CN114685619B - 一种抗原蛋白、其单克隆抗体或多克隆抗体及应用 - Google Patents

一种抗原蛋白、其单克隆抗体或多克隆抗体及应用 Download PDF

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Abstract

本发明实施例涉及一种抗原蛋白、其单克隆抗体或多克隆抗体及应用，该抗原蛋白由N段到C段包括通过连接序列依次相连的鲤疱疹病毒2型ORF153蛋白的第45‑56位氨基酸、第76‑95位氨基酸、124‑145位氨基酸、176‑281位氨基酸。该去除原始ORF153蛋白中疏水性区域表达的抗原蛋白，其抗原性分析结果显示优于原始ORF153蛋白，并且利用该抗原蛋白获得的单克隆抗体或多克隆抗体均可用于鲤疱疹病毒2型的检测。

Description

一种抗原蛋白、其单克隆抗体或多克隆抗体及应用
技术领域
本发明涉及免疫检测领域，具体涉及一种抗原蛋白、其单克隆抗体或多克隆抗体及应用。
背景技术
鲤疱疹病毒2型(Cyprinid Herpesvirus 2，CyHV-2)，又称金鱼造血器官坏死病毒(goldfish haematopoietic necrosis virus，GFHNV)，)是一种引起金鱼和鲫造血器官坏死病的高致病性病毒，严重危害金鱼、鲫养殖业。该病毒自1992年在日本首次发现后，迅速蔓延至亚洲、北美洲、大洋洲、欧洲，在我国鲫主养区大规模暴发流行，给金鱼、鲫鱼养殖产业造成了严重的经济损失。
该病毒是第二个分离自鲤科鱼类的疱疹病毒，按照国际病毒系统分类委员会的系统命名规则，将该病毒命名为鲤疱疹病毒2型(CyHV-2)，属于疱疹病毒目、异样疱疹病毒科、鲤科疱疹病毒属，是我国危害极大的鲫造血器官坏死病的病原。CyHV-2是具有囊膜的双链DNA病毒，病毒颗粒直径为170～220nm，基因全长约为290kbp，G基因和C基因所占比例为51.7％。基因组共编码154个开放阅读框(Open reading frame，ORF)，其中有4个末端重复序列，整个基因组还有两个无编码功能的碎片基因。
Davision等应用先进的生物信息技术对三种鲤科疱疹病毒能够编码的蛋白进行预测分析。结果显示，CyHV-2基因组含有约150个编码功能蛋白的ORFs，包含一些在三种鲤科疱疹病毒基因组内共有的保守ORFs：如ORF33编码DNA包装末端酶亚基；ORF71编码DNA解旋酶亚基；ORF72编码病毒衣壳三联体亚基；ORF78编码衣壳成熟蛋白酶；ORF79编码DNA聚合酶亚基等。其余的CyHV-2ORFs中只有少数的功能得到确认，如ORF25、ORF25C和ORF25D能够编码膜蛋白；ORF104编码类激酶蛋白，该蛋白在病毒感染鱼体过程中起重要的作用。其他的ORF功能还有待进一步的研究。
本发明选择的ORF153以ORF153家族的形式存在于CyHV-2基因组中，预测ORF153蛋白家族为3型膜蛋白，虽然蛋白功能分析显示ORF153编码蛋白为膜蛋白，但未见具体的验证，其深入的功能定位还不清楚，更多相关研究仍有待开展。
目前已有很多CyHV-2的检测诊断方法，但在实际广泛应用中主要还是基于分子的检测技术，血清学诊断并没有得到广泛的应用。尤其是对于潜伏感染的宿主来说，基于分子的检测并不能判断宿主体内是否存在病毒，而血清学诊断技术能弥补这个缺陷。基于免疫学的抗原检测方法的建立，需要有能特异性识别CyHV-2的抗体。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
发明目的
本发明的目的在于提供一种抗原蛋白、其单克隆抗体或多克隆抗体及其在制备检测鲤疱疹病毒2型的试剂盒中的应用。该去除原始ORF153蛋白中疏水性区域的抗原蛋白，其抗原性分析结果显示优于原始ORF153蛋白，并且利用该抗原蛋白获得的单克隆抗体或多克隆抗体均可用于鲤疱疹病毒2型的检测。
解决方案
为实现本发明目的，本发明实施例提供了一种抗原蛋白，其由N段到C段包括通过连接序列依次相连的鲤疱疹病毒2型ORF153蛋白的第45-56位氨基酸、第76-95位氨基酸、124-145位氨基酸、176-281位氨基酸，所述第45-56位氨基酸、第76-95位氨基酸、124-145位氨基酸、176-281位氨基酸分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。
在一种可能的实现方式中，所述连接序列为6个组氨酸。
在一种可能的实现方式中，所述抗原蛋白还包括纯化标签和/或增强可溶性标签。
在一种可能的实现方式中，所述抗原蛋白还包括His-tag和/或sumo标签。
本发明实施例还提供了一种编码上述抗原蛋白的多核苷酸。
本发明实施例还提供了一种连接有编码上述抗原蛋白的多核苷酸的载体。
本发明实施例还提供了一种含有上述载体的表达系统细胞。
本发明实施例还提供了一种抗上述抗原蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明实施例还提供了一种杂交瘤细胞株，其能生产抗上述抗原蛋白的单克隆抗体，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏编号为CGMCCNO.15784。该杂交瘤细胞株于2018年5月18日提交至位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.15784，分类命名为杂交瘤细胞株。
本发明实施例还提供了抗上述抗原蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体在制备检测鲤疱疹病毒2型的试剂盒中的应用。
本发明实施例还提供了一种检测鲤疱疹病毒2型的试剂盒，其包括：抗上述抗原蛋白的单克隆抗体和/或多克隆抗体。
在一种可能的实现方式中，抗上述抗原蛋白的单克隆抗体是由在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏编号为CGMCC NO.15784的杂交瘤细胞株生产的。
在一种可能的实现方式中，制备检测鲤疱疹病毒2型的试剂盒为双抗体夹心Elisa法试剂盒。
在一种可能的实现方式中，所述双抗体夹心Elisa法试剂盒中：包被抗体为抗上述抗原蛋白的单克隆抗体；
和/或，标记抗体为抗上述抗原蛋白的多克隆抗体。
有益效果
1、本发明实施例中去除原始ORF153蛋白中疏水性区域的抗原蛋白，其抗原性分析结果显示优于原始ORF153蛋白，利用该抗原蛋白获得的单克隆抗体或多克隆抗体均可用于鲤疱疹病毒2型的检测。
2、本发明实施例中通过筛选获得的杂交瘤细胞株CGMCC NO.15784，其可产生针对ORF153蛋白的、大于512,000的高效价。
3、本发明实施例中检测鲤疱疹病毒2型的双抗体夹心Elisa法试剂盒中，经过筛选配对，单抗和单抗、单抗和多抗、多抗和多抗、多抗与单抗，最终选择多抗作为包被抗体和单抗作为生物素标记抗体进行配对效果最好。
4、本发明实施例中检测鲤疱疹病毒2型的双抗体夹心Elisa法试剂盒灵敏度高、特异性强、重复性好。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
图1A是本发明实施例1中ORF153蛋白的原始序列示意图，其中未划线部分的序列是去除的疏水性区域，划线部分的序列是最终予以保留的序列；
图1B是本发明实施例1中最终表达的ORF153重组抗原蛋白的氨基酸序列(未给出sumo标签)，图1A中最终予以保留的序列部分之间分别用6个组氨酸连接表达。
图2是插入质粒酶切位点后编码本发明实施例1中最终表达的ORF153重组抗原蛋白的氨基酸序列(不带sumo标签)的核苷酸序列，用下划线表示，阴影部分表示酶切位点。
图3是本发明实施例1中镍柱亲和层析纯化获得最终表达的ORF153重组抗原蛋白(带有sumo标签)的SDS-PAGE图。M道为marker道，1道表示未纯化的表达上清液，2道表示纯化时冲洗液，3道表示纯化洗脱液。
图4是本发明实施例4中获得的ORF蛋白标准曲线，横坐标是A450值，纵坐标是蛋白浓度(单位为ng/ml)。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
实施例1、抗原蛋白的序列分析及抗原蛋白的表达
通过对原始ORF153蛋白(氨基酸序列如图1A所示)的亲疏水性、抗原性以及信号肽分析，去除原始ORF153蛋白中的跨膜疏水性区域，即：第1-44位氨基酸、57-75位氨基酸、96-123位氨基酸、146-175位氨基酸，剩余每段氨基酸序列用6个组氨酸连接表达(氨基酸序列如图1B和SEQ ID NO.5所示)，组氨酸一方面起连接氨基酸序列的作用，另一方面加入组氨酸也是为了纯化蛋白时使用镍柱，最终表达的带sumo标签的抗原蛋白ORF153的抗原性分析结果显示优于原始ORF153蛋白，本申请下文中将最终表达的带sumo标签的重组抗原蛋白称之为ORF153。具体ORF153表达过程如下：
基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成基因ORF153，双酶切连接至pSUMO-Mut载体的Stu I和Xho I之间，5’端添加t，防止移码；将获得的重组质粒pSUMO-Mut-ORF153转入TOP10克隆菌株，挑取阳性克隆子测序，测序结果拼接如图2所示，单划线区域为ORF153基因区域，测序验证正确。
将测序验证正确的表达质粒pSUMO-mut-ORF153载体转化大肠杆菌ArcticExpress(DE3)感受态细胞：1)将质粒1μl加入100μl感受态细菌中，置冰上20min；2)42℃热激90sec，迅速置冰中5min；加入600μl LB培养液；3)11℃，220rpm振摇1h，离心后全部涂布于含50μg/ml Kan的LB平板，37℃倒置培养过夜。
IPTG诱导pSUMO-mut-ORF153载体融合蛋白的表达：1)挑取转化平板上的单克隆接种于含50μg/ml Kan的3ml LB培养液的试管中，11℃220rpm振摇过夜；2)次日按1：100接种于50μg/ml Kan的30ml LB培养液中，37℃220rpm振摇至菌体OD600为0.6-0.8(约2h)；3)取出1ml培养物，10000g室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀；4)向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mM，11℃220rpm振摇过夜，诱导融合蛋白表达；5)取出1ml培养物，10000g室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。剩余培养物4000g，离心10min，弃上清，用PBS重悬菌体沉淀；重悬液进行超声波破碎后，分别取上清液与沉淀液加入上样缓冲液重悬；6)进行12％SDS-PAGE检测分析，考马斯亮蓝染色显带结果显示带sumo标签的ORF153蛋白(理论分子量大小为35KD)主要在细胞上清中表达。
取上清，镍柱亲和层析纯化获得带sumo标签的ORF153蛋白，使用缓冲液(20mMTris-HCl，0.15M NaCl，pH8.0)进行透析。进行12％SDS-PAGE分析，结果如图3所示，确认获得带sumo标签的重组ORF153蛋白。
实施例2、单克隆抗体制备
利用ORF153蛋白，免疫Balb/c小鼠，ELSIA检测鼠血清效价，以及病料提取上清检测鼠血清效价，效价正常，继续安排细胞融合及亚克隆实验，制备腹水，纯化抗体，进行抗体配对实验。
1、动物免疫
选取5只6-8周龄雌性BALB/c小鼠(18±2g)，将ORF153蛋白与弗氏佐剂混合免疫，皮下注射100ug，2-3周加强免疫一次。四免后采血检测，通过间接ELISA方法确定鼠抗血清针对ORF153蛋白的效价，效价正常，然后用病料提取上清检测鼠抗血清效价，效价正常。经结果所示，经免疫后小鼠均产生高效价抗体，鼠抗血清无论针对ORF153还是针对病料提取上清液，其滴度均可达1:121,500以上。
2、细胞融合
混合骨髓瘤细胞和免疫后的小鼠脾细胞，使骨髓瘤细胞同脾细胞数量比在1：20为宜。把细胞放到50ml离心管中，用DMEM基础培养基稀释，然后离心1000rpm 5min。弃上清。摇动离心管使细胞均匀。缓慢加入0.8ml 50％PEG，反应90秒，然后加入20-30ml DMEM培养基终止PEG，把融合的细胞放到37℃水浴锅中反应10分钟。1000rpm 5min，弃上清然后加入HATDMEM培养基.把融合的细胞铺到96孔板中，每孔100μl。然后将细胞培养板放到CO2培养箱中培养。融合后4天查看，杂交瘤细胞克隆率在50％以上，有少量的细胞碎片，细胞生长状态良好。融合10天后开始进行筛选检测。
3、融合筛选
在检测的前一天，用PBS包被5ug/ml抗原于ELISA板，过夜。次日吸取细胞上清100ul/孔进行ELISA检测根据ELISA结果，判断阳性孔(样品孔OD值/阴性孔OD值≥2.1则判定为阳性孔。用单道移液器挑检整板检测出的阳性孔，进行第二次确认检测，进一步确认阳性孔。选取阳性孔细胞进行亚克隆。
4、亚克隆
吹打阳性孔中细胞，计数，在离心管中加入N/4ml DMEM培养基(N为细胞计数结果)，取100ul细胞悬液到离心管中，吹匀后留1ml，补加DMEM到4ml，吹匀，留100ul(约2滴)在管底。在离心管中加DMEM至5ml，混匀后滴加至96孔板的前三行，每孔一滴管底留1.8-2ml左右，补加DMEM至5ml，吹匀后滴加至96孔板的D、E、F三行，每孔一滴，管底留1.5-1.8ml左右，补加DMEM至2.8-3ml左右，吹匀后滴加至96孔板的G、H行，每孔一滴，7-10天后在显微镜下观察，检测有克隆生长的孔，标记出单克隆的孔，尽可能挑取阳性的单克隆细胞进行再次亚克隆，检测至100％阳性后，挑出单克隆孔扩大培养定株，经Elisa筛选后选取5株杂交瘤细胞株进行腹水制备。
5、腹水制备
对上述5株杂交瘤细胞株进行腹水制备及纯化实验，获得纯化抗体。针对ORF153蛋白，其中7A5纯化抗体的效价最高，大于512,000。
杂交瘤细胞株7A5保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年5月18日，保藏中心登记入册编号为CGMCC NO.15784。该单克隆抗体经亚型鉴定为IgG2a。
实施例3、多克隆抗体制备
利用ORF153蛋白，免疫2只新西兰兔子，ELSIA检测兔血清效价，以及病料提取上清检测兔血清效价；通过抗原亲和纯化，进行兔多克隆抗体制备。
1、动物免疫
以ORF153蛋白进行BCA蛋白浓度测定后，免疫2只新西兰白兔(2-2.5kg)，皮下免疫400ug/次，2-3周免疫一次，免疫4次。通过间接ELISA方法确定兔抗血清针对ORF153蛋白的效价，效价正常，然后用病料提取上清检测兔抗血清效价，效价正常。经结果显示，经免疫后兔子均产生高效价抗体，兔抗血清无论针对ORF153还是针对病料提取上清液，其滴度均可达1:121,500以上。
2、抗体纯化
将ORF153蛋白与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，将所得抗血清与PBS等量混合后缓慢上样，待抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体，立即在PBS中进行4℃透析过夜，隔日获得多克隆抗体，效价可达1:256,000。
实施例4、双抗体夹心ELISA法中包被抗体和标记抗体的选择及灵敏度
采用双抗体夹心ELISA法，用抗ORF153蛋白抗体包被于酶标板上，实验时样品或标准品中的ORF153蛋白会与包被抗体结合，生物素标记抗体也可特异性的与ORF153蛋白结合，形成包被抗体-ORF153蛋白-生物素标记抗体免疫复合物，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(SA-HRP)(即HRP酶结合物)与生物素有高度亲和力，从而形成包被抗体-ORF153蛋白-生物素标记抗体-SA-HRP免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，ORF153蛋白浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中ORF153蛋白的浓度。
前述实施例2和实施例3中已分别获得了抗ORF153单克隆抗体和抗ORF153多克隆抗体，发明人对双抗体夹心法中的包被抗体和标记抗体分别采用上述抗体针对ORF153蛋白和阳性血清样品进行配对实验，以确认包被抗体和标记抗体的选择，即可以有表1中所列以下4种搭配：
表1
搭配序号 包被抗体 标记抗体
1 抗ORF153单克隆抗体 抗ORF153多克隆抗体
2 抗ORF153单克隆抗体 抗ORF153单克隆抗体
3 抗ORF153多克隆抗体 抗ORF153单克隆抗体
4 抗ORF153多克隆抗体 抗ORF153多克隆抗体
双抗体夹心Elisa法检测抗体配对情况，双抗体夹心Elisa法的具体步骤包括以下步骤：
(1)根据实验需要设计好包被板，并在板条上做上标记。
(2)包被
用磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)作为包被液，将表1中的包被抗体稀释成2.5ug/ml，混匀后加入板条中，每孔100ul，4℃冰箱过夜。
(3)封闭
包被好后，弃去包被液，洗板3次，每孔加入200ul封闭液，37℃恒温箱1h。取出酶标板，弃去内液，洗板1次。
(4)蛋白反应或阳性血清反应
蛋白反应：带sumo标签的重组ORF153蛋白，100ng/ml起始，2倍稀释，每孔100ul，37℃恒温箱60min。
阳性血清反应：阳性血清原液。
阴性血清反应：阴性血清原液。
(5)一抗反应
取出酶标板，弃去内液，洗板3次，向每孔中加入100ul稀释好的生物素标记抗体，37℃恒温箱60min。
(6)二抗反应
取出酶标板，弃去内液，洗板3次，向每孔中加入100ul稀释好的HRP酶结合物，HRP酶结合物(SA-HRP)，37℃恒温箱60min。
(7)显色
取出酶标板，弃去内液，洗板4次，每孔先加入100ul TMB显色液，根据颜色的深浅决定显色时间，一般37℃，15min。
(8)终止反应
每孔加入100ul 1M HCL溶液，终止反应。即刻在酶标仪上450nm读数。
经过筛选配对，单抗和单抗、单抗和多抗、多抗和多抗、多抗与单抗，因为灵敏度好、标准曲线线性关系最好，最终选择多抗作为包被抗体和单抗作为生物素标记抗体进行配对效果最好。
表2多抗作为包被抗体、单抗作为标记抗体针对ORF153蛋白的配对实验
通过夹心ELISA检测，该情况的夹心灵敏度在6.25ng/ml左右。
根据上表获得的ORF153蛋白标准曲线图如图4所示。
实施例5、双抗体夹心ELISA法的重复性及稳定性检测
按照实施例4中双抗体夹心Elisa法的步骤，针对特定浓度ORF153抗原蛋白检测该方法的重复性和稳定性。所得结果如下
1、重复性批内差检测结果如表4所示
表4
2、重复性批间差检测结果如表5所示
表5
重复性检测结果：批间和批内的变异系数均<10％，重复性检测结果符合要求。
3、稳定性检测结果如表6所示
表6
稳定性检测结果：将双抗体夹心Elisa法所用试剂和材料放入37℃环境下3天，7天，10天，14天，检测出的各个浓度ORF抗原蛋白的OD值有所降低，但是在合理范围内，稳定性检测结果符合要求。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国检验检疫科学研究院
<120> 一种抗原蛋白、其单克隆抗体或多克隆抗体及应用
<130> 1089-200246F
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 1
Asp Ile Asp Asp Gln Gln Ala Thr Gly Glu Cys Trp
1 5 10
<210> 2
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 2
Asn Tyr Gln Phe Gly Arg Thr Arg Thr Ile Leu Gly Thr Arg Ser Arg
1 5 10 15
Met Arg Phe
<210> 3
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 3
Met Asn Asp His Ala Asn Pro Lys Pro Thr Leu Asp Gln Leu Glu Gln
1 5 10 15
Gln Glu Lys Asp Val Pro
20
<210> 4
<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 4
Glu Met Glu Asp Arg Ala Val Asp Ala Glu Glu Asp Ala Leu Ile Gly
1 5 10 15
Ser Thr Ala Ser Ala Phe Thr Pro Asp Ser Thr Val Asp Leu Thr Ala
20 25 30
Ile Pro Pro Pro Leu Pro Pro Pro Tyr Asn Gly Asp Gly Val Pro Pro
35 40 45
Pro Ser Tyr Thr Asn Ile Ile Asn Ile Tyr Thr Gly Asn Asn Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Glu Ala Pro Pro Pro Ser Tyr Glu Val Ala Val Gly Glu Thr
65 70 75 80
Ser Gln Pro Glu Glu Pro Gln Gln Asp Ser Ser Glu Pro Gln Pro Asp
85 90 95
Ser Ser Glu Pro Gln Pro Glu Thr Arg Ile
100 105
<210> 5
<211> 177
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 5
Asp Ile Asp Asp Gln Gln Ala Thr Gly Glu Cys Trp His His His His
1 5 10 15
His His Asn Tyr Gln Phe Gly Arg Thr Arg Thr Ile Leu Gly Thr Arg
20 25 30
Ser Arg Met Arg Phe His His His His His His Met Asn Asp His Ala
35 40 45
Asn Pro Lys Pro Thr Leu Asp Gln Leu Glu Gln Gln Glu Lys Asp Val
50 55 60
Pro His His His His His His Glu Met Glu Asp Arg Ala Val Asp Ala
65 70 75 80
Glu Glu Asp Ala Leu Ile Gly Ser Thr Ala Ser Ala Phe Thr Pro Asp
85 90 95
Ser Thr Val Asp Leu Thr Ala Ile Pro Pro Pro Leu Pro Pro Pro Tyr
100 105 110
Asn Gly Asp Gly Val Pro Pro Pro Ser Tyr Thr Asn Ile Ile Asn Ile
115 120 125
Tyr Thr Gly Asn Asn Gly Ser Gly Ser Glu Ala Pro Pro Pro Ser Tyr
130 135 140
Glu Val Ala Val Gly Glu Thr Ser Gln Pro Glu Glu Pro Gln Gln Asp
145 150 155 160
Ser Ser Glu Pro Gln Pro Asp Ser Ser Glu Pro Gln Pro Glu Thr Arg
165 170 175
Ile

Claims (12)

1.一种抗原蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，其结构为由N端到C端通过连接序列依次相连的鲤疱疹病毒2型ORF153蛋白的第45-56位氨基酸、第76-95位氨基酸、124-145位氨基酸、176-281位氨基酸，所述第45-56位氨基酸、第76-95位氨基酸、124-145位氨基酸、176-281位氨基酸分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4所示，所述连接序列为6个组氨酸。
2.根据权利要求1所述的抗原蛋白，其特征在于：所述抗原蛋白还包括纯化标签和/或增强可溶性标签。
3.根据权利要求1所述的抗原蛋白，其特征在于：所述抗原蛋白还包括His-tag和/或sumo标签。
4.一种编码权利要求1-3之一所述的抗原蛋白的多核苷酸。
5.一种连接有权利要求4所述的多核苷酸的载体。
6.一种含有权利要求5所述载体的表达系统细胞。
7.一种抗权利要求1-3之一所述的抗原蛋白的多克隆抗体。
8.一种杂交瘤细胞株，其能生产抗权利要求1-3之一所述的抗原蛋白的单克隆抗体，其特征在于：在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏编号为CGMCCNO.15784。
9.一种抗权利要求1-3之一所述的抗原蛋白多克隆抗体或权利要求8中所述的杂交瘤细胞株生产的抗权利要求1-3之一所述的抗原蛋白的单克隆抗体在制备检测鲤疱疹病毒2型的试剂盒中的应用。
10.一种检测鲤疱疹病毒2型的试剂盒，其特征在于：包括抗权利要求1-3之一所述的抗原蛋白多克隆抗体和/或权利要求8中所述的杂交瘤细胞株生产的抗权利要求1-3之一所述的抗原蛋白的单克隆抗体。
11.根据权利要求9所述的应用或权利要求10所述的试剂盒，其特征在于：制备检测鲤疱疹病毒2型的试剂盒为双抗体夹心Elisa法试剂盒。
12.根据权利要求9所述的应用或权利要求10所述的试剂盒，其特征在于：所述双抗体夹心Elisa法试剂盒中：
包被抗体为抗上述抗原蛋白的单克隆抗体；
和/或，标记抗体为抗上述抗原蛋白的多克隆抗体。
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