CN112695135A - 一种非洲猪瘟病毒荧光pcr双通道检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，公开了一种非洲猪瘟病毒荧光PCR双通道检测试剂盒及检测方法。所述检测试剂包括特异性引物A‑F、A‑R、B‑F和B‑R，以及探针A‑P和B‑P；所述探针A‑P的5′端标记荧光报告基团HEX，3′端标记荧光淬灭基团BHQ1；探针B‑P的5′端标记荧光报告基团FAM，3′端标记荧光淬灭基团BHQ1。本发明的检测试剂盒具有HEX和FAM双重响应，引物之间干扰小，能兼具较高的检测效率、敏感性和特异性，且能分辨自然毒和MGF基因缺失疫苗毒，对目前非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗和免疫保护过程中的检测分辨具有显著的意义。

Description

一种非洲猪瘟病毒荧光PCR双通道检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒荧光PCR双通道检测试剂盒及检测方法。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是猪的一种高度接触性传染疾病，病死率可达100％，由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起与传播。该病发展非常迅速，不到1个世纪的时间内，从非洲开始席卷至近乎整个世界。ASF已是一种严重危害“世界经济”的动物疫病，也是世界动物卫生组织(OIE)规定的A类动物疫病。

非洲猪瘟病毒是ASF样病毒科的唯一成员，病毒粒子的直径为175～215纳米，呈20面体对称，有囊膜，基因组为双股线状DNA，大小170～190kb。该病毒主要以巨噬细胞为感染靶细胞，并以其特有基因数量众多、机制复杂的的病毒蛋白参与ASFV吸附、入侵宿主细胞、病毒复制与装配、逃避宿主免疫防御系统等功能，使病毒能够更有效地感染宿主细胞，引起猪的急性、热性、出血性的临床症状和病理损害。此外，非洲猪瘟存在复杂的感染循环方式，隐性感染猪以及受猪瘟病毒污染的生猪产品及其制品是非洲猪瘟引入健康地区猪群的重要传播媒介，该病毒还可感染野猪和软蜱，可在家猪与野猪之间、野猪与软蜱之间以及家猪与软蜱之间循环传播。

目前，ASF尚无有效疫苗预防及治疗方法，短期内，依靠早期诊断与区域化防控管理来进行防制，采用严格的监测计划，一经发现采取大范围扑杀方式切断传染源。OIE推荐的HAD、ELISA、IFA等血清学检测方法，耗时长，操作复杂，不适用与非洲猪瘟病毒的快速检测。实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR qPCR)具有操作简单、快速方便、灵敏度高、重复性好、污染率低的优点，被广泛应用于基因检测领域。

专利CN 108300808 A公开了一种非洲猪瘟病毒荧光PCR双通道检测试剂盒、制备方法及使用方法。包括ASFV-反应液、DNA酶混合液、ASFV-内标、ASFV-阳性对照、ASFV-阴性对照、核酸释放剂以及ASFV-定量参考品，所述ASFV-反应液包括：引物：ASF03F03和ASF03R03；内标引物：IPC05F01和IPC05R01；探针ASF03P和内标探针IPC05P；所述引物和探针对应于非洲猪瘟病毒p72基因的高度保守片段。该专利采用引物ASF03F03和ASF03R03以及探针ASF03P具有优良的敏感性与特异性，极大地减少了可能出现的因引物探针错配导致的漏检。配合内标引物IPC05F01和IPC05R01以及内标探针IPC05P可以监测整个PCR反应体系是否正常，从而避免因使用不当造成的错误的判定结果。

专利CN 109593893 A公开了一种非洲猪瘟病毒荧光PCR快速检测试剂盒，包括特异性引物ASFV-F和

R，以及TaqMan探针ASFV-P，探针的5′端标记报告荧光染料为HEX，3′端标记荧光淬灭基团为BHQ-1。该发明选取非洲猪瘟病毒高度保守的p72基因(编码B646L结构蛋白)作为靶基因，设计特异性引物及探针建立ASFV特异的荧光PCR检测方法。

上述检测试剂盒所采用的引物及探针虽然均是以非洲猪瘟病毒高度保守的p72基因作为靶基因，具有良好的特异性。但相应的扩增效率、检测准确率及稳定性仍有进一步改进的空间。且上述检测试剂盒在均含有p72基因的自然毒和疫苗毒的分辨上不具备检测能力。MGF基因缺失的非洲猪瘟病毒弱毒疫苗已被证实具有很好的安全性和免疫保护效果，随着MGF基因缺失的非洲猪瘟病毒弱毒疫苗的普遍使用，开发相应的能够区分自然病毒和MGF基因缺失疫苗毒的检测试剂盒具有显著的意义。

发明内容

针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种非洲猪瘟病毒荧光PCR双通道检测试剂盒。

本发明的另一目的在于提供上述非洲猪瘟病毒荧光PCR双通道检测试剂盒的制备方法。

本发明的再一目的在于提供一种非洲猪瘟病毒的荧光PCR双通道检测方法。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种非洲猪瘟病毒荧光PCR双通道检测试剂盒，包括由特异性引物A-F、A-R、B-F和B-R，以及探针A-P和B-P、Taq酶构成的PCR反应液；所述探针A-P的5′端标记荧光报告基团HEX，3′端标记荧光淬灭基团BHQ1；探针B-P的5′端标记荧光报告基团FAM，3′端标记荧光淬灭基团BHQ1；

其中特异性引物及探针序列如下：

A-F：5′-CCCAGGRGATAAAATGACTG-3′；

A-R：5′-CACTRGTTCCCTCCACCGATA-3′；

A-P：5′-HEX-TCCTGGCCRACCAAGTGCTT-BHQ1-3′；

B-F：5′-TAAGGCTCATAAAATCAGCAGGTAT-3′；

B-R：5′-TGCAAACAGTTTTATAAGGTTGTAGTT-3′；

B-P：5′-FAM-ATACGGCGTTAGTGAAGGCTGTAAGGG-BHQ1-3′。

进一步地，所述非洲猪瘟病毒荧光PCR双通道检测试剂盒还包括阴性对照和阳性对照。

进一步地，所述非洲猪瘟病毒荧光PCR双通道检测试剂盒还包括核酸释放剂。

进一步地，所述非洲猪瘟病毒荧光PCR双通道检测试剂盒中各试剂的含量为：

上述非洲猪瘟病毒荧光PCR双通道检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

(1)以非洲猪瘟病毒的VP72基因为靶基因，设计特异性引物A-F和A-R，以及探针A-P；以非洲猪瘟病毒的MGF基因为靶基因，设计特异性引物B-F和B-R，以及探针B-P；

(2)通过合成非洲猪瘟病毒的VP72和MGF基因，克隆到pUC57载体，获得pUC57-VP72-MGF重组质粒；然后转化至感受态细胞培养，提取质粒，作为阳性对照；

(3)将pUC57质粒转化至感受态细胞培养，提取质粒，作为阴性对照。

一种非洲猪瘟病毒的荧光PCR双通道检测方法，包括如下步骤：

(1)将PCR反应液加入不同PCR反应管中；

(2)向步骤(1)不同PCR反应管中分别加入待测样本、阴性对照和阳性对照，盖紧管盖后移至荧光PCR仪上进行PCR扩增，荧光信号收集同时设定为Fam和HEX荧光素；

(3)质控标准：阴性对照应无报告Ct值，阳性对照的Ct值应≤32.0；否则，此次实验视为无效；

(4)结果判断：无报告Ct值的样本为阴性；Ct值≤38的样本为阳性；38＜Ct值＜42且有典型的扩增曲线的样本需重复检测，重复检测结果无报告Ct值为阴性，否则为阳性。

进一步地，步骤(1)中将PCR反应液加入PCR反应管中的量为20μL，步骤(2)中分别加入待测样本、阴性对照和阳性对照的量为5μL。

进一步地，当步骤(2)中所述待测样本为血液或者血清时，用生理盐水或者纯净水稀释后离心，取上清液作为模板加入PCR反应管进行检测；当所述待测样本为唾液或鼻拭子时，采用柱提法或者磁珠法提取样本DNA模板加入PCR反应管进行检测；当所述待测样本为组织时，采用核酸释放剂提取样本DNA模板加入PCR反应管进行检测。

进一步地，步骤(2)中所述PCR扩增条件为：

一次95℃下活化30sec；95℃下变性5sec，60℃下退火延伸30sec，采集荧光信号，进行45个循环。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明的检测试剂盒具有HEX和FAM双重响应，引物之间干扰小，能兼具较高的检测效率、敏感性和特异性，且能分辨自然毒和MGF基因缺失疫苗毒，对目前非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗和免疫保护过程中的检测分辨具有显著的意义。

附图说明

图1～3分别为本发明实施例1中A试剂盒、本发明试剂盒、B试剂盒的荧光曲线测试结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

本实施例的一种非洲猪瘟病毒荧光PCR双通道检测试剂盒的制备方法，具体步骤如下：

(1)引物及探针制备：

基于非洲猪瘟病毒的VP72基因(GenBank:KJ195685.1)为靶基因，设计特异性引物A-F和A-R，以及探针A-P；基于非洲猪瘟病毒的MGF基因(GenBank:NC_044959.1)为靶基因，设计特异性引物B-F和B-R，以及探针B-P，由TaKaRa公司合成。所述探针A-P的5′端标记荧光报告基团HEX，3′端标记荧光淬灭基团BHQ1；探针B-P的5′端标记荧光报告基团FAM，3′端标记荧光淬灭基团BHQ1。

其中特异性引物及探针序列如下：

A-F：5′-CCCAGGRGATAAAATGACTG-3′(SEQ ID NO：1)；

A-R：5′-CACTRGTTCCCTCCACCGATA-3′(SEQ ID NO：2)；

A-P：5′-HEX-TCCTGGCCRACCAAGTGCTT-BHQ1-3′(SEQ ID NO：3)；

B-F：5′-TAAGGCTCATAAAATCAGCAGGTAT-3′(SEQ ID NO：4)；

B-R：5′-TGCAAACAGTTTTATAAGGTTGTAGTT-3′(SEQ ID NO：5)；

B-P：5′-FAM-ATACGGCGTTAGTGAAGGCTGTAAGGG-BHQ1-3′(SEQ ID NO：6)。

(2)阳性对照的制备：

1、非洲猪瘟病毒VP72基因和MGF基因的合成

根据已发表的非洲猪瘟病毒VP72基因序列和MGF基因序列，委托北京睿博兴科生物技术有限公司合成该基因，并要求将合成基因克隆到pUC57载体，获得pUC57-VP72-MGF重组质粒，提供测序报告。

2、携带非洲猪瘟病毒VP72基因和MGF基因重组质粒pUC57-VP72-MGF的转化

取100μL DH5α感受态细胞于冰浴上融化，加入1μL pUC57-VP72-MGF，轻轻吹打混匀，冰浴30分钟。将菌液放入42℃水浴中热激90秒，立即放入冰浴中2分钟。然后加入0.9mLLB培养基，于37℃恒温摇床上，200rpm，温育1小时。将菌液4,000rpm/min离心3分钟，留200μL上清将菌体打散，均匀涂布于含氨苄抗性的琼脂平板表面，平板于37℃倒置培养12～16小时。

3、PCR及测序鉴定结果

取菌液作PCR鉴定，大小与目的基因片段大小吻合。将PCR检定为阳性的菌液用质粒提取试剂盒提取质粒后，送测序公司测序，测序结果与模板序列100％一致，表明该质粒可作为制备阳性对照的重组质粒。

(3)阴性对照的制备：

将质粒pUC57转化至DH5α感受态细胞，在LB固体培养基(氨苄抗性)，37℃培养12～16小时，可见多个白色菌落。随机挑取单个白色菌落分别接种LB液体培养基(氨苄抗性)，37℃摇床振荡培养12～16小时。取菌液作荧光PCR鉴定，无目的基因条带出现，为VP72及MGF基因阴性。

(4)试剂盒的组成：将所制备的引物及探针与市购Taq酶组成PCR反应液，将1000μLPCR反应液与1000μL阴性对照和20μL阳性对照组成检测试剂盒。

(5)PCR扩增条件经实验优化为：一次95℃下活化30sec；95℃下变性5sec，60℃下退火延伸30sec，采集荧光信号，进行45个循环。

(6)对本发明试剂盒在测试仪器上灵敏度、检出率、特异性和荧光曲线进行测试，并与市场上两组双重定量试剂盒(以下简称为A试剂盒和B试剂盒)进行比较。核酸样品信息如下表1所示。

表1

1、对II型野毒核酸稀释样品Ct值的检测结果如下表2所示。

表2

从上表数据可知，A试剂盒对B2^-6至B2^-11核酸稀释样品的vp72基因和MGF基因的检出率均为100％(2/2)；对B2^-12至B2^-15核酸稀释样品的vp72基因的检出率为2/8，MGF基因的检出率为3/8。本发明试剂盒对B2^-6至B2^-11核酸稀释样品的vp72基因和MGF基因的检出率均为100％(2/2)；对B2^-12至B2^-15核酸稀释样品的vp72基因的检出率为3/8，MGF基因的检出率为4/8。B试剂盒对B2^-6至B2^-12核酸稀释样品的vp72基因和MGF基因的检出率均为100％(2/2)；对B2^-13至B2^-15核酸稀释样品的vp72基因的检出率为3/6，MGF基因的检出率为4/6。

2、对II型野毒样品核酸CT值的检测结果如下表3所示。

表3

从上表数据可知，A试剂盒、本发明试剂盒和B试剂盒对CT值<36临床样品的vp72基因和MGF基因的检出率均为100％(17/17)。A试剂盒对CT值>36的II野毒样品核酸的vp72基因的检出率为9/10，MGF基因的检出率为10/10。本发明试剂盒对CT值>36的II野毒样品核酸的vp72基因的检出率为10/10，MGF基因的检出率为9/10。B试剂盒对CT值>36的II野毒样品核酸的vp72基因的检出率为10/10，MGF基因的检出率为8/10。

3、2#毒、6#毒、组织、环境、I型野毒核酸CT值检测结果如下表4所示。

表4

从上表数据可知，A试剂盒、本发明试剂盒、B试剂盒对2#毒核酸、6#毒核酸、I型野毒核酸均是P72基因阳性，MGF基因阴性；对组织核酸、环境样品核酸均是P72基因阴性，MGF基因阴性。

4、A试剂盒、本发明试剂盒、B试剂盒的荧光曲线测试结果分别如图1、图2和图3所示。结果显示，A试剂盒中vp72基因对应的扩增曲线平台期不明显，呈类“S”型，MGF基因对应的扩增曲线平台期明显，呈“S”型。本发明试剂盒中vp72基因对应的扩增曲线平台期不明显，呈类“S”型，MGF基因对应的扩增曲线平台期明显，呈“S”型。B试剂盒中vp72基因对应的扩增曲线平台期明显，呈“S”型，MGF基因对应的扩增曲线平台期不明显，呈类“S”型。从各扩增曲线图可知，A试剂盒中vp72基因的最高荧光强度△Rn为0.8，MGF基因的最高荧光强度△Rn为0.8，两者差距最小。本发明试剂盒中vp72基因的最高荧光强度△Rn为0.7，MGF基因的最高荧光强度△Rn为1.2，两者差距较小。B试剂盒中vp72基因的最高荧光强度△Rn为1.4，MGF基因的最高荧光强度△Rn为0.7，两者差距较大。

通过以上结果可以看出，本发明的非洲猪瘟病毒荧光PCR双通道检测试剂盒具有良好的灵敏度、检出率、特异性和荧光曲线，符合实际检测要求。

实施例2

本实施例的一种非洲猪瘟病毒的荧光PCR双通道检测方法，具体步骤如下：

一、样品采集、存放及运输

1.采集：

1.1活猪样品无菌采集抗凝血或血清5ml。

1.2病死猪剖检样品或屠宰场剖检样品无菌采集死猪的脾、肺、肾、扁桃体、淋巴结、肌肉等组织样品。

1.3病猪污染的周边环境采集与病猪相关场所的粪便、饲料、污水样品。

2.存放：待测样品在2-8℃保存不应超过24小时；-20℃保存不应超过三个月；-70℃以下长期保存；待测样品应避免反复冻融。

3.运输：采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运输。

二、样品处理(样品处理区)

若样品为液体(血液或者血清)，取200微升(血清和沉淀物之间的区域)直接用生理盐水或者纯净水稀释5倍，震荡混匀，3000-5000转离心2分钟，取上清液作为模板即可直接检测。若液体样本为唾液，鼻拭子建议使用柱提法或者磁珠法提取样本DNA，以提高检测的准确性。若样品为组织，取5-10mg组织(大小约为半个绿豆)采用核酸释放剂提取，3000-5000转离心2分钟，取上清液作为模板即可直接检测。阴、阳性对照无需处理，直接加样。

三、扩增试剂准备(PCR前准备区)

从试剂盒中取出ASFV PCR反应液、室温融化并振荡混匀后，向设定的n个PCR反应管中分别加入20μL，转移至样品处理区。

四、加样(样品处理区)

向所设定的n个PCR反应管中分别加入步骤二中提取的DNA模板、阴性对照、阳性对照各5μL，盖紧管盖，将PCR反应管转移至检测区，置于PCR仪上，记录样品摆放顺序。

五、PCR扩增(检测区)

循环条件设置：

1.95℃:30sec；

2.95℃:5sec，60℃:30sec(收集荧光)：45循环。反应体系为25ul。

仪器检测通道选择：荧光信号收集同时设定为Fam和HEX(VIC)荧光素。

六、质控标准

1.阴性对照的Ct值应等于none。

2.阳性对照的Ct值应小于等于32.0。否则，此次实验视为无效。(Ct值应以S型曲线拐点的循环数为准)。

七、结果判断

1.Ct值为none的样品为阴性。

2.Ct值小于等于38.0的样品为阳性。

3.Ct值大于38.0且小于42，并有典型的扩增趋势的样品建议重做。重做结果Ct值为none为阴性，否则为阳性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 肇庆大华农生物药品有限公司

<120> 一种非洲猪瘟病毒荧光PCR双通道检测试剂盒及检测方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

cccaggrgat aaaatgactg 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

cactrgttcc ctccaccgat a 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

tcctggccra ccaagtgctt 20

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

taaggctcat aaaatcagca ggtat 25

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

tgcaaacagt tttataaggt tgtagtt 27

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

atacggcgtt agtgaaggct gtaaggg 27

Claims (9)

1.一种非洲猪瘟病毒荧光PCR双通道检测试剂盒，其特征在于：包括由特异性引物A-F、A-R、B-F和B-R，以及探针A-P和B-P、Taq酶构成的PCR反应液；所述探针A-P的5′端标记荧光报告基团HEX，3′端标记荧光淬灭基团BHQ1；探针B-P的5′端标记荧光报告基团FAM，3′端标记荧光淬灭基团BHQ1；

其中特异性引物及探针序列如下：

A-F：5′-CCCAGGRGATAAAATGACTG-3′；

A-R：5′-CACTRGTTCCCTCCACCGATA-3′；

A-P：5′-HEX-TCCTGGCCRACCAAGTGCTT-BHQ1-3′；

B-F：5′-TAAGGCTCATAAAATCAGCAGGTAT-3′；

B-R：5′-TGCAAACAGTTTTATAAGGTTGTAGTT-3′；

B-P：5′-FAM-ATACGGCGTTAGTGAAGGCTGTAAGGG-BHQ1-3′。

2.根据权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒荧光PCR双通道检测试剂盒，其特征在于：所述非洲猪瘟病毒荧光PCR双通道检测试剂盒还包括阴性对照和阳性对照。

3.根据权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒荧光PCR双通道检测试剂盒，其特征在于：所述非洲猪瘟病毒荧光PCR双通道检测试剂盒还包括核酸释放剂。

4.根据权利要求3所述的一种非洲猪瘟病毒荧光PCR双通道检测试剂盒，其特征在于：所述非洲猪瘟病毒荧光PCR双通道检测试剂盒中各试剂的含量为：

5.权利要求1～4任一项所述的一种非洲猪瘟病毒荧光PCR双通道检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)以非洲猪瘟病毒的VP72基因为靶基因，设计特异性引物A-F和A-R，以及探针A-P；以非洲猪瘟病毒的MGF基因为靶基因，设计特异性引物B-F和B-R，以及探针B-P；

(2)通过合成非洲猪瘟病毒的VP72和MGF基因，克隆到pUC57载体，获得pUC57-VP72-MGF重组质粒；然后转化至感受态细胞培养，提取质粒，作为阳性对照；

(3)将pUC57质粒转化至感受态细胞培养，提取质粒，作为阴性对照。

6.一种非洲猪瘟病毒的荧光PCR双通道检测方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将PCR反应液加入不同PCR反应管中；

(2)向步骤(1)不同PCR反应管中分别加入待测样本、阴性对照和阳性对照，盖紧管盖后移至荧光PCR仪上进行PCR扩增，荧光信号收集同时设定为Fam和HEX荧光素；

(3)质控标准：阴性对照应无报告Ct值，阳性对照的Ct值应≤32.0；否则，此次实验视为无效；

(4)结果判断：无报告Ct值的样本为阴性；Ct值≤38的样本为阳性；38＜Ct值＜42且有典型的扩增曲线的样本需重复检测，重复检测结果无报告Ct值为阴性，否则为阳性。

7.根据权利要求6所述的一种非洲猪瘟病毒的荧光PCR双通道检测方法，其特征在于：步骤(1)中将PCR反应液加入PCR反应管中的量为20μL，步骤(2)中分别加入待测样本、阴性对照和阳性对照的量为5μL。

8.根据权利要求6所述的一种非洲猪瘟病毒的荧光PCR双通道检测方法，其特征在于：当步骤(2)中所述待测样本为血液或者血清时，用生理盐水或者纯净水稀释后离心，取上清液作为模板加入PCR反应管进行检测；当所述待测样本为唾液或鼻拭子时，采用柱提法或者磁珠法提取样本DNA模板加入PCR反应管进行检测；当所述待测样本为组织时，采用核酸释放剂提取样本DNA模板加入PCR反应管进行检测。

9.根据权利要求6所述的一种非洲猪瘟病毒的荧光PCR检测方法，其特征在于：步骤(2)中所述PCR扩增条件为：

一次95℃下活化30sec；95℃下变性5sec，60℃下退火延伸30sec，采集荧光信号，进行45个循环。

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