CN113122549B - 一种非洲猪瘟假病毒及其制备方法和预防或治疗非洲猪瘟病毒感染的药物 - Google Patents

一种非洲猪瘟假病毒及其制备方法和预防或治疗非洲猪瘟病毒感染的药物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种非洲猪瘟假病毒及其制备方法和预防或治疗非洲猪瘟病毒感染的药物。本发明第一方面提供了一种非洲猪瘟假病毒的制备方法，包括将非洲猪瘟病毒基因组中p30蛋白以及p248R蛋白的全基因序列分别导入pcDNA3.1载体中，构建得到重组质粒，随后用重组质粒转染293T细胞，并使用VSV‑ΔG假病毒感染293T细胞，得到非洲猪瘟假病毒。本发明提供了一种非洲猪瘟病毒假病毒的制备方法，通过该方法制备得到的非洲猪瘟假病毒无复制活性，生物安全性高，能够为非洲猪瘟病毒的研究、抗病毒制剂和疫苗评价提供强有力的筛选工具，具备广泛的应用价值。

Description

一种非洲猪瘟假病毒及其制备方法和预防或治疗非洲猪瘟病 毒感染的药物
技术领域
本发明涉及一种非洲猪瘟假病毒及其制备方法和预防或治疗非洲猪瘟病毒感染的药物，涉及基因工程和分子生物学技术领域。
背景技术
非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus）是一类基因组为双链大DNA病毒，属于非洲猪瘟病毒科，ASFV形态为正二十面体，直径约200纳米，由多层物质构成：中央为内含拟核的蛋白质核壳，由内向外分别还有一层脂质包膜和蛋白质衣壳。
非洲猪瘟病毒主要通过虫媒进行传播，具有极高的传染性和致病性，急性病例病程短、死亡率高。虽然猪瘟病毒的3D精细结构已经被破译，但直今仍未有特效疫苗或抗病毒药物。非洲猪瘟病毒的活病毒研究需要在P3实验室开展，而国内外P3实验室的数量有限，进一步限制了对该病毒的研究，因此，如何提供一种无复制活性、生物安全性高的非洲猪瘟假病毒，受到了越来越多的关注。
发明内容
本发明提供了一种非洲猪瘟假病毒及其制备方法，该假病毒无复制活性，安全性较高，有利于对非洲猪瘟病毒进行研究。
本发明还提供了一种预防和治疗非洲猪瘟病毒感染的药物，通过上述假病毒筛选得到。
本发明第一方面提供了一种非洲猪瘟假病毒的制备方法，包括如下步骤：
步骤1、将非洲猪瘟病毒基因组中p30蛋白以及p248R蛋白的全基因序列分别导入pcDNA3.1载体中，构建得到pcDNA3.1-ASF-p30重组质粒和pcDNA3.1-ASF-p248R重组质粒；
步骤2、使用所述pcDNA3.1-ASF-p30重组质粒和pcDNA3.1-ASF-p248R重组质粒转染293T细胞，随后用VSV-ΔG假病毒感染所述293T细胞中，感染两小时后去除所述VSV-ΔG假病毒，进行细胞培养；
步骤3、培养结束后，收集细胞上清液，得到所述非洲猪瘟假病毒。
进一步地，步骤2之前，还包括将294T细胞贴壁培养8-12h。
进一步地，使用所述pcDNA3.1-ASF-p30重组质粒和pcDNA3.1-ASF-p248R重组质粒转染293T细胞具体包括如下步骤：
将培养好的293T细胞放置于含10%FBS和1%青霉素或链霉素的DMEM培养基中，加入所述pcDNA3.1-ASF-p30重组质粒、pcDNA3.1-ASF-p248R重组质粒以及Vigofect高效真核转染试剂，在37℃、5% CO2下培养。
进一步地，使用0.9%的NaCl溶液稀释25μg的pcDNA3.1-ASF-p30重组质粒、25μg的pcDNA3.1-ASF-p248R重组质粒和7.5μL的Vigofect高效真核转染试剂至500μL，混合均匀后加入到细胞培养液中。
进一步地，用VSV-ΔG假病毒加入到所述293T细胞具体包括如下步骤：
使用无血清DMEM培养基稀释所述VSV-ΔG假病毒，使所述VSV-ΔG假病毒的RLU为300000-500000，随后感染所述293T细胞，继续在37℃、5% CO2下培养。
进一步地，加入所述pcDNA3.1-ASF-p30重组质粒、pcDNA3.1-ASF-p248R重组质粒以及Vigofect高效真核转染试剂后的培养时间为6h，加入VSV-ΔG假病毒稀释液后的培养时间为2h。
进一步地，步骤3包括：
使用PBS溶液清洗所述293T细胞，随后在含10% FBS的DMEM培养基中在37℃、5%CO2条件下继续培养48h，培养结束后收取上清液，经离心、过滤后得到所述非洲猪瘟假病毒。
本发明第二方面提供了一种非洲猪瘟假病毒，所述非洲猪瘟假病毒经上述任一所述的制备方法制备得到。
本发明第三方面提供了一种预防或治疗非洲猪瘟病毒感染的药物，所述药物中包括Erythromycin Estolate。
进一步地，所述Erythromycin Estolate的浓度不低于80μM。
本发明的实施，至少具有以下优势：
1、本发明提供了一种非洲猪瘟病毒假病毒的制备方法，经该制备方法制备得到的非洲猪瘟假病毒包括VSV-ΔG骨架载体和2种非洲猪瘟病毒包膜蛋白，该假病毒无复制活性，生物安全性高，能够为非洲猪瘟的研究、抗病毒制剂和疫苗评价提供强有力的筛选工具，具备广泛的应用价值。
2、通过该假病毒筛选到大环内酯类抗生素药物Erythromycin Estolate能够抑制非洲猪瘟假病毒感染靶细胞，并经免疫荧光测试显示，该药物在80μM的浓度下就能很好地抑制非洲猪瘟活病毒的感染，能够为作为应对非洲猪瘟暴发的预防或治疗储备药物。
附图说明
图1为本发明一实施例提供的非洲猪瘟假病毒对敏感细胞的感染活性检测结果图；
图2为本发明一实施例提供的VSV病毒对非敏感细胞的感染活性检测结果图；
图3为本发明一实施例提供的非洲猪瘟假病毒包膜蛋白p248R表达的检测结果图；
图4为Erythromycin Estolate对非洲猪瘟假病毒感染的抑制效果图；
图5为Erythromycin Estolate对不同时间感染非洲猪瘟假病毒的抑制率；
图6为Erythromycin Estolate对不同阶段感染非洲猪瘟假病毒的抑制率；
图7为感染非洲猪瘟荧光病毒后的巨噬细胞的荧光检测图；
图8为感染非洲猪瘟荧光病毒后的巨噬细胞的荧光分析结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 制备非洲猪瘟假病毒
步骤1、将非洲猪瘟病毒基因组中p30蛋白以及p248R蛋白的全基因序列分别导入pcDNA3.1质粒中，构建得到pcDNA3.1-ASF-p30重组质粒和pcDNA3.1-ASF-p248R重组质粒，此步骤由南京金斯瑞生物技术有限公司合成并构建；
编码p30蛋白和p248R蛋白的基因序列可从NCBI数据库里获得，网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ，选取毒株编号为MK333180，p30蛋白具有SEQIDNO：1所示的氨基酸序列，p248R蛋白具有SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。
步骤2、将293T细胞（实验室保存，8´105个）铺10cm细胞培养皿（购自于ThermoScientific公司，货号150464 ），贴壁培养8-12个小时；
步骤3、将培养好的细胞放置于8mL含10% FBS（购自Gibco公司，货号10270-106）和1%青霉素溶液（购自美仑生物，货号MA0110）的DMEM培养基（购自美仑生物，货号MA0212）中；用0.9% NaCl稀释25μg的 pcDNA3.1-ASF-p30重组质粒、25μg的pcDNA3.1-ASF-p248R重组质粒以及7.5μL Vigofect高效转染试剂（购于威格拉斯生物技术有限公司，货号T001）至500μL，震荡混匀后，静置5分钟，将静置后混合溶液逐滴加入到细胞培养液中，在37℃、5% CO2条件下培养6小时。
同时，制备不含质粒只含转染试剂的溶液，并转染293T细胞，处理方法如上，即设置阴性对照。
步骤4、培养6小时后，用无血清DMEM培养基稀释VSV-ΔG假病毒（RLU：302630），震荡混匀后加入细胞培养液中，在37℃、5% CO2条件下培养2小时。
步骤5、培养2小时后，用PBS溶液清洗293T细胞3次，过程中保持动作的轻柔，保证293T细胞的贴壁，更换10mL含10%FBS的DMEM培养基，在37℃、5% CO2条件下继续培养48小时；
步骤6、培养48小时后，收集细胞上清液，并在3000转下离心10分钟，再使用0.45μm滤膜过滤，取上清液于-80℃下保存备用。
本发明进一步实施例1得到的假病毒进行分析验证，具体地：
（一）非洲猪瘟假病毒感染敏感细胞的Luciferase检测
1、1 ´104/孔的Vero细胞、BHK21细胞和RD细胞（均由本实验室保存）铺于96孔细胞培养板（购于NUNC公司，货号167008）中，在37℃、5% CO2条件下培养12小时；
2、将实施例1制备得到的非洲猪瘟假病毒用无血清DMEM培养基1:1稀释后加入96孔细胞培养板中，每孔100μL，同时将VSV病毒用无血清DMEM培养基1:1稀释后加入96孔细胞培养板中，每孔100μL，设置阴性对照组，在37℃、5% CO2条件下培养12小时；
3、培养12小时后，更换含1% FBS的DMEM培养基，每孔100μL，继续在37℃、5% CO2条件下培养48小时；
4、培养48 h后，弃去上清液并用PBS洗涤细胞一次，加入50μL细胞裂解液（购于Promega公司，货号0000389797）常温裂解1h；吸取40μL裂解上清加入96孔检测板，加入40μL的Renilla Luciferase substrate（购于Promega公司，货号 E2820）后，马上检测荧光值。
图1为本发明一实施例提供的非洲猪瘟假病毒对敏感细胞的感染活性检测结果图，图2为本发明一实施例提供的VSV病毒对非敏感细胞的感染活性检测结果图，如图1-2所示，该假病毒能够成功感染Vero细胞、BHK21细胞等易感细胞且不感染非敏感细胞RD细胞，阴性对照VSV病毒可感染RD细胞，表明本发明提供的非洲猪瘟假病毒与实际的非洲猪瘟病毒具有同样的感染特异性，可用于非洲猪瘟病毒的研究，并且安全性较高。
（二）检测包膜蛋白p248R在假病毒上的表达
1、选取非洲猪瘟基因组中p248R蛋白的全基因序列并在序列末尾添加His标签序列，构建至pcDNA3.1载体上，得到ASF-p248R-His重组质粒；
2、将293T细胞铺10cm细胞培养皿，贴壁培养8-12个小时；
3、将培养好的细胞放置于8mL含10%FBS的DMEM培养基中；用0.9% NaCl稀释25μg的pcDNA3.1-ASF-p30质粒、，16μg的pcDNA3.1-ASF-p248R和8μg ASF-p248R-His重组质粒以及7.5μL Vigofect高效转染试剂至500μL，震荡混匀后，静置5分钟，将静置后混合溶液逐滴加入到细胞培养液中，在37℃、5% CO2条件下培养6小时；
4、培养6小时后，用无血清DMEM培养基1ml稀释VSV-ΔG假病毒，震荡混匀后加入细胞培养液中，在37℃、5% CO2条件下培养2小时；
5、培养2小时后，用PBS洗细胞3次，过程中保持动作的轻柔，保证293T细胞的贴壁，更换10mL含10%FBS的DMEM培养基，在37℃、5% CO2条件下培养48小时；
6、培养48小时后，收集细胞上清液，并在3000转下离心10分钟，再使用0.45μm滤膜过滤，取上清液于-80℃下保存备用。
7、将非洲猪瘟假病毒以及阴性对照VSV-ΔG假病毒用Triton裂解液在37℃条件下裂解1小时；
8、将裂解后的非洲猪瘟假病毒以及阴性对照VSV-ΔG假病毒进行SDS-PAGE凝胶电泳。
图3为本发明一实施例提供的非洲猪瘟假病毒包膜蛋白p248R表达的检测结果图，如图 3所示，本发明所建立的假病毒能够成功表达非洲猪瘟病毒的目的包膜蛋白p248R。
使用实施例1提供的非洲猪瘟假病毒进行药物的筛选，并发现已知药物Erythromycin Estolate对非洲猪瘟假病毒具有一定的抑制活性，结合以下实验进行说明：
（一）Erythromycin Estolate对非洲猪瘟假病毒感染的抑制活性检测
1、将Vero细胞铺于96孔板中，每孔1×104个，在37℃、5% CO2 条件下培养12-16 h；
2、使用无血清DMEM培养基在96孔圆底板（购于NUNC,货号310109008）中2倍比梯度稀释Erythromycin Estolate、Genkwanin（购自陶素生化，货号T6S0095），起始浓度为80μM，共稀释6个浓度，每孔加药体积为100 μL，每个梯度设置3个重复；
3、将100μL非洲猪瘟假病毒液（RLU:68392）加入本实施例步骤（2）中的96孔板（加药物及病毒孔记为药物孔），同时设置病毒感染的阳性对照组（有病毒无药物，即病毒孔）及阴性对照组（无病毒无药物，即无药物孔），病毒与药物37℃条件下孵育30分钟；
4、取步骤（3）中的各组混合液200 μL加入步骤（1）的96孔板中，37℃、5% CO2条件下培养12 h，更换培养基为含有1% FBS 的DMEM培养基；
5、48小时后，应用luciferase实验检测荧光值；
6、计算抑制率，计算公式为：抑制率 =（病毒孔-药物组）/（病毒孔-阴性对照孔）×100%。
图4为Erythromycin Estolate对非洲猪瘟假病毒感染的抑制效果图，如图4所示，Erythromycin Estolate能够抑制非洲猪瘟假病毒感染，IC50为7.2 μM，Genkwanin作为阳性对照也显示出抑制活性。
（二）Erythromycin Estolate抑制非洲猪瘟假病毒感染的作用时段检测
1、将Vero细胞铺于96孔板中，每孔1×104个，在37℃、5% CO2 条件下培养12-16 h；
2、在不同时间加入Erythromycin Estolate（60μM）：在假病毒感染前0.5 h加入Erythromycin Estolate，记录此时间点为-0.5 h；病毒与Erythromycin Estolate同时加入细胞，记录此时间点为0 h；病毒与细胞孵育不同时间 （0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8h）后，加入Erythromycin Estolate，分别记录时间点为0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8h。上述试验孔记为药物孔，同时设置病毒感染的阳性对照组（有病毒无药物，即病毒孔）及阴性对照组（无病毒无药物，即无药物孔）每组设置3个重复。在37℃、5% CO2条件下培养12 h，更换培养基为含有1% FBS的DMEM培养基。
3、48 h后，应用luciferase实验检测荧光值
4、计算抑制率，计算公式为：抑制率 =（病毒孔-药物组）/（病毒孔-阴性对照孔）×100%。
图5为本发明一实施例提供的Erythromycin Estolate对不同时间感染非洲猪瘟假病毒的抑制率，结果如图5所示，Erythromycin Estolate能够在非洲猪瘟假病毒进入细胞的早期阶段抑制感染。
（三）Erythromycin Estolate抑制非洲猪瘟假病毒感染的作用对象检测
1、将Vero细胞铺于96孔板中，每孔1×104个，在37℃、5% CO2条件下培养12-16 h；
2、Erythromycin Estolate（60μM）与细胞共孵育1 h后，一组将该药物洗去，再加入病毒，另一组不洗Erythromycin Estolate，直接加入假病毒。上述试验孔记为药物孔，同时设置病毒感染的阳性对照组（有病毒无药物，即病毒孔）及阴性对照组（无病毒无药物，即无药物孔）每组设置3个重复。37℃、5% CO2条件下培养12 h，更换培养基为含有1% FBS的DMEM培养基；
3、48 h后，应用luciferase实验检测荧光值；
4、计算抑制率，计算公式为：抑制率 =（病毒孔-药物组）/（病毒孔-阴性对照孔）×100%。
结果如图6所示，Erythromycin Estolate能够在非洲猪瘟假病毒进入细胞时作用于假病毒，抑制该病毒的感染。
（四）Erythromycin Estolate对非洲猪瘟活病毒感染的抑制活性检测
1、将猪骨髓来源的巨噬细胞（由中国农业科学院兰州兽医研究所保存）铺于12孔板中，每孔1×104个，在37℃、5% CO2 条件下培养12-16 h后待用；
2、Erythromycin Estolate（80μM）、Etythrosin B（80μM，阴性对照）与细胞在37℃培养箱内共孵育12 h；
3、加入非洲猪瘟荧光病毒（由0.5 PFU/CELL），37℃培养箱内感染2h，去掉病毒，继续用含10%FBS（货号SH30809.1，购于GE）的1640培养基（货号F8318-500ML，购于SIGMA）培养；
4、感染24h后，检测显微镜观察绿色荧光，并进行荧光分析。
图7为感染非洲猪瘟荧光病毒后的巨噬细胞的荧光检测图，其中，a为不含药物和病毒的巨噬细胞的荧光检测图，b为感染非洲猪瘟荧光病毒后的巨噬细胞的荧光检测图，c为添加药物Erythromycin Estolate并感染非洲猪瘟荧光病毒后的巨噬细胞的荧光检测图，d为添加药物Etythrosin B 并感染非洲猪瘟荧光病毒后的巨噬细胞的荧光检测图，如图7所示，相比于b、d中的荧光比例，c中荧光比例明显降低，可见Erythromycin Estolate可有效抑制非洲猪瘟病毒。
图8为感染非洲猪瘟荧光病毒后的巨噬细胞的荧光分析结果，进一步证实了Erythromycin Estolate对于非洲猪瘟活病毒有很好的抑制效果。
综上，通过本发明提供的制备方法制备得到的非洲猪瘟假病毒无复制活性，生物安全性高，能够为非洲猪瘟的研究、抗病毒制剂和疫苗评价提供强有力的筛选工具，具备广泛的应用价值。此外，通过该假病毒筛选到大环内酯类抗生素药物Erythromycin Estolate能够抑制非洲猪瘟假病毒感染靶细胞，并经免疫荧光测试显示，该药物在80μM的浓度下就能很好地抑制非洲猪瘟活病毒的感染，能够为作为应对非洲猪瘟暴发的预防或治疗储备药物。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 复旦大学
<120> 一种非洲猪瘟假病毒及其制备方法和预防或治疗非洲猪瘟病毒感染的药物
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 192
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p30蛋白
<400> 1
Met Asp Phe Ile Leu Asn Ile Ser Met Lys Met Glu Val Ile Phe Lys
1 5 10 15
Thr Asp Leu Arg Ser Ser Gln Val Val Phe His Ala Gly Ser Leu Tyr
20 25 30
Asn Trp Phe Ser Val Glu Ile Ile Asn Ser Gly Arg Ile Val Thr Thr
35 40 45
Ala Ile Lys Thr Leu Leu Ser Thr Val Lys Tyr Asp Ile Val Lys Ser
50 55 60
Ala Arg Ile Tyr Ala Gly Gln Gly Tyr Thr Glu His Gln Ala Gln Glu
65 70 75 80
Glu Trp Asn Met Ile Leu His Val Leu Glu Glu Glu Thr Glu Ser Ser
85 90 95
Ala Ser Ser Glu Asn Ile His Glu Lys Asn Asp Asn Glu Thr Asn Glu
100 105 110
Cys Thr Ser Ser Phe Glu Thr Leu Phe Glu Gln Glu Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Val Pro Lys Asp Ser Lys Leu Tyr Met Leu Ala Gln Lys Thr Val Gln
130 135 140
His Ile Glu Gln Tyr Gly Lys Ala Pro Asp Phe Asn Lys Val Ile Arg
145 150 155 160
Ala His Asn Phe Ile Gln Thr Ile Tyr Gly Thr Pro Leu Lys Glu Glu
165 170 175
Glu Lys Glu Val Val Arg Leu Met Val Ile Lys Leu Leu Lys Lys Lys
180 185 190
<210> 2
<211> 248
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p248R蛋白
<400> 2
Met Gly Gly Ser Thr Ser Lys Asn Ser Phe Lys Asn Thr Thr Asn Ile
1 5 10 15
Ile Ser Asn Ser Ile Phe Asn Gln Met Gln Ser Cys Ile Ser Met Leu
20 25 30
Asp Gly Lys Asn Tyr Ile Gly Val Phe Gly Asp Gly Asn Ile Leu Asn
35 40 45
His Val Phe Gln Asp Leu Asn Leu Ser Leu Asn Thr Ser Cys Val Gln
50 55 60
Lys His Val Asn Glu Glu Asn Phe Ile Thr Asn Leu Ser Asn Gln Ile
65 70 75 80
Thr Gln Asn Leu Lys Asp Gln Glu Val Ala Leu Thr Gln Trp Met Asp
85 90 95
Ala Gly Thr His Asp Gln Lys Thr Asp Ile Glu Glu Asn Ile Lys Val
100 105 110
Asn Leu Thr Thr Thr Leu Ile Gln Asn Cys Val Ser Ser Leu Ser Gly
115 120 125
Met Asn Val Leu Val Val Lys Gly Asn Gly Asn Ile Val Glu Asn Ala
130 135 140
Thr Gln Lys Gln Ser Gln Gln Ile Ile Ser Asn Cys Leu Gln Gly Ser
145 150 155 160
Lys Gln Ala Ile Asp Thr Thr Thr Gly Ile Thr Asn Thr Val Asn Gln
165 170 175
Tyr Ser His Tyr Thr Ser Lys Asn Phe Phe Asp Phe Ile Ala Asp Ala
180 185 190
Ile Ser Ala Val Phe Lys Asn Ile Met Val Ala Ala Val Val Ile Val
195 200 205
Leu Ile Ile Val Gly Phe Ile Ala Val Phe Tyr Phe Leu His Ser Arg
210 215 220
His Arg His Glu Glu Glu Glu Glu Ala Glu Pro Leu Ile Ser Asn Lys
225 230 235 240
Val Leu Lys Asn Ala Ala Val Ser
245

Claims (10)

1.一种非洲猪瘟假病毒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、将非洲猪瘟病毒基因组中p30蛋白以及p248R蛋白的全基因序列分别导入pcDNA3.1载体中，构建得到pcDNA3.1-ASF-p30重组质粒和pcDNA3.1-ASF-p248R重组质粒；
所述p30蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，所述p248R蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示；
步骤2、使用所述pcDNA3.1-ASF-p30重组质粒和pcDNA3.1-ASF-p248R重组质粒转染293T细胞，随后用VSV-ΔG假病毒感染所述293T细胞，感染两小时后去除所述VSV-ΔG假病毒，进行细胞培养；
步骤3、培养结束后，收集细胞上清液，得到所述非洲猪瘟假病毒。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2之前，还包括将293T细胞贴壁培养8-12h。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，使用所述pcDNA3.1-ASF-p30重组质粒和pcDNA3.1-ASF-p248R重组质粒转染293T细胞具体包括如下步骤：
将培养好的293T细胞放置于含10%FBS和1%青霉素或链霉素的DMEM培养基中，加入所述pcDNA3.1-ASF-p30重组质粒、pcDNA3.1-ASF-p248R重组质粒以及Vigofect高效真核转染试剂，在37℃、5% CO2下培养。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，使用0.9%的NaCl溶液稀释25μg的pcDNA3.1-ASF-p30重组质粒、25μg的pcDNA3.1-ASF-p248R重组质粒和7.5μL的Vigofect高效真核转染试剂至500μL，混合均匀后加入到细胞培养液中。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，用VSV-ΔG假病毒感染所述293T细胞具体包括如下步骤：
使用无血清DMEM培养基稀释所述VSV-ΔG假病毒，使所述VSV-ΔG假病毒的RLU为330000-500000，随后感染所述293T细胞，继续在37℃、5% CO2下培养。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，加入所述pcDNA3.1-ASF-p30重组质粒、pcDNA3.1-ASF-p248R重组质粒以及Vigofect高效真核转染试剂后的培养时间为6h，加入VSV-ΔG假病毒稀释液后的培养时间为2h。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤3包括：
使用PBS溶液清洗所述293T细胞，随后在含10% FBS的DMEM培养基中在37℃、5% CO2条件下继续培养48h，培养结束后收取上清液，经离心、过滤后得到所述非洲猪瘟假病毒。
8.一种非洲猪瘟假病毒，其特征在于，所述非洲猪瘟假病毒经权利要求1-7任一项所述的制备方法制备得到。
9. Erythromycin Estolate在制备预防或治疗非洲猪瘟病毒感染的药物中的应用。
10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述Erythromycin Estolate的浓度不低于80μM。
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