CN110373500B - 一种基于双基因的双重荧光pcr检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种基于双基因的双重荧光pcr检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种双重荧光PCR检测试剂盒，尤其涉及一种高特异性和高灵敏度的基于双基因的双重荧光PCR检测试剂盒。本发明的检测试剂选用了针对非洲猪瘟病毒的两个基因（B646L和B438L）的保守片段的引物和探针，与常规的PCR及现有的荧光PCR检测技术相比较，具有更高的特异性和敏感性，并适配于市场上双通道的快检设备，且能同时检测大量样品，为科学合理地防控非洲猪瘟提供有效的工具，保障养猪业的健康发展。

Description

一种基于双基因的双重荧光PCR检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及一种双重荧光PCR检测试剂盒，尤其涉及一种高特异性和高灵敏度的基于双基因的双重荧光PCR检测试剂盒。
背景技术
非洲猪瘟(African Swine Fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus,ASFV) 引起的家猪和野猪出现一系列综合征的传染病，属于我国重点防范的一类动物疫情。自2018年8月在我国被首次确诊以来，在我国呈现大部分地区感染趋势，影响所有年龄的猪，引起出血热，最急性和急性感染死亡率高达100％，对我国养猪业构成了巨大的威胁。目前，最常用的安全、便捷的ASF V检测技术有间接免疫荧光、红细胞吸附试验、酶联免疫吸附试验、聚合酶链反应(PCR)以及实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR,Q-PCR)等。Q-PCR诊断方法能够对感染猪体内病毒核酸进行第一时间的检测，ELISA技术能够对血清中ASFV的特异性抗体和抗原进行进一步诊断，两种技术的结合有利于对ASF的流行病学进行精准监控和分析。然而，用于检测ASFV抗体或抗原的商业化ELISA试剂盒所具有的特异性和敏感性还有待提高，且绝大部分来自国外，拥有自主知识产权的产品极少，价格昂贵，不适宜大规模推广运用。
现有技术CN109593893A公开了一种非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂，所述检测试剂是针对以非洲猪瘟病毒VP72基因的保守片段为靶目标。另现有技术CN104745730A公开了一种非洲猪瘟病毒CP204L基因的荧光PCR检测试剂，包含一对特异性引物、一条特异性探针和一个阳性对照，扩增目标长度为79bp。但目前用于非洲猪瘟检测的荧光PCR试剂盒仅针对单个基因而设计，难以避免环境中单基因污染造成的假阳性。基于单个基因的荧光PCR检测，虽然有阳性对照和阴性对照，但是样本只进行了单次实验，为提高灵敏度需要进行重复实验，人力和物力均有很大程度的浪费。因此，进一步提高检测的特异性和灵敏度就显得非常有必要。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明目的是提供一种基于双基因的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒及其制备方法和应用，能快速有效的应用于养殖场、冷库、批发市场、农贸市场、超市、餐饮服务企业、生猪屠宰场、运输车辆、消毒效果和猪场无害化等环节进行病原检测，为“早、快、严、小”的控制非洲猪瘟，科学合理的制定防控措施提供有效工具。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
一种基于双基因的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，包括如下成分：PCR混合液、引物、探针、DEPC-H2O、阳性对照品、阴性对照品，其中引物和探针序列分别为：
ASFV-B646L-F:5'-GTAATCCGTRTCCCAAC-3’(SEQ ID NO.1)
ASFV-B646L-R:5'-CGATTAAAACCCCYGATG-3’(SEQ ID NO.2)
ASFV-B438L-F:5'-AATATTCAGCCTGRCCG-3’(SEQ ID NO.3)
ASFV-B438L-R:5'-ACAAAGCGTATCAAACCC-3’(SEQ ID NO.4)
ASFV-B646L-probe:FAM-5'-TGCTTTGAARCCACGGGAGG-3’-MGB(SEQ ID NO.5)
ASFV-B438L-probe:VIC-5'-CAATACTCTTAAACCGRGGC-3’-MGB(SEQ ID NO.6)
所用探针标记的荧光基团分别为FAM和VIC。
优选的，所述阳性对照品为B646L和B438L基因串联质粒载体，如SEQ ID NO.7所示，阴性对照品为TE-buffer。
串联B646L和B438L基因的质粒载体的基因片段序列信息如下：
TGAAATCTTTAGGAAAGGTGCTGTCTAGTTTGGAATCTCCAATTCCTCCCGTATATTTAGGTA TATAATTATTGTGTCTAGAAATTGTTTGCTTTGAGGTATCAAAATATTCAGCCTGACCGCTATTTCT TTTAGAATAATTCGGTATAGGGCTTGAGTAGTTGGCAATACTCTTAAACCGGGGCACCAAGGTAA CAATATTTTCCATATAATGGGTTTGATACGCTTTGTTTAAAAATGGGCTTACCGGCTTTATGCTTGT TAGTTGTGCATTGAGTACCGGTATGTCTTCTAGGATTTGTGGCTTTATAGAATGATTAGCAAACAC AGAATGTAGTATATTAGATACTTGTAGCATATGTCTATTTGCGGAAAATTCCTGGTATTCTCTGCCG TGTTGaagcttGAAGAAAGTTAATAGCAGATGCCGATACCACAAGATCAGCCGTAGTGATAGACCCC ACGTAATCCGTGTCCCAACTAATATAAAATTCTCTTGCTCTGGATACGTTAATATGACCACTGGGT TGGTATTCCTCCCGTGGCTTCAAAGCAAAGGTAATCATCATCGCACCCGGATCATCGGGGGTTTTAATCGCATTGCCTCCGTAGTGGAAGGGTATGTAAGAGCTGCAGAACTTTGATGGAAATTTATCGA TAAGATTGATACCATGAGCAGTTACGGAAATGTTTTTAATAATAGGTAATGTGATCGGATACGTAA CGGGGCTAATATCAGATATAGATGAACATGCGTCTGGAAGAGCTGTATCTCTATCCTGAAAGCTTA TCTCTGCGTGGTGAGT(SEQ ID NO.7)
优选的，所述PCR混合液为AceQ qPCR Probe Master Mix(2×)。
一种基于双基因的非洲猪瘟病毒双重荧光定量PCR检测方法，所述方法包括以下步骤：
(1)提取待检样本的DNA模板；
(2)对DNA模板进行PCR扩增，所用引物和探针序列如下：
ASFV-B646L-F:5'-GTAATCCGTRTCCCAAC-3’(SEQ ID NO.1)
ASFV-B646L-R:5'-CGATTAAAACCCCYGATG-3’(SEQ ID NO.2)
ASFV-B438L-F:5'-AATATTCAGCCTGRCCG-3’(SEQ ID NO.3)
ASFV-B438L-R:5'-ACAAAGCGTATCAAACCC-3’(SEQ ID NO.4)
ASFV-B646L-probe:FAM-5'-TGCTTTGAARCCACGGGAGG-3’-MGB(SEQ ID NO.5)
ASFV-B438L-probe:VIC-5'-CAATACTCTTAAACCGRGGC-3’-MGB(SEQ ID NO.6)
所用探针标记的荧光基团分别为FAM和VIC。
(3)结果分析：反应结束，根据待测样本的Ct值判断其是否存在非洲猪瘟病毒感染。
优选的，所述待检样品选自组织、血液、饲料中的一种或几种。
优选的，所述双重荧光定量PCR扩增体系为：5μl的AceQ qPCR Probe Master Mix(2×)，10μmol/L 的B646L和B438L上下游引物各0.2μl，10μmol/L的B646L-probe和B438L-probe各0.1μl， DEPC-H2O 0.4μl，待检DNA模板或阳性对照DNA或阴性对照1μl，加灭菌去离子水补足体积至10 μl。
所述双重荧光定量PCR反应条件为：首先95℃预变性5min；再95℃下变性10sec，60℃下退火延伸30sec，进行40个循环。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
(1)本发明的检测试剂选用了针对非洲猪瘟病毒的两个基因(B646L和B438L)的保守片段的引物和探针，与常规的PCR及现有的荧光PCR检测技术相比较，具有更高的特异性和敏感性，并适配于市场上双通道的快检设备，且能同时检测大量样品，为科学合理地防控非洲猪瘟提供有效的工具，保障养猪业的健康发展。
(2)本发明的试剂可对样品中低含量的ASFV病毒，阴性感染或持续带毒的宿主进行精准检测，对饲料、细胞培养物、血液、组织等多种样品DNA中的ASFV进行快速检测。该发明适用范围广，生物安全性高，临床指导作用强，能为非洲猪瘟的检测提供便利，促进养猪业的正常发展。
附图说明
图1是本发明的非洲猪瘟病毒双基因(B646L和B438L)DNA假病毒表达质粒的构建；
图2是本发明的双重荧光定量PCR检测的扩增曲线；
图3是本发明的双重荧光定量PCR检测的标准曲线；
图4是本发明的不同浓度标准质粒样品的普通PCR检测结果。
具体实施方式
以下将结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1
(1)引物和探针组合的选取与设计
该发明所设计的引物探针组合针对的是非洲猪瘟病毒双基因(B646L和B438L)保守片段为靶目标。
(2)试剂盒组分的制备和优化
双重荧光PCR检测试剂盒，包括双重荧光PCR混合液、引物、探针、DEPC-H2O、ASFV阳性对照物和ASFV阴性对照物，各个试剂组分的含量如下：
a.两对上游引物(F-Primer)和下游引物(R-Primer)各30μL；
b.两个探针(Probe)各15μL；
c.2×荧光PCR混合液Mix 600μL；
d.阳性对照物(PC)1个：提供20μL；
e.阴性对照物(NC)1个，提供20μL；
f.无菌水(ddH2O)1管，提供600μL；
(该试剂盒最少可做100个样品的检测，含每次的阴性对照和阳性对照)
所述PCR混合液为AceQ qPCR Probe Master Mix(2×)。
设置两种阳性对照物方案：方案①为：B646L基因的重组质粒和B438L基因的重组质粒两者等比例混合作为阳性对照物；方案②为：将B646L和B438L两种基因串联入克隆载体构建成一个独立的重组质粒，基因片段序列如SEQ ID NO.7所示，构建方式如图1所示。对照两种方式获得的检测结果，方案②阳性对照物具有更好的效果，结果(3个滴度下的标准质粒进行实验)如下表：
表1 两种阳性对照物的对比试验
Figure BDA0002153583430000051
结果显示，采用方案①进行实验，B646L基因的重组质粒和B438L基因的重组质粒两者等比例混合后，作为阳性对照物所得到不同通道荧光下的CT值存在较大的差异(两CT差值大于2)，表明同体积混合的重组质粒存在一定的浓度差异，且该浓度差异经过qPCR实验后进一步放大，在现有技术条件下难以去除。然而，采用方案②进行实验，将两种基因串联入克隆载体构建成一个独立的重组质粒作为阳性对照物所得到不同通道荧光下的CT值并无明显差异(两CT差值小于0.5)，表明该方案不存在两片段基因的浓度差异，提高了实验数据的准确性。
实施例2
1、试剂盒的使用方法：
(1)总DNA提取：提取待检样品(组织、血液、饲料等)的DNA，作为反应的模板；
(2)配制所需的预混体系：根据检测样品数(含阴性对照和阳性对照各1个)，加入荧光PCR混合液、引物探针组合和DEPC-H2O，混合后再分装成相应管数后，每管9μL，所述PCR混合液为AceQ qPCR Probe Master Mix(2×)。反应体系如下表2所示：
表2 PCR反应体系的配置
Figure BDA0002153583430000061
(3)反应组分配制：分别加入阴性对照、阳性对照和待检测样品各1μL，上样顺序(阴性和阳性样品位置固定)如表3(以8孔道为例)：
表3 样品顺序表
NC PC Test Test Test Test Test Test Test Test Test Test
(注释：蓝色标记为阴性对照，红色标记为阳性对照，紫色标记为待测样品)
(4)扩增：分别将阴性对照物、阳性对照物和检测物放入荧光PCR仪器中进行扩增，首先95℃预变性5min；再95℃下变性10sec，60℃下退火延伸30sec，进行40个循环；采集FAM和VIC两个通道的荧光信号；
(5)结果有效性分析：
根据荧光信号到达设定阈 值所经历的循环数Ct值判定结果，满足以下3个条件：
a.两个荧光信号(FAM和VIC)下，阳性对照的Ct值均小于30；
b.阳性对照和测出的阳性样品，两个荧光信号(FAM和VIC)得到的CT值相差1以内；
c.两个荧光信号(FAM和VIC)下，阴性对照的Ct值大于36或无Ct值。
(不满足上述条件时，结果无效，需重复相关样品的检测)
(6)样品判定结果：
a.样品CT值(FAM和VIC两个荧光信号)≤35，且出现典型的扩增曲线，则样品为阳性，表明样品中存在非洲猪瘟病毒感染；
b.样品CT值＞36或无扩增曲线，表明样品中无非洲猪瘟病毒；
c.35＜样品CT值≤36为可疑，重做结果CT＞36或无扩增曲线为阴性，否则为阳性。
2、不同浓度的阳性标准质粒的测试
建立试剂盒检测方法，确定能得到扩增曲线(图2)后，使用阴性对照物和不同浓度的阳性标准质粒(100，101，102，103，104，105，106，107，108)的测试，结果如表4所示：
表4 不同浓度的阳性标准质粒的测试结果
Figure BDA0002153583430000071
Figure BDA0002153583430000081
结合试验结果所取得的标准曲线(图3)，该方法建立的方法最小检测量可以达到1个拷贝数，但是为了保证实验结果的准确性，鉴定的阳性判定标准设置为：CT值小于35。
3、特异性检测试验
用本发明对灭活的非洲病毒(ASFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)以及正常PK15细胞和血清按照已建立的反应体系扩增后进行特异性比较检测。结果如下：
表5 特异性测试结果
Figure BDA0002153583430000082
非洲猪瘟样品的检测结果显示，两个基因检测到的CT值平均为25.8，根据样品判定标准，结果为阳性；而其他样品的检测结果显示，未探测到CT值，根据样品判定标准，结果为阴性。
4、敏感性分析试验
使用阴性对照物和不同浓度的阳性标准质粒(100，101，102，103，104，105，106，107，108) 作为模板，配制普通PCR反应体(即只使用B646L引物)系进行检测，结果(图4)显示，PCR方法最小检测量为1000个拷贝数，远低于本发明的灵敏度。
实施例3
与不同试剂盒比对分析试验
使用6个临床样品和国家通过评价的检测试剂盒在湖南省动物疫病预防与控制中心验证本发明的准确性，结果如下表所示：
表6 与不同试剂盒比对分析试验结果
Figure BDA0002153583430000091
结果显示，本发明制备的检测试剂盒与国家通过评价的检测试剂盒检测同样的对照物及样品，两者取得的结果相一致，表明本发明制备的试剂盒能有效应用于临床样品的检测分析。
上述实施例阐明的内容应当理解为这些实施例仅用于更清楚地说明本发明，而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落入本申请所附权利要求所限定的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖南阳铭生物科技有限公司
<120> 一种基于双基因的双重荧光PCR检测试剂盒及其应用
<130> 1
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
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<211> 18
<212> DNA
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tgaaatcttt aggaaaggtg ctgtctagtt tggaatctcc aattcctccc gtatatttag 60
gtatataatt attgtgtcta gaaattgttt gctttgaggt atcaaaatat tcagcctgac 120
cgctatttct tttagaataa ttcggtatag ggcttgagta gttggcaata ctcttaaacc 180
ggggcaccaa ggtaacaata ttttccatat aatgggtttg atacgctttg tttaaaaatg 240
ggcttaccgg ctttatgctt gttagttgtg cattgagtac cggtatgtct tctaggattt 300
gtggctttat agaatgatta gcaaacacag aatgtagtat attagatact tgtagcatat 360
gtctatttgc ggaaaattcc tggtattctc tgccgtgttg aagcttgaag aaagttaata 420
gcagatgccg ataccacaag atcagccgta gtgatagacc ccacgtaatc cgtgtcccaa 480
ctaatataaa attctcttgc tctggatacg ttaatatgac cactgggttg gtattcctcc 540
cgtggcttca aagcaaaggt aatcatcatc gcacccggat catcgggggt tttaatcgca 600
ttgcctccgt agtggaaggg tatgtaagag ctgcagaact ttgatggaaa tttatcgata 660
agattgatac catgagcagt tacggaaatg tttttaataa taggtaatgt gatcggatac 720
gtaacggggc taatatcaga tatagatgaa catgcgtctg gaagagctgt atctctatcc 780
tgaaagctta tctctgcgtg gtgagt 806

Claims (4)

1.一种基于双基因的双重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，包括如下成分： PCR混合液、引物、探针、DEPC-H2O、阳性对照品、阴性对照品，其中引物和探针序列分别为：
ASFV-B646L-F的核酸序列如SEQ ID NO.1所示；
ASFV-B646L-R的核酸序列如SEQ ID NO.2所示；
ASFV-B438L-F的核酸序列如SEQ ID NO.3所示；
ASFV-B438L-R的核酸序列如SEQ ID NO.4所示；
ASFV-B646L-probe的核酸序列如SEQ ID NO.5所示；
ASFV-B438L-probe的核酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所用探针标记的荧光基团分别为FAM和VIC。
2.根据权利要求1所述的基于双基因的双重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为B646L和B438L基因串联质粒载体，基因片段序列如SEQ ID NO.7所示，阴性对照品为TE-buffer。
3.根据权利要求1所述的基于双基因的双重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR混合液为2 ×AceQ qPCR Probe Master Mix。
4.一种如权利要求1-3任一项所述基于双基因的双重荧光PCR检测试剂盒在制备检测非洲猪瘟病毒试剂中的应用。
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