CN113373263A

CN113373263A - 用于检测lsdv的引物和试剂盒

Info

Publication number: CN113373263A
Application number: CN202110583002.8A
Authority: CN
Inventors: 李守军; 王京煜; 贾坤
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2021-05-27
Filing date: 2021-05-27
Publication date: 2021-09-10

Abstract

本发明属于检测技术领域，公开了用于检测LSDV的引物和试剂盒，本发明通过检测LSDV RPO30基因，借助ERA技术，结合荧光探针的特性，构建出能够检测LSDV的ERA方法，其最低检测限为1×10²拷贝/μL。综上所述，本研究建立的LSDV RPO30的检测方法，42℃恒温条件15分钟即可实现对目的片段的有效扩增，具有操作简单、敏感性高、特异性强和快速等优点，适用于现场和基层检测。

Description

用于检测LSDV的引物和试剂盒

技术领域

本发明涉及检测技术领域，更具体地，涉及用于检测LSDV的引物和试剂盒。

背景技术

牛结节性皮肤病(Lumpy skin disease，LSD)，也被称为牛疙瘩皮肤病、牛结节疹或牛结节性皮炎，是一种重要的以牛为主要自然宿主和传染源的痘病毒疾病，是由痘病毒科(Poxviridae)脊椎动物痘病毒亚科(Chordopoxvirinae，ChPV)山羊痘病毒属(Capripoxvirus，CaPV)牛结节性皮肤病病毒(Lumpy skin disease virus，LSDV)引起的。通常情况下，LSDV在常温下可以长时间存活，尤其在干燥的结痂中可以存活35天，非常稳定。此外，LSDV在风干的兽皮中至少存活18天，在坏死的皮肤结节中能存活长达33天甚至更久。该病毒还对紫外线和含有脂质溶剂的洗涤剂较敏感。

对于牛结节性皮肤病目前并没有好的免疫方法和治疗措施，只能通过快速检测来控制疫情的发展，目前对于LSDV的诊断方法主要包括临床检查、常规聚合酶链式反应(PCR)，实时荧光定量PCR，高分辨率熔解(high-resolution melting，HRM)曲线分析法，环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)和重组酶聚合酶扩增法(recombinase polymerase amplification，RPA)。免疫学方法能定性、定量检测血清抗体或感染性抗原，是LSD实验室诊断的重要依据，可取牛结节或活检样品研磨液、破溃结节内浆液、眼鼻分泌物、血清等进行检测。OIE推荐应用病毒中和试验(virus neutralizationtest，VNT)检测LSDV特异性血清抗体。该方法也适用于LSD群流行病学调查和疫苗免疫保护效果评价等。此外，已有商品化酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒用于羊痘病毒属的检测，但不能进行属内不同种病毒的区分。

上述检测方法要么需要专业的技术人员操作，要么检测时间和程序较为复杂，不适合现场快速检测。

发明内容

本发明为了克服现有技术中缺乏LSDV的现场快速检测方法，首先提供用于适用于现场快速检测的LSDV的引物和探针。

本发明的第二个目的是提供含有上述引物和探针的试剂盒。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

用于检测LSDV的ERA引物和探针，所述引物为RPO30-ERA-F1、RPO30-ERA-R1，序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，所述探针为RPO30-ERA-probe，序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明还提供用于检测LSDV的ERA试剂盒，包含所述的引物和探针。

优选的，所述的试剂盒还包括激活剂和溶解剂；均来自基础型核酸扩增试剂盒。

优选的，所述试剂盒的反应体系：探针0.72μL、引物RPO30-ERA-F1 2.1μL、引物RPO30-ERA-R1 2.1μL、模板2μL、激活剂2μL、溶解剂20μL、ddH₂O 21.08μL。

优选的，所述试剂盒的反应温度为42℃。

LSD是一种新传入我国的动物疫病，有必要运用快速准确的检测方法加强监测。直至目前为止，我国牛结节性皮肤病疫情总体可控，但是尚无有效的治疗药物和商品化疫苗，所以只能通过检测手段阻止疫情的蔓延。实验室检测方法手段很多，一般都PCR、rPCR、SNT、HRM等分子生物学方法，可实现LSDV的特异性检测、羊痘病毒属不同种病毒的通用检测以及LSDV野毒株和疫苗株的区分。LSDV RPO30基因是痘苗病毒E4L基因的同源基因，编码依赖于DNA的RNA聚合酶，因为该基因在山羊痘病毒属中是高度保守的，国内外很多研究将该基因的核苷酸序列的变异应用于LSDV、GTPV、SPPV之间的鉴别诊断，以揭示不同毒株之间的同源关系。

ERA技术作为新式的分子生物学诊断方法，它可在37-42度的条件下实现核酸扩增，同时可以在20min内检测到病原。该方法可在不同条件下摸索不同条件来实现病原的快速检测。ERA技术引物的设计是关系试验成功的关键。ERA引物设计与普通PCR引物设计基本一致，但与普通PCR相比，ERA引物长度要更长一些。普通PCR引物一般是18-25bp，而ERA引物是31-35bp。同时ERA引物应避免在5’端出现多个鸟嘌呤，引物对之间避免形成二聚体。ERA技术与PCR技术相比，最大的特点就是恒温扩增，只需要在37-42℃条件下利用特殊的酶打开模板链，即可完成扩增。ERA技术不需要热变性，反应时间短。ERA技术与传统的技术相比最大的特点是对于设备的需求很低，只需要一般的恒温设备，检测成本更低。

本发明还提供利用上述试剂盒检测牛结节性皮肤病(Lumpy skin disease，LSD)的方法，包括以下步骤：

S1、提取待检样品的DNA作为模板DNA，控制模板DNA水溶液的OD260/OD280值为1.6～2.0，浓度为10～100ng/μL；

S2、牛结节性皮肤病病毒的ERA等温扩增：

(1)准备1.5mL高压过的离心管，在离心管中配置每份样本的预混液，预混液由以下组分组成：溶解剂20μL，正向引物(10μM)、反向引物(10μM)各2.1μL，ddH₂O 21.08μL，探针0.72μL，模板2μL，充分震荡混匀并短暂离心。

(2)将48μL的预混液转移至每管荧光扩增试剂中。振荡混匀直到扩增试剂重悬，并短暂离心。

(3)对于每份样本，在反应管盖上加上2μL激活剂，小心盖紧管盖，通过短暂离心使激活剂进入预混液中。短暂振荡并再次快速离心。

(4)将反应管放入合适的恒温荧光检测仪中，启动检测，42℃，持续20分钟，每30秒采集一次FAMt通道荧光值。

(5)反应结束后，保存数据并弃置样本管。

S3、结果判读

若所述样品出峰时间≤15min或Ct值<35，判断为阳性，所述样品含有牛结节性皮肤病病毒；若所述样品出峰时间≥20min或Ct值≥35，判断为阴性，所述样品不含有牛结节性皮肤病病毒。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过检测LSDV RPO30基因，借助ERA技术，结合荧光探针的特性，构建出能够检测LSDV的ERA方法，其最低检测限为1×10²拷贝/μL。综上所述，本研究建立的LSDVRPO30的检测方法，42℃恒温条件15分钟即可实现对目的片段的有效扩增，具有操作简单、敏感性高、特异性强和快速等优点，适用于现场和基层检测。

附图说明

图1为ERA-LSDV-PRO30引物的筛选和优化，图1A为RT-PCR引物鉴定M：DL2000；1：RPO30-ERA-F1/R1；2：RPO30-ERA-F2/R2；3：RPO30-ERA-F3/R3；图1B为ERA引物鉴定结果；引物1为RPO30-ERA-F1/R1；引物2为RPO30-ERA-F2/R2；引物3为RPO30-ERA-F3/R3；引物4为RPO30-ERA-F4/R4；引物5为RPO30-ERA-F5/R5；

图2为引物1在不同温度下，不同探针体积对结果的影响，其中图2A为37℃下不同探针体积的对ERA结果的影响；图2B为39℃下不同探针体积的对ERA结果的影响；图2C为42℃下不同探针体积的对ERA结果的影响；其中，条件1为探针0.18μL、条件2为探针0.36μL、条件3为探针0.54μL、条件4为探针0.72μL；

图3为ERA-LSDV-PRO30引物特异性实验，图中，1、BEFV；2、BVDV；3、SV；4、BPIV3；5、牛支原体；6、肺炎克雷伯菌；7、沙门氏菌；8、ddH₂O；

图4为ERA-LSDV-PRO30引物敏感性实验；

图5为ERA-LSDV-PRO30引物重复性实验。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

基础型核酸扩增试剂盒(ERA法)购自苏州先达基因科技有限公司。Phanta MaxSuper-Fidelity DNA Polymerase购自南京诺唯赞生物科技有限公司。GenStar 2×TaqPCR StarMix和Loading Dye购自广州康润生物公司。

牛流行热病毒(BEFV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛支原体、仙台病毒(SV)、肺炎克雷菌、沙门氏菌均由本实验室保存。

实施例1引物和探针的设计

收集NCBI上公布的LSDV全基因组序列，利用MEGA6软件分析不同毒株之间RPO30最为保守的区域。在生工生物工程(上海)股份有限公司合成RPO30的全基因质粒PUC57-LSDV-RPO30，计算PUC57-LSDV-RPO30的拷贝数。根据TwistDX公司给出的指导建议(https://www.twistdx.co.uk/en/support/rpa-assay-design-2)设计ERA引物和探针(表1)，通过BLAST比对确定引物和探针的特异性，送生工生物工程(上海)股份有限公司合成标记。

表1ERA引物和探针序列

将生工合成的LSDV RPO30全基因质粒命名为PUC-LSDV-RPO30，并通过公式计算质粒拷贝数，PUC-LSDV-RPO30的DNA拷贝数分别为1.54×10¹⁰copies/μL。

以生工合成的标准质粒PUC57-LSDV-RPO30为模版，使用聚合酶链式反应获得ERA引物对应的目的片段的方法，来筛选出较优单一条带的ERA引物对。反应体系：2×Taq PCRStarMix各10μL，上、下游引物(10μmol/L)各0.4μL，模板30ng，ddH₂O补足20μL。反应程序：94℃2min；94℃30s、52℃(RPO30)、72℃45s、35个循环；72℃延伸5min。

使用常规ERA方法，以进行引物的筛选，筛选出实验效果较优引物对。反应体系：溶解剂各20μL，上、下游引物(10μmol/L)各2.1μL，模板30ng，激活剂各2μL，ddH₂O补足50μL。反应程序：37℃30min，每15s收集FAM荧光信号。

将生工合成的LSDV RPO30全基因质粒命名为PUC-LSDV-RPO30,并通过公式计算质粒拷贝数，PUC-LSDV-RPO30的DNA拷贝数分别为1.54×10¹⁰copies/μL。

将每对RPO30-ERA引物，分别进行普通聚合酶链式反应扩增。结果显示(图1A)，发现每对引物的特异性很好。使用ERA体系，对每对ERA引物进行荧光检测。结果以反应管内的荧光信号到达设定的域值(△Rn threshold：5000)时所经历的循环数(Cycle threshold，Ct)最低，并荧光值最大为标准(图1B)。分析后，得出RPO30-ERA-F1/R1为最优引物对(其荧光强度高，起峰时间短)。

同时我们对ERA反应条件进行优化(如图2)，优化后的条件为：温度42℃、探针0.72μL、引物F1 2.1μL、引物R1 2.1μL、模板2μL、激活剂2μL、ddH₂O 21.08μL、溶解剂20μL。

实施例2特异性实验

以BEFV、BVDV、SV、牛支原体、肺炎克雷伯菌的DNA或cDNA作为对照，加入蒸馏水为空白对照，使用优化后的ERA方法进行荧光检测，观察有无扩增曲线，检测方法的特异性。

对BEFV、BVDV、SV、牛支原体、肺炎克雷菌的DNA或cDNA进行ERA方法的检测，ddH₂O为阴性对照，进行优化后的ERA方法的检测。结果显示(图3)，该方法对其他5种病原的DNA或cDNA无特异性扩增，可见该方法能够特异性的扩增LSDV，表明该方法特异性较强。

实施例3敏感性实验

将PUC57-LSDV-RPO30模板质粒按10倍梯度稀释至10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹和10⁰copies/μL。以各浓度梯度的PUC57-LSDV-RPO30为模板，同时加入蒸馏水作为空白对照。使用优化后的ERA方法进行荧光检测，以测试引物和探针的敏感性。

以1.0×10¹⁰-1.0×10¹copies/μL浓度梯度的PUC57-LSDV-RPO30质粒为模板，使用优化过的ERA方法进行检测。结果显示(图4)，ERA-LSDV-RPO30方法检测出现结果所花时间分别为10min内，优化后的ERA方法对质粒的检测限为1.0×10²copies/μL。

实施例4重复性实验

将上述稀释的DNA模板进行重复试验，验证建立的RT-ERA方法的重复性是否良好。选取10⁶、10⁵、10⁴、10³拷贝浓度的DNA模板进行试验，每个浓度进行5次重复试验。根据荧光曲线出现的时间计算其变异系数。

为了评估上述建立方法的稳定性和重复性，选取4个浓度的质粒模板分别进行5次重复性试验，变异系数结果均小于10％，说明本研究建立的RT-ERA具有良好的重复性(表2，图5)。

表2

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 用于检测LSDV的引物和试剂盒

<130> ZM212140ZL

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

ctcttgtttg tatcatgacg ggaatagtgt 30

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

gtgatcttat acgtacgaca aatggaacag ag 32

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 3

cactcagggc atgggaggtt atacttttta aaaacattaa aatattc 47

Claims

1.用于检测LSDV的ERA引物和探针，其特征在于，所述引物为RPO30-ERA-F1、RPO30-ERA-R1，序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，所述探针为RPO30-ERA-probe，序列如SEQID NO：3所示。

2.用于检测LSDV的ERA试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的引物和探针。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括激活剂和溶解剂。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒的反应体系：探针0.72μL、引物RPO30-ERA-F1 2.1μL、引物RPO30-ERA-R1 2.1μL、模板2μL、激活剂2μL、溶解剂20μL、ddH₂O21.08μL。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应温度为42℃。