CN116814848B - 基于荧光raa检测小鼠微小病毒的引物和探针及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于荧光RAA检测小鼠微小病毒的引物和探针及方法，所述引物包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，探针是在SEQ ID No.3所示核苷酸序列的基础上5’端第34位碱基标记发光基团，第36位碱基替换为THF，第38为碱基标记淬灭基团，3’端用阻断剂标记。本发明建立的MVM荧光RAA法，操作简单，特异性强、灵敏度高，能够快速有效地检出临床样本。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检验领域，具体涉及一种基于荧光RAA检测小鼠微小病毒的引物和探针及方法。
背景技术
小鼠微小病毒(MVM)是目前动物病毒中最小最简单的单链DNA病毒之一，属于细小病毒科，细小病毒属。小鼠感染MVM病毒虽无明显的临床症状但可对一些免疫、移植和肿瘤等实验的结果造成严重的干扰。无论是在国外的FELESA、Charles River等大型检测实验室的实验小鼠健康监测的指南中还是国内关于实验动物检测的国标中均明确了MVM病毒的检测为实验小鼠的必检项目。目前常见的MVM检测方法包括血清学检测技术IFA、ELIS A法、分子病原学PCR、qPCR法等，也有一些新的病原分子核酸检测技术如环介导等温扩增技术(LAMP)等。血清学等回顾性检测适用于病毒感染后的检测，但是对免疫功能低下或免疫缺陷小鼠(如SCID小鼠和裸小鼠等)进行抗体检测，不能反映出动物感染病原的真实情况；PCR和qPCR等分子病原学检测技术识别病原，但耗时相对较长，对程序控温仪器有要求，不适合现场检测；LAMP虽然灵敏度高但其引物设计复杂繁琐，难度较大。因此建立一种快速简单并准确的检测技术十分必要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种快速简单准确的检测小鼠微小病毒的方法。
本发明的技术方案为：基于荧光RAA检测小鼠微小病毒的引物和探针组合，所述引物包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，探针是在SEQ ID No.3所示核苷酸序列的基础上5’端第34位碱基标记发光基团，第36位碱基替换为THF，第38为碱基标记淬灭基团，3’端用阻断剂标记。
进一步地，所述发光基团为FAM，淬灭基团为BHQ1，阻断剂为C3 spacer。
基于荧光RAA检测小鼠微小病毒的试剂盒，该试剂盒含有上述所述的引物和探针组合。
进一步地，还包括RAA荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性指控品、阳性指控品中的一种或多种。
基于荧光RAA检测小鼠微小病毒的方法，包括如下步骤：
(1)提取待检测样本的基因组DNA；
(2)以提取的基因组DNA为模板，以权利要求1或2所述的引物和探针组合进行RAA扩增，检测荧光信号；
(3)通过荧光信号进行结果判定。
参照NCBI上发表的MVM基因组序列，经BLAST比对，本发明选择保守性高、具有代表性的NS1基因片段设计检测引物和探针，具有高度特异性，保证了检测的准确性。灵敏度与传统的荧光定量PCR方法相当。实际样本和核酸模拟样本的验证研究证实本研究建立的实时荧光RAA检测方法具有与传统荧光定量PCR方法一致的稳定性和可靠性，两种方法的检测符合率为100％。与传统荧光定量PCR方法相比，本发明建立的实时荧光RAA检测方法的检测周期极短(包括结果判读在内，仅需20～30min)、操作也相对更加简单。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明针对MVM病毒所建立的荧光RAA检测方法具有快速方便、灵敏度高、特异性强等优点。
附图说明
图1普通RAA法引物筛选；
图2荧光RAA法的特异性试验结果；
图3MVM病毒qPCR法和荧光RAA法的灵敏度，A:qPCR法、B:荧光RAA法；图中1～5表示105～101copies/μL，6阴性对照；
图4MVM的小鼠样本检测结果：荧光RAA检测时间(Tt)和qPCR检测周期(Ct)间的线性回归分析。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
1材料与方法
1.1实验动物
45只SPF级BALB/C小鼠，雄性，6周龄来自于北京维通利华实验动物技术有限公司[SYXK(京)2022-0052]。
1.2病毒
小鼠微小病毒(MVM)、小鼠肝炎A59型(MHV-A59)，小鼠肝炎1型(MHV-1)，小鼠肝炎3型(MHV-3)，小鼠肝炎JHM型(MHV-JHM)，小鼠呼肠孤病毒3型(Reo-3)本单位保存。
1.3主要试剂与仪器
Takara MiniBEST Viral RNA/DNA提取试剂盒(批号：ALG0523A)购自宝日医生物工程(大连)有限公司；Probe dPCR Mix(批号：ALF2404A)均购自北京六合通经贸有限公司；ZC-Basic kits，ZC-/>exo kits(批号：84822012)和ZC-RT-/>exo kits(批号：83833013)购自杭州众测生物有限公司；核酸抽提液(批号：20180426)购自北京索莱宝生物科技有限公司；1×TE缓冲液(批号：H421KA9723)购自生工生物工程股份有限公司；DMEM培养基(批号：AH29820716)购自美国丹纳赫集团；ABI7500荧光定量PCR仪购自美国应用生物系统公司(ABI)；NanoDrop 2000C超微量分光光度计购自美国Thermo Scientific公司。
1.4实验方法
1.4.1核酸提取
本文提到的病毒和小鼠盲肠内容物的核酸均使用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒(TaKaRa，大连，中国)提取，按照制造商的说明操作提取。
1.4.2引物和探针的设计
依据NCBI上发表的MVM(NC_001510)基因组序列，经BLAST比对选择MVM高度保守区域NS1基因设计引物和探针，见表1和表2。所有引物探针均由生工生物工程(上海)有限公司合成。
1.4.3qPCR反应体系及反应条件
qPCR反应采用ABI 7500荧光仪进行。qPCR反应体系为：2X Premix Ex Taq(ProbeqPCR)10μL,PCR Forward Primer(10μM)0.4μL,PCR Reverse Primer(10μM)0.4μL,Probe0.8μL,ROX Reference DyeⅡ(50X)0.2μL,DNA模板2μL,无RNA酶水6.2μL；阴性对照中2μL无RNA酶水取代DNA模板。反应条件：95℃5min；95℃30s，60℃34s，40个循环。
1.4.4普通RAA及荧光RAA法反应体系及反应条件
在RAA检测中，使用了酶和蛋白质的特定组合，包括重组酶、链置换DNA聚合酶和单链结合蛋白。基础RAA的反应体系为：每反应单元管总量50μL,其中25μL ABuffer缓冲液，上下游引物各2μL(10μm)，5μL DNA模板，13.5μL无RNase酶水和2.5μL B Buffer反应液。反应产物在2％琼脂糖凝胶中进行电泳，后经溴化乙锭染色，用凝胶成像仪观察结果。荧光RAA法每反应单元管总量也为50μL，除了RAA法需要加的反应体系另加0.6μL探针，并根据总量调整无RNase酶水的含量。荧光RAA反应条件：39℃1min；39℃30s,45个循环。用ABI 7500荧光仪观察实验结果。
1.4.5普通RAA法筛选引物
本研究根据普通RAA试剂引物探针设计的说明在MVM高度保守的NS1基因上设计了四对引物(表2)。利用不同引物RAA扩增结果选择一对扩增效果最好的引物(表2)。在优选的引物间设计一条荧光探针(表2)。荧光RAA采用ZC-exo试剂盒(杭州众测生物有限公司，中国)进行检测。
1.4.6荧光RAA灵敏度试验
MVM病毒核酸用ddPCR测得其浓度为1X105copies/μL，将MVM病毒核酸从105copies/μL用1×TE溶液依次10倍倍比稀释至100copies/μL，每个稀释度3次重复，利用上述建立的荧光RAA反应扩增体系对以上MVM核酸稀释样品进行检测，考察该方法的灵敏度。
1.4.7荧光RAA特异性试验
提取Reo-3、MHV-1、MHV-3、MHV-A59、MHV-JHM病毒的核酸，进行荧光RAA检测，考察该引物和探针的特异性。以无RNase酶水作为阴性对照的扩增模板。
1.4.8小鼠样本中MVM的检测
本研究取本实验室被送检的45只SPF小鼠盲肠内容物作为检测MVM的样本。按照中华人民共和国国家标准GB/T14926.42.2001《实验动物细菌学检测标本采集》中方法无菌采集盲肠内容物于1.5mL离心管，保存-80℃。将每份小鼠盲肠内容物0.2g加入1mL DMEM培养基，涡旋振荡1min，2000r离心5min后取上清液200μL,提取样本核酸。用qPCR法对其进行检测。
(1)MVM小鼠阳性模拟样本的建立
qPCR法的检测结果为45只MVM的小鼠样本均为阴性。后随机取其中15份，按每0.1g小鼠盲肠内容物加入50μL适当倍数稀释的病毒原液，混匀制成MVM阳性模拟样本，使阳性模拟样本初始病毒核酸量在1/4×102copies/μL～1/4×106copies/μL范围之间。同时将一份已知MVM病毒提取核酸作为此次样本的阳性质控品。
(2)荧光RAA和qPCR法对MVM阳性模拟样本的检测分析
为了评价荧光RAA检测MVM的可靠性，分别采用荧光RAA和qPCR法对样本进行检测，分析两种方法的相关性。
1.5统计学方法
采集达到设定的荧光阈值(threshold)时荧光RAA的检测时间(Tt)和qPCR检测周期(Ct)数据，应用IBM SPSS Statistics 22统计软件进行统计学分析,分析方法为线性回归分析。通过判定系数R2(也称为拟合优度或决定系数)来判断观测值的拟合效果，R2越接近1，表示回归模型拟合效果越好。通过F检验来判断回归模型的回归效果，即检验因变量与所有自变量之间的线性关系是否显著。显著性(P值)≤0.05时，具有统计学显著性意义。
2.结果
表1 qPCR的引物和探针
表2荧光RAA的引物和探针
2.1特异性试验结果
选择定量后的MVM病毒核酸作为扩增模板，利用以上四对引物对其进行扩增。由扩增结果可知引物MVM FP1/RP1，FP3/RP3在MVM病毒核酸模板上进行扩增时扩增效果较好，FP3/RP3相对扩增更好。因此选定MVM FP3/RP3引物作为本方法后续的扩增引物。后在MVMFP3/RP3引物上设计了相应的探针，利用荧光RAA试剂盒检测该探针的适用性是良好的。后将MVM病毒核酸作为模板，Rnase-free water作为阴性对照，检测Reo-3、MHV-1、MHV-3、MHV-A59、MHV-JHM的核酸模板，验证所建立荧光RAA方法的特异性，结果显示在检测模板为MVM病毒核酸时只需5min左右的反应时间即可检测到明显的荧光扩增信号，其他病毒和阴性对照在20min反应时间内均未见荧光扩增信号，表明所建立的荧光RAA法具有很强的特异性(图2)。
2.2敏感性试验结果
MVM病毒核酸从105copies/μL用1×TE溶液依次10倍倍比稀释至100copies/μL，每个稀释度进行3次重复实验。从实验结果来看两种方法均能在模板浓度为100copies/μL时出现明显的扩增曲线。当模板浓度较低时RAA检测方法的荧光扩增曲线的峰值较低。将MVM病毒核酸荧光RAA法与qPCR法的敏感性进行比较得到荧光RAA法的灵敏度同qPCR法检测结果一致均为101copy/μL(图3)。采用3个独立重复，确定荧光RAA和qPCR检测的重复性，阴性对照样本在两种检测方法检测时均未产生明显的荧光扩增信号。
2.3小鼠样品的检测结果
利用本研究所建立的MVM荧光RAA检测法和传统的荧光定量PCR检测法分别对30份阴性小鼠盲肠内容物、15份模拟阳性样品和质控品进行检测，结果显示RAA检测方法与荧光定量PCR检测方法的检测结果完全一致，符合率为100％。应用IBM SPSS Statistics 22统计软件对样本荧光RAA的检测时间(Tt)和qPCR检测周期(Ct)数据进行统计学分析,分析方法为线性回归分析。结果表明两种方法的关联性为R2＝0.85(图4)，F检验结果P＝0.01，两个变量之间具有显著的相关性。
表3小鼠样本的检测结果
注：“+”表示positive，“－”表示negative。
Claims (4)
1.基于荧光RAA检测小鼠微小病毒的引物和探针组合，其特征在于，所述引物包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，探针是在SEQ ID No.3所示核苷酸序列的基础上在5’端第34位碱基标记发光基团，第36位碱基替换为THF，第38为碱基标记淬灭基团，3’端用阻断剂标记。
2. 根据权利要求1所述的引物和探针组合，其特征在于，所述发光基团为FAM，淬灭基团为BHQ1，阻断剂为C3 spacer。
3.基于荧光RAA检测小鼠微小病毒的试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有权利要求1或2所述的引物和探针组合。
4.非疾病诊断目的的基于荧光RAA检测小鼠微小病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）提取待检测样本的基因组DNA；
（2）以提取的基因组DNA为模板，以权利要求1或2所述的引物和探针组合进行RAA扩增，检测荧光信号；
（3）通过荧光信号进行结果判定。
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