CN114859064B - 一种牛流行热病毒蛋白复合物及在牛流行热病毒自然感染抗体检测中的应用 - Google Patents

一种牛流行热病毒蛋白复合物及在牛流行热病毒自然感染抗体检测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种牛流行热病毒蛋白复合物及其在制备牛流行热病毒自然感染抗体检测试剂盒中的应用。首先，本发明意外发现，牛流行热病毒GNS‑N端蛋白、GNS‑C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白、β蛋白作为抗原能够特异性的区分牛流行热病毒自然感染和疫苗感染，用于牛流行热病毒自然感染抗体检测；其次，由牛流行热病毒GNS‑N端蛋白、GNS‑C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白、β蛋白组成的复合物可捕获牛流行热病毒感染牛产生的抗体，而不与疫苗免疫牛产生的抗体反应，可用于牛流行热病毒感染牛的筛查，有效避免由于窗口期造成的利用单一抗原进行检测可能存在的漏检问题；且具有更高的灵敏度和准确度。

Description

一种牛流行热病毒蛋白复合物及在牛流行热病毒自然感染抗体检测中的应用
技术领域
本发明属于牛流行热病毒检测技术领域，具体涉及一种牛流行热病毒蛋白复合物及其在制备牛流行热病毒自然感染抗体检测试剂盒中的应用。
背景技术
牛流行热(bovine ephemeral fever，BEF)是由牛流行热病毒(bovine ephemeralfever virus，BEFV)引起的黄牛、奶牛、肉牛及水牛的一种急性非接触性传染病。因为该病的流行特点，它又被称为三日热、暂时热、僵硬病等。该病会引起奶牛产奶量降低，乳品质下降，役用牛跛行及瘫痪，对养殖业造成重大经济损失。目前，该病感染动物包括黄牛、奶牛、水牛、牦牛、白牦牛等。
目前在牛流行热流行地区，主要利用疫苗接种防控该病。前期我们建立了以G蛋白为检测抗原的ELISA诊断方法(ZL 201410244271.1)可用于免疫水平监测，但在疫苗接种牛或自然感染牛均存在G蛋白抗体，因此基于G蛋白无法区别牛自然感染BEFV或BEF疫苗免疫产生的抗体，在推广应用中发现有疫苗受种史的疑似病牛无法利用G蛋白抗体ELISA进行诊断。目前已知BEFV编码N、P、M、G和L、α1、α2、α3、β、γ等蛋白，但尚不清楚病毒感染和疫苗免疫动物产生抗体的差别，可用于甄别自然感染的病毒抗原成为鉴别诊断的瓶颈。而且经前期研究发现，BEFV编码的N、P、M、α1、γ和L蛋白不能区分BEFV自然感染牛和疫苗接种牛，无法用于牛流行热病毒自然感染抗体的检测。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明通过筛选，获得可用于甄别自然感染的病毒抗原，提出一种牛流行热病毒蛋白复合物及其在牛流行热病毒自然感染抗体检测中的应用。具体包括以下内容：
第一方面，本发明提供了牛流行热病毒蛋白在制备牛流行热病毒自然感染抗体检测试剂或试剂盒中的应用，所述牛流行热病毒蛋白选自牛流行热病毒GNS-N端蛋白、GNS-C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白、β蛋白中的至少一种；所述GNS-N端蛋白、GNS-C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白、β蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1-5所示。
优选地，所述牛流行热病毒蛋白由牛流行热病毒GNS-N端蛋白、GNS-C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白和β蛋白组成。
优选地，所述牛流行热病毒GNS-N端蛋白、GNS-C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白和β蛋白的比例为1：1：2：2：2。
第二方面，本发明提供了一种牛流行热病毒蛋白组合物，所述牛流行热病毒蛋白组合物由牛流行热病毒GNS-N端蛋白、GNS-C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白和β蛋白组成；所述GNS-N端蛋白、GNS-C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白和β蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1-5所示。
优选地，所述牛流行热病毒GNS-N端蛋白、GNS-C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白和β蛋白的比例为1：1：2：2：2。
第三方面，本发明提供了上述第二方面所述的牛流行热病毒蛋白组合物在制备牛流行热病毒自然感染抗体检测试剂或试剂盒中的应用。
第四方面，本发明提供了一种上述第二方面所述的牛流行热病毒蛋白组合物的制备方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
(1)分别以牛流行热病毒RNA为模板，利用含载体重组序列的引物进行RT-PCR，扩增GNS-N端蛋白编码区、GNS-C端蛋白编码区、α2蛋白编码区、α3蛋白编码区和β蛋白编码区，分别将对应的编码区克隆至原核表达载体，转化表达菌株，经过抗性筛选后进行培养发酵，纯化获得重组GNS-N端蛋白、重组GNS-C端蛋白、重组α2蛋白、重组α3蛋白和重组β蛋白；
(2)将获得的重组GNS-N端蛋白、重组GNS-C端蛋白、重组α2蛋白、重组α3蛋白和重组β蛋白混合即得牛流行热病毒蛋白组合物。
第五方面，本发明提供了一种牛流行热病毒自然感染抗体检测ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒包括：酶标板、酶结合物、阳性对照、阴性对照、显色液、浓缩洗涤液、终止液、封板膜和血清稀释液；其中，所述酶标板上包被有牛流行热病毒GNS-N端蛋白、GNS-C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白和β蛋白中的至少一种；所述GNS-N端蛋白、GNS-C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白、β蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1-5所示。
优选地，所述酶标板上包被有牛流行热病毒GNS-N端蛋白、GNS-C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白、β蛋白的组合物。
优选地，所述牛流行热病毒GNS-N端蛋白、GNS-C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白和β蛋白的比例为1：1：2：2：2。
优选地，所述酶结合物为兔抗牛酶标二抗。
优选地，所述阳性对照为牛流行热病毒感染牛血清；所述阴性对照为未感染牛流行热病毒的牛血清；所述显色液为TMB显色液；所述洗涤液为PBST；所述终止液为H2SO4。
本发明的有益效果是：首先，本发明提供的牛流行热病毒GNS-N端蛋白、GNS-C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白、β蛋白及其组合物仅与BEFV感染牛血清反应但与疫苗接种牛血清无交叉反应，解决了现有技术无法区分牛流行热病毒野毒感染于疫苗免疫动物的技术难题；其次，利用本发明提供的牛流行热病毒GNS-N端蛋白、GNS-C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白、β蛋白的组合物为复合抗原，实现自然感染牛的α2、α3、β和GNS抗体同时检测，有效避免由于窗口期造成的利用单一抗原进行检测可能存在的漏检问题。
附图说明
图1BEFV重组GNS-N端蛋白表达及纯化；其中泳道1为Marker，自上而下分别为180kD、130kD、100kD、70kD、55kD、40kD、35kD、25kD、15kD、10kD；泳道2为诱导前；泳道3为1mMIPTG诱导表达后3h；泳道4为1mM IPTG诱导表达后4h；泳道5为1mM IPTG诱导表达后5h；泳道6为1mM IPTG诱导表达后6h；泳道7为菌体超声后上清；泳道8为菌体超声后沉淀；泳道9为纯化蛋白；
图2BEFV重组GSN-C端蛋白及纯化；其中泳道1为Marker，自上而下分别为180kD、130kD、100kD、70kD、55kD、40kD、35kD、25kD、15kD、10kD；泳道2为诱导前；泳道3为1mM IPTG诱导表达后3h；泳道4为1mM IPTG诱导表达后4h；泳道5为1mM IPTG诱导表达后5h；泳道6为1mM IPTG诱导表达后6h；泳道7为Marker；泳道8为纯化蛋白；
图3BEFV重组α2蛋白表达鉴定及纯化；其中泳道1为Marker，自上而下分别为180kD、130kD、100kD、70kD、55kD、40kD、35kD、25kD、15kD、10kD；泳道2为诱导前；泳道3为1mMIPTG诱导表达后3h；泳道4为1mM IPTG诱导表达后4h；泳道5为1mM IPTG诱导表达后5h；泳道6为1mM IPTG诱导表达后6h；泳道7为菌体超声后上清；泳道8为菌体超声后沉淀；泳道9为纯化蛋白；
图4BEFV重组α3蛋白表达及纯化；其中泳道1为Marker；泳道2为诱导前；泳道3为1mM IPTG诱导表达后3h；泳道4为1mM IPTG诱导表达后4h；泳道5为1mM IPTG诱导表达后5h；泳道6为1mM IPTG诱导表达后6h；泳道7为菌体超声后上清；泳道8为菌体超声后沉淀；泳道9为纯化蛋白；
图5BEFV重组β蛋白的表达及纯化；其中泳道1为Marker；泳道2为诱导前；泳道3为1mM IPTG诱导表达后6h；泳道4为菌体超声后上清；泳道5为菌体超声后沉淀；泳道6为上清纯化；泳道7为超声沉淀蛋白纯化；
图6BEFV感染血清与部分重组蛋白的Western blot图；其中，泳道1为Marker；泳道2为BEFV重组N蛋白；泳道3为BEFV重组M蛋白；泳道4为BEFV重组P蛋白；泳道5为BEFV重组α2蛋白；泳道6为BEFV重组β蛋白；7为BEFV重组γ蛋白；泳道8为BEFV重组GNS-N蛋白；泳道9为BEFV重组L蛋白；
图7BEF疫苗免疫血清与部分蛋白的Western blot图；其中，泳道1为Marker；泳道2为BEFV重组N蛋白；泳道3为BEFV重组M蛋白；泳道4为BEFV重组P蛋白；泳道5为BEFV重组α2蛋白；泳道6为BEFV重组β蛋白；泳道7为BEFV重组γ蛋白；泳道8为BEFV重组GNS-N蛋白；泳道9为BEFV重组L蛋白；
图8BEFV重组α3蛋白的Western blot图；其中，泳道1、3为Marker；泳道2为BEFV重组α3蛋白与感染血清作用；泳道4为BEFV重组α3蛋白与疫苗免疫血清作用；
图9BEFV重组GNS-C蛋白的Western blot图；其中，泳道1为BEFV重组GNS-C与感染血清作用；泳道2为Marker；泳道3为BEFV重组GNS-C与免疫血清作用；
图10BEFV重组α1蛋白的Western Blot图；其中，泳道1为BEFV重组α1蛋白与感染血清作用，无反应；泳道2为Marker；泳道3为BEFV重组α1蛋白与免疫血清作用，无反应；
图11ELISA检测结果，其中，A为BEFV重组N蛋白，B为BEFV重组M蛋白，C为BEFV重组P蛋白，D为BEFV重组L蛋白，J为BEFV重组γ蛋白建立的ELISA检测结果；G为BEFV重组α1蛋白建立的ELISA检测结果；E为BEFV重组GNS-N端蛋白，F为BEFV重组GNS-C端蛋白，H为BEFV重组α2蛋白，I为BEFV重组α3蛋白，K为BEFV重组β蛋白，L为本申请所述重组GNS-N端蛋白、GNS-C端蛋白、α2蛋白α3蛋白β蛋白组合物建立的ELISA检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。
本发明发现，BEFV编码的N、P、M、α1、γ和L蛋白不能区分BEFV自然感染牛和疫苗接种牛，无法用于牛流行热病毒自然感染抗体的检测。而只有本申请所述的BEFV病毒GNS-N端蛋白、GNS-C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白β蛋白及其组合物能够显著区分BEFV自然感染牛和疫苗接种牛，可用于牛流行热病毒自然感染抗体的特异性检测，具体包括以下内容：
实施例1BEFV重组GNS-N端蛋白、GNS-C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白、β蛋白及其组合物的制备
1.BEFV重组GNS-N端蛋白、GNS-C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白、β蛋白的制备
以牛流行热病毒RNA为模板，进行RT-PCR，分别利用含载体重组序列的引物扩增GNS-N端蛋白编码区和GNS-C端编码区，回收目的片段，取100ng与利用BamHI、Xho双酶切处理的pPROExHTb载体(100ng)共同转化BL21(DE3)感受态细胞，利用含60μg/mL氨苄青霉素的琼脂培养基筛选阳性克隆，提取质粒测序验证后，将重组菌进行培养发酵，在OD600为0.6时加入IPTG(终浓度为0.75mM)，诱导培养6-8h，镍柱纯化获得重组GNS-N端蛋白、GNS-C端蛋白；
所用引物为：GNS-NF：5’-tttcagggcgccatgggatccatgttcctgcaactcttt-3’；
GNS-NR：5’-cttggtaccgcatgcctcgagaatcaactctagtctaata-3’；
以及GNS-CF：5’-tttcagggcgccatgggatccagcattatatatgatagtaattttgg-3’；
GNS-CR：5’-cttggtaccgcatgcctcgagttcccttctatttttcctat-3’。
以牛流行热病毒RNA为模板，利用含载体重组序列的引物进行RT-PCR，扩增α2蛋白编码区，回收目的片段，取50ng与利用BamHI、Xho双酶切处理的pPROExHTb载体(100ng)共同转化BL21(DE3)感受态细胞，利用含60μg/mL氨苄青霉素的琼脂培养基筛选阳性克隆，提取质粒测序验证后，将重组菌进行培养发酵，在OD600为0.6时加入IPTG(终浓度为1mM)，诱导培养6-8h，镍柱纯化获得重组α2蛋白；
所用引物为：α2F：5’-tttcagggcgccatgggatccatgtttggttacatggaaa-3’；
α2R：5’-cttggtaccgcatgcctcgagtcaaaagaagaacaattt-3’。
以牛流行热病毒RNA为模板，利用含载体重组序列的引物进行RT-PCR，扩增α3编码区，回收目的片段，取50ng与利用BamHI、Xho双酶切处理的pET-42a载体(100ng)共同转化BL21(DE3)感受态细胞，利用含50μg/mL卡那霉素的琼脂培养基筛选阳性克隆，提取质粒测序验证后，将重组菌进行培养发酵，在OD600为0.6时加入IPTG(终浓度为1mM)，诱导培养6-8h，镍柱纯化获得重组α3蛋白；
所用引物为：α3F：5’-tccatgggatatcggggatccatggaaattgatggagga-3’；
α3R：5’-gtggtggtggtggtgctcgagtcataaataatcggttt-3’。
以牛流行热病毒RNA为模板，利用含载体重组序列的引物进行RT-PCR，扩增β编码区，取50ng与利用BamHI、Xho双酶切处理的pPROExHTb载体(100ng)共同转化BL21(DE3)感受态细胞，利用含60μg/mL氨苄青霉素的琼脂培养基筛选阳性克隆，提取质粒测序验证后，将重组菌进行培养发酵，在OD600为0.6时加入IPTG(终浓度为1mM)，诱导培养6-8h，镍柱纯化获得重组β蛋白。
所用引物为：βF：5’-tttcagggcgccatgggatccatggactttatccggtgtc-3’；
βR：5’-cttggtaccgcatgcctcgagctatccttgaatgagta-3’。
其中，BEFV重组GNS-N端蛋白、GNS-C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白、β蛋白的表达表达纯化结果分别如图1-5所示；本实施例分别获得了，BEFV重组GNS-N端蛋白、GNS-C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白、β蛋白。
2.BEFV蛋白与病毒感染血清、疫苗免疫血清的反应原性
分别利用0.2μg的重组N蛋白、M蛋白、P蛋白、L蛋白、α1蛋白、γ蛋白以及本发明中制备的重组α2蛋白、α3蛋白；GNS-N蛋白、GNS-C蛋白、β蛋白进行SDS-PAGE，转印至PVDF膜，分别与1:500倍稀释的BEFV感染牛血清、1:500倍稀释的BEF疫苗免疫牛进行Western blot，二抗和底物为1:8 000倍稀释的HRP兔抗牛IgG(Sigma公司)及SuperSignal West Pico底物，或1:300倍稀释的碱性磷酸酶(AP)标记的兔抗牛IgG(北京索莱宝科技有限公司)及BCIP/NBT显色试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，避光显色。
实验结果如图6-10所示，结果表明，BEFV的N、P、M、L、γ蛋白作为抗原进行检测时，不仅能够与BEFV感染牛血清反应，而且与疫苗免疫牛血清也发生反应，所以不能特异性的检测BEFV自然感染；而BEFV的α1蛋白与BEFV感染牛血清和BEF疫苗免疫牛血清均不反应，无法用于BEFV自然感染的检测；只有本申请所述的BEFV的GNS-N、GNS-C、α2、α3、β蛋白能够特异性地与BEFV感染牛血清反应，而不与BEF疫苗免疫牛血清反应，可作为鉴别自然感染牛(而非疫苗免疫牛)的诊断抗原，用于BEFV自然感染的特异性检测。
3.BEFV重组GNS-N端蛋白、GNS-C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白、β蛋白组合物的制备。
将上述制备的BEFV重组GNS-N端蛋白、GNS-C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白、β蛋白按照1：1：2：2：2进行混合，制备获得BEFV重组GNS-N端蛋白、GNS-C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白、β蛋白组合物。
实施例2牛流行热病毒自然感染抗体检测ELISA试剂盒
构建的ELISA试剂盒包括：酶标板、酶标二抗、阳性对照、阴性对照、显色液、浓缩洗涤液、终止液、封板膜和血清稀释液。
包被酶标板：分别将实施例1制备的BEFV重组GNS-N端蛋白、GNS-C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白、β蛋白或其组合物利用碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(胶囊购自Sigma-Aldrich公司，每个胶囊溶于100mL去离子水)分别稀释至浓度为0.5μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、1.0μg/mL、1.0μg/mL、1.0μg/mL，取100μL包被96孔酶标板，4℃包被过夜；次日甩掉抗原液，PBST溶液洗板3次，5％脱脂奶粉37℃封闭60min，PBST溶液洗板3次，晾干抽真空包装，4℃存放。
检测方法：(1)酶标板每孔加入90μL血清稀释液，然后分别加入10μL待检样品、阳性对照血清2孔、阴性对照血清2孔，轻轻震荡混匀，用封口膜封口，37℃孵育30min；(2)每孔加300μL洗涤液(1×)，洗涤3次，拍干；(3)加入1:4000倍稀释的酶标兔抗牛酶标二抗，每孔100μL，用封口膜封口，37℃孵育30min；(4)取出酶标板，打开封口膜，每孔加300μL洗涤液(1×)，洗涤3次，拍干；(5)每孔加入100μL底物，封口膜封口，37℃避光作用10min；(6)每孔加入100μL终止液，用酶标仪读取450nm吸光值(OD450nm值)；(7)当样品OD450nm值>阴性对照均值±3SD时，判定为阳性。
检测抗体：辣根化物酶标记的兔抗牛酶标二抗，购自Sigma-Aldrich公司。
显色液：单组分TMB显色液，购自北京索莱宝科技有限公司。
浓缩洗涤液：25倍PBST：称取200g NaCl，5g KCl，36g Na2HPO4，溶解于800mL去离子水中，调节pH至7.4，利用去离子水定容至1000mL，加入12.5mL吐温-20，充分溶解后分装。
终止液：2M H2SO4：分别量取108.7mL 98％浓硫酸和891.3mL去离子水，将浓硫酸玻璃棒引流沿烧瓶壁慢慢注入水中，不断搅拌散热，冷却至室温后分装存放。
封板膜：购自Axygen(爱思进)公司。
血清稀释液：购自济南百迪泰生物科技有限公司。
阳性对照：用8mL BEFV HN1/2012毒株人工接种中国荷斯坦奶牛，体温升高至39.5-42.0℃，体温正常后同剂量再次接种。共计接种3次，体温正常后第15天无菌采集全血分离血清，56℃加热30min，-20℃保存。
阴性对照：无菌采集无疫苗接种史、无BEFV感染史的中国荷斯坦奶牛的全血，病毒中和试验阴性，分离血清，-20℃保存。
实施例3样本检测
用本发明实施例2所述的ELISA试剂盒分别检测了10份未经疫苗免疫且病毒中和试验阴性的田间牛血清、3头BEFV第一次感染第7天的牛阳性血清、两个批次的商品化疫苗的免疫牛各3头的第4次免疫后血清。
检测结果如图11所示，其中，A为BEFV重组N蛋白，B为BEFV重组M蛋白，C为BEFV重组P蛋白，D为BEFV重组L蛋白，J为BEFV重组γ蛋白建立的ELISA检测结果；G为BEFV重组α1蛋白建立的ELISA检测结果；E为BEFV重组GNS-N端蛋白，F为BEFV重组GNS-C端蛋白，H为BEFV重组α2蛋白，I为BEFV重组α3蛋白，K为BEFV重组β蛋白，L为本申请所述重组GNS-N端蛋白、GNS-C端蛋白、α2蛋白α3蛋白β蛋白组合物建立的ELISA检测结果。结果表明：基于BEFV重组N蛋白、M蛋白、P蛋白、L蛋白、γ蛋白分别建立的ELISA试剂盒检测BEFV自然感染牛血清和BEF疫苗接种牛血清的抗体检测结果均在检测临界值之上，表明BEFV重组N蛋白、M蛋白、P蛋白、L蛋白、γ蛋白未能区分BEFV自然感染牛血清和BEF疫苗接种牛血清，不具备BEFV自然感染抗体检测特异性；BEFV重组α1蛋白建立的ELISA检测BEFV自然感染牛血清、BEF疫苗接种牛血清以及阳性血清的抗体检测结果均在检测临界值之下，未检出感染阳性，无法用于BEFV感染抗体的检测；只有本申请所述的BEFV重组GNS-N端蛋白、GNS-C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白、β蛋白或其组合物建立的ELISA试剂盒仅与BEFV感染牛血清反应(检测结果在检测临界值之上)，与疫苗接种牛血清无交叉反应(检测结果在检测临界值之下)，解决了现有技术无法区分牛流行热病毒野毒感染于疫苗免疫动物的技术难题，能够特异性的检测BEFV自然感染牛血清；而且由本发明提供的BEFV重组GNS-N端蛋白、GNS-C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白、β蛋白的组合物为复合抗原组成的ELISA试剂盒，在实现自然感染牛的α2、α3、β和GNS抗体同时检测，能够有效避免由于窗口期造成的利用单一抗原进行检测可能存在的漏检问题；且检测灵敏度和准确率更高，具有广阔的应用前景。
本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 一种牛流行热病毒蛋白复合物及在牛流行热病毒自然感染抗体检测中的应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Phe Leu Gln Leu Phe Asn Leu Ile Leu Val Tyr Cys Val Lys Thr
1               5                   10                  15
Ser Lys Ser Thr Trp Ile Asn Tyr Pro Glu Asn Cys Thr Ser Ile Ser
            20                  25                  30
Leu Gln Asp Gly Leu Lys Glu Leu Cys Gly Gly Asp Pro Leu Met Asn
        35                  40                  45
Ile Arg Asn Arg Leu Leu Asp Asp Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Glu Ile
    50                  55                  60
Cys Thr Pro Asn Tyr Ser Met Glu Lys Lys Ser Glu Gly Tyr Arg Cys
65                  70                  75                  80
Ala Ser Ile Lys Lys Lys Val Ile Cys Lys Met Leu Glu Asn Phe Asp
                85                  90                  95
His Glu Val Thr Tyr Ile Ser Glu Ser His Pro Ile Asp Lys Ala Lys
            100                 105                 110
Cys His Glu Leu Ile Ile Ser Lys Asp Leu Leu Asn Asn Ile Glu Glu
        115                 120                 125
Pro Tyr Tyr Pro Pro Pro Lys Cys Asp Ser Ser Lys Ser Ser Val Ser
    130                 135                 140
Glu Leu Glu Phe Ile Lys Leu Ile Asn Tyr Asp Val Val Leu Asp Pro
145                 150                 155                 160
Val Gly Phe Gln Asn Glu Asp Asn Tyr Leu Phe Lys Phe Asp Lys Thr
                165                 170                 175
Asn Ala Ile Pro Ile Asp Tyr Ile Tyr Gln Ser Glu Phe Cys Gln Ser
            180                 185                 190
Lys Asn Trp Ile Cys His Gly Asp Lys Ser Tyr Ile Pro Leu Glu Ile
        195                 200                 205
Phe Lys Gly Asp Asn Gln Ala Ser Ile Arg Leu Glu Leu Ile
    210                 215                 220
<210> 2
<211> 344
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ser Ile Ile Tyr Asp Ser Asn Phe Gly Glu Leu Pro Val Lys Asp Ala
1               5                   10                  15
Cys Trp Leu His Tyr Cys Gly Arg Pro Ala Ile Lys Leu Phe Asn Gly
            20                  25                  30
Ala Ile Ile Lys Ile Lys Glu Ser Pro Ile Ile Leu Gly Leu Pro Ser
        35                  40                  45
Cys Asn Trp Ser Gly Ile Glu Met Pro Glu Thr Asn Leu Ala Lys Lys
    50                  55                  60
Arg Tyr Ser Asn Val Gly Pro Val Leu Leu Thr Thr Leu Asn Lys Arg
65                  70                  75                  80
Phe Glu Leu Cys Lys Lys Ile Lys Lys Asn Leu Glu Ser Lys Gln Ser
                85                  90                  95
Ile Pro Ile Tyr Asn Leu His Tyr Leu Ala Pro Phe Glu Pro Gly Lys
            100                 105                 110
His Pro Ala Leu Val Tyr Arg Leu Val Cys Thr Thr Ile Ser Gln Ser
        115                 120                 125
Leu Arg Ser Lys Val Val Pro Val Gly Met Leu Ser Met Ser Met Cys
    130                 135                 140
Glu Tyr Ile Thr Gly Gln Ile Ile Glu Asp Gly Ile Lys Lys Asn Leu
145                 150                 155                 160
Thr Asp Glu Asp Thr Val Ile Ile Leu Ala Asn Asn Lys Glu Ile Lys
                165                 170                 175
Trp Lys Asp Phe Lys Gly Arg Glu Asn Trp Tyr Lys Glu Gln Ala Asn
            180                 185                 190
Pro Asn Ile Ile Asp Lys Asn Pro Asp Glu Leu Ser His Tyr Trp Tyr
        195                 200                 205
Asn Gly Val Met Arg Arg Glu Asp Lys Leu Thr Tyr Pro Ser Ser Tyr
    210                 215                 220
Ile Leu Gln Thr Leu Lys Lys Ile Tyr Thr Asp Thr Glu Arg Glu Ser
225                 230                 235                 240
Arg Ile Ser Phe Phe Lys Phe Arg Leu Glu Arg Asn Ile Thr Lys Thr
                245                 250                 255
Glu Ile Ile Lys Phe Lys Asp Thr Glu Glu Ser Leu Asn Gln Thr His
            260                 265                 270
Ser Ser Ser Val Asn Asp Thr Leu Asp Gly Asp Asp Tyr Leu Asn Trp
        275                 280                 285
Val Glu Glu Asn Thr Gly Asp Lys Asn Lys Thr Glu Gly Ser Ile Gly
    290                 295                 300
Asp Glu Lys Gln Thr Ile Gln Asn Lys Glu Tyr Trp Asn Glu Glu Ser
305                 310                 315                 320
Ser Ile Trp Gly Ile Ser Thr Ile Ile Thr Val Leu Gly Ile Tyr Tyr
                325                 330                 335
Ile Tyr Arg Lys Asn Arg Arg Glu
            340
<210> 3
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Phe Gly Tyr Met Glu Ile Cys Val Arg Val Glu Ile Gly Lys Gln
1               5                   10                  15
Asn Asn Arg Ile His Lys Leu Glu Leu Trp Lys Leu Met Glu Glu Gly
            20                  25                  30
Leu His Ala Leu Met Lys Lys Glu Lys Leu Asp Ile Met Leu Lys Glu
        35                  40                  45
Glu Ala Asn Phe Gly Phe Cys Arg Trp Leu Asn Thr Arg Gly Asn Trp
    50                  55                  60
Leu Cys Leu Glu Asp Val Arg Lys Pro Ile Ile Tyr Glu Phe Gln Asn
65                  70                  75                  80
Leu Phe Asn Cys Met Ser Tyr Pro Ser Arg Val Tyr Lys Ile Thr Val
                85                  90                  95
Gln Asn Asn Asp Tyr Lys Leu Gly Ser Ile Lys Asp Leu Gln Ile Lys
            100                 105                 110
Leu Phe Phe Phe
        115
<210> 4
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Glu Ile Asp Gly Gly Arg Leu Ala Cys Pro Asp Glu Glu Gly Lys
1               5                   10                  15
Ile Gly His Asn Ala Lys Gly Arg Ser Lys Leu Arg Leu Leu Ser Met
            20                  25                  30
Ala Gln His Gln Arg Glu Leu Val Met Phe Gly Arg Cys Lys Glu Thr
        35                  40                  45
Asp Tyr Leu
    50
<210> 5
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Asp Phe Ile Arg Cys His Val Ala Met Gln Ile Ile Asn Phe Arg
1               5                   10                  15
Ala Leu Glu Ile Asp Lys Arg Ser Leu Leu Gly Ile Leu Val Ile Lys
            20                  25                  30
Asn Ile Lys Asn Leu His Arg Ser Asn Gln Leu Leu Thr Arg Leu Ser
        35                  40                  45
Asp Leu Met Ile Pro Ser Val Ile His Asn Gly Gly Phe Val Met Arg
    50                  55                  60
Asn Asp Lys Asn Asn Lys Leu Trp Ile Phe Val Gly Glu Ser Trp Ala
65                  70                  75                  80
Ser Leu Asp Leu Glu Asp Leu Asn Gly Val Arg Asp Asn Val Phe Asn
                85                  90                  95
Leu Ser Lys Thr Val Pro Leu Leu Ile Gln Gly
            100                 105

Claims (9)

1.牛流行热病毒蛋白在制备区分牛流行热病毒自然感染牛和疫苗接种牛的检测试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述牛流行热病毒蛋白选自牛流行热病毒GNS-N端蛋白、GNS-C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白、β蛋白中的至少一种；所述GNS-N端蛋白、GNS-C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白、β蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1-5所示。
2.一种牛流行热病毒蛋白组合物，其特征在于，所述牛流行热病毒蛋白组合物由牛流行热病毒GNS-N端蛋白、GNS-C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白和β蛋白组成；所述GNS-N端蛋白、GNS-C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白、β蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1-5所示。
3.如权利要求2所述的牛流行热病毒蛋白组合物，其特征在于，所述牛流行热病毒GNS-N端蛋白、GNS-C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白和β蛋白的比例为1：1：2：2：2。
4.如权利要求2或3所述的牛流行热病毒蛋白组合物在制备区分牛流行热病毒自然感染牛和疫苗接种牛的检测试剂或试剂盒中的应用。
5.如权利要求2或3所述的牛流行热病毒蛋白组合物的制备方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
（1）分别以牛流行热病毒RNA为模板，利用含载体重组序列的引物进行RT-PCR，扩增GNS-N端蛋白编码区、GNS-C端蛋白编码区、α2蛋白编码区、α3蛋白编码区和β蛋白编码区，分别将对应的编码区克隆至原核表达载体，转化表达菌株，经过抗性筛选后进行培养发酵，纯化获得重组GNS-N端蛋白、重组GNS-C端蛋白、重组α2蛋白、重组α3蛋白和重组β蛋白；
（2）将获得的重组GNS-N端蛋白、重组GNS-C端蛋白、重组α2蛋白、重组α3蛋白和重组β蛋白混合即得牛流行热病毒蛋白组合物。
6.一种牛流行热病毒自然感染抗体检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述ELISA试剂盒包括：酶标板、酶结合物、阳性对照、阴性对照、显色液、浓缩洗涤液、终止液、封板膜和血清稀释液；其中，所述酶标板上包被有牛流行热病毒GNS-N端蛋白、GNS-C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白、β蛋白的组合物；所述GNS-N端蛋白、GNS-C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白、β蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1-5所示。
7.如权利要求6所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述牛流行热病毒GNS-N端蛋白、GNS-C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白和β蛋白的比例为1：1：2：2：2。
8.如权利要求6所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述酶结合物为兔抗牛酶标二抗。
9.如权利要求6所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为感染血清；所述阴性对照为未感染牛流行热病毒的牛血清；所述显色液为TMB显色液；所述洗涤液为PBST；所述终止液为H2SO4。
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