CN104561389A - 荧光定量rt-pcr鉴别检测蓝耳病毒株的方法 - Google Patents

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Abstract

一种荧光定量RT-PCR鉴别检测蓝耳病毒株的方法，包括以下步骤：1)采集血样，提取RNA，并设计特异性引物；上游引物的核苷酸序列为：CTTCCGACACCATCCGAG，下游引物的核苷酸序列为：TTGGCAGGTTGGTCACAG；2)以步骤1)所提取的RNA为模板，加入特异性引物，特异性引物的终浓度为0.2μMol/L；用TARAKA试剂盒反转录，用SYBR Green试剂盒实时荧光定量PCR扩增，扩增条件为：95℃，30s；95℃，15s，55℃，10s，72℃，30s，共循环30次，建立PCR扩增曲线；电泳结束后，取5μl在2％琼脂糖凝胶电泳中检测扩增结果；3)分析PCR扩增曲线、溶解曲线以及电泳结果。从根本上解决了现有检测方法无法同时检测高致病性蓝耳病毒株、经典毒株以及疫苗毒株的重大问题。

Description

荧光定量RT-PCR鉴别检测蓝耳病毒株的方法
技术领域
本发明涉及一种动物重大疫病防控检测技术，是属于一种病毒多个毒株的同时鉴别诊断的mRNA检测技术，具体地说是一种荧光定量RT-PCR技术同时鉴别检测蓝耳病各个毒株的方法，主要用于对蓝耳病病毒经典毒株(包括野毒和疫苗毒)、高致病毒株(包括野毒和疫苗毒)和天津疫苗毒株TJM-F92同时精确、快速地检测区分。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征，又称为蓝耳病，是一种由病毒引起的猪呼吸与繁殖障碍性疾病，是养猪业世界范围内的一种主要传染病，其高死亡率和高传染率给猪场带来了严重的经济损失。其主要由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)所致，现阶段流行的蓝耳病毒株包括蓝耳经典毒株、高致病毒株，而防治该病的有效方法是接种疫苗。依据PRRSV结构基因序列的不同可以将其分为欧洲型和美洲型两种基因型，而依据其致病力的不同，又可将其中的美洲型PRRSV分为经典株和高致病性株两种亚型。
对于蓝耳病的传统检测方法主要有动物试验、血清中和试验、免疫荧光试验、ELISA试验。其中，血清中和试验和ELISA试验检测时间长，且难以鉴别疫苗抗体和感染后产生的抗体。目前，PCR技术广泛应用到蓝耳病的检测中，但尚无同时检测蓝耳病经典毒株、高致病毒株以及疫苗毒株的荧光定量PCR方法。聚合酶链式反应(Polymerase ChainReaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于扩增特定的DNA片段。随着PCR技术研究和应用的深化，该技术在兽医领域得到广泛应用，几乎所有已知的DNA和RNA序列的病毒均可用PCR和RT-PCR方法进行特异性检测、诊断，如口蹄疫、猪瘟、蓝耳、伪狂犬病、细小病毒感染、传染性法氏囊病、禽流感等。
对于高致病性蓝耳病的检测方法，曾有人作出了改进，如授权公告号为CN101319253B的发明专利，公开了“一种高致病性蓝耳病的检测方法”，该方法主要通过环介导等温扩增快速检测技术，使用特异性引物，利用环介导等温扩增技术(RT-LAMP)平台扩增靶序列的特定区域，在一系列质控和阴性、阳性对照的辅助下，从分子水平对包括高致病性蓝耳病毒核酸进行检测。该方法主要解决了ELISA法或RT-PCR法检测时间长、仪器条件要求高、检测灵敏度低的问题，所使用上游引物的核苷酸序列为5GCTCCGCGCAGGAAGGTCA,下游引物的核苷酸序列为GTGCGTCAGCGTTGTTGTC。但该方法仅能在特定条件下针对高致病性蓝耳病病毒进行检测，无法采用该方法同时检测另外两种毒株(经典毒株、疫苗毒株)。猪蓝耳病是重大疫病之一，属于强制性免疫，该技术无法鉴别诊断疫苗毒和引起疾病的野毒株，不能判定野毒感染。
而对于同时检测高致病性蓝耳病毒株和经典毒株的方法(试剂盒)，如申请公布号为CN103205507A的发明专利申请，公开了“一种检测高致病性猪蓝耳病与经典猪蓝耳病的RT-PCR引物及试剂盒”，其上游引物的核苷酸序列为GGCGACAATGTCCCTAAC，下游引物的核苷酸序列为GATGGCTTGAGCTGAGTAT。该方法的原理是利用高致病性猪蓝耳病和经典猪蓝耳病病毒的Nsp2基因的同源性，应用OLIG6.0软件，合成一对靶核苷酸序列的特异性引物，通过RT-PCR扩增后分别产生不同长度的目的片段，扩增HP-PRRS病毒特异性核酸目的片段长度为426bp，扩增经典猪蓝耳病病毒特异核酸目的片段为516bp，从而达到鉴别诊断两种病原的目的。但是，该试剂盒也仅能用于高致病性和经典毒株的同时检测，不能区分疫苗毒株，因此在蓝耳病疫苗强制性免疫的今天不能鉴别野毒感染，仍存在一定局限性，并不能完全替代现有的检测方法。为弥补现有检测方法的缺陷，发明人提出了如下技术方案。
发明内容
本发明的目的是提供一种荧光定量RT-PCR鉴别检测蓝耳病毒株的方法，从根本上解决了现有检测方法无法同时检测高致病性蓝耳病毒株、经典毒株以及疫苗毒株的重大问题。
一方面，本发明请求保护一种荧光定量RT-PCR鉴别检测蓝耳病毒株的特异性引物，其技术要点是：所述特异性引物上游引物的核苷酸序列为：CTTCCGACACCATCCGAG，下游引物的核苷酸序列为：TTGGCAGGTTGGTCACAG。
发明人对特异性引物是的确定是这样实现的：2006年出现的高致病性猪繁殖与呼吸综合征毒株与经典型毒株差异在于NSP2基因有30个氨基酸的缺失，表现为(1+29)氨基酸缺失形式。而天津株(TJ)病毒在传代遗传致弱过程中，发现在缺失30个氨基酸之外，又发现连续缺失了120AA。此片段的自然缺失，可用作弱毒活疫苗(TJM-F92)的标志。所以，发明人试图建立一种RT-PCR，能快速区分经典毒株、高致病性毒株及疫苗毒株(TJM)，这对于能否快速掌握猪场感染疫情，及时做出免疫方案及能否实现猪场免疫进化将起到关键作用。为此，发明人在GENEBank中下载多个PRRSV毒株的基因序列，用DNAstar软件进行序列分析，找到共同的保守片段，用Primer5.0进行特异性引物的设计。
另一方面，本发明还请求保护一种荧光定量RT-PCR鉴别检测蓝耳病毒株的方法，其技术要点是，包括以下步骤：
1)提取待测血样中的RNA,并设计特异性引物；
上游引物的核苷酸序列为：CTTCCGACACCATCCGAG，
下游引物的核苷酸序列为：TTGGCAGGTTGGTCACAG；
2)以步骤1)所提取的RNA为模板，加入特异性引物，特异性引物的终浓度为0.2μMol/L；用TARAKA试剂盒反转录，用SYBR Green试剂盒实时荧光定量PCR扩增，扩增条件为：95℃，30s；95℃，15s，55℃，10s，72℃，30s，共循环30次，建立PCR扩增曲线；电泳结束后，取5μl在2％琼脂糖凝胶电泳中检测扩增结果；
3)分析PCR扩增曲线、溶解曲线以及电泳结果，从而对蓝耳病毒株进行鉴别；高致病性毒株的PCR产物大小为820bp；经典毒株的PCR产物大小为907bp；天津疫苗毒株
(TJM-F92)的PCR产物大小为460bp。
采用SYBRGreen荧光定量PCR方法，可在荧光定量PCR仪器上建立快速、灵敏、特异性区分检测PRRSV经典毒株、高致病毒株和疫苗毒株TJM-F92，而口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪胃肠炎病毒等猪瘟病毒无非特异性扩增反应，本发明的方法具有良好的特异性，可将PRRSV区别于其他病毒，检测灵敏度可达10-5数量级。
附图说明
图1为PRRSV毒株区分不同疫苗毒株扩增曲线结果；
图2为PRRSV毒株区分不同疫苗毒株试验电泳鉴定结果；
图3为PRRSV病毒特异性试验的扩增曲线结果；
图4为PRRSV灵敏度试验的扩增曲线结果；
图5为PRRSV灵敏度试验的溶解曲线结果；
图6为猪血清样本扩增结果电泳图。
具体实施方式
以下结合图1-6，通过具体实施例详细说明本发明的内容。该荧光定量RT-PCR鉴别检测蓝耳病毒株的方法包括以下步骤：1)各取200μl待测血样，用常规方法提取待测血样中的RNA，并设计特异性引物；
上游引物的核苷酸序列为：CTTCCGACACCATCCGAG，
下游引物的核苷酸序列为：TTGGCAGGTTGGTCACAG；
2)以步骤1)所提取的RNA为模板，用20μl无RNA酶的0.1％的DEPC水将RNA溶解，加入特异性引物，特异性引物的终浓度为0.2μMol/L；用TARAKA试剂盒反转录，用SYBR Green(生产商：TARAKA)试剂盒实时荧光定量PCR扩增，扩增条件为：95℃，30s；95℃，15s，55℃，10s，72℃，30s，共循环30次，以DEPC水为阴性对照，建立PCR扩增曲线；电泳结束后，取5μl在2％琼脂糖凝胶电泳中检测扩增结果；
3)分析PCR扩增曲线、溶解曲线以及电泳结果。
实施例1
分别取基因缺失疫苗毒株TJM-F92、经典疫苗毒株CH-1a、高致病性疫苗毒株JXA-1的RNA，并以其作为模板用20μl无RNA酶的0.1％的DEPC水将RNA溶解，加入特异性引物，特异性引物的终浓度为0.2μMol/L；用TARAKA试剂盒反转录，用SYBR Green(生产商：TARAKA)试剂盒实时荧光定量PCR扩增，扩增条件为：95℃，30s；95℃，15s，55℃，10s，72℃，30s，共循环30次，以DEPC水为阴性对照。三种蓝耳病毒株的扩增曲线结果如图1所示。
取5μl在2％琼脂糖凝胶电泳中检测扩增结果，三种蓝耳病毒株的荧光检测结果如图2所示，从左到右依次为高致病性毒株JXA-1、经典疫苗毒株CH-1a、基因缺失疫苗毒株TJM-F92、阴性对照、分子marker。
实施例2
特异性扩增曲线结果如图3所示，分别以PRRSV、猪瘟病毒、猪乙型脑炎病毒、伪狂犬病毒、口蹄疫病毒、猪胃肠炎传染病毒的核酸为模板做PRRSV的特异性荧光RT-PCR反应，同时以DEPC水为阴性对照。反转录反应体系使用TAKARA试剂盒，每条引物的终浓度为10nmol，加入DEPC水将每个反应补充至20μl，反应条件为预变性95℃，30s；95℃，15s，55℃，10s，72℃，30s共30循环，仅PRRSV毒株有扩增曲线。其结果，从左到右依次为基因缺失疫苗毒株TJM-F92、经典疫苗毒株CH-1a、高致病性毒株JXA-1；而猪瘟病毒、猪乙型脑炎病毒、伪狂犬病毒、口蹄疫病毒、猪胃肠炎传染病毒结果为阴性。
实施例3
灵敏度扩增曲线结果如图4、5所示，以病毒中和试验测定疫苗毒的TCID50，将疫苗毒10倍比梯度稀释，将10倍比稀释样提取RNA，在荧光定量PCR仪器上检测到扩增曲线的最大稀释倍数即荧光定量PCR的灵敏度。图4中，从左到右的稀释倍数依次是依次为100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、空白对照。图5为PRRSV灵敏度试验的溶解曲线,结果中各稀释倍数在特定范围内均存在峰值，而且为单峰，说明没有非特异扩增。
实施例4
通过荧光RT-PCR检测方法对18例蓝耳病感染猪场猪送检血样进行检测。其电泳结果如图6所示，猪血清样本1～4、7、9、11、13～16为高致病性蓝耳病病毒株，大小为820bp；而血清样本5、6、8、10、12、17为接种蓝耳病疫苗毒株(TJM-F92)，大小为460bp；而本次检测样本中无经典毒株，未检测到经典毒株(大小为907bp)。高致病性毒株的PCR产物大小为820bp；经典毒株的PCR产物大小为820bp+87bp＝907bp；疫苗毒株(TJM)的PCR产物大小为820bp-360bp＝460bp。因此，可将三种病毒加以区分。
综合以上实施例可知，本方法可用于快速准确地鉴别三种毒株。

Claims (2)

1.一种荧光定量RT-PCR鉴别检测蓝耳病毒株的特异性引物，其特征在于：所述特异性引物上游引物的核苷酸序列为：CTTCCGACACCATCCGAG，下游引物的核苷酸序列为：TTGGCAGGTTGGTCACAG。
2.一种荧光定量RT-PCR鉴别检测蓝耳病毒株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测血样中的RNA，并设计特异性引物；
上游引物的核苷酸序列为：CTTCCGACACCATCCGAG，
下游引物的核苷酸序列为：TTGGCAGGTTGGTCACAG；
2)以步骤1)所提取的RNA为模板，加入特异性引物，特异性引物的终浓度为0.2μMol/L；用TARAKA试剂盒反转录，用SYBR Green试剂盒实时荧光定量PCR扩增，扩增条件为：95℃，30s；95℃，15s，55℃，10s，72℃，30s，共循环30次，建立PCR扩增曲线；电泳结束后，取5μl在2％琼脂糖凝胶电泳中检测扩增结果；
3)分析PCR扩增曲线、溶解曲线以及电泳结果，从而对蓝耳病毒株进行鉴别；高致病性毒株的PCR产物大小为820bp；经典毒株的PCR产物大小为907bp；天津疫苗毒株(TJM-F92)的PCR产物大小为460bp。
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