CN117701779A - 鉴别非洲猪瘟毒株的方法、引物探针组合、试剂、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种鉴别非洲猪瘟毒株的方法、引物探针组合、试剂、试剂盒及应用；基于引物探针组合的开发，本发明通过多重荧光定量PCR，建立了靶向三个不同目的片段的鉴别方法，其中，三个不同目的片段分别为猪ACTB基因、非洲猪瘟病毒p72基因和非洲猪瘟病毒I177L基因；以此，本发明可以精准区分野生型非洲猪瘟毒野生型毒株和非洲猪瘟I177L基因缺失毒株，为疫苗的研发提供技术支撑。
Description
技术领域
本发明属于病毒的核酸分析领域，尤其涉及一种鉴别非洲猪瘟毒株的方法、引物探针组合、试剂、试剂盒及应用。
背景技术
生猪产业是农业的重要组成部分，猪肉是城乡居民主要蛋白质来源之一，但是，非洲猪瘟（African swine fever，ASF）会对生猪产业造成巨大经济损失。被非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染的家猪，出现临床症状有：高热、厌食、嗜睡和全身虚弱，死后检查显示脾脏和淋巴结异常肿大。灭活疫苗不能对强毒株感染起到保护作用，减毒疫苗又具有感染的潜在风险；值得关注的是，2020年有美国的研究人员报道了缺失非洲猪瘟I177L基因的活疫苗ASFV-G-ΔI177L毒株可有效保护流行毒株，而这个非瘟活疫苗与越南在2022年批准上市的疫苗为同一个毒株。
虽然有实验证明了缺失I177L基因的非洲猪瘟病毒疫苗的有效性，经过不同剂量越南疫苗毒株免疫后攻毒的猪只全部存活；但是，Viruses上发表的文章《Evaluation ofthe Safety Profile of the ASFV Vaccine Candidate ASFV-G-ΔI177L》中，安全性评价实验显示越南疫苗存在严重的排毒现象，极有可能造成免疫猪群的散毒、弱毒苗的毒力返强与病毒基因重组等问题。因此，需要对非洲猪瘟毒株进行鉴定，以区分非洲猪瘟I177L基因缺失毒株和非洲猪瘟野生型毒株，从而为疫苗研发等进一步的研究提供技术支撑。
然而，目前报道的非洲猪瘟毒株鉴定方法大部分为非洲猪瘟病毒表达结构蛋白的p72基因（又称B646L基因）的单一基因PCR扩增，并不能同时满足p72和I177L两种基因的鉴别，无法快速准确地将非洲猪瘟I177L基因缺失毒株与非洲猪瘟野生型毒株进行区分。
鉴于此，有必要提供一种鉴别非洲猪瘟毒株的方法、引物探针组合、试剂、试剂盒及应用，以解决或至少缓解上述现有技术无法快速准确地将非洲猪瘟I177L基因缺失毒株与非洲猪瘟野生型毒株进行区分的技术缺陷。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种鉴别非洲猪瘟毒株的方法、引物探针组合、试剂、试剂盒及应用，以解决上述现有技术无法快速准确地将非洲猪瘟I177L基因缺失毒株与非洲猪瘟野生型毒株进行区分的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种用于鉴别非洲猪瘟毒株的引物探针组合，所述引物探针组合包括第一引物对、第一探针、第二引物对、第二探针、第三引物对、第三探针；
所述第一引物对的上游引物具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，所述第一引物对的下游引物具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列；
所述第一探针具有如SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列，所述第一探针上还具有第一荧光基团和淬灭基团；
所述第二引物对的上游引物具有如SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列，所述第二引物对的下游引物具有如SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列；
所述第二探针具有如SEQ ID NO.17所示的核苷酸序列，所述第二探针上还具有第二荧光基团和淬灭基团；
所述第三引物对的上游引物具有如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列，所述第三引物对的下游引物具有如SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列；
所述第三探针具有如SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列，所述第三探针上还具有第三荧光基团和淬灭基团。
本发明还提供了一种用于鉴别非洲猪瘟毒株的PCR试剂，所述PCR试剂中含有如上述任意所述的引物探针组合。
本发明还提供了一种如上述任意所述的引物探针组合在制备非洲猪瘟毒株鉴别试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种非洲猪瘟毒株鉴别试剂盒，包括阳性对照品、阴性对照品和如上述任意述的PCR试剂。
进一步地，所述阳性对照品中含有阳性标准质粒，所述阳性标准质粒具有如SEQID NO.1所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种基于多重荧光定量PCR非诊断目的鉴别非洲猪瘟毒株的方法，包括步骤：
S1，提供如上述任意所述的非洲猪瘟毒株鉴别试剂盒；
S2，将阳性测试液、阴性测试液、检测液进行多重荧光定量PCR处理，并获取所述阳性测试液、所述阴性测试液、所述检测液在多重荧光定量PCR处理过程中的第一荧光信号、第二荧光信号、第三荧光信号；
所述阳性测试液为所述阳性对照品和所述PCR试剂的混合液；所述阴性测试液为所述阴性对照品和所述PCR试剂的混合液；所述检测液为待测液和所述PCR试剂的混合液，所述待测液中含有待测样本的核酸提取物；
所述第一荧光信号对应所述第一荧光基团，所述第二荧光信号对应所述第二荧光基团，所述第三荧光信号对应所述第三荧光基团；
S3，获取所述阳性测试液中所述第一荧光信号达到阈值线时的循环数，记为第一阳性循环数；获取所述阳性测试液中所述第二荧光信号达到阈值线时的循环数，记为第二阳性循环数；获取所述阳性测试液中所述第三荧光信号达到阈值线时的循环数，记为第三阳性循环数；
获取所述阴性测试液中所述第一荧光信号达到阈值线时的循环数，记为第一阴性循环数；获取所述阴性测试液中所述第二荧光信号达到阈值线时的循环数，记为第二阴性循环数；获取所述阴性测试液中所述第三荧光信号达到阈值线时的循环数，记为第三阴性循环数；
获取所述检测液中所述第一荧光信号达到阈值线时的循环数，记为第一检测循环数；获取所述检测液中所述第二荧光信号达到阈值线时的循环数，记为第二检测循环数；获取所述检测液中所述第三荧光信号达到阈值线时的循环数，记为第三检测循环数；
S4，当所述第一阳性循环数、所述第二阳性循环数、所述第三阳性循环数均不高于预设阳性循环数，且所述第一阴性循环数、所述第二阴性循环数、所述第三阴性循环数均不存在时，根据所述第一检测循环数、所述第二检测循环数、所述第三检测循环数判断所述待测样本的种类；
其中，当所述第一检测循环数和所述第二检测循环数均不高于预设检测循环数，所述第三检测循环数不存在，且所述检测液中所述第一荧光信号和所述第二荧光信号均具有指数型增长时，判定所述待测样本中的毒株为非洲猪瘟I177L基因缺失毒株。
进一步地，所述步骤S4还包括：当所述第一检测循环数、所述第二检测循环数、所述第三检测循环数均不高于所述预设检测循环数，且所述检测液中所述第一荧光信号、所述第二荧光信号、所述第三荧光信号均具有指数型增长时，判定所述待测样本中的毒株为非洲猪瘟野生型毒株；
当所述第一检测循环数不高于所述预设检测循环数，所述第二检测循环数和所述第三检测循环数均高于所述预设检测循环数，且所述检测液中所述第一荧光信号、所述第二荧光信号、所述第三荧光信号具有指数型增长时，对所述检测液进行复检；在所述复检过程中，当所述第一检测循环数不高于所述预设检测循环数，所述第二检测循环数和所述第三检测循环数均高于所述预设检测循环数，且所述检测液中所述第一荧光信号、所述第二荧光信号、所述第三荧光信号具有指数型增长时，判定所述待测样本中的毒株为非洲猪瘟野生型毒株；
当所述第一检测循环数不高于所述预设检测循环数，所述第二检测循环数高于所述预设检测循环数，所述第三检测循环数不存在，且所述检测液中所述第一荧光信号、所述第二荧光信号具有指数型增长时，对所述检测液进行复检；在所述复检过程中，当所述第一检测循环数不高于所述预设检测循环数，所述第二检测循环数高于所述预设检测循环数，所述第三检测循环数不存在，且所述检测液中所述第一荧光信号、所述第二荧光信号具有指数型增长时，判定所述待测样本中的毒株为非洲猪瘟I177L基因缺失毒株；
当所述第一检测循环数不高于所述预设检测循环数，且所述第二检测循环数和所述第三检测循环数不存在时，所述待测样本中不含非洲猪瘟核酸；
当所述第一检测循环数高于所述预设检测循环数，且所述待测样本为猪源样本时，重新获取所述待测样本的核酸提取物后进行鉴定。
本发明的有益效果至少包括：
本发明可以精准区分野生型非洲猪瘟毒野生型毒株和非洲猪瘟I177L基因缺失株；与传统PCR和现有qPCR检测技术相比，本发明基于探针的实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR, qPCR），建立了靶向三个不同目的片段的多重检测方法，三个不同目的片段分别为猪ACTB基因、非洲猪瘟病毒p72基因和非洲猪瘟病毒I177L基因。
本发明通过将猪ACTB基因、非洲猪瘟病毒p72基因和非洲猪瘟病毒I177L基因串联至克隆载体，构建成一个独立的重组质粒作为阳性对照物，优化了荧光PCR快速检测的体系成分和反应条件，可提高实验的特异性和灵敏度，实现对病原基因的精准定量。
本发明通过引入猪源内参基因，可以有效监控猪源样品采集、核酸提取过程，避免因核酸质量未达标导致的假阴性；本发明针对p72和I177L两个基因，最低检测限8个拷贝数，具有较好的敏感性，组内、组间整体平均CV值低于5%，具有较好的重复性。
本发明提供的引物探针组合，不仅具有较佳的敏感性和稳定性；且与猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒以及猪繁殖障碍综合征病毒均无交叉反应，具有优异的特异性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中阳性标准质粒的质粒图谱；
图2为本发明实施例1中引物对1的熔解曲线图；
图3为本发明实施例1中引物对2的熔解曲线图；
图4为本发明实施例1中引物对3的熔解曲线图；
图5为本发明实施例1中引物对4的熔解曲线图；
图6为本发明实施例1中引物对5的熔解曲线图；
图7为本发明实施例2中各病毒和阳性标准质粒在多重荧光定量PCR中猪ACTB基因的扩增曲线图；
图8为本发明实施例2中各病毒和阳性标准质粒在多重荧光定量PCR中非洲猪瘟病毒p72基因扩增曲线图；
图9为本发明实施例2中各病毒和阳性标准质粒在多重荧光定量PCR中非洲猪瘟病毒I177L基因的扩增曲线图；
图10为本发明实施例2中各病毒（猪圆环病毒2型PCV2、猪细小病毒PPV、猪伪狂犬病毒PRV、猪繁殖障碍综合征病毒PRRSV、猪瘟病毒CSFV、猪流行性腹泻病毒PEDV以及猪传染性胃肠炎病毒TGEV）进行普通PCR扩增后的琼脂凝胶电泳验证图；其中，M为GL DNA Marker1000；1为PPV；2为CSFV；3为TGEV；4为PRRSV；5为PEDV；6为PCV2；7为PRV；
图11为本发明实施例2中阳性标准质粒在不同浓度下猪ACTB基因的扩增曲线图；
图12为本发明实施例2中阳性标准质粒在不同浓度下非洲猪瘟病毒p72基因的扩增曲线图；
图13为本发明实施例2中阳性标准质粒在不同浓度下非洲猪瘟病毒I177L基因的扩增曲线图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施方式，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明的一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
并且，本发明各个实施方式之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。本领域技术人员需要知晓的是，本发明实施例中的NC为阴性对照；本发明中的Ct值指代的是达到阈值线时的PCR循环数，即达到仪器可探测到的荧光值的循环数，具体以仪器的检测为准；本发明实施例的表格中，拷贝数指代拷贝数/μL。
为避免越南疫苗毒株造成的非洲猪瘟疫情，急需研发出快速、准确监测I177L缺失毒株的方法；并且，需知晓的是，除缺失I177L基因的越南疫苗外，我国也有研究人员构建了I177L基因缺失的毒株。
例如：授权公告号为CN115851626B的中国发明专利公开了一种缺失CD2v和I177L基因片段的减毒非洲猪瘟病毒毒株及其构建方法和应用；授权公告号为CN113122511B的中国发明专利公开了一种同时缺失了CD2v，MGF(12L,13L,14L)和I177L基因片段的基因缺失毒株及其构建方法和应用；授权公告号为CN114015660B的中国发明专利公开了一种缺失十个基因（包含I177L）的减毒非洲猪瘟病毒株及作为疫苗的应用。
由此，建立针对非洲猪瘟I177L基因缺失毒株特异性的检测方法，为非洲猪瘟基因缺失疫苗的研发和疫病防控提供技术支撑，具有十分必要的意义。
为了实现非洲猪瘟I177L基因缺失毒株的鉴定，将其与非洲猪瘟野生型毒株进行区分，本发明提供了一种用于鉴别非洲猪瘟毒株的引物探针组合，所述引物探针组合包括第一引物对、第一探针、第二引物对、第二探针、第三引物对、第三探针。
所述第一引物对的上游引物具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，所述第一引物对的下游引物具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。
所述第一探针具有如SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列，所述第一探针上还具有第一荧光基团和淬灭基团。
所述第二引物对的上游引物具有如SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列，所述第二引物对的下游引物具有如SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列。
所述第二探针具有如SEQ ID NO.17所示的核苷酸序列，所述第二探针上还具有第二荧光基团和淬灭基团。
所述第三引物对的上游引物具有如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列，所述第三引物对的下游引物具有如SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列。
所述第三探针具有如SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列，所述第三探针上还具有第三荧光基团和淬灭基团。
需说明的是，所述第一荧光基团、所述第二荧光基团和所述第三荧光基团应当具有区分度，所述第一荧光基团、所述第二荧光基团和所述第三荧光基团分别可以是ROX、FAM、VIC中的一种，且互不重合；所述淬灭基团可以为BHQ2、MGB中的一种，各探针上的所述淬灭基团可以相同或不相同。
本发明中，所述第一引物对和所述第一探针适用于猪核酸基因组内参基因（ACTB），所述第一荧光基团可以为ROX，所述第一探针上的所述淬灭基团可以为BHQ2。
所述第二引物对和所述第二探针适用于非洲猪瘟病毒表达结构蛋白的非洲猪瘟病毒p72基因（又称B646L基因），所述第二荧光基团可以为FAM，所述第二探针上的所述淬灭基团可以为MGB。
所述第三引物对和所述第三探针适用于非洲猪瘟病毒I177L基因，非洲猪瘟病毒I177L基因为非洲猪瘟病毒的一个毒力基因；所述第三荧光基团可以为VIC；所述第三探针上的所述淬灭基团可以为BHQ2。
具体而言，本发明在试验过程中，根据GenBank中登录的猪内源基因和非洲猪瘟毒株序列信息，选用Primer premier 5软件，针对猪ACTB基因（GenBank number：XR002342206）、非洲猪瘟病毒p72基因（GenBank number：OR660699）和非洲猪瘟病毒I177L基因（GenBank number：OR660699）区域分别设计了三对特异性引物和探针，详细见下表：
以此，针对猪ACTB基因、非洲猪瘟病毒p72基因和非洲猪瘟病毒I177L基因，本发明分别设计了荧光PCR引物和探针，建立了荧光PCR检测方法，为研制非洲猪瘟毒株鉴别试剂盒提供了参考。
从效果上来讲，本发明提供的三组灵敏度和特异性较高的荧光定量PCR特异性引物和探针组合，可特异的同时检测猪ACTB基因、非洲猪瘟病毒p72基因、非洲猪瘟病毒I177L基因，并且可以避免其他病毒的干扰，提升鉴别非洲猪瘟毒株的准确性。
由于本发明提供的引物探针组合能够用于鉴别非洲猪瘟毒株，尤其是鉴别非洲猪瘟I177L基因缺失毒株，本发明还提供了一种如上述任意所述的引物探针组合在鉴别非洲猪瘟毒株（非诊断目的）中的应用。
本发明还提供了一种用于鉴别非洲猪瘟毒株的PCR试剂，所述PCR试剂中含有如上述任意所述的引物探针组合。
作为本领域技术人员的普遍认知，所述PCR试剂中还可以含有用于PCR扩增的常规物质，以保证PCR的正常运行；例如：除所述引物探针组合外，所述PCR试剂中还可以含有TaqDNA聚合酶、缓冲液、无菌水、4种dNTP混合物中的一种或多种。
为了便于非洲猪瘟毒株鉴别工作的开展，本发明还提供了一种如上述任意所述的引物探针组合在制备非洲猪瘟毒株鉴别试剂盒中的应用；并且，本发明还提供了一种非洲猪瘟毒株鉴别试剂盒。
本发明提供的非洲猪瘟毒株鉴别试剂盒包括阳性对照品、阴性对照品和如上述任意所述的PCR试剂。通过引入所述阳性对照品和所述阴性对照品，本发明可以更加精准地针对不同基因进行定量分析和比较。
所述阳性对照品中可以含有阳性标准质粒（重组质粒），所述阴性对照品中可以包括或为灭菌水。所述阳性标准质粒中可以含有猪ACTB基因、非洲猪瘟病毒p72基因和非洲猪瘟病毒I177L基因的核苷酸序列，具体可以将三基因的序列（猪ACTB基因、非洲猪瘟病毒p72基因和非洲猪瘟病毒I177L基因）串联于pSP72克隆载体上得到；所述阳性标准质粒具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO.1的核苷酸序列为GATATCTACCTCCTGTCTGCTGAGAAGCTGTGATGGACGCAGGCGAGAGGGTGAGGCCCCCCAGGAGGGGCACCCGTCTTGCCCCCACACCTCCGGAGGGAGTGAGGCACAGAAACCCACCCCCTAAGTCCATCCAGATTTGAGGCCCTGAGGGGGCCCCTTCCGGTGAACCTCTCCAGGTTTACCCTTCACCTTGGGGGCCGAGGCCCTTGGGGACGGGTCCATTCCAGGTCTGGAGGAACGCGAGAAATGGAACCTTCAGCGCAAGGTGGGGAGGAGACTGCGGGCCGTGGGGATGGGCCCCCAAACCACATGGGCGCCCCAGGCGGGCTTCCCAGGTCAGTCAGTACCTGCCGTCCTGTCCAGAAGGGGCCTATTCCCCAGGGTGTCCCGAGCTGCCTCTCACCTGGGCAGAAAGAAGAGCAGAGTCAGAGGGAGCTCTTTAACGGCATAATTATCAAATGCGAAGGGGGATCCGTATAAAATCCTAGCTTGCCGGTAATGGCTATTAAGTTAAATTTGGTACCAGTAACACTAATATTTAAAAAGCCCTGATCATTAACTTTCCACATTAAAAGATTATTATATTCGAATGTTTGTCCAATATGGACAACTTTGTCACCAGATGTTACATTTGATTTGGTTGTTAGTGGCTGAAGCTTGGCACAATCAAAAATAAGCCCATTAACACTAAGATATAGAGGAGTGGGTTGATCTATTTTCTCATAGTTTAATATTCCATCTTTCCACGTAATAGCTTGATAATTATCCGCAGCAATGAGTTGAAATTTTATAAATAGTACAGGGGTTTTAGTTGTCGTTATACATTTAAAGGGTGTTTTCTAGAATGCAGCCCACTCACCACGCAGAGATAAGCTTTCAGGATAGAGATACAGCTCTTCCAGACGCATGTTCATCTATATCTGATATTAGCCCCGTTACGTATCCGATCACATTACCTATTATTAAAAACATTTCCGTAACTGCTCATGGTATCAATCTTATCGATAAATTTCCATCAAAGTTCTGCAGCTCTTACATACCCTTCCACTACGGAGGCAATGCGATTAAAACCCCCGATGATCCGGGTGCGATGATGATTACCTTTGCTTTGAAGCCACGGGAGGAATACCAACCCAGTGGTCATATTAACGTATCCAGAGCAAGAGAATTTTATATTAGTTGGGACACGGATTACGTGGGGTCTATCACTACGGCTGATCTTGTGGTATCGGCATCTGCTATTAACTTTCTTCTTCTTCAGGAATTC。
由于本发明提供的非洲猪瘟毒株鉴别试剂盒可以准确鉴别非洲猪瘟I177L基因缺失毒株，并将其与非洲猪瘟野生型毒株区分，本发明还提供了一种如上述任意所述的试剂盒在鉴别非洲猪瘟毒株（非诊断目的）中的应用。
本发明中，所述非洲猪瘟毒株包括非洲猪瘟I177L基因缺失毒株和非洲猪瘟野生型毒株中的至少一种；具体而言，所述非洲猪瘟毒株可以为非洲猪瘟I177L基因缺失毒株和/或非洲猪瘟野生型毒株。
由于疫苗研发等科研过程中，往往需要确定病毒的种类或基因型；因此，本发明还提供了一种基于多重荧光定量PCR鉴别非洲猪瘟毒株（非诊断目的）的方法，包括步骤：
S1，提供如上述任意所述的试剂盒。
S2，将阳性测试液、阴性测试液、检测液进行多重荧光定量PCR处理，并获取所述阳性测试液、所述阴性测试液、所述检测液在多重荧光定量PCR处理过程中的第一荧光信号、第二荧光信号、第三荧光信号。
所述阳性测试液为所述阳性对照品和所述PCR试剂的混合液；所述阴性测试液为所述阳性对照品和所述PCR试剂的混合液；所述检测液为待测液和所述PCR试剂的混合液，所述待测液中含有待测样本的核酸提取物，具体可以为所述待测样本的核酸提取液，所述待测样本通常为猪源样本。
所述第一荧光信号对应所述第一荧光基团，所述第二荧光信号对应所述第二荧光基团，所述第三荧光信号对应所述第三荧光基团。
为了获得所述待测样本的核酸提取物，本发明可以经样品采集、保存及运输，获得剖检猪取扁桃体、脾脏、肺脏等组织；也可以将待检活猪用注射器取血5 mL或分离血清，2~8℃保存，加冰密封运输（要求送检病料新鲜，严禁反复冻融）。然后，采用相应的病毒DNA提取试剂盒提取获得病毒DNA，作为反应模板。
为了获得所述阳性测试液、所述阴性测试液、所述检测液，本发明在试验过程中，按所需反应管数进行所述PCR试剂（荧光反应液）的配制，根据检测样品数（含阴性对照和阳性对照各1个），加入PCR试剂中的各成分混合后再分装成相应管数后，每管15 μL，配制体系如下表所示：
其中，“0.2+0.2+0.2 μL”指代每种上游引物或每种下游引物在15 μL体系中的加入量均为0.2 μL，“0.1+0.1+0.1 μL”指代每种探针在15 μL体系中的加入量均为0.1 μL。
本发明中，酶预混液中包含AceTaq DNA Polymerase，dNTP和合适浓度Mg2+；每种上游引物在20 μL体系中的终浓度可以在0.1~0.8 μM之间；每种下游引物在20 μL体系中的终浓度可以在0.1~0.8 μM之间，每种探针在20 μL体系中的终浓度可以在0.1~0.4 μM之间，具体以能够保证PCR反应正常进行为准。
在配制得到所述PCR试剂后，本发明将PCR试剂分装至PCR管中，每个PCR管中分装15 μL，然后向各PCR管中均加入5 μL的模板液，混匀，瞬时离心，将各PCR管放置于仪器样品槽相应位置，记录放置顺序，按照下表所示设置仪器核酸扩增相关参数，进行试验过程中的荧光PCR扩增：
需指出的是，本发明中的模板液分别为阳性对照液、阴性对照液和待测液；所述阳性对照液中含有所述阳性标准质粒，所述阳性标准质粒在5 μL模板液中的量可以为0.004ng；所述阴性对照液中含有灭菌水；所述待测液中含有待测样本的核酸提取物，该核酸提取物在5 μL模板液中的量可以为10-100 ng；具体以能够保证PCR反应正常进行为准。
S3，获取所述阳性测试液中所述第一荧光信号达到阈值线时的循环数，记为第一阳性循环数；获取所述阳性测试液中所述第二荧光信号达到阈值线时的循环数，记为第二阳性循环数；获取所述阳性测试液中所述第三荧光信号达到阈值线时的循环数，记为第三阳性循环数。
获取所述阴性测试液中所述第一荧光信号达到阈值线时的循环数，记为第一阴性循环数；获取所述阴性测试液中所述第二荧光信号达到阈值线时的循环数，记为第二阴性循环数；获取所述阴性测试液中所述第三荧光信号达到阈值线时的循环数，记为第三阴性循环数。
获取所述检测液中所述第一荧光信号达到阈值线时的循环数，记为第一检测循环数；获取所述检测液中所述第二荧光信号达到阈值线时的循环数，记为第二检测循环数；获取所述检测液中所述第三荧光信号达到阈值线时的循环数，记为第三检测循环数。
本领域技术人员知晓的是，阈值线为所述第一荧光信号、所述第二荧光信号和所述第三荧光信号达到仪器可探测到的荧光值；阈值线由仪器自动生成，主要用于探测荧光信号。
S4，当所述第一阳性循环数、所述第二阳性循环数、所述第三阳性循环数均不高于预设阳性循环数，且所述第一阴性循环数、所述第二阴性循环数、所述第三阴性循环数均不存在时，根据所述第一检测循环数、所述第二检测循环数、所述第三检测循环数判断所述待测样本的种类。
其中，当所述第一检测循环数和所述第二检测循环数均不高于预设检测循环数，所述第三检测循环数不存在，且所述检测液中所述第一荧光信号和所述第二荧光信号均具有指数型增长时，判定所述待测样本中的毒株为非洲猪瘟I177L基因缺失毒株。
当所述第一检测循环数、所述第二检测循环数、所述第三检测循环数均不高于所述预设检测循环数，且所述检测液中所述第一荧光信号、所述第二荧光信号、所述第三荧光信号均具有指数型增长时，判定所述待测样本中的毒株为非洲猪瘟野生型毒株。
当所述第一检测循环数不高于所述预设检测循环数，所述第二检测循环数和所述第三检测循环数均高于所述预设检测循环数，且所述检测液中所述第一荧光信号、所述第二荧光信号、所述第三荧光信号具有指数型增长时，对所述检测液进行复检；在所述复检过程中，当所述第一检测循环数不高于所述预设检测循环数，所述第二检测循环数和所述第三检测循环数均高于所述预设检测循环数，且所述检测液中所述第一荧光信号、所述第二荧光信号、所述第三荧光信号具有指数型增长时，判定所述待测样本中的毒株为非洲猪瘟野生型毒株。
当所述第一检测循环数不高于所述预设检测循环数，所述第二检测循环数高于所述预设检测循环数，所述第三检测循环数不存在，且所述检测液中所述第一荧光信号、所述第二荧光信号具有指数型增长时，对所述检测液进行复检；在所述复检过程中，当所述第一检测循环数不高于所述预设检测循环数，所述第二检测循环数高于所述预设检测循环数，所述第三检测循环数不存在，且所述检测液中所述第一荧光信号、所述第二荧光信号具有指数型增长时，判定所述待测样本中的毒株为非洲猪瘟I177L基因缺失毒株。
当所述第一检测循环数不高于所述预设检测循环数，且所述第二检测循环数和所述第三检测循环数不存在时，所述待测样本中不含非洲猪瘟核酸。
当所述第一检测循环数高于所述预设检测循环数，且所述待测样本为猪源样本时，更换所述检测液后采用前述方法和判定标准重新进行鉴定，即重新获取所述待测样本的核酸提取物后进行鉴定。
需指出的是，所述多重荧光定量PCR处理具有设定的循环次数，即处理循环数；本发明中，所述多重荧光定量PCR处理的循环次数为40次；所述预设阳性循环数、所述预设阴性循环数和所述预设检测循环数为35次。本领域技术人员可以理解的是，本发明中，阳性循环数、阴性循环数和检测循环数指代的是PCR循环次数；即，在PCR过程中，变性、退火+延伸的循环次数。
作为对本发明的细化说明，本发明的结果有效性分析：根据荧光信号到达阈值线（机器自动生成，探测荧光信号，判定阴阳性）所经历的循环数Ct值判定结果。
本发明中，基于前述探针设计，三个荧光信号（FAM、VIC、ROX）下，阳性对照的Ct值均≤35，有明显指数增长，呈典型的S型曲线；三个荧光信号（FAM、VIC、ROX）下，阴性对照的Ct值均无，无明显指数增长期和平台期，则结果有效。
不满足上述条件时，结果无效，需重复相关样品的检测。
当结果有效时，参照下表对鉴别非洲猪瘟毒株：
本发明所建立的检测方法，在保证结果准确率的前提下，一方面可用于鉴别诊断野生型毒株和基因缺失毒株，另一方面可以确认用于检测的猪源样品是否符合于检测诊断。在具体应用场景上，本发明可实际应用于养殖场、检测实验室、屠宰场、学术科研等；在实际应用过程中，本发明可在短时间内有效鉴别非洲猪瘟野毒毒株感染或基因缺失毒株感染，并对病原进行定性检测和定量分析。
以下为本发明的具体示例：
实施例1
一、构建阳性对照模板质粒
为保证结果中阳性对照物的准确性和实现精准定量，将猪ACTB基因、非洲猪瘟病毒p72基因和非洲猪瘟病毒I177L基因三个基因串联于克隆载体，构建成一个独立的重组质粒，记为阳性标准质粒；阳性标准质粒具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列（三个基因串联后形成的序列），阳性标准质粒的质粒图谱如图1所示。
二、针对猪ACTB基因的引物对比
针对猪ACTB基因的保守片段为靶目标设计三对引物；其中，设计引物对1的区域为猪ACTB基因第1601-1727位碱基位置；设计引物对2的区域为猪ACTB基因第1581-1727位碱基位置；设计引物对3的区域为猪ACTB基因第1580-1711位碱基位置。
三对引物的核苷酸序列如下所示：
使用阴性对照（无菌水5 μL）和不同浓度的阳性标准质粒（8.0×101拷贝数/μL~8.0×107拷贝数/μL）对引物对1-3进行引物筛选，结果如下表及图2-4所示。
采用引物对1-3分别对阳性标准质粒通过染料法扩增。选取熔解曲线呈现单一且尖锐峰且无非特异性扩增的引物对；其中，引物对2的扩增产物特异性好且无非特异性扩增及引物二聚体：
三、针对非洲猪瘟I177L基因的引物对比
针对非洲猪瘟I177L基因的保守片段为靶目标设计两对引物；其中，设计引物对4的区域为非洲猪瘟I177L基因第236-450位碱基位置；设计引物对5的区域为非洲猪瘟I177L基因第236-418位碱基位置。
两对引物的核苷酸序列如下所示：
使用阴性对照（无菌水5 μL）和不同浓度的阳性标准质粒（8.0×101拷贝数/μL~8.0×107拷贝数/μL）对引物对4-5进行引物筛选，结果如下表及图5-6所示。
采用引物对4-5分别对阳性标准质粒通过染料法扩增。选取熔解曲线呈现单一且尖锐峰及无非特异性扩增的引物对；其中，引物对5相较于引物对4，其扩增产物特异性好且无非特异性扩增：
四、针对非洲猪瘟p72基因的引物探针组合对比
针对非洲猪瘟p72基因的保守片段为靶目标设计三组引物探针组合；其中，设计引物对6的区域为非洲猪瘟p72基因第167-330位碱基位置，设计探针6的区域为非洲猪瘟p72基因第235-256位碱基位置；设计引物对7区域为非洲猪瘟p72基因第99-234位碱基位置，设计探针7的区域为非洲猪瘟p72基因第170-190位碱基位置；设计引物对8的区域为非洲猪瘟p72基因第99-233位碱基位置，设计探针8的区域为非洲猪瘟p72基因第172-190位碱基位置。
三组引物探针组合的核苷酸序列如下所示：
使用阴性对照（去离子无菌水5 μL）和不同浓度的阳性标准质粒（1.0×101拷贝数/μL~1.0×107拷贝数/μL）进行引物探针筛选。
采用引物探针组合6-8分别对阳性标准质粒通过探针法扩增后，选取灵敏度和特异性最佳的引物探针组合7，具体数据见下表：
采用引物探针组合6-8分别对PCV2（猪圆环病毒2型）和PCV3（猪圆环病毒3型）通过探针法扩增后，选取对PCV2和PCV3无特异性扩增的引物探针组合7，具体数据见下表：
实施例2
一、阳性对照和引物探针组合的确定
选取实施例1中的阳性标准质粒作为阳性对照。
选取实施例1中的引物对2，并将探针2与引物对2搭配，构成针对猪ACTB基因的引物探针组合2；其中，探针2的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，设计探针2的区域为猪ACTB基因第1143-1160位碱基位置。
选取实施例1中的引物对5，并将探针5和引物对5搭配，构成针对非洲猪瘟I177L基因的引物探针组合5；其中，探针5的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示，设计探针5的区域为非洲猪瘟I177L基因第274-295位碱基位置。
选取实施例1中引物探针组合7，用于针对非洲猪瘟p72基因。
二、建立检测体系及测试
将引物探针组合2、5、7进行测试，使用阴性对照（灭菌水5 μL）和不同浓度的阳性标准质粒（8.0×100拷贝数/μL~8.0×106拷贝数/μL）按本发明建立的反应体系进行多重荧光定量PCR，以得到标准曲线，试验结果见下表：
采用上表中的数据构建浓度-循环数标准曲线，发现：p72基因对应的标准曲线R2为0.995，I177L基因对应的标准曲线R2为0.996，ACTB基因对应的标准曲线R2为0.997，所建立的标准曲线R2均大于0.99，具有良好的线性关系；同时，基于测试结果，本发明将阳性样本的判定标准设置为：Ct值≤35。
三、特异性比较检测试验
对灭活的猪圆环病毒2型（PCV2）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病毒（PRV）提取DNA，对灭活的猪繁殖障碍综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）以及猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）提取RNA后逆转录cDNA，将上述核酸样品（DNA/cDNA）和本发明构建的阳性标准质粒，按照本发明建立的反应体系用引物探针组合2、5、7扩增后进行特异性比较检测。
参见图7-9进行理解，相关病毒样品的检测结果显示：对于阳性标准质粒，ACTB基因、p72和I177L三个基因（图中指示的基因来源于阳性标准质粒）检测到的CT均值分别为24.38、23.66、23.18；而其他样品（病毒）中，除ACTB基因外均无CT值，证明本发明具有较好的特异性。
图7中，除阴性对照外，均出现CT值；其中，ACTB（来源于阳性标准质粒）的CT值小于其他各病毒。图8中，仅p72（来源于阳性标准质粒）出现CT值，其他病毒和阴性对照无CT值。图9中，仅I177L（来源于阳性标准质粒）出现CT值，其他病毒和阴性对照无CT值。
将对上述各病毒均采用普通PCR方法（采用各病毒的特异性引物进行针对性扩增）进行跑胶验证，跑胶结果能呈现出单一清晰且符合大小的目的片段，验证结果见图10，证实了上述试验结果的有效性。
四、敏感性分析试验
使用阴性对照（无菌水）和不同浓度的阳性标准质粒作为模板，并按照本发明建立的反应体系，用引物探针组合2、5、7进行多重荧光定量PCR。
参见图11-13进行理解，可以看出，猪ACTB基因、非洲猪瘟病毒p72基因和非洲猪瘟病毒I177L基因的最小检出量均为8拷贝数/μL。
五、稳定性分析试验
为了评价本发明中鉴别方法的重复性和稳定性，将阳性标准质粒十倍梯度稀释，稀释到7个不同浓度（8.0×100拷贝数/μL~8.0×106拷贝数/μL），用引物探针组合2、5、7对每个模板做三个组内重复试验。以上实验间隔1天做1次，进行3次组间试验，每次3个重复取平均值，计算最终变异系数CV及方差SD，试验结果如下表所示：
由上表可知，用本发明建立的多重荧光PCR方法对将ACTB基因、p72和I177L三个基因进行组内和组间重复试验，计算最终变异系数CV，整体平均CV值低于5%，表明本发明建立的多重荧光PCR方法有很好的重复性和稳定性。
本发明的上述技术方案中，以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的技术构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围。
Claims (7)
1.一种用于鉴别非洲猪瘟毒株的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括第一引物对、第一探针、第二引物对、第二探针、第三引物对、第三探针；
所述第一引物对的上游引物具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，所述第一引物对的下游引物具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列；
所述第一探针具有如SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列，所述第一探针上还具有第一荧光基团和淬灭基团；
所述第二引物对的上游引物具有如SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列，所述第二引物对的下游引物具有如SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列；
所述第二探针具有如SEQ ID NO.17所示的核苷酸序列，所述第二探针上还具有第二荧光基团和淬灭基团；
所述第三引物对的上游引物具有如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列，所述第三引物对的下游引物具有如SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列；
所述第三探针具有如SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列，所述第三探针上还具有第三荧光基团和淬灭基团。
2.一种用于鉴别非洲猪瘟毒株的PCR试剂，其特征在于，所述PCR试剂中含有如权利要求1所述的引物探针组合。
3.一种如权利要求1所述的引物探针组合在制备非洲猪瘟毒株鉴别试剂盒中的应用。
4.一种非洲猪瘟毒株鉴别试剂盒，其特征在于，包括阳性对照品、阴性对照品和如权利要求2所述的PCR试剂。
5. 根据权利要求4所述的非洲猪瘟毒株鉴别试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品中含有阳性标准质粒，所述阳性标准质粒具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
6.一种基于多重荧光定量PCR非诊断目的鉴别非洲猪瘟毒株的方法，其特征在于，包括步骤：
S1，提供如权利要求4或5所述的非洲猪瘟毒株鉴别试剂盒；
S2，将阳性测试液、阴性测试液、检测液进行多重荧光定量PCR处理，并获取所述阳性测试液、所述阴性测试液、所述检测液在多重荧光定量PCR处理过程中的第一荧光信号、第二荧光信号、第三荧光信号；
所述阳性测试液为所述阳性对照品和所述PCR试剂的混合液；所述阴性测试液为所述阴性对照品和所述PCR试剂的混合液；所述检测液为待测液和所述PCR试剂的混合液，所述待测液中含有待测样本的核酸提取物；
所述第一荧光信号对应所述第一荧光基团，所述第二荧光信号对应所述第二荧光基团，所述第三荧光信号对应所述第三荧光基团；
S3，获取所述阳性测试液中所述第一荧光信号达到阈值线时的循环数，记为第一阳性循环数；获取所述阳性测试液中所述第二荧光信号达到阈值线时的循环数，记为第二阳性循环数；获取所述阳性测试液中所述第三荧光信号达到阈值线时的循环数，记为第三阳性循环数；
获取所述阴性测试液中所述第一荧光信号达到阈值线时的循环数，记为第一阴性循环数；获取所述阴性测试液中所述第二荧光信号达到阈值线时的循环数，记为第二阴性循环数；获取所述阴性测试液中所述第三荧光信号达到阈值线时的循环数，记为第三阴性循环数；
获取所述检测液中所述第一荧光信号达到阈值线时的循环数，记为第一检测循环数；获取所述检测液中所述第二荧光信号达到阈值线时的循环数，记为第二检测循环数；获取所述检测液中所述第三荧光信号达到阈值线时的循环数，记为第三检测循环数；
S4，当所述第一阳性循环数、所述第二阳性循环数、所述第三阳性循环数均不高于预设阳性循环数，且所述第一阴性循环数、所述第二阴性循环数、所述第三阴性循环数均不存在时，根据所述第一检测循环数、所述第二检测循环数、所述第三检测循环数判断所述待测样本的种类；
其中，当所述第一检测循环数和所述第二检测循环数均不高于预设检测循环数，所述第三检测循环数不存在，且所述检测液中所述第一荧光信号和所述第二荧光信号均具有指数型增长时，判定所述待测样本中的毒株为非洲猪瘟I177L基因缺失毒株。
7.根据权利要求6所述的鉴别非洲猪瘟毒株的方法，其特征在于，所述步骤S4还包括：当所述第一检测循环数、所述第二检测循环数、所述第三检测循环数均不高于所述预设检测循环数，且所述检测液中所述第一荧光信号、所述第二荧光信号、所述第三荧光信号均具有指数型增长时，判定所述待测样本中的毒株为非洲猪瘟野生型毒株；
当所述第一检测循环数不高于所述预设检测循环数，所述第二检测循环数和所述第三检测循环数均高于所述预设检测循环数，且所述检测液中所述第一荧光信号、所述第二荧光信号、所述第三荧光信号具有指数型增长时，对所述检测液进行复检；在所述复检过程中，当所述第一检测循环数不高于所述预设检测循环数，所述第二检测循环数和所述第三检测循环数均高于所述预设检测循环数，且所述检测液中所述第一荧光信号、所述第二荧光信号、所述第三荧光信号具有指数型增长时，判定所述待测样本中的毒株为非洲猪瘟野生型毒株；
当所述第一检测循环数不高于所述预设检测循环数，所述第二检测循环数高于所述预设检测循环数，所述第三检测循环数不存在，且所述检测液中所述第一荧光信号、所述第二荧光信号具有指数型增长时，对所述检测液进行复检；在所述复检过程中，当所述第一检测循环数不高于所述预设检测循环数，所述第二检测循环数高于所述预设检测循环数，所述第三检测循环数不存在，且所述检测液中所述第一荧光信号、所述第二荧光信号具有指数型增长时，判定所述待测样本中的毒株为非洲猪瘟I177L基因缺失毒株；
当所述第一检测循环数不高于所述预设检测循环数，且所述第二检测循环数和所述第三检测循环数不存在时，所述待测样本中不含非洲猪瘟核酸；
当所述第一检测循环数高于所述预设检测循环数，且所述待测样本为猪源样本时，重新获取所述待测样本的核酸提取物后进行鉴定。
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