TWI774032B - 用於非洲豬瘟病毒蛋白的重組桿狀病毒及其免疫組成物 - Google Patents

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Abstract

本揭露提供一種載體、一種重組病毒及其使用和製備方法。本揭露另提供一種含重組非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)的免疫組成物，其用於在施用該免疫組成物的宿主動物中誘導免疫反應。本揭露另提供一種套組及一種於動物樣品中檢測非洲豬瘟病毒抗原存在之方法。

Description

用於非洲豬瘟病毒蛋白的重組桿狀病毒及其免疫組成物
本揭露係涉及載體、病毒及其製備和使用方法。本揭露尤係涉及表現目標基因產物的重組載體，以及由其所獲得的重組病毒，並涉及受此種載體及病毒所感染、轉化或轉染的細胞或昆蟲。此外，本揭露另涉及針對非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)誘導免疫反應的載體和病毒，以及具有免疫性的和產生免疫性的此類組成物，或對ASFV感染賦予保護免疫性的疫苗組成物。本揭露內容還涉及用於製備和使用此類載體和組成物以及其產物的用途和方法，以及由此產生的產物，例如用於檢測ASFV的方法及套組。
豬係提供高質量蛋白質的重要來源，並於畜牧業和經濟中貢獻了重要份額。然而，養豬業備受好幾種傳染病的威脅。在這些疾病中，當前又尤以非洲豬瘟(ASF)備受關注，特別是自2018年傳入中國並於中國迅速傳播之後，中國係為豬肉的主要消費國，全球近半之豬隻皆於此飼養。非洲豬瘟病毒(ASFV)導致幾乎所有受感染的豬和野豬迅速死亡。礙於疫苗的缺乏，某些地區又有被感染的野生豬科動物而使控制更加複雜。由於ASF是世界動物衛生組 織(World Organisation for Animal Health，OIE)的應通報疾病，其被引入新國家或地區將導致貿易限制措施的實施，因而可能造成嚴重的經濟損失。然此種疾病之控制係需要國際間的合作，故於疫苗和其他控制策略之開發係存在巨大的需求缺口。
非洲豬瘟病毒(ASFV)是一種具有套膜的病毒(enveloped virus)，屬於非洲豬瘟病毒科(Asfarviridae)非洲豬瘟病毒屬(Asfivirus)，其基因組係由具末端反向重複之170至190kb的線性雙股去氧核糖核酸(dsDNA)分子所組成。所述病毒基因組編碼大於50種之結構蛋白及數種非結構蛋白。許多病毒蛋白已進行表現並測試，以保護豬隻免受ASFV感染。然而，此些早期開發的疫苗不是失效，就是僅對豬隻提供部分保護。經證明，減毒活病毒係較次單位疫苗(subunit vaccine)更具效果。但此些疫苗導致慢性ASFV感染，並顯示包括肺炎、流產、運動障礙、病灶壞死甚至死亡等之副作用。因此，亟需一種有效且具安全性的疫苗。
於一方面，本揭露係提供一種用於治療和預防ASFV感染的組成物和方法。
另一方面，本揭露係涉及一種具抗原性的、免疫性的、產生免疫性的或疫苗的組成物，或用於在接種該組成物的宿主動物中誘導抗原的、產生免疫性的或免疫反應之治療組成物。該組成物係包含一重組病毒，如桿狀病毒，並且涉及在桿狀病毒的套膜上展示的ASFV蛋白或與桿狀病毒殼蛋白融合的 ASFV蛋白。在桿狀病毒表面上展示ASFV蛋白或蛋白次單元保留其自然構形，並增強所展示的ASFV蛋白或蛋白次單元的免疫原性。
另一方面，在本揭露中，桿狀病毒係作為載體來攜帶和展示ASFV蛋白或蛋白次單元，也作為佐劑，以增強所展示之蛋白或蛋白次單元的作用。此外，由於桿狀病毒會自受感染的細胞中釋出，毋需過多努力即可由培養基中收集疫苗抗原，故透過桿狀病毒展示具有減少純化蛋白質次單元的作用。
因此，本揭露係公開一種重組桿狀病毒，其係具有非洲豬瘟病毒(ASFV)之蛋白P72、P49、PE120R、P54、P30和CD2v中的至少一種或其片段或其組合。
於一實施態樣中，該重組桿狀病毒包含ASFV蛋白，其與一桿狀病毒蛋白或其片段融合。於一實施態樣中，該ASFV蛋白係展示在重組桿狀病毒的表面上，其中，該表面是桿狀病毒的衣殼或套膜。於另一實施態樣中，與一桿狀病毒蛋白或其片段融合的該ASFV蛋白係以其自然構形展示在該表面上。於另一實施態樣中，該ASFV蛋白P72、P49和PE120R中的至少一種係展示在該桿狀病毒衣殼的表面上。於又一實施態樣中，該ASFV蛋白P54、P30和CD2v中的至少一種係展示在該桿狀病毒套膜的表面上。於一實施態樣中，該桿狀病毒蛋白或其與該ASFV蛋白融合的片段係殼蛋白或外套膜蛋白。於另一實施態樣中，該桿狀病毒蛋白或其與ASFV蛋白融合的片段是VP39、融合(fusion,F)蛋白或GP64。
於一實施態樣中，該重組桿狀病毒係包括展示在該桿狀病毒衣殼上的ASFV蛋白P72、P49和PE120R中的至少一種，及同時展示在該桿狀病毒套膜上的ASFV蛋白P54、P30和CD2v中的至少一種。
於另一實施態樣中，該重組桿狀病毒係表現一種佐劑蛋白。於另一實施態樣中，該佐劑蛋白係顆粒性白血球巨噬細胞群叢刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GMCSF)、趨化因子C-C模體配體25(chemokine C-C motif ligand 25，CCL25)或趨化因子C-C模體配體29(chemokine C-C motif ligand 29，CCL29)。
本揭露另涉及一選殖載體，其生產該重組桿狀病毒。
本揭露之另一面係涉及一種免疫組成物，其包含如上所述之重組桿狀病毒，並涉及一種用於在能對ASFV產生免疫反應的宿主中誘導對ASFV的免疫反應之方法，其係包括對該宿主投予該免疫組成物。
在另一方面，本揭露係涉及一種受如上所述之重組桿狀病毒感染的細胞。於一實施態樣中，該細胞係在該細胞表面上展示ASFV蛋白。在另一方面，本揭露係涉及一種用於在宿主中檢測ASFV之方法，其係包括自該細胞及由該宿主取得之樣品間檢測一複合物之形成。該檢測係透過免疫測定法、反向免疫電泳(counter immuno-electrophoresis)、放射免疫測定法、放射免疫沉澱測定法、酵素聯結免疫吸附測定法、墨點免疫測定法、競爭抑制測定法或三明治測定法進行。自該宿主取得之樣品係可含有抗原性分子的任何生物物質，例如血清或抗血清。於一實施態樣中，該宿主為豬。
在另一方面，本揭露係涉及一種套組，其係包括一個或多個如上所述之細胞及一種用於免疫檢測的試劑。
從以下結合附圖的詳細描述中，將能更容易地理解本揭露。
圖1係顯示表現卡匣之組織以及質體pTriEx-VP39-P72、pTriEx-P72-VP39、pTriEx-P72、pTriEx-P54、pTriEx-CD2v、pTriEx-P30和pTriEx-GMCSF之構建圖，以用於膜錨定(membrane-anchored)之重組桿狀病毒的生成，分別為VP39-P72-Bac、P72-VP39-Bac、P72-Bac、P54-Bac、CD2v-Bac、P30-Bac和GMCSF-Bac。TM：桿狀病毒套膜醣蛋白64(GP64)跨膜域(transmembrane domain，TM)；CTD：GP64細胞質尾域(cytoplasmic tail domain，CTD)；SP：蜜蜂蜂毒信號肽；6H：6xHis標籤。
圖2A至圖2G係顯示在感染VP39-P72-Bac、P72-VP39-Bac、P72-Bac、P54-Bac、CD2v-Bac、P30-Bac和GMCSF-Bac的Sf21細胞於感染後3天之細胞裂解物，其病毒感染劑量(multiplicity of infection，MOI)為5，所檢測之ASFV的VP39-P72(圖2A)、P72-VP39(圖2B)、P72(圖2C)、P54(圖2D)、CD2v(圖2E)、P30(圖2F)和GMCSF(圖2G)蛋白之西方墨點圖。N：陰性對照組；1至13：以不同構建體獲得之細胞裂解物；wt：野生型AcMNPV病毒感染的Sf21細胞之細胞裂解物。
圖3A至圖3C係顯示用於檢測ASFV抗體和抗血清之基於細胞的ELISA結果。圖3A係顯示抗His抗體的ELISA讀取值；圖3B係顯示ASFV豬血清的ELISA讀取值；以及圖3C係顯示對照血清的ELISA讀取值。由左而右：P72、VP39-P72、P72-VP39、P30、P54和wt(野生型)。
一方面，本揭露係涉及一種重組病毒，如重組桿狀病毒，其係包含ASFV的核苷酸序列。依據本揭露，該重組桿狀病毒係表現外源ASFV基因的 基因產物。將編碼ASFV抗原蛋白的特定序列插入桿狀病毒載體，並將所得之重組桿狀病毒用於感染動物。ASFV基因在細胞或動物中的表現產物可導致動物對ASFV的免疫反應。因此，本揭露之重組桿狀病毒可用於免疫組成物或疫苗中，以對有其需要之受試者誘導免疫反應。
本揭露另涵蓋一種載體，其編碼和表現等效核苷酸序列，例如：既不改變功能性，也不改變所考慮基因或由此基因編碼的該多肽的抗原性之序列。因代碼簡併性而不同的序列係涵蓋於其中。於一實施態樣中，該序列是針對昆蟲細胞進行密碼子優化的。
實施例中使用的核苷酸序列係源自公開資料庫。舉例來說，P72係取自GenBank登錄號MH722357.1；P54係取自GenBank登錄號MH735140.1；CD2v係取自GenBank登錄號MH735142.1；P30係取自GenBank登錄號MH735141.1；GMCSF係取自GenBank登錄號U67175.1。此些序列或其片段或其編碼抗原蛋白或目的表位的區域也可用於本揭露中。
本揭露另涵蓋於本文和於本文引用的文獻中使用的等效序列，例如能在高度嚴謹條件下與核苷酸序列雜交之序列(參見，如Sambrook等人(1989))。在等效序列中，還述及保留完整序列之抗原性的基因片段，例如，目標表位(epitope of interest)。
在進一步詳細描述本揭露的實施態樣之前，應注意，如本文和所附申請專利範圍中所使用的，單數形式「一」、「一個」及「該」係包括複數對象，除非上下文清楚地另有規定。
除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語係具有與本揭露所屬領域之一般技術者通常所理解相同之含義。除非另有說明或本揭露所屬領域之一般技術者已知，否則所有給定的範圍及數值可在1%至5%之間變 化。因此，通常從說明書和申請專利範圍中省略術語「約」。應當理解，類似於或等同於本文所述的方法和材料之任何方法及材料都可用於本揭露的實施或測試中。本說明書中所述之所有公開資料均係以引用的方式併入本文中，以結合所引用之公開資料所揭示及描述的物質、賦形劑、載體和方法。對任何公開資料之引用不應理解為承認本揭露已根據先前公開的資料而被提早揭露。
除非另有說明，否則本揭露將採用分子生物學、微生物學、重組DNA技術、蛋白質化學和免疫學之常規技術，其在本揭露所屬領域之一般技術範圍內。此些技術於相關文獻中已有充分的說明。
在本揭露的上下文中，術語「免疫反應」或「免疫性反應」係指，但不限於，對如本文所述和/或定義的一種或多種ASFV或組成物或免疫性組成物或疫苗所發展之細胞和/或抗體介導的免疫反應。通常，免疫或免疫性反應係包括但不限於以下一種或多種作用：抗體、B細胞、輔助性T細胞、抑制性T細胞和/或細胞毒性T細胞的產生或活化，其係特異性針對一抗原，或如本文所述和/或定義的一種或多種ASFV中所包含的抗原或如本文所述和/或定義的組成物或免疫性組成物或疫苗。宿主將顯示治療性或保護性免疫(記憶)反應，從而增強對新感染的抵抗力和/或降低疾病的臨床嚴重性。這種保護藉由減少症狀的數量、症狀的嚴重性、或缺乏與野生型ASFV感染相關的一種或多種症狀，延遲病毒血症發作，降低病毒持續性，總體病毒載量的減少和/或病毒排泄的減少而呈現。
在本揭露的上下文中，術語「有效劑量」係指但不限於抗原量，其對施用該抗原之動物中引起或能引起減輕臨床症狀的免疫反應。
在本揭露的上下文中，術語「有效量」在組成物的上下文中係指一種能誘導免疫反應的免疫原性組成物的量，該免疫反應係降低動物感染發生 或減輕感染或疾病之嚴重程度。舉例來說，有效量係指每劑的溶菌斑形成單位(plaque forming unit，pfu)。換句話說，在治療的上下文中，術語「有效量」係指足以減少或改善非洲豬瘟的嚴重性或持續時間或其一種或多種症狀，以防止此疾病發展，引起此疾病的消退，並避免與此類疾病相關的一種或多種症狀的復發、發展、發作或進展，或增強或改善另一種療法或治療劑的預防或治療之治療量。
於一些實施態樣中，本揭露之免疫性組成物係包含一佐劑。如本文所述之「佐劑」係包括除抗原蛋白外能增強宿主免疫反應之任何物質。於一實施態樣中，其包括顯示於重組桿狀病毒表面之免疫因子和介白素，例如GMCSF(或GM-CSF，顆粒性白血球巨噬細胞群叢刺激因子)、CCL25(趨化因子(C-C模體)配體25)或CCL29(趨化因子(C-C模體)配體29)。於其他實施態樣中，該佐劑係包括氫氧化鋁、磷酸鋁和皂苷，例如Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Inc.，劍橋(麻薩諸塞州))、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals Inc.，伯明罕(阿拉巴馬州))、油包水乳化液、水包油乳化液和水包油包水乳化液。該乳化液係可基於輕質液態石蠟油(歐洲藥典類型)；異戊二烯油，例如角鯊烷或角鯊烯；自烯烴(例如異丁烯或癸烯)寡聚而得之油；含直鏈烷基之酸或醇的酯，如植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三-(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；支鏈脂肪酸或醇之酯，如異硬脂酸酯。該油與乳化劑結合係用以形成乳液。該乳化劑係可為非離子表面活性劑，如脫水山梨醇、甘露糖醇(例如脫水甘露醇油酸酯)、二醇、聚甘油、丙二醇和油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸或羥基硬脂酸等的酯，其任選地被乙氧基化，以及聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，如Pluronic產品，例如L121。
如本文所述和/或定義的免疫性組成物和/或疫苗可使用與其他藥物組成物相似的技術來進行配製。因此，如本文所述和/或定義的佐劑及一種或多種ASFV係可以冷凍乾燥形式儲存，並在給藥前於生理上可接受的溶媒中重配製以形成懸浮液。或者，如本文所述和/或定義的佐劑及一種或多種ASFV可儲存於載體中。於一些實施態樣中，載體是無菌溶液，如無菌緩衝溶液，例如磷酸鹽緩衝鹽水。於載體中結合如本文所述和/或定義的佐劑及一種或多種ASFV以提高免疫性組成物的免疫有效性之任何方法都是合適的。
如本文所述和/或定義的組成物和/或免疫性組成物和/或疫苗之單劑量的體積係可變化的，但通常在常規疫苗合理使用的範圍內。
本揭露之製劑係包含如本文所述和/或定義的組成物和/或免疫性組成物和/或疫苗的有效免疫量，以及生理上可接受的載體。疫苗係包括如本文所述和/或定義的免疫性組成物之有效免疫量及生理上可接受的載體。該製劑應適合所使用之投藥方式。
如有需要，本文所述和/或定義的組成物和/或免疫性組成物和/或疫苗也可包含少量的濕潤劑或乳化劑或pH緩衝劑。如本文所述和/或定義的組成物和/或免疫性組成物和/或疫苗係可為液態溶液、懸浮液、乳劑、片劑、丸劑、膠囊劑、緩釋製劑或粉劑。口服製劑係可包括標準載體，例如藥用級的甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。
在本揭露的上下文中，術語「藥學上可接受的或獸醫學上可接受的載體」係包括任何所有溶劑、分散介質、包衣、佐劑、穩定劑、稀釋劑、防腐劑、抗菌和抗真菌劑、等滲劑，吸附延遲劑之類的。於一些實施態樣中，本揭露可包括冷凍乾燥的免疫性組成物，且於本揭露所用之穩定劑係包括用於冷凍乾燥(lyophilization)或凍結乾燥(freeze-drying)的穩定劑。
如本文所述和/或定義的組成物和/或免疫性組成物和/或疫苗可以藉由任何方便的方式進行投藥。於一實施態樣中，重組桿狀病毒或其表現產物、本揭露的組成物如免疫、抗原或疫苗組成物或治療組成物之投藥程序係可通過腸胃外途徑(例如皮內、肌內或皮下)進行投藥。此種投藥方式引起全身性的免疫反應、或體液性的或細胞介導的反應。
所述組成物和/或免疫性組成物和/或疫苗係可單獨施用，或可與組成物(例如：與其他免疫、抗原或疫苗或治療組成物)共同施用或相繼施用，從而提供多價或「雞尾酒」或結合本揭露的組成物及採用其之方法。同樣地，可透過將如特定宿主動物的年齡、性別、體重、種類和狀況以及投藥途徑之類的因素列入考量，來判定投藥之成分及方式(順序或共同給藥)及劑量。
實施例
以下實施例進一步描述本揭露的示例性實施態樣，但不限制本揭露的範圍。
實施例1：重組病毒的構建及製備
質體構建
ASFV免疫性蛋白P72(SEQ ID NO.9)、P54(SEQ ID NO.10)、CD2v(SEQ ID NO.11)、P30(SEQ ID NO.12)和GMCSF(SEQ ID NO.13)以昆蟲細胞優化的密碼子由Tools(台灣，Tools)進行合成，然後選殖至pTriEx-4質體(Novagen，Merck Biosciences，Darmstadt，德國)中。經選殖的ASFV免疫性蛋白的胺基酸序列如下表1所示。
表1、經選殖的ASFV免疫性蛋白的胺基酸序列
Figure 109126054-A0202-12-0011-3
Figure 109126054-A0202-12-0012-4
pTriEx-4質體係包含三分的p10(tripartite p10)、巨細胞病毒(CMV)和T7啟動子，便於在昆蟲、哺乳動物及細菌細胞中表現。P72、P54、CD2v、P30及GMCSF基因係由pTriEx-4質體中的TriEx啟動子驅動，接續有HM信號蛋白(蜜蜂蜂毒信號肽)和6xHis標籤，以分別產生pTriEx-VP39-P72、pTriEx-P72-VP39、pTriEx-P72、pTriEx-P54、pTriEx-CD2v、pTriEx-P30及pTriEx-GMCSF質體(圖1)，其中，含有密碼子優化的全長P72和AcMNPV(加州苜蓿夜蛾核多角體病毒)衍生的VP39(SEQ ID NO.14)基因的pTriEx-VP39-P72和pTriEx-P72-VP39用於產生衣殼融合重組桿狀病毒VP39-P72-Bac和P72-VP39-Bac。pTriEx-P72、pTriEx-P54、pTriEx-CD2v、pTriEx-P30和pTriEx-GMCSF係包含與GP64跨膜域(TM)(SEQ ID NO.15)及GP64細胞質域(CTD)(SEQ ID NO.16)相接的密碼子優化的P72、P54、CD2v、P30及GMCSF基因，用於膜錨定。經選殖的VP39、GP64跨膜域(TM)和GP64細胞質域(CTD)的胺基酸序列係顯示於下表2。
表2、經選殖的VP39、GP64跨膜域的胺基酸序列
Figure 109126054-A0202-12-0013-5
Figure 109126054-A0202-12-0014-6
將所有質體構建體插入由sv40-pag啟動子驅動的mCherry螢光蛋白基因作為報導基因。mCherry基因係由雙sv40-pag啟動子驅動，用於在Sf21和哺乳動物細胞中發射報導螢光。該質體係根據In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech Laboratories Inc.，加利福尼亞州，美國)的說明手冊構建而成。由此分別獲得了質體pTriEx-VP39-P72、pTriEx-P72-VP39、pTriEx-P72、pTriEx-P54、pTriEx-CD2v、pTriEx-P30和pTriEx-GMCSF。
重組桿狀病毒製備
藉由Cellfectin(Life Technologies，加利福尼亞州，美國)將pTriEx-VP39-P72、pTriEx-P72-VP39、pTriEx-P72、pTriEx-P54、pTriEx-CD2v、pTriEx-P30和pTriEx-GMCSF質體與FlashBAC(Mirus，威斯康辛州，美國)DNA共轉染到Sf21細胞中生產重組桿狀病毒VP39-P72-Bac、P72-VP39-Bac、P72-Bac、 P54-Bac、CD2v-Bac、P30-Bac和GMCSF-Bac。mCherry基因產物及6xHis標籤之表現係用於追踪適宜的病毒感染和蛋白質表現。
病毒滴定測定(透過50%組織培養物感染劑量，TCID50)
將Sf21細胞(4 x 104)接種在96孔板中，並在室溫(26℃)培育至少1至2小時以完全附著。將重組桿狀病毒製劑的病毒溶液以含有TC-100昆蟲培養基的10%胎牛血清(FBS)終點稀釋至不同濃度(10-1至10-10)。將Sf21細胞接種板每個孔中的培養基替換為每一稀釋液中的100μL病毒溶液。每一稀釋液重複八次。為了有效感染病毒，使板於2,000rpm轉速下離心30分鐘，並在觀察前置於26℃的培養箱中放置4至5天。然後透過計算每種病毒稀釋度下感染孔的數目來判斷病毒滴定量。
選擇具有高滴定量的VP39-P72-Bac、P72-VP39-Bac、P72-Bac、P54-Bac、CD2v-Bac、P30-Bac和GMCSF-Bac病毒複製體，並將其用於重組桿狀病毒的生產。
實施例2：重組病毒表現ASFV蛋白及融合蛋白
為證實重組病毒在細胞中表現ASFV蛋白，進行了蛋白質墨點分析。具體地，在Sf21細胞中繁殖重組桿狀病毒VP39-P72-Bac、P72-VP39-Bac、P72-Bac、P54-Bac、CD2v-Bac、P30-Bac和GMCSF-Bac後，將Sf21細胞裂解並進行西方墨點分析，以用於評估VP39-P72、P72-VP39、P72、P54、CD2v、P30和GMCSF蛋白的表現。
為進行西方墨點分析，收集細胞裂解物，並於Laemmli樣品緩衝液(TOOLS，TAAR-TB2，台灣)中煮沸10分鐘，然後置入具濃度梯度的十二 烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺電泳凝膠(SDS-PAGE)(HR濃度梯度凝膠溶液，TOOLS，台灣)。以電泳緩衝液(200mM甘胺酸、1% SDS、2.5mM Tris/HCl)將樣品於10%的SDS-PAGE中解析。經解析後，以轉移緩衝液(25mM Tris、192mM甘胺酸、10%甲醇)將樣品在300mA和4℃條件下轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上90分鐘。將含有蛋白質樣品的PVDF膜在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中短暫洗滌，並在室溫下用在PBS中的5%脫脂牛奶進行封閉反應1小時。以特異性抗體檢測該蛋白質樣品。以抗6xHis標籤小鼠單株抗體(1：5,000稀釋，EnoGene，紐約州，美國)檢測蛋白質信號。然後，將接合至辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)的抗小鼠山羊IgG(1：5,000稀釋液，Invitrogen，加利福尼亞州，美國)用作信號檢測的第二抗體。透過使用Clarity Western ECL墨點受質(Bio-Rad)和Classic Blue Autoradiography膜BX(Life Science，密蘇里州，美國)檢測蛋白帶。
源自VP39-P72-Bac(圖2A)、P72-VP39-Bac(圖2B)、P72-Bac(圖2C)、P54-Bac(圖2D)、CD2v-Bac(圖2E)、P30-Bac(圖2F)和GMCSF-Bac(圖2G)的各別單一病毒選殖體所表現之VP39-P72、P72-VP39、P72、P54、CD2v、P30和GMCSF蛋白的陽性信號係分別在115kDa、115kDa、74kDa、30kDa、50kDa、35kDa和30kDa的大小被觀察到。作為陰性對照，在野生型AcMNPV病毒感染的Sf21細胞的裂解物中係未觀察到可檢測信號。
實施例3：在重組桿狀病毒感染的細胞表面展示ASFV蛋白
重組桿狀病毒感染的細胞在其細胞表面展示ASFV蛋白，可用於提供基於細胞的ELISA(酵素免疫測定法)以檢測ASFV病毒。
為確認ASFV蛋白在用重組桿狀病毒感染的細胞表面上的展示，進行了免疫螢光測定。具體而言，將Sf21細胞(2×105)接種到8孔Millicell EZ載玻片(Millipore)中，並使用感染劑量(MOI)為1的重組桿狀病毒轉導細胞。將載玻片以2,000rpm轉速在室溫下離心30分鐘，然後在26℃下培育48hpi(即感染後培育48小時)。然後，將細胞以4%三聚甲醛固定，接著用3%牛血清白蛋白(BSA)封閉1小時。然後，將細胞與第一抗體於4℃下隔夜培育。以抗6xHis標籤小鼠單株抗體(1：5,000稀釋，EnoGene，紐約州，美國)檢測蛋白質信號。經隔夜培育後，將細胞以DPBST(Dulbecco的磷酸鹽緩衝鹽水，DPBS加入0.1%的Tween 20)洗滌3次，並與1：200稀釋的Alexa Fluor 488抗小鼠IgG山羊第二抗體(Invitrogen)一起培育。使用Fluor 63×/1.40 NA油浸物鏡，透過Zeiss雷射光共聚焦顯微鏡(LSM780)獲得影像。所有影像係使用1024×1024直徑像素擷取，並通過ZEN 2010軟體(Zeiss)進行螢光強度分析。
結果顯示在以MOI為1感染後3天，用於感染Sf21細胞的重組桿狀病毒P72-VP39-Bac、P54-Bac、P30-Bac和CD2v-Bac係表現該病毒蛋白，並分別在細胞表面上顯示P72-VP39、P54、P30和CD2v蛋白。
實施例4：在重組桿狀病毒P72-VP39-Bac、P54-Bac、P30-Bac和CD2v-Bac表面展示的病毒蛋白之電子顯微鏡觀測
自P72-VP39-Bac接種的、P54-Bac接種的、P30-Bac接種的和CD2v-Bac接種的Sf21細胞中收集上清液。透過以10,000rpm轉速離心30分鐘粗略地去除細胞碎片，然後收集上清液並置於SW28管(Beckman，加利福尼亞州，美國)中的25%(w/w)蔗糖墊，以24,000rpm轉速於4℃下離心80分鐘獲得病毒沉澱物。在丟棄上清液後，將病毒沉澱物重懸於1mL的PBS中，然後在28,000rpm 轉速下進行25%至60%(w/w)的蔗糖濃度梯度處理3小時。收集病毒粒子並用PBS洗滌以除去蔗糖。然後將這些純化的病毒粒子固定，用抗His免疫金進行標記，並透過電子顯微鏡(EM)以本領域所述之負染色觀察。簡而言之，將等份的10μL病毒粒子製劑置於碳塗層的網格上，靜置5分鐘。然後，用2%的磷鎢酸(PTA)將網格染色1分鐘，接著將多餘的PTA排乾並完全乾燥。在EM下直接觀測該網格。
為進行免疫金標記，將病毒粒子置於膠棉塗層的EM網格上5分鐘。以濾紙在網格邊緣輕輕吸去多餘的病毒粒子後，將抗His標籤抗體(Invitrogen)添加至該網格中，並在室溫下培育1小時。然後，將網格在室溫下於PBS中洗滌10秒鐘共六次，並與6nm金結合的抗小鼠IgG一起培育1小時。經於PBS中洗滌六次後，用2%的PTA染色網格1分鐘，排乾並完全乾燥，然後在EM下進行觀測。
結果顯示，以本揭露的質體及重組桿狀病毒表現的P54、P30和CD2v蛋白係被定位並顯示在桿狀病毒上，並且該病毒蛋白P72與VP39表現在桿狀病毒之衣殼。
實施例5：用於檢測ASFV抗原的基於細胞的ELISA
使用重組桿狀病毒P72-Bac、VP39-P72-Bac、P72-VP39-Bac、P54-Bac和P30-Bac分別感染Sf21細胞，並於Sf21細胞表面展示P72、P54和P30蛋白。在His標籤抗體的抗體識別判定前，將細胞以4%三聚甲醛固定，並以0.2%的Triton進行通透處理。然後，將感染細胞包覆的孔盤以100μL的PBST(含0.05% Tween 20的PBS)洗滌3次，並於室溫下與His標籤抗體培育1小時。經洗滌後，將100μL結合HRP的抗小鼠山羊IgG(1：5,000稀釋，Invitrogen，加利福尼亞 州，美國)用作第二抗體，培育1小時，然後與3,3'-5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)物質反應以用於信號檢測。
將細胞與不同稀釋倍數的抗His抗體、抗ASFV抗血清或對照血清進行雜交反應。抗ASFV抗血清係由Pirbright Institute合作實驗室的Linda Dixon博士提供，並由感染ASFV的豬中取得，故含抗ASFV的抗體。對照血清係由台灣大學獸醫學院的張惠文博士提供，並由健康動物中取得。經發現，展示在細胞表面上的病毒蛋白可被抗His抗體(圖3A)及抗ASFV抗血清(圖3B)所識別，並顯現黃色作為陽性信號，但對照血清(圖3C)係未顯示。這表明基於細胞的ELISA，其利用本揭露的重組桿狀病毒將病毒蛋白展示在細胞表面，可與取自受ASFV感染的動物之抗血清一起使用並檢測ASFV抗原的存在。
雖本揭露已參照特定實施態樣進行描述，但本揭露所屬技術領域中具有通常知識者當理解，只要不脫離本揭露的技術精神或必要特徵，則可將本揭露以其它特定形式體現。因此，以上所描述的實施例係在各方面都被認為是用以說明而非用以限制。再者，本揭露的請求項範圍係包括所有衍生自本揭露的意涵與範圍以及其均等物之所有改良及變更。
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Figure 109126054-A0305-02-0021-1
Figure 109126054-A0202-12-0021-8
Figure 109126054-A0202-12-0022-9
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<210> 2
<211> 183
<212> PRT
<213> 非洲豬瘟病毒
<400> 2
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<210> 3
<211> 345
<212> PRT
<213> 非洲豬瘟病毒
<400> 3
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<210> 4
<211> 198
<212> PRT
<213> 非洲豬瘟病毒
<400> 4
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<210> 5
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 部分GMCSF序列
<400> 5
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<210> 6
<211> 346
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 棒狀病毒VP39部分序列
<400> 6
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Figure 109126054-A0202-12-0034-24
<210> 7
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GP64跨膜域
<400> 7
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<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GP64細胞質域
<400> 8
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<210> 9
<211> 1950
<212> DNA
<213> 非洲豬瘟病毒
<400> 9
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<210> 10
<211> 549
<212> DNA
<213> 非洲豬瘟病毒
<400> 10
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<210> 11
<211> 1077
<212> DNA
<213> 非洲豬瘟病毒
<400> 11
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<211> 594
<212> DNA
<213> 非洲豬瘟病毒
<400> 12
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<210> 13
<211> 381
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<213> 人工序列
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<223> 部分GMCSF核苷酸序列
<400> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 棒狀病毒VP39部分序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> GP64跨膜域
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> GP64細胞質域
<400> 16
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Claims (20)

  1. 一種重組桿狀病毒，係包含非洲豬瘟病毒蛋白P72、P49、PE120R、P54、P30和CD2v或其片段的至少一種或其組合，其中，該非洲豬瘟病毒蛋白係與桿狀病毒蛋白或其片段融合。
  2. 如請求項1所述之重組桿狀病毒，其中，與該非洲豬瘟病毒蛋白融合的該桿狀病毒蛋白係殼蛋白或套膜蛋白。
  3. 如請求項2所述之重組桿狀病毒，其中，與該非洲豬瘟病毒蛋白融合的該桿狀病毒蛋白係VP39、融合蛋白F或GP64。
  4. 如請求項1所述之重組桿狀病毒，其中，該非洲豬瘟病毒蛋白或其片段係展示於該重組桿狀病毒的表面上。
  5. 如請求項4所述之重組桿狀病毒，其中，該表面係桿狀病毒之衣殼或套膜。
  6. 如請求項5所述之重組桿狀病毒，其中，該非洲豬瘟病毒蛋白P72、P49和PE120R中的至少一種係展示於該桿狀病毒之該衣殼的該表面上。
  7. 如請求項5所述之重組桿狀病毒，其中，該非洲豬瘟病毒蛋白P54、P30和CD2v中的至少一種係展示在該桿狀病毒之該套膜的該表面上。
  8. 一種免疫組成物，係包含至少一種如請求項1所述之重組桿狀病毒及其藥學上可接受的載體。
  9. 如請求項8所述之免疫組成物，另包括佐劑。
  10. 如請求項9所述之免疫組成物，其中，該佐劑係表現顆粒性白血球巨噬細胞群叢刺激因子、趨化因子C-C模體配體25或趨化因子C-C模體配體29的重組桿狀病毒。
  11. 一種如請求項1所述之重組桿狀病毒之用途，其係用於製備在有其需要之宿主中誘導對非洲豬瘟病毒的免疫反應的藥物。
  12. 一種受如請求項1所述之重組桿狀病毒感染的細胞。
  13. 一種用於在其宿主中檢測非洲豬瘟病毒之方法，係包括自如請求項12所述之細胞及由該宿主取得之樣品間檢測複合物之形成。
  14. 如請求項13所述之方法，其中，該檢測係透過免疫測定法、反向免疫電泳、放射免疫測定法、放射免疫沉澱測定法、酵素聯結免疫吸附測定法、墨點免疫測定法、競爭抑制測定法或三明治測定法進行。
  15. 如請求項13所述之方法，其中，該宿主係豬。
  16. 如請求項13所述之方法，其中，該樣品係血清。
  17. 如請求項16所述之方法，其中，該血清係抗血清。
  18. 一種套組，係包括如請求項1所述之非洲豬瘟病毒蛋白中的任一種及用於免疫檢測的試劑。
  19. 一種套組，係包括如請求項12所述之細胞及用於免疫檢測的試劑。
  20. 一種選殖載體，係包括核酸序列，其係用於編碼如請求項1所述之非洲豬瘟病毒蛋白中的任一種。
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