋白质水解酶手册》，第100章，第499-504页，2013年第3版）。因此可以自然地认为ACE2的残余精氨酸273（R273）的突变也可能导致酶活性的显著降低或耗尽，因为它对盐桥至底物酶中间体的R产生正电荷。
ACE2变体或突变体可用于本发明的方法。使得产生化学等效或化学类似氨基酸序列的改变包括在本发明的范围内。测试与ACE2催化区具有序列同一性的多肽，以确保它们适用于本发明的方法。本发明多肽的变体可以自然发生，例如通过突变，或者可以例如通过多肽工程技术如定点突变来制备，这是本领域已知的氨基酸替代技术。例如，疏水性残基如甘氨酸可以被另一疏水性残基如丙氨酸取代。丙氨酸残基可被更疏水的残基如亮氨酸、缬氨酸或异亮氨酸取代。带负电的氨基酸如天冬氨酸可以取代谷氨酸。带正电的氨基酸如赖氨酸可被另一带正电氨基酸如精氨酸取代。
因此，本发明包括在氨基酸序列中具有保守变化或取代的多肽。保守取代插入一个或多个氨基酸，其具有与被取代的氨基酸相似的化学性质。本发明包括进行不破坏化合物活性的保守取代的序列。
包含一种或多种d-氨基酸的多肽在本发明中被考虑。还考虑了一种或多种氨基酸在N末端乙酰化的多肽。本领域技术人员认识到，多种技术可用于构建多肽模拟物，其具有与本发明相应多肽化合物相同或相似的所需化合物活性，但在溶解度、稳定性和/或对水解和蛋白水解的敏感性方面具有比多肽更有利的活性。例如，参Morgan和Gainor, Ann. Rep.Med. Chem., 24:243-252 (1989)。多肽模拟物的示例的美国专利5,643,873。描述如何制造和使用模拟物的其他专利包括，例如，美国专利5,786,322、5,767,075、5,763,571、5,753,226、5,683,983、5,677,280、5,672,584、5,668,110、5,654,276、5,643,873。本发明多肽的模拟物也可以根据本领域已知的其他技术制造。例如，通过用通过将氢基团转化为另一基团如羟基或氨基而化学改变侧基的试剂处理本发明的多肽。模拟物优选包括完全由氨基酸组成的序列或包括氨基酸和修饰的氨基酸或其他有机分子的杂交序列。
本发明还包括杂交体和多肽，例如，核苷酸序列与第二序列组合。
本发明还包括使用ACE2多肽片段的方法，如果片段保持活性，其可用于赋予化合物活性。
本发明还包括可以用作表征多肽或其活性研究的本发明的多肽和多肽片段。所述多肽优选由至少5个氨基酸组成。在优选实施方案中，它们可以由6至10、11至15、16至25、26至50、51至75、76至100或101至250或250至500个氨基酸组成。片段可以包括去除了一个或多个氨基酸的序列，例如化合物序列中的C端氨基酸。
特别地，ACE2多肽在突变的催化位点具有增强的结合亲和力。在一个实施方案中，ACE2-vECD突变体或变体对MERS的结合亲和力高于野生型ACE2或野生型ACE2-ECD的亲和力。其所述亲和力提高150%、200%、300%、400%、500%、600%或700%。
在另一个实施方案中，与野生型ACE2相比，ACE2多肽对其结合伴侣保持相同或更高的结合亲和力。
在另一个实施方案中，结合亲和力的增加/增强是由催化区域外的突变引起的。表3中列出了突变的示例。
多肽及其融合
本发明提供了突变过程后723个氨基酸残基的胞外结构域（ACE-vECD）的融合蛋白，其通过N端或C端融合以ACE2-vECD-Fc的形式与人IgG（例如IgG1 Fc或IgG4）Fc结构域融合（图4）。
一旦ACE2-Fc分子的ACE2部分与特定的病毒结合，其Fc部分可以发挥其生物学功能，如补体激活和Fc受体阳性细胞来攻击复合物。
ACE2-ECD-Fc和ACE2-vECD-Fc变体的组合物在ACE胞外域融合到人IgG1-Fc片段的N端或c端时被工程化。ACE2-ECD-Fc的野生型ACE2衍生Fc融合蛋白分子分析的实例如下所示（图4，图5A，5B，表4）：
表4 - ACE2-ECD-Fc的分子分析
突变的ACE2-vECD或ACE-vECD-Fc可以包括额外残基处的修饰，只要该蛋白保持酶SARS-COV结合活性，同时消耗二价金属离子结合活性（图6）。例如，突变的ACE2可以包括HEXXE区中其他残基处的取代，所述残基包括ACE2-ECD的H374、E375、H378、E402位。一旦ACE2失去催化功能，就会成为冠状病毒的粘合剂，阻止病毒感染和传播（图7和图8）。（以SEQID NO:1作为野生型ACE2-ECD）。
本发明提供了编码各种ACE2突变体或ACE2-vECD的核酸分子（图9和图10）。
在一些实施例中，所述核酸分子编码野生型ACE2、突变ACE2/ACE2-vECD变体或其融合蛋白，其具有与SEQ ID NO：1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28或29，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的氨基酸序列。
在特定实例中，ACE2-vECD的多肽包含或由SEQ ID NO：3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27或28组成。
在特定实施例中，野生型ACE2-ECD的多肽包含或由SEQ ID NO：1,2或29组成。
在特定实施例中，野生型ACE2-vECD的多核苷酸包含或由SEQ ID No：65或71组成。
在非限制性实例中，分离的多核苷酸包含或由SEQ ID NO：64, 65, 66, 67, 68,69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80或81的任何核苷酸序列组成；
在另一个实施例中，分离的多核苷酸包含或由编码SEQ ID NO：1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25,26, 27, 28或29的任何核酸序列组成。
还提供包含编码突变ACE2氨基酸序列的任何分离的核酸分子的载体。在一些实施方案中，编码突变ACE2/ACE2-vECD的核酸分子可操作地连接到启动子以驱动ACE2或ACE2蛋白表达。在一些实施例中，ACE2多核苷酸与编码SEQ ID NO：1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28或29的核苷酸，具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同。
载体和制备
野生型ACE2、ACE2-vECD或ACE2-v ECD-Fc通过哺乳动物细胞培养系统（如中国仓鼠卵巢（CHO）、幼仓鼠肾脏（BHK）细胞）表达和制造，并纯化至同质，作为预防和/或紧急治疗冠状病毒感染性疾病（如SARS、MERS和新冠肺炎或变种）的药物。基本的克隆和分子生物学方法是本领域已知的，可以在参考文献中找到（Green，M.R.等人，2012，2012, MolecularCloning: A Laboratory Manual，第四版，Cold Spring Harbor Laboratory PressBookstore A Division of CSHL）。
野生型ACE2、ACE2-vECD或ACE2-v-ECD-Fc被进一步载体化以递送至人体，用于感兴趣基因的长期作用表达。图11简单描述了载体设计和生产过程。载体包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘病毒、人泡沫病毒（HFV）和慢病毒。所有病毒载体基因组都已通过删除其基因组的某些区域进行了修改，从而使其复制变得紊乱，并使其更安全，但该系统存在一些问题，例如其显著的免疫原性，导致炎症系统的诱导，导致转导组织的退化；以及毒素产生，包括死亡性，插入性突变；以及它们在转基因容量大小上的限制。在过去几年中，已经设计了一些具有特定受体的病毒载体，可以将转基因转移到一些其他特定细胞，上述细胞不是它们的天然靶细胞（重靶向）。
非病毒系统包括除病毒系统外的所有物理和化学系统，通常包括化学方法，如阳离子脂质体和聚合物，或物理方法，如基因枪、电穿孔、粒子轰击、超声利用和磁感染。更重要的是，所述方法对免疫系统的诱导较少，而且与病毒系统相比，转基因DNA的大小没有限制。迄今为止，所述方法在基因递送方面比非病毒递送系统更有效。
野生型ACE2、ACE-vECD或ACE2-vECD-Fc编码的DNA片段也将使用上文所述的病毒载体或非病毒载体克隆到基因递送系统中。
编码ACE2或其突变体/变体的多核苷酸可克隆在载体中，用于制造目的表达其多肽。所述载体也可用于基因治疗。当使用AAV载体时，所述载体可以包括反向末端重复（ITRs）序列。在一些实施方案中，AAV载体包含与核苷酸AAV至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述载体包含与核苷酸AAV载体至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述载体是AAV载体。AAV血清型可以是用于向受试者递送转基因的任何合适的血清型。在一些例子中，AAV载体是血清型8 AAV（AAV8）。在其他实施例中，AAV载体是血清型1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11或12载体（即，AAV1, AAV2, AAV3,AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV9, AAV10, AAV11或AAV12）。在其他实施例中，AAV载体是两种或更多种AAV血清型（例如但不限于AAV2/1, AAV2/7, AAV2/8或AAV2/9）的混合物。AAV血清型的选择部分取决于基因治疗靶向的细胞类型。
本发明提供了将载体转染或感染到宿主细胞中以进行表达的方法。这样的宿主细胞可以产生多肽。或者，所述宿主细胞可用于细胞治疗目的。
本发明提供包含本文公开的核酸分子或载体的分离的宿主细胞。例如，分离的宿主细胞可以是适于生产重组AAV（rAAV）的细胞（或细胞系）。在一些实例中，宿主细胞是哺乳动物细胞，例如CHO、HeLa、HEK-293、BHK、Vero、RD、HT-1080、A549、Cos-7、ARPE-19或MRC-5细胞。
携带ACE2-vECD-Fc的病毒载体可以在任何真核细胞培养系统中产生，如哺乳动物细胞、昆虫细胞和酵母细胞。
还涉及一种通过生产重组病毒储备的方法，其通过生产适合于基因治疗的病毒，包括编码ACE2的DNA。所述方法优选包括转染允许病毒复制的细胞（含有核酸分子的病毒）并收集产生的病毒。
本发明还包括转化细胞，其包含载体和重组ACE2或ACE2-vECD核酸分子序列。
治疗和免疫
本发明提供使用ACE2-vECD作为病毒受体阻断剂，分子不发挥ACE2酶活性。通过所述方法，不期望的生物学后果不会导致ACE2治疗剂（如重组蛋白、DNA、mRNA或载体介导的治疗）的施用产生不期望的影响。在一个实施例中，使用野生型ACE2。
在一个实施方案中，作为病毒-受体相互作用阻断剂，当病毒进入体内并计入ACE-vECD蛋白的可溶性形式时，它与宿主细胞表面ACE2分子，病毒受体，竞争病毒的结合，并阻止宿主ACE2与病毒的结合。病毒复制过程终止。可溶性细胞表面ACE2的结合被挽救，细胞的正常生物学被维持。
进一步提供了包含本文所述的核酸分子的重组AAV（rAAV）。在一些实施例中，rAAV是rAAV5。然而，AAV血清型可以是任何其他合适的AAV血清类型，例如AAV1, AAV2, AAV3,AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV9, AAV10, AAV11或AAV12，或两种或更多种AAV血清（例如但不限于AAV2/1, AAV2/7, AAV2/8或AAV2/9）的混合物。
本发明还提供了包含所述的rAAV和药学上可接受的载体的组合物。在一些实施方案中，配制组合物用于静脉内或肌肉内给药。例如，可在美国专利申请公开号2012/0219528中找到用于给与rAAV的合适药物制剂（引用并入本文）。
所述的ACE2-vECD或ACE2-vECD-Fc是冠状病毒的可溶性受体。ACE2-vECD或ACE2-vECD-Fc融合蛋白的发明可以特异性结合SARS冠状病毒（SARS-CoV-1）、中东呼吸综合征（MERS）冠状病毒的尖峰蛋白（MERS-CoV）和当前世界流行的新冠肺炎、SARS-CoV2和HCoV-NL63。
ACE2或ACE2-vECD多肽用于治疗心血管疾病、高血压、心肌梗死（MI）、纤维化、炎症，等其他更多应列出的。
本发明可用于治疗由这些新出现的冠状病毒和其他进一步相关的病毒引起的感染；所结合的病毒可以被Fc受体阳性免疫细胞清除。
进一步提供了治疗被诊断为病毒感染的受试者的方法，包括选择具有所述感染的受试者，并向受试者施用所述的治疗有效量的rAAV（或包含rAAV的组合物）。
本发明的AAV-ACE2-vECD或AAV-ACE2-vECD-Fc可根据所用AAV载体的血清型转导非免疫细胞，例如AAV5可转导肝细胞、肌肉、上皮细胞。这对于那些免疫应答较低且免疫可由非免疫细胞构建的人来说非常重要，其被载体如AAVx-ACE2-vECD-Fc载体转导。
在一个实施方案中，所述载体组合物可以持续表达ACE2-vECD-Fc融合蛋白多年，从而提供对病毒感染的长期保护。
本发明还提供了通过使用具有rAAV/ACE2-vECD、ACE2、ACE-vECD的组合物在健康受试者中预防或预防性治疗的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用所述的治疗有效量的rAAV（或包含rAAV的组合物）。在一些实施例中，受试者患有病毒感染。所述感染可以是SARS-Cov-1、SARC-Cov-2、MERS-Cov1或HCoV-NL63。因此，在一些示例中，所述方法包括选择具有不同病毒感染的受试者。
锌离子结合基序的突变完全消除了ACE2酶活性，蛋白质分子、ACE2-ECD-Fc、ACE2-vECD-Fc和携带所述类型DNA片段的载体（病毒或非病毒）及其蛋白质产物仅作为中和抗体而不具有酶功能。因此，使用这些产品是安全的。
此外，锌结合基序N端或附近的一些相关氨基酸残基的变化显著增强了SARS-CoV-1、SARS-CoV-2和MERS-CoV的S1蛋白与ACE2受体的结合。
例如，在美国专利中解释了向分离细胞或动物施用ACE2（包括在基因治疗中）的方法和组合物。例如，美国专利编号5,672,344、5,645,829、5,741,486、5,656,465、5,547,932、5,529,774、5,436,146、5,399,346、5,670,488、5,240,84、6,322,536、6,306,830和6,071,890以及美国专利申请20010029040，引用并入本文。
所述方法和组合物可以在体内或体外使用。本发明还包括组合物（优选用于基因治疗的药物组合物）。所述组合物包括含有ACE2的载体。所述载体可以是药物载体或包括所述载体的宿主细胞转化体。本领域已知的载体包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒（AAV）、疱疹病毒载体，如痘苗病毒载体、HIV和慢病毒的载体，或质粒。本发明还包括生产所述载体所需的包装和辅助细胞系。本发明还包括生产所述载体的方法和使用所述载体的基因治疗方法。
一般而言，药物载体的性质将取决于所采用的特定给药方式。例如，非肠道制剂通常包括可注射流体，其包括药学和生理学上可接受的流体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等作为载体。对于固体组合物（例如粉末、丸剂、片剂或胶囊形式），常规无毒固体载体可包括例如药物级甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物中性载体之外，待施用的药物组合物可含有少量无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或山梨糖醇单月桂酸酯。
免疫原性或免疫组合物也可以水包油乳液的形式配制。水包油乳液可基于例如轻质液体石蜡油（欧洲药典型）；类异戊二烯油，如角鲨烷、角鲨烯、EICOSANE.TM、或四十四烷；烯烃（例如异丁烯或癸烯）低聚产生的油；含有直链烷基的酸或醇的酯，例如植物油、油酸乙酯、丙二醇二（辛酸酯/辛酸酯）、三甘油酯（辛酸酯）或丙二醇二醇酯；支链脂肪酸或醇的酯，例如异硬脂酸酯。油有利地与乳化剂组合使用以形成乳液。乳化剂可以是非离子表面活性剂，例如山梨糖醇、甘露醇（例如，脱水山梨醇油酸酯）、甘油、聚甘油、丙二醇、蔗糖、海藻糖和油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸的酯，其任选地被乙氧基化，以及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，例如Pluronic.RTM。佐剂可以是乳化剂、胶束形成剂和油的混合物，例如商品名为Provax.RTM的油。（IDEC Pharmaceuticals, San Diego, Calif.）。
本发明的免疫原性组合物可含有额外的物质，例如润湿剂或乳化剂、缓冲剂或佐剂，以增强疫苗的效力（Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, MackPublishing Company, (ed.) 1980）。
也可包括佐剂。佐剂包括但不限于矿物盐（例如，AlK(SO4)2、AlNa(SO4)3、AlNH(SO4)2、二氧化硅、明矾、Al(OH)3、Ca3(PO4)2、高岭土或碳），具有或不具有免疫刺激复合物（ISCOMs）的多核苷酸（例如，CpG寡核苷酸，如在Chuang, T. H.等人, (2002) J. Leuk.Biol. 71(3): 538-44；Ahmad-Nejad, P.等人 (2002) Eur. J. Immunol. 32(7): 1958-68中描述的； 聚IC或聚AU酸、具有或不具有CpG的聚精氨酸（在本领域中也称为IC31；参见Schellack，C.等人(2003)《德国免疫学学会第34届年会论文集》；Lingnau，K.等人(2002)Vaccine 20(29-30): 3498-508），JuvaVax.TM（美国专利6,693,086），某些天然物质（例如，来自结核分枝杆菌的Wax D、微小角杆菌、百日咳杆菌或布鲁氏菌属中发现的物质）、鞭毛蛋白（Toll样受体5配体；见McSorley,S.J.等人，(2002) J. Immunol. 169(7): 3914-9），皂苷类，如QS21、QS17和QS7（美国专利5,057,540, 5,650,398, 6,524,584, 6,645,495），单磷酸脂A，特别是3-de-O-酰化单磷酸脂A（3D-MPL），咪喹莫特（在本领域也称为IQM，商用名为Aldara.RTM；参见美国专利4,689,338, 5,238,944；Zuber，A.K.等人，(2004) 22(13-14): 1791-8），以及CCR5抑制剂CMPD167（参见Veazey，R.S.等人，(2003) J. Exp. Med.198: 1551-1562）。
氢氧化铝或磷酸盐（明矾）通常以0.05至0.1%的磷酸盐缓冲盐水溶液使用。可以使用的其他佐剂，特别是DNA疫苗，是霍乱毒素，特别是CTA1-DD/ISCOMs（参见Mowat，A.M.等人，(2001) J. Immunol. 167(6): 3398-405），聚磷腈（Allcock, H.R. (1998) App.Organometallic Chem. 12(10-11): 659-666；Payne, L. G.等人， (1995) Pharm.Biotechnol. 6: 473-93），细胞因子比如但不限于IL-2, IL-4, GM-CSF, IL-12, IL-15IGF-1, IFN-α, IFN-β, and IFN-γ。（Boyer等人，(2002) J. Liposome Res. 121:137-142; WO01/095919），免疫调节蛋白如CD40L（ADX40；参见例如WO03/063899）和天然杀伤细胞的CD1a配体（也称为CRONY或α-半乳糖基神经酰胺；参见Green, T.D.等人，(2003) J.Virol. 77(3): 2046-2055），免疫刺激性融合蛋白如与免疫球蛋白Fc片段融合的IL-2（Barouch等人，Science 290:486-492, 2000）和共刺激分子B7.1和B7.2（Boyer），所有这些都可以作为蛋白质，或以DNA的形式在与编码所述抗原的表达载体相同的表达载体上，或在单独的表达载体中施用。
免疫原性组合物可被设计为将核酸或表达载体引入期望的作用位点并以适当和可控的速率释放。制备控释制剂的方法是本领域已知的。例如，可通过使用聚合物来复合或吸收免疫原和/或免疫原性组合物来制备控释放制剂。控释制剂可使用已知提供所需控释特性或释放曲线的适当大分子（例如，聚酯、聚氨基酸、聚乙烯、吡咯烷酮、乙酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素或硫酸鱼精蛋白）制备。通过控释制剂控制作用持续时间的另一种可能方法是将活性成分掺入聚合材料的颗粒中，例如聚酯、聚氨基酸、水凝胶、聚乳酸、聚乙醇酸、这些酸的共聚物或乙烯-乙酸乙烯酯共聚物。或者，代替将这些活性成分掺入聚合物颗粒中，可以将这些材料包埋到例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，在胶体药物递送系统（例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊）或PEI衍生的或大乳液中。这些技术公开在《疫苗的新趋势和发展》，Voller等人(eds.), University Park Press,Baltimore, Md., 1978和Remington's Pharmaceutical Sciences, 第16版。
本领域技术人员可以容易地确定本发明免疫原性组合物中本发明核酸和表达载体（统称为免疫原）的合适剂量。例如，免疫原的剂量可以根据给药途径和受试者的大小而变化。合适的剂量可由本领域技术人员确定，例如通过使用常规免疫学技术测量受试者（例如实验动物）的免疫反应，并适当调整剂量。用于测量受试者的免疫应答的此类技术包括但不限于铬释放测定、四聚体结合测定、IFN-γ、ELISPOT测定、IL-2 ELISPOT检测、细胞内细胞因子测定和其他免疫检测测定，例如，如Ed Harlow和David Lane的“抗体：实验室手册”一文中所述。
在一些实施方案中，rAAV以约1x106至约1x1015载体基因组(vgvg)/kg的剂量施用。在一些实例中，rAAV以约1x1011至约8x1013vg/kg或约1x1012至约8x1013vg/kg的剂量施用。在其他实施例中，rAAV以约1x1013至约6x1013vg/kg的剂量施用。在特定的非限制性实例中，rAAV以至少约1x1010、至少约5x1010、至少大约1x1011、至少大约5x1011、至少大约1x1012、至少约5x1012、至少大约1x1013、至少大约5x1013或至少大约1x1014vg/kg的剂量施用。在其他非限制性实例中，rAAV以不大于约1x1010、不大于约5x1010、不小于约1x1011、不大于大约5x1011、不大于约1x1012、不大于约5x1012、不大于约1x1013、不大于约5x1013或不大于约1x1014vg/kg的剂量施用。在一个非限制性实例中，rAAV以约1x1012vg/kg的剂量施用。在另一非限制性实例中，rAAV以约1x1011vg/kg的剂量施用。rAAV可以单剂量给药，或根据需要以多剂量（例如2、3、4、5、6、7、8、9或10剂量）给药，以获得期望的治疗结果。免疫原性组合物可以使用任何合适的递送方法施用，包括但不限于肌肉内、静脉内、皮内、粘膜和局部递送。此类技术为本领域技术人员所熟知。递送方法的更具体示例是肌肉注射、吸入、喷雾、饮用或摄入、皮内注射、静脉内腹腔注射（IP）和皮下注射。然而，递送不必限于注射方法。此外，DNA向动物组织的递送可以通过阳离子脂质体实现（Watanabe等人，(1994) Mol. Reprod.Dev. 38:268-274；和WO 96/20013），将裸DNA直接注射到动物肌肉组织中（Robinson等人，(1993) Vaccine 11:957-960；Hoffman等人，(1994) Vaccine 12: 1529-1533；Xiang等人，(1994) Virology 199: 132-140；Webster等人，(1994) Vaccine 12: 1495-1498；Davis等人，(1994) Vaccine 12: 1503-1509；和Davis等人，(1993) Hum. Mol. Gen. 2: 1847-1851），或使用“基因枪”技术皮内注射DNA（Johnston等人，(1994) Meth. Cell Biol. 43:353-365）。或者，递送途径可以是口服、鼻内或通过任何其他合适的途径。也可通过粘膜表面如肛门、阴道或口腔粘膜进行递送。在本文公开的方法的一些实施方案中，AAV通过口服、鼻、耳、皮下、肌肉内、静脉内或鞘内给药。
动物（包括人类）的免疫计划（或方案）是众所周知的，并且可以针对特定的受试者对免疫原性组合物进行确定。因此，可向受试者施用一次或多次免疫原。优选地，在免疫原性组合物的单独给药之间存在设定的时间间隔。虽然每个受试者的间隔时间不同，但通常从10天到几周不等，通常为2、4、6或8周。对于人类来说，间隔时间通常为2至6周。在本发明的一个特别有利的实施方案中，间隔更长，有利地约为10周、12周、14周、16周、18周、20周、22周、24周、26周、28周、30周、32周、34周、36周、38周、40周、42周、44周、46周、48周、50周、52周、54周、56周、58周、60周、62周、64周，66周、68周或70周。在最有利的实施例中，间隔为约16周或约53周。
免疫方案通常具有1至6次免疫原性组合物的施用，但可以具有少至1次、2次或4次的施用。诱导免疫应答的方法还可以包括用免疫原施用佐剂。在某些情况下，每年、半年或其他长间隔（5-10年）的加强免疫可以补充初始免疫方案。
本发明的方法还包括多种主要增强方案，例如DNA主要腺病毒增强方案。在所述方法中，一次或多次启动免疫后进行一次或多次增强免疫。对于每种免疫，实际的免疫原性组合物可以相同或不同，免疫原性成分的类型（例如，含有蛋白质或表达载体）、途径和免疫原的配方也可以不同。例如，如果表达载体用于启动和增强步骤，它可以是相同或不同类型的（例如，DNA或细菌或病毒表达载体）。一种有用的初级强化免疫方案提供两次初级免疫，间隔四周，然后在最后一次初级免疫后的4周和8周进行两次强化免疫。对于本领域技术人员来说，还应该容易理解，使用本发明的DNA、细菌和病毒表达载体来提供启动和增强方案，包括上述几种的排列和组合。在病毒载体表达US2-11的情况下，它们可以重复使用，同时表达源自不同病原体的不同抗原。
筛选实验
本发明提供了筛选针对野生型ACE2、ACE2-vECD或其融合蛋白的激动剂或拮抗剂的方法。激动剂或拮抗剂的化合物包括a）在高通量筛选中将一定量的具有突变基因的转染细胞群与多种测试试剂接触一段时间，并在适当条件下使测试试剂影响ACE2酶活性；和b）如果与接触前水平相比，测试试剂使ACE2酶活性和结合亲和力水平呈现统计学上地显著增加或减少，则选择该测试试剂。
本发明还包括用于检测ACE2激活剂的筛选实验，其可用于治疗包括但不限于病毒性疾病的疾病。所述实验是在体外或体内进行的。在优选的实施方案中，本发明包括用于评估候选化合物是否能够增加内皮细胞、肾细胞、肺细胞或心脏细胞测定的ACE2表达或活性。在至少一种待测化合物的存在下培养细胞，进而测定所述化合物激活ACE2表达或活性的能力。本发明的另一个方面涉及一种ACE2敲除小鼠，用于测定可克服ACE2丧失影响的化合物。在另一个实施方案中，可通过施用增加ACE2基因表达的试剂（包括使用本申请中的筛选实验鉴定的任何试剂）来增加ACE2的基因表达。
通过这些实验中测试多肽和小有机分子。本发明包括使用所述的筛选方法鉴定的，并且适合在药物组合物中给药于动物的所有化合物。
工作实施例
1. 实施例：野生型ACE2-ECD和ACE2-vECD及其突变体的设计、分子克隆基因突变和克隆
一系列ACE2突变体是通过在蛋白质的5'端融合人抗体重链分泌信号肽和3'端融合IgG1 Fc片段而产生的。使用SnapGene程序(GSL Biotech, San Diego, CA)将野生型ACE2-Fc蛋白序列反向翻译为DNA序列，并输出现代人密码子。人工进一步修改ACE2-Fc DNA序列以调整GC含量，并将其作为三个重叠的DNA片段发至Twist Bioscience(South SanFrancisco, CA)进行合成。
对于构建载体，所有引物均由本领域技术人员设计，名称列于表5中。
制备如表3所述的构建体。构建AMI074-pFB-CMV-SV40intron-Vh-ACE2- G449D-Fc，用EcoRI切割质粒AMI063-pFB-CMV-hGH_intron-hCOMP-Ang1以分离骨架片段。用引物A120和A121以及AMI060作为模板，PCR扩增CMV启动子-SV40内含子片段（748bps）。用引物A056和A145 PCR扩增5’-ACE2片段（1517bps），用引物A146和A147 PCR扩增中间ACE2片段（840bps），用合成的DNA片段作为模板用引物A148和A122 PCR扩增3’-ACE2片段（660bps）。进行第二轮PCR以将CMV-SV40内含子片段与5’-ACE2片段与引物A120和A145一起连接，使用引物A146和A122将中间和3’-AACE2片段与另一个PCR反应连接。使用NEBuilder HiFi DNA组装试剂盒(New England Biolabs, Ipswich, MA)纯化这两个连接的PCR片段并克隆到质粒AMI063的EcoRI位点。AMI080-pSV40prom-DHFR-NeoR-CMV-ACE2-Fc是通过用引物A098和A161扩增质粒AMI074中的CMV-SV40-intron-ACE2-pA片段并连接到AMI069的SalI和MluI位点而产生的。AMI081-pFB-CMV-SV40intron-Vh-ACE2_E402Q-G449D-Fc是通过用SfoI切割质粒AMI074以分离骨架片段。用引物A162和A163以及AMI074作为模板，PCR扩增具有所需突变的540bp-ACE2片段。用NEBuilder HiFi DNA组装试剂盒纯化PCR片段并克隆到SfoI位点。用BamHI和FseI切割质粒AMI081-pFB-CMV-SV40intron-Vh-ACE2_E402Q-G449D-Fc，以去除ACE2的突变部分，并用来自AMI080-pSV40prom-DHFR-NeoR-CMV-ACE2-Fc的野生型-ACE2片段替换，以产生AMI089-pFB-CMV-SV40intron-Vh-ACE2-Fc。为了克隆AMI090-pFB-CMV-SV40in-Vh-ACE2_E385Q-Fc，用AleI和FseI切割质粒AMI081以分离骨架片段。用引物A156和A170扩增5’-ACE2片段，用引物A169和A158扩增3’-ACE2片段，质粒AMI081作为模板。使用第二轮PCR将两个PCR片段连接在一起，然后使用NEBuilder HiFi DNA组装试剂盒将其克隆到AleI和FseI位点。为了克隆AMI082-pFB-CMV-SV40intron-Vh-ACE2_H357A-E385Q-Fc，将质粒AMI090切割AleI和FseI以分离骨架片段。用引物A156、A157和A158以及质粒AMI090作为模板扩增ACE2片段。将ACE2 PCR片段克隆到AMI090的AleI和FseI中，以得到克隆AMI082-pFB-CMV-SV40intron-Vh-ACE2_H357A-E385Q-Fc。AleI和FseI之间的ACE2片段用引物A156、A159和A158以及质粒AMI090作为模板进行PCR扩增，以包含所需的E358-385Q突变，并克隆到AMI0900中，以得到AMI083-pFB-CMV-SV40intron-Vh-ACE2_E358-385Q-Fc。AleI和FseI之间的ACE2片段用引物A156、A160和A158和质粒AMI090作为模板进行PCR扩增，以包含所需的E358-385Q+H357A突变，并克隆到AMI0900中以产生AMI084-pFB-CMV-SV40intron-Vh-ACE2_E358-385Q+H357A-Fc。AleI和FseI之间的ACE2片段用引物A156、A160和A158和质粒AMI089作为模板进行PCR扩增，以包含所需的H357A+385Q突变，并克隆到AMI089中，以得到AMI085-pFB-CMV-SV40intron-Vh-ACE2_H357A+385Q-Fc。
使用AMI082质粒作为骨架构建表3中从AMI121到AMI129的第二组ACE2突变体质粒。简言之，Twist Biosciences将所有突变序列合成为两个重叠的DNA片段。用引物A056和A385对5'片段进行PCR扩增，用引物A386和A158对3'片段进行扩增。纯化每个突变体的两个PCR片段，并用引物A056和A158连接在一起。再次纯化连接的PCR片段，用NEBuilder HiFiDNA组装试剂盒克隆到AMI082的AflII和FseI位点，以得到各个突变体质粒。使用引物A024、A145、A169和A148通过DNA测序分析验证突变序列。
表1和表3列出了本项目中使用的具有所需ACE2-vECD-Fc变体突变的质粒构建体，表5列出了用于PCR和DNA测序的所有引物。所有构建体的完整ACE2编码DNA序列如下所示。
按照上述步骤，克隆了编码ACE2-vECD或ACE2-vECD-Fc融合蛋白的其余突变蛋白的DNA构建体，特征在于其DNA测序，所述DNA序列仅为编码ACE2-v ECD-Fc融合蛋白的序列。
表5 - 用于分子克隆的引物的寡核苷酸序列ID
本项目中使用的具有所需ACE2突变的质粒构建体列于表3中，所有构建体的完整ACE2编码DNA序列列于上文。用于PCR和DNA测序的所有引物列于表5中。
所有构建体首先克隆到我们的哺乳动物专有表达载体中，最终载体列于上表4中。
2. 实施例：构建体在哺乳动物细胞培养系统中的瞬时表达
人HEK293细胞在含有10%FBS(ATCC Manassas, VA)在37°C的CO2培养箱中。为了维持传代，将细胞以1:10的比例每周传代两次。为了转染，将细胞接种在10 cm的细胞培养皿上(Corning, NY) 2 x 106个细胞/皿，置于10mL培养基中过夜。将14µg质粒DNA和22µLLipofectamine 3000分别稀释在0.5mL Opti-培养基中，并混合在一起。在室温下孵育5分钟后，将混合物滴加到细胞中，并在37°C的CO2培养箱中孵育48小时。收获培养基用于进一步实验。
在瞬时转染前1天，将HEK293细胞以2 x 106的密度接种到10cm的组织培养皿上。按照制造商的方案，使用14µg/皿DNA和Lipofectamine 3000试剂(Invitrogen, Carlsbad,CA)对ACE2-ECD-Fc(野生型)或ACE2-vECD-Fc变体质粒进行每次转染。在转染后48小时收集细胞培养上清液并通过蛋白质印迹分析蛋白质表达。所有转染均在至少三次独立实验中进行三次。
通过SDS-PAGE和Western Blot分析确定ACE2-ECD-Fc (野生型)或ACE2-vECD-Fc变体蛋白。将从质粒转染48小时或从AAV5-ACE2转导72小时收集的HEK293细胞培养基（上清液）用于Western Blot分析。将总体积为30μL的细胞上清液与10ul的4倍加载缓冲液混合，并加载到NuPAGE 10%三甘氨酸凝胶(Invitrogen)上进行电泳。随后使用X Cell II™模块将蛋白质转移到PVDF膜上 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。在室温下用PBS(ThermoScientific, Waltham, MA, USA)中的酪蛋白阻断剂处理膜至少一小时，并用山羊抗人IgG1-Fc抗体-生物素缀合物（Abcam，Cambridge，UK）探测，然后用与辣根过氧化物酶（Abcam）缀合的链霉亲和素孵育。使用ECL™Western Blot试剂盒(Amersham)检测蛋白质，使用iBrightTM CL1500成像系统(Invitrogen, Carlsbad, CA)记录图像。（图12）。
3. 实施例：ACE2-ECD-Fc(野生型)和ACE2-vECD-Fc变体的纯化
表达的ACE2-ECD-Fc(野生型)或ACE2-vECD-Fc变体蛋白通过蛋白A亲和柱色谱(MabselectTM)从HEK293细胞培养收获物中纯化。
通过0.2µm注射器过滤器(Millipore)过滤培养上清液。为了从每个过滤培养物中纯化分泌的ACE2，分别使用HiTrapTM 1mL MabSelectTM蛋白A柱 (GE Health CareLifesciences, Marlborough, MA 01752)。当pH值达到3-4.0时，柱色谱图显示出从柱上洗脱的尖锐峰（图13（a））。通过BCA蛋白质测定法测定每种制剂的色谱蛋白质浓度，结果列于表6(Thermo scientific, Hayward, CA)。每个构建体的蛋白质大小如预期（图13（b））。
表6 - HEK 293细胞培养上清液中纯化的ACE2-ECD-Fc和ACE2-vECD-Fc蛋白的汇总
4. 实施例：ACE vECD-Fc融合蛋白的酶活性测定
亲和柱色谱纯化的ACE2-ECD-Fc融合蛋白变体的酶活性根据Fenxia Xiao和KevinB.Burns（参考：生物流体中血管紧张素转化酶2（ACE2）活性的测量，第8章，高血压：方法和方案，分子生物学中的方法，vol.1527，Rhian M.Touyz和Ernesto L.Schiffrin（编辑），DOI: 10.1007/978-1-4939-6625-7_8, © Springer Science+Business Media LLC2017）。测量的机制基于在ACE2特异性抑制剂MLN-4760（Merck Millipore CalbiochemTMACE2抑制剂, MLN-4760）存在或不存在的情况下，分子内淬灭的荧光ACE2底物的水解，其是IC50＝440 pM的高度有效的ACE2抑制。当使用野生型ACE2-ECD-Fc融合蛋白时，ACE2-ECD-Fc融合蛋白的特异性通过使用ACE2抑制剂MLN-4760抑制在滤波器对激发330nm和发射450nm处测量的荧光信号来确定。同时，当同时测试野生型和突变蛋白时，在存在和不存在ACE2抑制剂MLN-4760的情况下测试ACE2 ECD-Fc突变蛋白酶活性。
ACE2酶测定在酶测定缓冲液，50mM 2-（N-吗啉基）乙磺酸（MES）、300 mM NaCl, 10µM ZnCl2, pH 6.81中进行。ACE2荧光底物合成肽分子，Mca-Ala-Pro-Lys(Dnp)-OH(AnaSpec, cat. # 60757, San Jose, CA, USA)。将基质溶于1%NH4OH至15mM。以10µL每小瓶等分基质溶液，并在-80℃下储存。蛋白酶抑制剂N-乙基马来酰亚胺(NEM,(MilliporeSigma Cat. 34115-5GM, St Louis, MO, USA)在Milli Q水中为100mM，苯基甲基磺酰氟(PMSF)在100%乙醇中为100mM。ACE2抑制剂MLN-4760(MerckMilliporeCalbiochem, San Diego, CA, USA, Catalog Number: 530616)在Milli Q水中为10µM。根据下表7制备新鲜的测定缓冲液/基质混合物。
表7 - ACE2酶活性测定
在100µL的反应混合物中，加入70µL的测定缓冲液/底物混合物，因此最终浓度缓冲液成分为35 mM MES、210 mM NaCl、7µM ZnCl2。ACE2底物、蛋白酶抑制剂的最终浓度分别为10.5µM和0.7 mM。
野生型ACE2 ECD-Fc（AMI080）和五种突变ACE2 ECD-Fc蛋白（AMI081、AMI082、AMI1083、AMI084和AMI085）如上所述被纯化。
所述测定在96孔微量滴定板中进行。对于每种蛋白质，分别在500、100、20、10、5、2.5 ng/mL 3.13和1.56 nM的无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS, HyPureTM, GE Healthcare,Hyclone Laboratories, Logan, Utah)中稀释。取样方案如下表8所示。测定设置了两个空白对照孔。
表8 - 测定ACE2 ECD-Fc蛋白的浓度
在暗96孔板中进行反应，每种蛋白质重复测试。加入所有反应物和缓冲混合物后，充分混合，立即密封并用铝箔包裹。将该板置于摇动平台上，在环境温度下以140rpm缓慢摇动16-20小时。
用荧光计ƒmax (Molecular Device, Sunnyvale, CA, USA)读取板的相对荧光单位（RFU），激发波长为355nm，发射波长为460nm。数据是重复读数的平均值。以下是RFU对每个单独ACE2 ECD-Fc蛋白的蛋白浓度的制图。
如图14所示，野生型wtACE2 ECD-Fc具有酶活性，相对荧光单位（RFU）随着添加到反应中的蛋白质浓度而增加。在ACE2抑制剂MLN 4760的存在下，RFU显著降低。ACE2酶测定具有特异性，因为ACE2特异性抑制剂0.73µM可以抑制反应。它具有高度的重复性，批间CV为3.6%，批内CV为1-6%。锌结合基序中一个或多个氨基酸残基的突变耗尽ACE2酶活性。任何突变的ACE2-Fc都没有酶活性（载脂酶）。所有突变的ACE2-ECD-Fc蛋白均未产生显著的RFU，表明ACE2-vECD-Fc变体蛋白的酶活性因突变而丧失，或单个氨基酸残基AMI090仅E402Q的单个突变而耗尽，其催化活性损失超过99.9%。为了更好地了解每个ACE2-vECD-Fc蛋白的催化活性，酶反应结果分别显示在图15A、15B中，与酶活性的序列突变相关性显示在表9中。
表9 - 野生型和突变型Fc融合蛋白ACE2酶活性的结果汇总
数据显示，催化中心锌结合基序中任何可烧结残基的突变都会耗尽酶活性。
活性耗尽的ACE2-vECD在融合到Fc后不显示酶活性。
5. 实施例：通过酶联受体配体测定（ELRLA）将ACE2-ECD-Fc蛋白与冠状病毒的刺突蛋白结合
通过酶联受体配体测定（ELRLA）测定3种冠状病毒刺突蛋白与ACE2-ECD-Fc或ACE2-vECD-Fc的结合。
所有缓冲液均在无菌M.Q水或无菌PBS(Cat: SH30529.03, GE Healthcare LifeScience, Logan, Utah)中制备。一个96孔微孔板，每个微孔板用10 nM和20 nM的SARS-CoV-1、SARS-CoV-2或MERS-CoV刺突蛋白1（S1）在碳酸钠缓冲液(50 mM NaCO3, NaHCO3, pH9.6)中单独稀释，以50μL/孔涂布。S1蛋白购自Sino Biological (SARS-CoV-1 S1 cat#40150-V08B1, SARS-CoV-2 S1 cat# 40591-V08H, MERS-CoV S1 protein cat#: 40069-V08H, 中国北京)。将微孔板紧密密封并在2-8℃下孵育12小时，用磷酸盐缓冲盐水(10磷酸盐缓冲液, 150 mM NaCl, pH 7.2, 0.01% 吐温20, PBS-T)洗涤3次，并在37°C下用封闭缓冲液（PBST于1%BSA）封闭2小时。洗涤连续稀释的ACE2-ECD-Fc或ACE2-vECD-Fc变体蛋白后，以20nM、10nM、5nM、2.5nM、1.25nM、0.63nM和0.313nM浓度，以50μ/孔重复两次加入每孔中。将板密封并在37°C下孵育60分钟。用PBS-T洗涤板3次。将50μL/孔山羊抗人IgG Fc-生物素缀合物(Abcam cat. ab98618, Cambridge, MA)在PBS-T-0.5%（w/v）BSA中稀释至1:10000，然后在3℃下孵育60分钟。用PBS-T洗涤微孔板3次，然后以50μL/孔加入1:15000稀释的链霉亲和素-辣根过氧化物酶（HRP），并在37℃孵育60 min。用PBS-T洗涤微板3次，用PBS洗涤1次，以去除剩余的吐温20。在37°C下用100μL/孔的1-StepTMABTS底物(Thermo ScientificREF 37615, Rockford, CA)进行反应30分钟，并用50μL/孔2%（w/v）SDS停止反应。使用VERSAmax酶标仪(Molecular Device, Sunnyvale, CA)在405nm下读取板。结果如图16A所示。根据结合测定，SARS-CoV-2刺突蛋白与野生型AMI080（ACE2-ECD-Fc）和AMI082（ACE2-vCECD-Fc，H274A，E402Q）和AMI090（ACE2-vECD-Fc，E402Q）的变体结合，具有非常相似的结合谱（图16A），但亲和力和Ymax值发生了变化。
令人惊讶的是，MERS-CoV S1蛋白几乎不与野生型ACE2-ECD-Fc结合，但突变体AMI090和AMI082的结合亲和力比野生型增加了>200%和>150%（图16A）。
为了更清楚地证明单个ACE2-ECD-Fc或ACE2-vECD-Fc与SARS-CoV-1、SARS-CoV-2和MERS-CoV-S蛋白反应，按照程序准确地涂覆和分析了20nM的每个S1蛋白，每个构建蛋白与三种配体的反应性如图17A、17B所示。
基于结合了ELALA和酶分析数据，我们可以得出结论，通过保持与病毒刺突蛋白结合能力的突变体AMI082和AMI090可知，氨基酸H374和E402不影响SARS-CoV-1和SARS-CoV-2S1蛋白与其宿主细胞上的同源受体的结合。其他残基E375和H378对结合都很重要（图16A）。
至于MERS-CoV，H374A和E402Q的突变显著增强了病毒S1蛋白与ACE2-vECD-Fc（AMI090和AMI082）的结合，相比于它们的最大反应值（Ymax值），有分别约为500和800%的增强。AMI083也显示出约200%的结合增加，而其他突变几乎没有显示出与ACE2的结合。因此，我们预测突变体ACE2-vECD-Fc（AMI090和AMI082）也可以用于阻断MERS-CoV感染。
从上述数据中，我们发现了氨基酸残基、ACE2催化活性和冠状病毒结合特性之间的关系。我们总结了表10中的结果。
表10 - 野生型和突变型Fc融合蛋白的ACE2酶和冠状病毒S1蛋白结合的结果汇总
结合亲和力根据Hill方程(Mohameedyaseen Syedbasha等人，J. Visual. Exp.2016,1109: 4-10)进行估计，其与SARS-COV-2 S1和SARS-COV-1 S1蛋白的结合结果分别显示在表11和表12中。
表11 - vACE2-Fc与SARS-COV-2 S1蛋白的结合亲和力
df* 变体ACE2-Fc与野生型ACE2-Fc的KD差异
变体ACE2-Fc AMI082和AMI090在与SARS-COV-2 S1蛋白结合方面显示出比野生型ACE2-Fc-AMI080蛋白高约30-50倍的亲和力（表11）。结合亲和力的增加可能意味着ACE-2和SARS-COV-2病毒颗粒之间的相互作用更紧密。
同时，还使用相同的测定程序评估了ACE2-Fc变体与SARS-COV-1 S1蛋白的结合。结果显示AMI082和AMI090的结合亲和力比野生型ACE2-Fc提高了13倍（表12）。
表12 - vACE2-Fc与SARS-COV-1 S1蛋白的结合亲和力
df* 变体ACE2-Fc与野生型ACE2-Fc的KD差异
为了进一步确定所述ACE-Fc变体蛋白与SARS-COV-2变体的结合亲和力，SARS-COV-2 B117（N501Y）(Sino biologics cat #: 40592-V08H82)的病毒受体结合域（RBD）的纯化蛋白。用10nM的vAC2-Fc蛋白包被平板，以0.01, 0.04, 0.13, 0.40, 1.27, 4.07,13.02, 39.01, 125和400nM的浓度重复测试SARS-COV-2 B117（N501Y）RBD蛋白。结合亲和力根据Hill方程(Mohameedyaseen Syedbasha等人，J. Visual. Exp. 2016,1109: 4-10)进行估计，结果如图16B和表13所示。在所述ACE2-Fc变体蛋白中，AMI090、AMI126和AMI133具有非常相似的KD，<1nM。AMI090的Ymax值最高（图16B）。
表13 - vACE2-Fc与SARS-COV-2 B117（N501Y）S1受体结合域（RBD）的结合亲和力
在定性结合实验中，评估ACE2-Fc变体AMI080、AMI082和AMI090与各种SARS-COV-2突变体的结合。在实验中清楚地表明，E484K变体对ACE2-Fc蛋白的反应比其他变体强烈（表14）。
表14 - ACE2-Fc蛋白与各种SARS-COV刺突蛋白结合的定性分析
6. 实施例：通过表面等离子共振（SPR）使冠状病毒刺突蛋白结合病毒抗原
为了测定野生型ACE2-ECD-Fc和突变蛋白对冠状病毒刺突1蛋白的结合能力，采用了表面等离子体共振（SPR）方法。在含有0.01%吐温20（PBS-T）的磷酸盐缓冲盐水中，野生型ACE2-ECD-Fc或突变体ACE2-vECD-Fc（AMI084）以5µg/mL的浓度与传感器芯片蛋白A(GEHealthcare，现为Cytiva, cat 29-1275-57, Uppsala, Sweden)结合。SARS-CoV-2的S1蛋白，ACE2-ECD-Fc蛋白能够通过IgG1-Fc区与芯片上的蛋白配体结合。SARS-CoV-1和MERS-CoV从Sino-biologicals（中国北京）获得。S1蛋白在PBS-T中稀释至最终浓度200、100、50、25、12.5、6.25、3.13和1.56nM。该程序使用BiaCore 3000仪器作为结合动力学进行操作。观察到的表观结合亲和力表明，重组野生型ACE2-ECD-Fc和突变ACE2-vECD-Fc能够分别与SARS-Cov-2、SARS-Cov-1和MERS-Cov的S1蛋白结合。在ACE2催化中心具有3个氨基酸突变的AMI084将显示与野生型ACE2 ECD-Fc蛋白相似的结合谱。突变较少的蛋白质制剂也被认为能够与所述冠状病毒的S1蛋白结合。
结果：由BiaCore 3000测定，纯化的ACE2-Fc蛋白制剂与的SARS-CoV-2的刺突蛋白S1结合（图18）。纯化的变体ACE2-vECD-Fc蛋白仍在测定中。AMI080与野生型ACE2-Fc的结合亲和力（KD）为16.81nM，而变体ACE2-Fc蛋白AMI090为0.49nM，Biacore分析表明结合增加。
7. 实施例：SARS-Cov-2伪病毒颗粒的体外中和
使用SARS-CoV-2假病毒进行体外病毒中和筛选实验，当其结合人ACE2（hACE2）蛋白时，SARS-CoV-2 S1慢病毒载体表达绿色荧光蛋白（GFP），稳定转染的HEK293细胞表面上的SARS-CoV-1受体（293T-hACE2）。这是一种评估病毒化合物、抗体或可溶性受体的安全和特异性筛选方法。
简要地，每孔1.5x104的293T-hACE2细胞（CMV-hACE2）种于明胶涂层的96孔板，并在37℃、5%CO2和95%湿度下培养过夜。ACE2-ECD-Fc或ACE2-vECD-Fc变体蛋白在PBS中分别以20, 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625和0.313µg/mL的浓度在单独的96孔“设置”板中以1:2系列稀释，每个样品进行重复测试。将假病毒原液稀释成每毫升约100万个感染形成单位（IFU）（106 IFU/mL）。将稀释的60µL假病毒溶液添加到所有含有ACE2变体蛋白的孔和假病毒加细胞对照孔中。将平板充分混合并在37°C下培养1小时。小心地将含有抗体和病毒稀释液的设置板各孔中的100µL混合物添加到孔中，以替换HEK293T-hACE2细胞板相应孔中的培养基。最终Trans plus™ 根据供应商手册，将(Alstem, Cat# V050, Richmond, CA)添加至各孔中使最终浓度为1X。将平板在37°C下孵育48-60小时，读取荧光读数。对每个孔中的荧光焦点进行计数。
该实验的结果是，293T-hACE2细胞在不存在阻断剂或中和剂的情况下显示出绿色荧光灶（GFF），当存在特异性中和剂时则没有显示GFF（图19）。SARS-CoV-2包膜病毒的中和结果如图20和图20所示[1] 。ACE2-ECD-Fc、ACE2-vECD-Fc（AMI082）和ACE2-vECD-Fc（AMI090）的50%中和浓度估计分别约为5µg/mL。其他三种构建体，ACE2-vECD-Fc（AMI081）、ACE2-vECD-Fc（AM I083）和ACE2-vECD-Fc（AMI084）约为10µg/mL（图20）。
8. 实施例：通过TCID50测定的体外SARS-CoV-2中和效力
毒力中和实验在南方研究所(2000 Ninth Avenue South, Birmingham, Alabama35205)进行。选择的野生型ACE2-ECD-Fc（AMI080）或vACE2-ECD-Fc变体蛋白（AMI082和AMI090）中和SARS-CoV-2，使用Vero6细胞培养物感染的SARS-CoV-2强毒株（毒株名称：USA-WA1/2020, SARS-CoV-2）。
蛋白质、基因质粒DNA，编码野生型ACE2-ECD-Fc（AMI080）、ACE2-vECD-Fc（AMI082）和vACE2-ECD-Fc（AMI090），通过分别用AMI080、AMI082和AMI090质粒DNA制备物转染HEK293细胞的单层培养物。表15总结了蛋白质制剂。
表15
名称 长度(aa) 浓度, mg/mL 摩尔浓度 (µM) 缓冲液
AMI080 949 0.87 3.99 PBS, pH 7.0-7.2
AMI082 949 1.20 5.51 PBS, pH 7.0-7.2
AMI090 949 1.20 5.50 PBS, pH 7.0-7.2
SARS-COV-2冠状病毒细胞病变效应（CPE）减少实验（中和）的实验程序如下所述。
第一步是稀释ACE2-Fc蛋白。将在PBS中连续稀释的AMI080、AMI02和AMI090分别转移到空ECHO板（储备板）的孔中。将40µL的每个储备样品转移到含有40µL PBS的相邻孔中并混合，使ACE2-Fc蛋白稀释2倍。重复该过程以产生8个连续稀释的样品孔，每个孔含有前一个孔稀释3倍样品。使用ECHO555声学液体处理系统将每个样品的90nL等分试样分配到相应的分析准备板孔中。3倍连续稀释时，最终测定浓度范围为200至0.01µg/mL。将PBS添加到对照孔中，以使所有孔中测定浓度于0.3%保持一致。
第二步是测定化合物的抗病毒作用：
Vero E6细胞在补充10%HI FBS的MEM中生长，并在测定当天在于2%HI FBS、1%Pen/Strep的MEM中收获。在BSL-2实验室中，通过向每个孔中加入5μL测定培养液，制备预给药的实验化合物AMI080、AMI082和AMI00的测定准备板。然后将平板和细胞送入BSL-3设施。用SARS-CoV-2（USA_WA1/2020; M.O.I.~0.002）批量接种细胞，使得感染后72小时约5%的细胞存活率。将25μL的病毒接种细胞等分试样（4000 Vero E6细胞/孔）添加到测定板第3-24列的每个孔中。23-24列中的孔仅包含用于0%CPE减少对照的病毒感染细胞。在病毒接种之前，将25μL的细胞等分试样添加到每个平板的第1-2列，用于细胞仅100%CPE减少对照。在37°C/5%CO2和90%湿度下孵育板72小时后，向每个孔中加入30μL Cell Titer Glo（Promega），并在室温下孵育10分钟后，使用BMG CLARIOstar酶标仪读取发光，以测量细胞活力。在发光读数之前，用透明盖密封板并对其表面进行净化。为了获得中和实验的信心，几种小病毒抑制
测定ACE2-Fc蛋白制剂的细胞毒性作用的方法
在BSL-2计数器屏幕中评估ACE2-Fc蛋白、AMI080、AMI082和AMI090的细胞毒性，如下所示：将培养基中的宿主细胞以25μl等分试样（4000个细胞/孔）的形式添加到用上述测试蛋白制备的分析准备板的每个孔中。仅细胞（100%活力）和用100µM最终浓度的透明胺处理的细胞（0%活力）分别作为高和低信号对照，用于测定细胞毒性效应。PBS在所有孔中保持恒定浓度，这取决于所述蛋白质浓度的储备稀释因子。在37°C/5%CO2和90%湿度下培养板72小时后，向每个孔中加入30μl Cell Titer Glo（Promega）。在室温下孵育10分钟后，使用BMG PHERAstar酶标仪读取发光以测量细胞活力。
数据分析
对于所有分析，来自板读数器的原始数据被导入ActivityBase，其中的数值匹配化合物ID和测试浓度。
对于抗病毒CPE减少测定，原始信号值通过以下公式转换为CPE减少百分比：
%CPE减少=100 x（测试蛋白值–平均值感染细胞对照）/（平均值未感染细胞对照–平均值受感染细胞对照组）。
对于测量化合物细胞毒性的细胞活力测定，细胞活力%计算如下：
%活力=100*（测试蛋白值-平均低信号对照）/（平均高信号对照-平均低信号对照）。
使用ActivityBase的Xlfit模块，根据数据的四参数逻辑拟合计算50%的病毒感染抑制浓度（IC50）和50%的细胞毒性浓度（CC50），顶部和底部分别限制为100%和0%。SARS-COV-2（USA-WA1/2020）的分析数据如图21所示，这表明野生型和酶去耦的ACE2-Fc变体AMI082和AMI090实现了SARS-CO-2（USA-WA1-2020）的有效中和。
ACE2-Fc蛋白AMI080、AMI082和AMI090的IC50分别为5.55、5.43和5.33µg/mL。三种构建体没有观察到显著差异，认为变体ACE2-Fc AMI082和AMI090显示S1蛋白受体结合测定的亲和力（KD）增加30-50倍。
9. 实施例：使用腺相关病毒载体（AAV）生产ACE2-ECD-Fc和ACE2-vECD-Fc的递送载体
在本发明中选择AAV5是因为AAV5能够转导气道上皮细胞，AAV3通过使用鼻窦、鼻腔和/或肺部输送方法，还可以根据待递送的靶组织或细胞使用AAV的其他血清型。可使用几种动物，包括大鼠、猫、豚鼠、仓鼠、小鼠、水貂、绵羊和兔子。
AAV6倾向于优先转导肺细胞。对于这个测试，我们从AAV5开始生产用于递送目的的载体。
SF9衍生的昆虫细胞系V432A细胞在康宁储存瓶中，在28℃下，在ESF AF培养基（表达系统）中培养，该培养基补充了100单位/ml青霉素和100g/ml链霉素(Corning)。一旦细胞密度达到7 x 106个细胞/ml，将细胞以1:4的比例传代以进行维持。
根据Invitrogen的方案(Carlsbad, CA)产生重组杆状病毒（rBVs）。简言之，将构建的质粒用于转化DH10Bac，并分离重组bacmid DNA。将bacmid DNA转染V432A细胞以产生rBVs。rBVs用QPCR法定量。
AAV载体生产、纯化和定量 - V432A细胞培养至7 x 106细胞/ml，并用新鲜ESF AF培养液1:1稀释。分别加入约200个病毒/含有指定rep-cap基因的rBV细胞和100个病毒/含有编码ACE2-ECD-Fc或ACE2-vECD-Fc变体蛋白质的DNA序列的rBV细胞，以在摇床培养箱中于28℃下感染V432A细胞3天。通过以3000rpm离心10分钟收获感染的V432A细胞。在SF9裂解缓冲液（50mM Tris-HCl，pH7.8，50mM NaCl，2mM MgCl2，1%Sarkosyl，1%Triton X-100，和140单位/ml苯并酶®，Millipore，Burlington，MA）中裂解细胞团块。通过在37℃孵育1小时来消化基因组DNA。在温育结束时，加入氯化钠以将裂解物的盐浓度调节至约1M，以进一步将AAV载体与细胞基质分离。通过以8000rpm离心30分钟去除细胞碎片。将清除的裂解物加载到CsCl梯度上，并在旋转斗转子中以28000rpm超速离心20小时。将病毒带通过带有18号针的注射器抽取，并装载到第二个CsCl上，以65000rpm进行线性超速离心20小时。
然后绘制病毒带并通过两个PD-10脱盐柱（GE HealthCare）以去除CsCl和洗涤剂，同时换至缓冲液B（1xPBS、0.1M柠檬酸钠和0.001%pluronic F-68）。使用ITR引物和探针进行定量实时PCR（qPCR）以确定AAV载体基因组拷贝数，如下所示：
ITR-QPCR-F: 5’-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3’ (SEQ ID NO: 61)
ITR-QPCR-R: 5’- CGGCCTCAGTGAGCGA-3’ (SEQ ID NO: 62)
ITR-FAM-2ITR-MGB: 5’- CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-3’ (SEQ ID NO: 63)
SDS-PAGE和SimplyBlue染色以验证AAV载体的纯度 - 将AAV5载体与SDS-PAGE加载缓冲液（Invitrogen）混合，并在95℃下加热5分钟。然后将载体加载到10%的SDS-PAGE凝胶上，并在100伏下运行，直到染料到达凝胶底部。根据制造商的方案（Invitrogen）对凝胶进行染色。
在实验中，AAV5-ACE2-ECD-Fc或AAV5-ACE 2-vECD-Fc变体载体单独生产和纯化。用选自上述ITR序列的引物对和探针测定每个AAV5-ACE2-ECD-Fc或AAV5-ACE 2-vECD-Fc变体载体的滴度。所述AAV载体的滴度、生产力和蛋白质水平如表16所示。
表16 - ITR-QPCR测定的AAV载体产量
AAV5载体的SDS-PAGE和SimplyBlue染色
AAV载体的纯度通过SimplyBlue染色法测定。简言之，将26µl AAV样品与10µl的4x加载缓冲液加上4µl 10x还原试剂（Invitrogen）混合，并在95ºC下孵育2分钟。如图22所示，上样约1E +11 vg的每种AAV样品。获得了具有预期的VP1、VP2和VP3组分水平的典型凝胶模式（图22）。
重组AAV5载体表达ACE2-ECD-Fc和ACE2-vECD-Fc
使用HEK293细胞进一步评估表11所列AAV5载体的每种构建蛋白的产生。将HEK293细胞以1.5e+5个细胞/孔接种在24孔板中，并在含有10%FBS的0.5mL DMEM中培养过夜。次日早上，用无血清DMEM冲洗细胞，并用不同滴度的AAV5-ACE2载体在0.5mL无血清DMEM与20µM依托泊苷中转导。隔夜转导后，移除接种物并用含有10%FBS的0.5mL/孔DMEM代替。转导总共72小时后，收集细胞培养基，添加蛋白酶抑制剂，并在使用前于≤-65ºC下储存。
表达的ACE2 vECD Fc或ACE2 v-ECD Fc变体
将从质粒转染48小时或从AAV5-ACE2转导72小时收集的HEK293细胞培养基（上清液）用于Western Blot分析。将总体积为30μl的细胞上清液与10ul的4x加载缓冲液混合，并加载到NuPAGE 10%三甘氨酸胶（Invitrogen）上进行电泳。随后使用X Cell II™印迹模块(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)将蛋白质转移到PVDF膜上。在室温下用PBS(ThermoScientific, Waltham, MA, USA)中的酪蛋白阻断剂处理膜至少一小时，并用与生物素缀合的山羊抗人IgG Fc抗体(Abcam, Cambridge, UK)探测，然后与辣根过氧化物酶(Abcam)缀合的链霉亲和素孵育。使用ECL™ Western Blot试剂盒(Amersham)检测蛋白质，并用iBrightTM CL1500成像系统(Invitrogen)记录的图像。
Western Blot图像显示，使用非还原性胶，检测到每个构建体约250kDa的单个且清晰的条带，表明vACE2-Fc构建体由用AAV5-ACE2-Fc病毒载体转导的HEK293细胞表达。此外，每道中都有一小部分较小的蛋白质，约10-30%，表明较小的蛋白质是非糖基化的（图23）。
抗冠状病毒的紧急治疗
在紧急情况下使用重组ACE2-ECD-Fc或ACE2-vECD-Fc蛋白治疗冠状病毒感染。
ACE2-ECD-Fc或ACE2-vECD-Fc的组合物通过重组技术的生产工艺制造。所述病毒包括但不限于β组冠状病毒，包括严重呼吸道综合征（SARS）冠状病毒（SARS-CoV-1）、中东呼吸综合征（MERS）冠状病毒（MERS-CoV），以及最近世界大流行性新冠肺炎（CoVID-19）、SARS-CoV-2和低致病性的HCoV-NL63。
、SARS-CoV-2、MERS-CoV和HCoV-NL63等通用疫苗
通过注射单剂量AAV5-ACE2-vECD-Fc载体产品预防冠状病毒感染，该载体产品转导多种类型的非免疫细胞，并在体内产生足够水平的ACE2-vECD-Fc蛋白。
一旦病毒颗粒进入体内，ACE2-vECD-Fc起中和抗体的作用，与病毒结合形成ACE2-vECD-Fc-SARS-CoV-2复合物，该复合物可被惰性和活性免疫细胞消除。这对免疫功能低下的老年人尤其有价值，抗体无法得到增强，当灭活病毒疫苗、RNA疫苗、cDNA疫苗和重组疫苗仍在行业中开发时。
AAV可以在保护水平下产生ACE2-vECD-Fc多年。所述方法优于正在开发的任何一种疫苗。
ACE2-vECD-Fc DNA可克隆到蛋白质表达质粒中，用于转染哺乳动物细胞系、酵母或其他真真菌表达系统。所得细胞系可用于通过大规模发酵和一系列纯化工艺步骤生产ACE2-vECD-Fc蛋白产物。本产品用于紧急治疗SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS-CoV-11或HCoV-NL63感染引起的病毒感染，可能会导致未来新出现的冠状病毒使用相同的受体进入。此外，病毒：ACE2-vECD-Fc可以通过具有IgG1受体的细胞调节的免疫应答途径清除，并最终终止病毒复制周期。
将选择的替代突变体克隆到腺相关病毒（AAV）包装质粒中。携带感兴趣基因（GOI）ACE2-vECD-Fc的AAV被称为AAV5-ACE2-vECD-Fc，用于治疗和预防冠状病毒感染。
除非另有说明，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。除非上下文另有明确规定，否则单数术语“一个”、“一些”、“其”、“所述的”包括复数含义。“包含A或B”是指包括A、B或A和B。还应理解，核酸或多肽的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子量值都是近似值，并提供用于描述。与本文所述方法和材料类似或等效的方法和材料可用于本申请的实践或测试，本发明描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用全部并入本文。如有冲突，以本说明书（包括术语解释）为准。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的，并不旨在限制本发明。
鉴于可以应用本申请发明的原理的许多可能的实施例，应当认识到，所示的实施例仅仅是本发明的优选示例，不应当被视为限制本发明的范围。相反，本发明的范围由以下权利要求限定。因此，我们要求将落入这些权利要求的范围和思想内的所有内容作为我们的发明。
序列表
SEQ ID NO: 1. 人ACE2氨基酸序列的胞外结构域（ECD）
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SEQ ID NO: 10 ctkvtmddfl tahAQmghiq ydmayaaqpf llrnganegf hQavgeimsl
SEQ ID NO: 11 ctkvtmddfl tahhQmgAiq ydmayaaqpf llrnganegf hQavgeimsl
SEQ ID NO: 12 ctkvtmddfl tahAQmgAiq ydmayaaqpf llrnganegf hQavgeimsl
SEQ ID NO: 13 ctkvtmddfl tahAQmghiq ydmayaaqpf llrnganegf heavgeimsl
SEQ ID NO: 14 ctkvtmddfl tahhQmgAiq ydmayaaqpf llrnganegf heavgeimsl
SEQ ID NO: 15 ctkvtmddfl tahAQmgAiq ydmayaaqpf llrnganegf heavgeimsl
SEQ ID NO: 16 AMI074/G466D
CTKVTMDDFLTAHHEMGHIQYDMAYAAQPFLLRNGANEGFHEAVGEIMSL
SEQ ID NO: 17 AMI081
CTKVTMDDFLTAHHEMGHIQYDMAYAAQPFLLRNGANEGFHQAVGEIMSL
SAATPKHLKSIGLLSPDFQEDNETEINFLLKQALTIVGTLPFTYMLEKWRWMVFKD
SEQ ID NO: 18 AMI083
CTKVTMDDFLTAHHQMGHIQYDMAYAAQPFLLRNGANEGFHQAVGEIMSL
SEQ ID NO: 19 AMI085
CTKVTMDDFLTAHAQMGHIQYDMAYAAQPFLLRNGANEGFHEAVGEIMSL
SEQ ID NO: 20 AMI121
CTKVTMDDFLTAHAEMGRIQYDMAYVAQPFLLRNGANEGFHQAVGEIMSL
SEQ ID NO: 21 AMI122
CTKVTMDDFLTAHAEMGRIQYDMAYVAQPFLLRNGANEGFHQAVGEIMSL
SEQ ID NO: 22 AMI123
CTKVTMDDFLTAHAEMGHIQYDMAYALQPFLLRNGANEGFHQAVGEIMSL
SEQ ID NO: 23 AMI124
CTKVTMDDFLTAHAEMGRIQYDMAYALQPFLLRNGANEGFHQAVGEIMSL
SEQ ID NO: 24 AMI125
CTKVTMDDFLTAHAEMGAIQYDMAYALQPFLLRNGANEGFHQAVGEIMSL
SEQ ID NO: 25 AMI126
CTKVTMDDFLTAHAEMGRIQYDMAYALQPFLLRNGANEGFHQAVGEIMSL
SEQ ID NO: 26 AMI127
CTKVTMDDFLTAHLEMGHIQYDMAYALQPFLLRNGANEGFHQAVGEIMSL
SEQ ID NO: 27 AMI128
CTKVTMDDFLTAHAEMGHIQYDMAYALQPFLLRNGANEGFHQAVGEIMSL
SEQ ID NO: 28 AMI129
CTKVTMDDFLTAHLEMGRIQYDMAYALQPFLLRNGANEGFHQAVGEIMSL
SEQ ID NO: 29
ACE2-ECD-Fc (野生型)
18 qst ieeqaktfld kfnheaedlf yqsslaswny ntniteenvq
61 nmnnagdkwsaflkeqstlaqmyplqeiqnltvklqlqalqqngssvlse dkskrlntil
121 ntmstiystg kvcnpdnpqe clllepglne imansldyne rlwaweswrs evgkqlrply
181 eeyvvlknem aranhyedyg dywrgdyevn gvdgydysrg qliedvehtf eeikplyehl
241 hayvraklmn aypsyispig clpahllgdm wgrfwtnlys ltvpfgqkpn idvtdamvdq
301 awdaqrifke aekffvsvgl pnmtqgfwen smltdpgnvq kavchptawd lgkgdfrilm
361 ctkvtmddfl tahhemghiq ydmayaaqpf llrnganegf heavgeimsl saatpkhlks
421 igllspdfqe dneteinfll kqaltivgtl pftymlekwr wmvfkgeipk dqwmkkwwem
481 kreivgvvep vphdetycdp aslfhvsndy sfiryytrtl yqfqfqealc qaakhegplh
541 kcdisnstea gqklfnmlrl gksepwtlal envvgaknmn vrpllnyfep lftwlkdqnk
601 nsfvgwstdw spyadqsikv rislksalgd kayewndnem ylfrssvaya mrqyflkvkn
661 qmilfgeedv rvanlkpris fnffvtapkn vsdiiprtev ekairmsrsr indafrlndn
721 sleflgiqpt lgppnqppvs dkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisr tpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmh
SEQ ID NO: 33 A024 ATCCAGCCTCCGGACTCTAGAGTTAACTGGTAAGTTTAGT
SEQ ID NO: 34 A056
GTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGCCGCCACCatgGAGTTCGGCCTGAGCTGGCTGTTCCT
SEQ ID NO: 35 A074 AACAGCTATGACCATG
SEQ ID NO: 36 A098
ATGTACGGGCCAGATATACGCGTTCGTTACATAACTTACGGTAAA
SEQ ID NO: 37 A120 TGATTATTGACTAGTATCTGCGTTACATAACTTACGGTAA
SEQ ID NO: 38 A121 ACTCcatGGTGGCGGCAGGCCTAGAAGTAAAGGCAACATC
SEQ ID NO: 39 A122 ATAAAGATATTTTATTTTCGAATTCTCAGC
SEQ ID NO: 40 A123 CTGTTCTACCAGAGCAGCCTGGCCA
SEQ ID NO: 41 A124 CTGGGAGAACAGCATGCTGACCGAC
SEQ ID NO: 42 A125 AGAGCATCAAGGTGAGAATCAGCCT
SEQ ID NO: 43 A126 CGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAG
SEQ ID NO: 44 A145 TCGTGGGGCACGGGCTCCACCACGC
SEQ ID NO: 45 A146 GCGTGGTGGAGCCCGTGCCCCACGA
SEQ ID NO: 46 A147 TGGGGGGGAACAGGAACACGCTGGG
SEQ ID NO: 47 A148 GCGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCC
SEQ ID NO: 48 A156 GAATCCTGATGTGCACCAAGGTGACCATGGACGACTTCC
SEQ ID NO: 49 A157 GGTGACCATGGACGACTTCCTGACCGCCCACGCCGAGATGGGCCACATC
SEQ ID NO: 50 A158 GCATGTTGAACAGCTTCT
SEQ ID NO: 51 A159 GACCATGGACGACTTCCTGACCGCCCACCACCAGATGGGCCACATCCAG
SEQ ID NO: 52 A160 GACCATGGACGACTTCCTGACCGCCCACGCCCAGATGGGCCACATCCAG
SEQ ID NO: 53 A161 CGCCAAGCTCTAGCTAGAGGTCGACGCGGCCGCTCGGTCCGCAC
SEQ ID NO: 54 A162 TTCCTGCTGAGAAACGGCGCCAACGAGGGCTTCCACcAGGCCGTGGGCG
SEQ ID NO: 55 A163 GGGGTCTCACGTTCATGTTC
SEQ ID NO: 56 A169 GAGATGGATGGTGTTCAAGGGCGAGATCCCCAAGGACCAG
SEQ ID NO: 57 A170 CTGGTCCTTGGGGATCTCGCCCTTGAACACCATCCATC
SEQ ID NO: 58 A385 CCGAAGGGCACGGTCAGGCTGTACA
SEQ ID NO: 59 A386 TGTACAGCCTGACCGTGCCCTTCGG
ITR-QPCR-F: 5’-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3’(SEQ ID NO: 61)
ITR-QPCR-R: 5’- CGGCCTCAGTGAGCGA-3’(SEQ ID NO: 62)
ITR-FAM-2ITR-MGB: 5’- CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-3’(SEQ ID NO: 63)
附件：每个ACE2-ECD-Fc或ACE2-vECD-Fc变体的完整DNA序列
SEQ ID NO: 64 AMI074
CAGAGCACCATCGAGGAGCAGGCCAAGACCTTCCTGGACAAGTTCAACCACGAGGCCGAGGACCTGTTCTACCAGAGCAGCCTGGCCAGCTGGAACTACAACACCAACATCACCGAGGAGAACGTGCAGAACATGAACAACGCCGGCGACAAGTGGAGCGCCTTCCTGAAGGAGCAGAGCACCCTGGCCCAGATGTACCCCCTGCAGGAGATCCAGAACCTGACCGTGAAGCTGCAGCTGCAGGCCCTGCAGCAGAACGGCAGCAGCGTGCTGAGCGAGGACAAGAGCAAGAGACTGAACACCATCCTGAACACCATGAGCACCATCTACAGCACCGGCAAGGTGTGCAACCCCGACAACCCCCAGGAGTGCCTGCTGCTGGAGCCCGGCCTGAACGAGATCATGGCCAACAGCCTGGACTACAACGAGAGACTGTGGGCCTGGGAGAGCTGGAGAAGCGAGGTGGGCAAGCAGCTGAGACCCCTGTACGAGGAGTACGTGGTGCTGAAGAACGAGATGGCCAGAGCCAACCACTACGAGGACTACGGCGACTACTGGAGAGGCGACTACGAGGTGAACGGCGTGGACGGCTACGACTACAGCAGAGGCCAGCTGATCGAGGACGTGGAGCACACCTTCGAGGAGATCAAGCCCCTGTACGAGCACCTGCACGCCTACGTGAGAGCCAAGCTGATGAACGCCTACCCCAGCTACATCAGCCCCATCGGCTGCCTGCCCGCCCACCTGCTGGGCGACATGTGGGGCAGATTCTGGACCAACCTGTACAGCCTGACCGTGCCCTTCGGCCAGAAGCCCAACATCGACGTGACCGACGCCATGGTGGACCAGGCCTGGGACGCCCAGAGAATCTTCAAGGAGGCCGAGAAGTTCTTCGTGAGCGTGGGCCTGCCCAACATGACCCAGGGCTTCTGGGAGAACAGCATGCTGACCGACCCCGGCAACGTGCAGAAGGCCGTGTGCCACCCCACCGCCTGGGACCTGGGCAAGGGCGACTTCAGAATCCTGATGTGCACCAAGGTGACCATGGACGACTTCCTGACCGCCCACCACGAGATGGGCCACATCCAGTACGACATGGCCTACGCCGCCCAGCCCTTCCTGCTGAGAAACGGCGCCAACGAGGGCTTCCACGAGGCCGTGGGCGAGATCATGAGCCTGAGCGCCGCCACCCCCAAGCACCTGAAGAGCATCGGCCTGCTGAGCCCCGACTTCCAGGAGGACAACGAGACCGAGATCAACTTCCTGCTGAAGCAGGCCCTGACCATCGTGGGCACCCTGCCCTTCACCTACATGCTGGAGAAGTGGAGATGGATGGTGTTCAAGGaCGAGATCCCCAAGGACCAGTGGATGAAGAAGTGGTGGGAGATGAAGAGAGAGATCGTGGGCGTGGTGGAGCCCGTGCCCCACGACGAGACCTACTGCGACCCCGCCAGCCTGTTCCACGTGAGCAACGACTACAGCTTCATCAGATACTACACCAGAACCCTGTACCAGTTCCAGTTCCAGGAGGCCCTGTGCCAGGCCGCCAAGCACGAGGGCCCCCTGCACAAGTGCGACATCAGCAACAGCACCGAGGCCGGCCAGAAGCTGTTCAACATGCTGAGACTGGGCAAGAGCGAGCCCTGGACCCTGGCCCTGGAGAACGTGGTGGGCGCCAAGAACATGAACGTGAGACCCCTGCTGAACTACTTCGAGCCCCTGTTCACCTGGCTGAAGGACCAGAACAAGAACAGCTTCGTGGGCTGGAGCACCGACTGGAGCCCCTACGCCGACCAGAGCATCAAGGTGAGAATCAGCCTGAAGAGCGCCCTGGGCGACAAGGCCTACGAGTGGAACGACAACGAGATGTACCTGTTCAGAAGCAGCGTGGCCTACGCCATGAGACAGTACTTCCTGAAGGTGAAGAACCAGATGATCCTGTTCGGCGAGGAGGACGTGAGAGTGGCCAACCTGAAGCCCAGAATCAGCTTCAACTTCTTCGTGACCGCCCCCAAGAACGTGAGCGACATCATCCCCAGAACCGAGGTGGAGAAGGCCATCAGAATGAGCAGAAGCAGAATCAACGACGCCTTCAGACTGAACGACAACAGCCTGGAGTTCCTGGGCATCCAGCCCACCCTGGGCCCCCCCAACCAGCCCCCCGTGAGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCAGAGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCCCGGCTGA
SEQ ID NO: 65 AMI080
CAGAGCACCATCGAGGAGCAGGCCAAGACCTTCCTGGACAAGTTCAACCACGAGGCCGAGGACCTGTTCTACCAGAGCAGCCTGGCCAGCTGGAACTACAACACCAACATCACCGAGGAGAACGTGCAGAACATGAACAACGCCGGCGACAAGTGGAGCGCCTTCCTGAAGGAGCAGAGCACCCTGGCCCAGATGTACCCCCTGCAGGAGATCCAGAACCTGACCGTGAAGCTGCAGCTGCAGGCCCTGCAGCAGAACGGCAGCAGCGTGCTGAGCGAGGACAAGAGCAAGAGACTGAACACCATCCTGAACACCATGAGCACCATCTACAGCACCGGCAAGGTGTGCAACCCCGACAACCCCCAGGAGTGCCTGCTGCTGGAGCCCGGCCTGAACGAGATCATGGCCAACAGCCTGGACTACAACGAGAGACTGTGGGCCTGGGAGAGCTGGAGAAGCGAGGTGGGCAAGCAGCTGAGACCCCTGTACGAGGAGTACGTGGTGCTGAAGAACGAGATGGCCAGAGCCAACCACTACGAGGACTACGGCGACTACTGGAGAGGCGACTACGAGGTGAACGGCGTGGACGGCTACGACTACAGCAGAGGCCAGCTGATCGAGGACGTGGAGCACACCTTCGAGGAGATCAAGCCCCTGTACGAGCACCTGCACGCCTACGTGAGAGCCAAGCTGATGAACGCCTACCCCAGCTACATCAGCCCCATCGGCTGCCTGCCCGCCCACCTGCTGGGCGACATGTGGGGCAGATTCTGGACCAACCTGTACAGCCTGACCGTGCCCTTCGGCCAGAAGCCCAACATCGACGTGACCGACGCCATGGTGGACCAGGCCTGGGACGCCCAGAGAATCTTCAAGGAGGCCGAGAAGTTCTTCGTGAGCGTGGGCCTGCCCAACATGACCCAGGGCTTCTGGGAGAACAGCATGCTGACCGACCCCGGCAACGTGCAGAAGGCCGTGTGCCACCCCACCGCCTGGGACCTGGGCAAGGGCGACTTCAGAATCCTGATGTGCACCAAGGTGACCATGGACGACTTCCTGACCGCCCACCACGAGATGGGCCACATCCAGTACGACATGGCCTACGCCGCCCAGCCCTTCCTGCTGAGAAACGGCGCCAACGAGGGCTTCCACGAGGCCGTGGGCGAGATCATGAGCCTGAGCGCCGCCACCCCCAAGCACCTGAAGAGCATCGGCCTGCTGAGCCCCGACTTCCAGGAGGACAACGAGACCGAGATCAACTTCCTGCTGAAGCAGGCCCTGACCATCGTGGGCACCCTGCCCTTCACCTACATGCTGGAGAAGTGGAGATGGATGGTGTTCAAGGGCGAGATCCCCAAGGACCAGTGGATGAAGAAGTGGTGGGAGATGAAGAGAGAGATCGTGGGCGTGGTGGAGCCCGTGCCCCACGACGAGACCTACTGCGACCCCGCCAGCCTGTTCCACGTGAGCAACGACTACAGCTTCATCAGATACTACACCAGAACCCTGTACCAGTTCCAGTTCCAGGAGGCCCTGTGCCAGGCCGCCAAGCACGAGGGCCCCCTGCACAAGTGCGACATCAGCAACAGCACCGAGGCCGGCCAGAAGCTGTTCAACATGCTGAGACTGGGCAAGAGCGAGCCCTGGACCCTGGCCCTGGAGAACGTGGTGGGCGCCAAGAACATGAACGTGAGACCCCTGCTGAACTACTTCGAGCCCCTGTTCACCTGGCTGAAGGACCAGAACAAGAACAGCTTCGTGGGCTGGAGCACCGACTGGAGCCCCTACGCCGACCAGAGCATCAAGGTGAGAATCAGCCTGAAGAGCGCCCTGGGCGACAAGGCCTACGAGTGGAACGACAACGAGATGTACCTGTTCAGAAGCAGCGTGGCCTACGCCATGAGACAGTACTTCCTGAAGGTGAAGAACCAGATGATCCTGTTCGGCGAGGAGGACGTGAGAGTGGCCAACCTGAAGCCCAGAATCAGCTTCAACTTCTTCGTGACCGCCCCCAAGAACGTGAGCGACATCATCCCCAGAACCGAGGTGGAGAAGGCCATCAGAATGAGCAGAAGCAGAATCAACGACGCCTTCAGACTGAACGACAACAGCCTGGAGTTCCTGGGCATCCAGCCCACCCTGGGCCCCCCCAACCAGCCCCCCGTGAGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCAGAGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCCCGGCTGA
SEQ ID NO: 66 AMI081
CAGAGCACCATCGAGGAGCAGGCCAAGACCTTCCTGGACAAGTTCAACCACGAGGCCGAGGACCTGTTCTACCAGAGCAGCCTGGCCAGCTGGAACTACAACACCAACATCACCGAGGAGAACGTGCAGAACATGAACAACGCCGGCGACAAGTGGAGCGCCTTCCTGAAGGAGCAGAGCACCCTGGCCCAGATGTACCCCCTGCAGGAGATCCAGAACCTGACCGTGAAGCTGCAGCTGCAGGCCCTGCAGCAGAACGGCAGCAGCGTGCTGAGCGAGGACAAGAGCAAGAGACTGAACACCATCCTGAACACCATGAGCACCATCTACAGCACCGGCAAGGTGTGCAACCCCGACAACCCCCAGGAGTGCCTGCTGCTGGAGCCCGGCCTGAACGAGATCATGGCCAACAGCCTGGACTACAACGAGAGACTGTGGGCCTGGGAGAGCTGGAGAAGCGAGGTGGGCAAGCAGCTGAGACCCCTGTACGAGGAGTACGTGGTGCTGAAGAACGAGATGGCCAGAGCCAACCACTACGAGGACTACGGCGACTACTGGAGAGGCGACTACGAGGTGAACGGCGTGGACGGCTACGACTACAGCAGAGGCCAGCTGATCGAGGACGTGGAGCACACCTTCGAGGAGATCAAGCCCCTGTACGAGCACCTGCACGCCTACGTGAGAGCCAAGCTGATGAACGCCTACCCCAGCTACATCAGCCCCATCGGCTGCCTGCCCGCCCACCTGCTGGGCGACATGTGGGGCAGATTCTGGACCAACCTGTACAGCCTGACCGTGCCCTTCGGCCAGAAGCCCAACATCGACGTGACCGACGCCATGGTGGACCAGGCCTGGGACGCCCAGAGAATCTTCAAGGAGGCCGAGAAGTTCTTCGTGAGCGTGGGCCTGCCCAACATGACCCAGGGCTTCTGGGAGAACAGCATGCTGACCGACCCCGGCAACGTGCAGAAGGCCGTGTGCCACCCCACCGCCTGGGACCTGGGCAAGGGCGACTTCAGAATCCTGATGTGCACCAAGGTGACCATGGACGACTTCCTGACCGCCCACCACGAGATGGGCCACATCCAGTACGACATGGCCTACGCCGCCCAGCCCTTCCTGCTGAGAAACGGCGCCAACGAGGGCTTCCACcAGGCCGTGGGCGAGATCATGAGCCTGAGCGCCGCCACCCCCAAGCACCTGAAGAGCATCGGCCTGCTGAGCCCCGACTTCCAGGAGGACAACGAGACCGAGATCAACTTCCTGCTGAAGCAGGCCCTGACCATCGTGGGCACCCTGCCCTTCACCTACATGCTGGAGAAGTGGAGATGGATGGTGTTCAAGGaCGAGATCCCCAAGGACCAGTGGATGAAGAAGTGGTGGGAGATGAAGAGAGAGATCGTGGGCGTGGTGGAGCCCGTGCCCCACGACGAGACCTACTGCGACCCCGCCAGCCTGTTCCACGTGAGCAACGACTACAGCTTCATCAGATACTACACCAGAACCCTGTACCAGTTCCAGTTCCAGGAGGCCCTGTGCCAGGCCGCCAAGCACGAGGGCCCCCTGCACAAGTGCGACATCAGCAACAGCACCGAGGCCGGCCAGAAGCTGTTCAACATGCTGAGACTGGGCAAGAGCGAGCCCTGGACCCTGGCCCTGGAGAACGTGGTGGGCGCCAAGAACATGAACGTGAGACCCCTGCTGAACTACTTCGAGCCCCTGTTCACCTGGCTGAAGGACCAGAACAAGAACAGCTTCGTGGGCTGGAGCACCGACTGGAGCCCCTACGCCGACCAGAGCATCAAGGTGAGAATCAGCCTGAAGAGCGCCCTGGGCGACAAGGCCTACGAGTGGAACGACAACGAGATGTACCTGTTCAGAAGCAGCGTGGCCTACGCCATGAGACAGTACTTCCTGAAGGTGAAGAACCAGATGATCCTGTTCGGCGAGGAGGACGTGAGAGTGGCCAACCTGAAGCCCAGAATCAGCTTCAACTTCTTCGTGACCGCCCCCAAGAACGTGAGCGACATCATCCCCAGAACCGAGGTGGAGAAGGCCATCAGAATGAGCAGAAGCAGAATCAACGACGCCTTCAGACTGAACGACAACAGCCTGGAGTTCCTGGGCATCCAGCCCACCCTGGGCCCCCCCAACCAGCCCCCCGTGAGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCAGAGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCCCGGCTGA
SEQ ID NO: 67 AMI082
CAGAGCACCATCGAGGAGCAGGCCAAGACCTTCCTGGACAAGTTCAACCACGAGGCCGAGGACCTGTTCTACCAGAGCAGCCTGGCCAGCTGGAACTACAACACCAACATCACCGAGGAGAACGTGCAGAACATGAACAACGCCGGCGACAAGTGGAGCGCCTTCCTGAAGGAGCAGAGCACCCTGGCCCAGATGTACCCCCTGCAGGAGATCCAGAACCTGACCGTGAAGCTGCAGCTGCAGGCCCTGCAGCAGAACGGCAGCAGCGTGCTGAGCGAGGACAAGAGCAAGAGACTGAACACCATCCTGAACACCATGAGCACCATCTACAGCACCGGCAAGGTGTGCAACCCCGACAACCCCCAGGAGTGCCTGCTGCTGGAGCCCGGCCTGAACGAGATCATGGCCAACAGCCTGGACTACAACGAGAGACTGTGGGCCTGGGAGAGCTGGAGAAGCGAGGTGGGCAAGCAGCTGAGACCCCTGTACGAGGAGTACGTGGTGCTGAAGAACGAGATGGCCAGAGCCAACCACTACGAGGACTACGGCGACTACTGGAGAGGCGACTACGAGGTGAACGGCGTGGACGGCTACGACTACAGCAGAGGCCAGCTGATCGAGGACGTGGAGCACACCTTCGAGGAGATCAAGCCCCTGTACGAGCACCTGCACGCCTACGTGAGAGCCAAGCTGATGAACGCCTACCCCAGCTACATCAGCCCCATCGGCTGCCTGCCCGCCCACCTGCTGGGCGACATGTGGGGCAGATTCTGGACCAACCTGTACAGCCTGACCGTGCCCTTCGGCCAGAAGCCCAACATCGACGTGACCGACGCCATGGTGGACCAGGCCTGGGACGCCCAGAGAATCTTCAAGGAGGCCGAGAAGTTCTTCGTGAGCGTGGGCCTGCCCAACATGACCCAGGGCTTCTGGGAGAACAGCATGCTGACCGACCCCGGCAACGTGCAGAAGGCCGTGTGCCACCCCACCGCCTGGGACCTGGGCAAGGGCGACTTCAGAATCCTGATGTGCACCAAGGTGACCATGGACGACTTCCTGACCGCCCACgcCGAGATGGGCCACATCCAGTACGACATGGCCTACGCCGCCCAGCCCTTCCTGCTGAGAAACGGCGCCAACGAGGGCTTCCACcAGGCCGTGGGCGAGATCATGAGCCTGAGCGCCGCCACCCCCAAGCACCTGAAGAGCATCGGCCTGCTGAGCCCCGACTTCCAGGAGGACAACGAGACCGAGATCAACTTCCTGCTGAAGCAGGCCCTGACCATCGTGGGCACCCTGCCCTTCACCTACATGCTGGAGAAGTGGAGATGGATGGTGTTCAAGGGCGAGATCCCCAAGGACCAGTGGATGAAGAAGTGGTGGGAGATGAAGAGAGAGATCGTGGGCGTGGTGGAGCCCGTGCCCCACGACGAGACCTACTGCGACCCCGCCAGCCTGTTCCACGTGAGCAACGACTACAGCTTCATCAGATACTACACCAGAACCCTGTACCAGTTCCAGTTCCAGGAGGCCCTGTGCCAGGCCGCCAAGCACGAGGGCCCCCTGCACAAGTGCGACATCAGCAACAGCACCGAGGCCGGCCAGAAGCTGTTCAACATGCTGAGACTGGGCAAGAGCGAGCCCTGGACCCTGGCCCTGGAGAACGTGGTGGGCGCCAAGAACATGAACGTGAGACCCCTGCTGAACTACTTCGAGCCCCTGTTCACCTGGCTGAAGGACCAGAACAAGAACAGCTTCGTGGGCTGGAGCACCGACTGGAGCCCCTACGCCGACCAGAGCATCAAGGTGAGAATCAGCCTGAAGAGCGCCCTGGGCGACAAGGCCTACGAGTGGAACGACAACGAGATGTACCTGTTCAGAAGCAGCGTGGCCTACGCCATGAGACAGTACTTCCTGAAGGTGAAGAACCAGATGATCCTGTTCGGCGAGGAGGACGTGAGAGTGGCCAACCTGAAGCCCAGAATCAGCTTCAACTTCTTCGTGACCGCCCCCAAGAACGTGAGCGACATCATCCCCAGAACCGAGGTGGAGAAGGCCATCAGAATGAGCAGAAGCAGAATCAACGACGCCTTCAGACTGAACGACAACAGCCTGGAGTTCCTGGGCATCCAGCCCACCCTGGGCCCCCCCAACCAGCCCCCCGTGAGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCAGAGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCCCGGCTGA
SEQ ID NO: 68 AMI083
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SEQ ID NO: 69 AMI084
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SEQ ID NO: 70 AMI085
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SEQ ID NO: 72 AMI090
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SEQ ID NO: 73 AMI121
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SEQ ID NO: 74 AMI122
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SEQ ID NO: 75 AMI123
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SEQ ID NO: 76 AMI124
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SEQ ID NO: 77 AMI125
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SEQ ID NO: 78 AMI126
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SEQ ID NO: 79 AMI127
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SEQ ID NO: 80 AMI128
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刘胜江
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 13
Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp Phe Leu Thr Ala His Ala Gln Met
1 5 10 15
Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu
20 25 30
Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met
35 40 45
Ser Leu
50
<210> 14
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 14
Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp Phe Leu Thr Ala His His Gln Met
1 5 10 15
Gly Ala Ile Gln Tyr Asp Met Ala Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu
20 25 30
Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met
35 40 45
Ser Leu
50
<210> 15
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 15
Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp Phe Leu Thr Ala His Ala Gln Met
1 5 10 15
Gly Ala Ile Gln Tyr Asp Met Ala Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu
20 25 30
Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met
35 40 45
Ser Leu
50
<210> 16
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 16
Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp Phe Leu Thr Ala His His Glu Met
1 5 10 15
Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu
20 25 30
Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met
35 40 45
Ser Leu
50
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 17
Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp Phe Leu Thr Ala His His Glu Met
1 5 10 15
Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu
20 25 30
Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe His Gln Ala Val Gly Glu Ile Met
35 40 45
Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys His Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu
50 55 60
Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn Glu Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu
65 70 75 80
Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly Thr Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu
85 90 95
Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe Lys Asp
100 105
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<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 18
Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp Phe Leu Thr Ala His His Gln Met
1 5 10 15
Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu
20 25 30
Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe His Gln Ala Val Gly Glu Ile Met
35 40 45
Ser Leu
50
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<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 19
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Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu
20 25 30
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35 40 45
Ser Leu
50
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 20
Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp Phe Leu Thr Ala His Ala Glu Met
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Gly Arg Ile Gln Tyr Asp Met Ala Tyr Val Ala Gln Pro Phe Leu Leu
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<213> 人工序列
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<400> 21
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<220>
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<400> 22
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Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala Tyr Ala Leu Gln Pro Phe Leu Leu
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Ser Leu
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<211> 50
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<220>
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<400> 23
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Gly Arg Ile Gln Tyr Asp Met Ala Tyr Ala Leu Gln Pro Phe Leu Leu
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35 40 45
Ser Leu
50
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<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 24
Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp Phe Leu Thr Ala His Ala Glu Met
1 5 10 15
Gly Ala Ile Gln Tyr Asp Met Ala Tyr Ala Leu Gln Pro Phe Leu Leu
20 25 30
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35 40 45
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50
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<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 25
Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp Phe Leu Thr Ala His Ala Glu Met
1 5 10 15
Gly Arg Ile Gln Tyr Asp Met Ala Tyr Ala Leu Gln Pro Phe Leu Leu
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<220>
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<400> 26
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1 5 10 15
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<220>
<223> 合成的
<400> 27
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1 5 10 15
Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala Tyr Ala Leu Gln Pro Phe Leu Leu
20 25 30
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<211> 50
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<400> 28
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50
<210> 29
<211> 932
<212> PRT
<213> 智人
<400> 29
Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe Asn
1 5 10 15
His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp Asn
20 25 30
Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn Ala
35 40 45
Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala Gln
50 55 60
Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln Leu
65 70 75 80
Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys Ser
85 90 95
Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser Thr
100 105 110
Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu Glu
115 120 125
Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu Arg
130 135 140
Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu Arg
145 150 155 160
Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg Ala
165 170 175
Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu Val
180 185 190
Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu Asp
195 200 205
Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu His
210 215 220
Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile Ser
225 230 235 240
Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly Arg
245 250 255
Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys Pro
260 265 270
Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala Gln
275 280 285
Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu Pro
290 295 300
Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro Gly
305 310 315 320
Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly Lys
325 330 335
Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp Phe
340 345 350
Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala Tyr
355 360 365
Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe His
370 375 380
Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys His
385 390 395 400
Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn Glu
405 410 415
Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly Thr
420 425 430
Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe Lys
435 440 445
Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met Lys
450 455 460
Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr Tyr
465 470 475 480
Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe Ile
485 490 495
Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala Leu
500 505 510
Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile Ser
515 520 525
Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu Gly
530 535 540
Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala Lys
545 550 555 560
Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe Thr
565 570 575
Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr Asp
580 585 590
Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu Lys
595 600 605
Ser Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met Tyr
610 615 620
Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe Leu Lys
625 630 635 640
Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val Ala
645 650 655
Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro Lys
660 665 670
Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile Arg
675 680 685
Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp Asn Ser
690 695 700
Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gln Pro
705 710 715 720
Pro Val Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
725 730 735
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
740 745 750
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
755 760 765
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
770 775 780
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785 790 795 800
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
805 810 815
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820 825 830
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835 840 845
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850 855 860
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865 870 875 880
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885 890 895
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
900 905 910
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
915 920 925
Ser Val Met His
930
<210> 30
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 30
atccagcctc cggactctag agttaactgg taagtttagt 40
<210> 31
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 31
gttgccttta cttctaggcc tgccgccacc atggagttcg gcctgagctg gctgttcct 59
<210> 32
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 32
aacagctatg accatg 16
<210> 33
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 33
atgtacgggc cagatatacg cgttcgttac ataacttacg gtaaa 45
<210> 34
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 34
tgattattga ctagtatctg cgttacataa cttacggtaa 40
<210> 35
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 35
actccatggt ggcggcaggc ctagaagtaa aggcaacatc 40
<210> 36
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 36
ataaagatat tttattttcg aattctcagc 30
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 37
ctgttctacc agagcagcct ggcca 25
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 38
ctgggagaac agcatgctga ccgac 25
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 39
agagcatcaa ggtgagaatc agcct 25
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 40
cggccagccc gagaacaact acaag 25
<210> 41
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 41
tcgtggggca cgggctccac cacgc 25
<210> 42
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 42
gcgtggtgga gcccgtgccc cacga 25
<210> 43
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 43
tgggggggaa caggaacacg ctggg 25
<210> 44
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 44
gcggccccag cgtgttcctg ttccc 25
<210> 45
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 45
gaatcctgat gtgcaccaag gtgaccatgg acgacttcc 39
<210> 46
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 46
ggtgaccatg gacgacttcc tgaccgccca cgccgagatg ggccacatc 49
<210> 47
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 47
gcatgttgaa cagcttct 18
<210> 48
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 48
gaccatggac gacttcctga ccgcccacca ccagatgggc cacatccag 49
<210> 49
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 49
gaccatggac gacttcctga ccgcccacgc ccagatgggc cacatccag 49
<210> 50
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 50
cgccaagctc tagctagagg tcgacgcggc cgctcggtcc gcac 44
<210> 51
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 51
ttcctgctga gaaacggcgc caacgagggc ttccaccagg ccgtgggcg 49
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 52
ggggtctcac gttcatgttc 20
<210> 53
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 53
gagatggatg gtgttcaagg gcgagatccc caaggaccag 40
<210> 54
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 54
ctggtccttg gggatctcgc ccttgaacac catccatc 38
<210> 55
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 55
ccgaagggca cggtcaggct gtaca 25
<210> 56
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 56
tgtacagcct gaccgtgccc ttcgg 25
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 57
ggaaccccta gtgatggagt t 21
<210> 58
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 58
cggcctcagt gagcga 16
<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 59
cactccctct ctgcgcgctc g 21
<210> 60
<211> 2850
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 60
cagagcacca tcgaggagca ggccaagacc ttcctggaca agttcaacca cgaggccgag 60
gacctgttct accagagcag cctggccagc tggaactaca acaccaacat caccgaggag 120
aacgtgcaga acatgaacaa cgccggcgac aagtggagcg ccttcctgaa ggagcagagc 180
accctggccc agatgtaccc cctgcaggag atccagaacc tgaccgtgaa gctgcagctg 240
caggccctgc agcagaacgg cagcagcgtg ctgagcgagg acaagagcaa gagactgaac 300
accatcctga acaccatgag caccatctac agcaccggca aggtgtgcaa ccccgacaac 360
ccccaggagt gcctgctgct ggagcccggc ctgaacgaga tcatggccaa cagcctggac 420
tacaacgaga gactgtgggc ctgggagagc tggagaagcg aggtgggcaa gcagctgaga 480
cccctgtacg aggagtacgt ggtgctgaag aacgagatgg ccagagccaa ccactacgag 540
gactacggcg actactggag aggcgactac gaggtgaacg gcgtggacgg ctacgactac 600
agcagaggcc agctgatcga ggacgtggag cacaccttcg aggagatcaa gcccctgtac 660
gagcacctgc acgcctacgt gagagccaag ctgatgaacg cctaccccag ctacatcagc 720
cccatcggct gcctgcccgc ccacctgctg ggcgacatgt ggggcagatt ctggaccaac 780
ctgtacagcc tgaccgtgcc cttcggccag aagcccaaca tcgacgtgac cgacgccatg 840
gtggaccagg cctgggacgc ccagagaatc ttcaaggagg ccgagaagtt cttcgtgagc 900
gtgggcctgc ccaacatgac ccagggcttc tgggagaaca gcatgctgac cgaccccggc 960
aacgtgcaga aggccgtgtg ccaccccacc gcctgggacc tgggcaaggg cgacttcaga 1020
atcctgatgt gcaccaaggt gaccatggac gacttcctga ccgcccacca cgagatgggc 1080
cacatccagt acgacatggc ctacgccgcc cagcccttcc tgctgagaaa cggcgccaac 1140
gagggcttcc acgaggccgt gggcgagatc atgagcctga gcgccgccac ccccaagcac 1200
ctgaagagca tcggcctgct gagccccgac ttccaggagg acaacgagac cgagatcaac 1260
ttcctgctga agcaggccct gaccatcgtg ggcaccctgc ccttcaccta catgctggag 1320
aagtggagat ggatggtgtt caaggacgag atccccaagg accagtggat gaagaagtgg 1380
tgggagatga agagagagat cgtgggcgtg gtggagcccg tgccccacga cgagacctac 1440
tgcgaccccg ccagcctgtt ccacgtgagc aacgactaca gcttcatcag atactacacc 1500
agaaccctgt accagttcca gttccaggag gccctgtgcc aggccgccaa gcacgagggc 1560
cccctgcaca agtgcgacat cagcaacagc accgaggccg gccagaagct gttcaacatg 1620
ctgagactgg gcaagagcga gccctggacc ctggccctgg agaacgtggt gggcgccaag 1680
aacatgaacg tgagacccct gctgaactac ttcgagcccc tgttcacctg gctgaaggac 1740
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<211> 2850
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<213> 智人
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<220>
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ctgaccaaga accaggtgag cctgacctgc ctggtgaagg gcttctaccc cagcgacatc 2640
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ctggacagcg acggcagctt cttcctgtac agcaagctga ccgtggacaa gagcagatgg 2760
cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 2820
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<210> 75
<211> 2850
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 75
cagagcacca tcgaggagca ggccaagacc ttcctggaca agttcaacca cgaggccgag 60
gacctgttct accagagcag cctggccagc tggaactaca acaccaacat caccgaggag 120
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caggccctgc agcagaacgg cagcagcgtg ctgagcgagg acaagagcaa gagactgaac 300
accatcctga acaccatgag caccatctac agcaccggca aggtgtgcaa ccccgacaac 360
ccccaggagt gcctgctgct ggagcccggc ctgaacgaga tcatggccaa cagcctggac 420
tacaacgaga gactgtgggc ctgggagagc tggagaagcg aggtgggcaa gcagctgaga 480
cccctgtacg aggagtacgt ggtgctgaag aacgagatgg ccagagccaa ccactacgag 540
gactacggcg actactggag aggcgactac gaggtgaacg gcgtggacgg ctacgactac 600
agcagaggcc agctgatcga ggacgtggag cacaccttcg aggagatcaa gcccctgtac 660
gagcacctgc acgcctacgt gagagccaag ctgatgaacg cctaccccag ctacatcagc 720
cccatcggct gcctgcccgc ccacctgctg ggcgacatgt ggggcagatt ctggaccaac 780
ctgtacagcc tgaccgtgcc cttcggccag aagcccaaca tcgacgtgac cgacgccatg 840
gtggaccagg cctgggacgc ccagagaatc ttcaaggagg ccgagaagtt cttcgtgagc 900
gtgggcctgc ccaacatgac ccagggcttc tgggagaaca gcatgctgac cgaccccggc 960
aacgtgcaga aggccgtgtg ccaccccacc gcctgggacc tgggcaaggg cgacttcaga 1020
atcctgatgt gcaccaaggt gaccatggac gacttcctga ccgcccacct ggagatgggc 1080
cacatccagt acgacatggc ctacgccctg cagcccttcc tgctgagaaa cggcgccaac 1140
gagggcttcc accaggccgt gggcgagatc atgagcctga gcgccgccac ccccaagcac 1200
ctgaagagca tcggcctgct gagccccgac ttccaggagg acaacgagac cgagatcaac 1260
ttcctgctga agcaggccct gaccatcgtg ggcaccctgc ccttcaccta catgctggag 1320
aagtggagat ggatggtgtt caagggcgag atccccaagg accagtggat gaagaagtgg 1380
tgggagatga agagagagat cgtgggcgtg gtggagcccg tgccccacga cgagacctac 1440
tgcgaccccg ccagcctgtt ccacgtgagc aacgactaca gcttcatcag atactacacc 1500
agaaccctgt accagttcca gttccaggag gccctgtgcc aggccgccaa gcacgagggc 1560
cccctgcaca agtgcgacat cagcaacagc accgaggccg gccagaagct gttcaacatg 1620
ctgagactgg gcaagagcga gccctggacc ctggccctgg agaacgtggt gggcgccaag 1680
aacatgaacg tgagacccct gctgaactac ttcgagcccc tgttcacctg gctgaaggac 1740
cagaacaaga acagcttcgt gggctggagc accgactgga gcccctacgc cgaccagagc 1800
atcaaggtga gaatcagcct gaagagcgcc ctgggcgaca aggcctacga gtggaacgac 1860
aacgagatgt acctgttcag aagcagcgtg gcctacgcca tgagacagta cttcctgaag 1920
gtgaagaacc agatgatcct gttcggcgag gaggacgtga gagtggccaa cctgaagccc 1980
agaatcagct tcaacttctt cgtgaccgcc cccaagaacg tgagcgacat catccccaga 2040
accgaggtgg agaaggccat cagaatgagc agaagcagaa tcaacgacgc cttcagactg 2100
aacgacaaca gcctggagtt cctgggcatc cagcccaccc tgggcccccc caaccagccc 2160
cccgtgagcg acaagaccca cacctgcccc ccctgccccg cccccgagct gctgggcggc 2220
cccagcgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatcag cagaaccccc 2280
gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaggacc ccgaggtgaa gttcaactgg 2340
tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc ccagagagga gcagtacaac 2400
agcacctaca gagtggtgag cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag 2460
gagtacaagt gcaaggtgag caacaaggcc ctgcccgccc ccatcgagaa gaccatcagc 2520
aaggccaagg gccagcccag agagccccag gtgtacaccc tgccccccag cagagacgag 2580
ctgaccaaga accaggtgag cctgacctgc ctggtgaagg gcttctaccc cagcgacatc 2640
gccgtggagt gggagagcaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac cccccccgtg 2700
ctggacagcg acggcagctt cttcctgtac agcaagctga ccgtggacaa gagcagatgg 2760
cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 2820
cagaagagcc tgagcctgag ccccggctga 2850
<210> 76
<211> 2850
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 76
cagagcacca tcgaggagca ggccagaacc ttcctggaca agttcaacca cgaggccgag 60
gacctgttct accagagcag cctggccagc tggaactaca acaccaacat caccgaggag 120
aacgtgcaga acatgaacaa cgccggcgac aagtggagcg ccttcctgaa ggagcagagc 180
accctggccc agatgtaccc cctgcaggag atccagaacc tgaccgtgaa gctgcagctg 240
caggccctgc agcagaacgg cagcagcgtg ctgagcgagg acaagagcaa gagactgaac 300
accatcctga acaccatgag caccatctac agcaccggca aggtgtgcaa ccccgacaac 360
ccccaggagt gcctgctgct ggagcccggc ctgaacgaga tcatggccaa cagcctggac 420
tacaacgaga gactgtgggc ctgggagagc tggagaagcg aggtgggcaa gcagctgaga 480
cccctgtacg aggagtacgt ggtgctgaag aacgagatgg ccagagccaa ccactacgag 540
gactacggcg actactggag aggcgactac gaggtgaacg gcgtggacgg ctacgactac 600
agcagaggcc agctgatcga ggacgtggag cacaccttcg aggagatcaa gcccctgtac 660
gagcacctgc acgcctacgt gagagccaag ctgatgaacg cctaccccag ctacatcagc 720
cccatcggct gcctgcccgc ccacctgctg ggcgacatgt ggggcagatt ctggaccaac 780
ctgtacagcc tgaccgtgcc cttcggccag aagcccaaca tcgacgtgac cgacgccatg 840
gtggaccagg cctgggacgc ccagagaatc ttcaaggagg ccgagaagtt cttcgtgagc 900
gtgggcctgc ccaacatgac ccagggcttc tgggagaaca gcatgctgac cgaccccggc 960
aacgtgcaga aggccgtgtg ccaccccacc gcctgggacc tgggcaaggg cgacttcaga 1020
atcctgatgt gcaccaaggt gaccatggac gacttcctga ccgcccacgc cgagatgggc 1080
cacatccagt acgacatggc ctacgccctg cagcccttcc tgctgagaaa cggcgccaac 1140
gagggcttcc accaggccgt gggcgagatc atgagcctga gcgccgccac ccccaagcac 1200
ctgaagagca tcggcctgct gagccccgac ttccaggagg acaacgagac cgagatcaac 1260
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agaaccctgt accagttcca gttccaggag gccctgtgcc aggccgccaa gcacgagggc 1560
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ctgagactgg gcaagagcga gccctggacc ctggccctgg agaacgtggt gggcgccaag 1680
aacatgaacg tgagacccct gctgaactac ttcgagcccc tgttcacctg gctgaaggac 1740
cagaacaaga acagcttcgt gggctggagc accgactgga gcccctacgc cgaccagagc 1800
atcaaggtga gaatcagcct gaagagcgcc ctgggcgaca aggcctacga gtggaacgac 1860
aacgagatgt acctgttcag aagcagcgtg gcctacgcca tgagacagta cttcctgaag 1920
gtgaagaacc agatgatcct gttcggcgag gaggacgtga gagtggccaa cctgaagccc 1980
agaatcagct tcaacttctt cgtgaccgcc cccaagaacg tgagcgacat catccccaga 2040
accgaggtgg agaaggccat cagaatgagc agaagcagaa tcaacgacgc cttcagactg 2100
aacgacaaca gcctggagtt cctgggcatc cagcccaccc tgggcccccc caaccagccc 2160
cccgtgagcg acaagaccca cacctgcccc ccctgccccg cccccgagct gctgggcggc 2220
cccagcgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatcag cagaaccccc 2280
gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaggacc ccgaggtgaa gttcaactgg 2340
tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc ccagagagga gcagtacaac 2400
agcacctaca gagtggtgag cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag 2460
gagtacaagt gcaaggtgag caacaaggcc ctgcccgccc ccatcgagaa gaccatcagc 2520
aaggccaagg gccagcccag agagccccag gtgtacaccc tgccccccag cagagacgag 2580
ctgaccaaga accaggtgag cctgacctgc ctggtgaagg gcttctaccc cagcgacatc 2640
gccgtggagt gggagagcaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac cccccccgtg 2700
ctggacagcg acggcagctt cttcctgtac agcaagctga ccgtggacaa gagcagatgg 2760
cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 2820
cagaagagcc tgagcctgag ccccggctga 2850
<210> 77
<211> 2850
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 77
cagagcacca tcgaggagca ggccaagacc ttcctggaca agttcaacca cgaggccgag 60
gacctgttct accagagcag cctggccagc tggaactaca acaccaacat caccgaggag 120
aacgtgcaga acatgaacaa cgccggcgac aagtggagcg ccttcctgaa ggagcagagc 180
accctggccc agatgtaccc cctgcaggag atccagaacc tgaccgtgaa gctgcagctg 240
caggccctgc agcagaacgg cagcagcgtg ctgagcgagg acaagagcaa gagactgaac 300
accatcctga acaccatgag caccatctac agcaccggca aggtgtgcaa ccccgacaac 360
ccccaggagt gcctgctgct ggagcccggc ctgaacgaga tcatggccaa cagcctggac 420
tacaacgaga gactgtgggc ctgggagagc tggagaagcg aggtgggcaa gcagctgaga 480
cccctgtacg aggagtacgt ggtgctgaag aacgagatgg ccagagccaa ccactacgag 540
gactacggcg actactggag aggcgactac gaggtgaacg gcgtggacgg ctacgactac 600
agcagaggcc agctgatcga ggacgtggag cacaccttcg aggagatcaa gcccctgtac 660
gagcacctgc acgcctacgt gagagccaag ctgatgaacg cctaccccag ctacatcagc 720
cccatcggct gcctgcccgc ccacctgctg ggcgacatgt ggggcagatt ctggaccaac 780
ctgtacagcc tgaccgtgcc cttcggccag aagcccaaca tcgacgtgac cgacgccatg 840
gtggaccagg cctgggacgc ccagagaatc ttcaaggagg ccgagaagtt cttcgtgagc 900
gtgggcctgc ccaacatgac ccagggcttc tgggagaaca gcatgctgac cgaccccggc 960
aacgtgcaga aggccgtgtg ccaccccacc gcctgggacc tgggcaaggg cgacttcaga 1020
atcctgatgt gcaccaaggt gaccatggac gacttcctga ccgcccacct ggagatgggc 1080
agaatccagt acgacatggc ctacgccctg cagcccttcc tgctgagaaa cggcgccaac 1140
gagggcttcc accaggccgt gggcgagatc atgagcctga gcgccgccac ccccaagcac 1200
ctgaagagca tcggcctgct gagccccgac ttccaggagg acaacgagac cgagatcaac 1260
ttcctgctga agcaggccct gaccatcgtg ggcaccctgc ccttcaccta catgctggag 1320
aagtggagat ggatggtgtt caagggcgag atccccaagg accagtggat gaagaagtgg 1380
tgggagatga agagagagat cgtgggcgtg gtggagcccg tgccccacga cgagacctac 1440
tgcgaccccg ccagcctgtt ccacgtgagc aacgactaca gcttcatcag atactacacc 1500
agaaccctgt accagttcca gttccaggag gccctgtgcc aggccgccaa gcacgagggc 1560
cccctgcaca agtgcgacat cagcaacagc accgaggccg gccagaagct gttcaacatg 1620
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atcaaggtga gaatcagcct gaagagcgcc ctgggcgaca aggcctacga gtggaacgac 1860
aacgagatgt acctgttcag aagcagcgtg gcctacgcca tgagacagta cttcctgaag 1920
gtgaagaacc agatgatcct gttcggcgag gaggacgtga gagtggccaa cctgaagccc 1980
agaatcagct tcaacttctt cgtgaccgcc cccaagaacg tgagcgacat catccccaga 2040
accgaggtgg agaaggccat cagaatgagc agaagcagaa tcaacgacgc cttcagactg 2100
aacgacaaca gcctggagtt cctgggcatc cagcccaccc tgggcccccc caaccagccc 2160
cccgtgagcg acaagaccca cacctgcccc ccctgccccg cccccgagct gctgggcggc 2220
cccagcgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatcag cagaaccccc 2280
gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaggacc ccgaggtgaa gttcaactgg 2340
tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc ccagagagga gcagtacaac 2400
agcacctaca gagtggtgag cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag 2460
gagtacaagt gcaaggtgag caacaaggcc ctgcccgccc ccatcgagaa gaccatcagc 2520
aaggccaagg gccagcccag agagccccag gtgtacaccc tgccccccag cagagacgag 2580
ctgaccaaga accaggtgag cctgacctgc ctggtgaagg gcttctaccc cagcgacatc 2640
gccgtggagt gggagagcaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac cccccccgtg 2700
ctggacagcg acggcagctt cttcctgtac agcaagctga ccgtggacaa gagcagatgg 2760
cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 2820
cagaagagcc tgagcctgag ccccggctga 2850

Claims (30)

1.一种分离的血管紧张素转化酶2 (ACE2)多肽，相对于野生型ACE2具有一个或多个突变，所述突变导致与野生型ACE2相比，其ACE2酶活性丧失。
2.根据权利要求1所述的突变ACE2，其中所述酶活性丧失是由野生型ACE2催化区中的突变引起的。
3.根据权利要求2所述的ACE2多肽，其中所述一个或多个突变包括H374、E375、H378、E402中的一个或其中两个、三个或更多个突变的组合。
4.根据权利要求1所述的ACE2多肽，其选自SEQ ID编号3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27和28。
5.一种融合蛋白，其包含权利要求1~4任一项所述的分离的突变ACE2多肽，其于N或C末端融合肽，其中所述肽能与免疫系统相关细胞的受体结合。
6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中多核苷酸是DNA或RNA。
7.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中所述肽是与淋巴细胞的免疫细胞上的Fc结合受体(FcγR)结合的配体。
8.根据权利要求7所述的融合蛋白，其中所述淋巴细胞的免疫细胞选自T细胞、B细胞、自然杀伤细胞。
9.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中所述肽是人IgG抗体的Fc结构域(FcT)。
10.一种分离的多核苷酸，其编码如权利要求1所述的突变ACE2多肽，其中所述突变的ACE2多肽包含SEQ ID编号：3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27和28。
11.一种分离的多核苷酸，其包含SEQ ID编号：64, 66, 67, 68, 69, 70, 72, 73,74, 75, 76, 77, 78, 79, 80或81。
12.一种载体，其包含权利要求7和8中任一项的多核苷酸。
13.根据权利要求12所述的载体，其包括病毒载体或非病毒载体。
14.根据权利要求13所述的载体，其中所述病毒载体包含AAV。
15.根据权利要求13所述的病毒载体，其中所述非病毒载体包括质粒、纳米颗粒、脂质体、PEI衍生的或胶体的金颗粒。
16.一种细胞，其包含权利要求12~15中任一项所述的载体，其中由所述载体中的分离的多核苷酸编码的多肽在所述细胞中表达。
17.根据权利要求16所述的细胞，其选自原核细胞或真核细胞。
18.根据权利要求17所述的细胞，其中所述的原核细胞是细菌细胞。
19.根据权利要求17所述的细胞，其中所述真核细胞选自哺乳动物细胞和非哺乳动物细胞。
20.根据权利要求19所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞，选自HEK293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0细胞和BHK-21细胞。
21.一种组合物或药物组合物，其包含：
(1)权利要求1~4中任一项所述的多肽，或权利要求5~9中任一项所述的融合蛋白，或权利要求10~11中任一项所述的多核苷酸，或权利要求16~20中任一项所述的细胞，和
(2)任选地药学上可接受的载体。
22.一种疫苗组合物，其包含权利要求12~15中任一项所述的载体。
23.一种治疗病毒感染的方法，包括对人类受试者施用有效量的如权利要求13所述的组合物，其中所述病毒感染选自冠状病毒感染、α冠状病毒感染、β冠状病毒感染、SARS-CoV-2感染、SARS-CoV-1感染、MERS-CoV感染、人NL63冠状病毒感染。
24.一种预防病毒感染或预防性治疗的方法，其通过向健康人受试者注射权利要求22所述的疫苗组合物。
25.一种分离的血管紧张素转化酶2 (ACE2)多肽，相对于野生型人ACE2具有一个或多个突变，所述一个或多个突变导致ACE2多肽中ACE2酶活性丧失，其中所述ACE2多肽与野生型ACE2相比，其与结合伴侣保持相同或有更高的结合亲和力。
26.根据权利要求25所述的分离的ACE2多肽，其中所述ACE2多肽提高的结合亲和力是由催化区中的突变或催化区外区域中的突变引起的。
27.根据权利要求25所述的分离的ACE2多肽，其中所述突变包括在K26、T27、L79、N330、H374、E375、H378、A386、A387、E402、G466、L795位点处的突变，和其任何两个、三个、四个、五个、六个、七个或更多个突变的组合。
28.根据权利要求27所述的分离的ACE2多肽，其中所述突变选自K26R、T27Y、L79S、N330F、H374A、E375Q、H378R、A386V、A387L、E402Q、G466D、L795H位点出的突变，及其两个、三个、四个、五个、六个、七个或更多个突变的组合。
29.根据权利要求25所述的分离的ACE2多肽，其选自SEQ ID编号：3, 4, 5, 6, 7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27和28。
30.一种融合蛋白，其包含权利要求25~29任一项所述的分离的ACE2多肽，其于N或C末端与肽融合以形成融合蛋白，其中所述肽能与免疫系统相关细胞的受体结合。
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