KR20100001169A - 하이브리도마 세포주, 이에 의해 생산된 단클론항체,구제역 진단 시약, 진단 키트 및 구제역 바이러스 중화항체검출방법 - Google Patents
하이브리도마 세포주, 이에 의해 생산된 단클론항체,구제역 진단 시약, 진단 키트 및 구제역 바이러스 중화항체검출방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 구제역 바이러스의 O형, A형 및 Asia 1형에 공통적인 면역반응성을 나타내는 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주, 구제역 바이러스 O형 VP1 사이트 A에 대한 특이적인 면역반응성과 바이러스 중화능을 나타내는 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주, 구제역 바이러스 A형 VP1 사이트 A에 대한 특이적인 면역반응성과 바이러스 중화능을 나타내는 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주, 상기 각 하이브리도마 세포주에 의해 생산되는 단클론항체, 상기 단클론항체를 포함하는 구제역 진단 시약, 상기 구제역 진단 시약을 포함하는 구제역 진단 키트 및 구제역 바이러스 중화항체 검출방법 또는 구제역 진단방법에 관한 것이다.
본 발명에 의하면 구제역 바이러스 혈청형에 대한 각각의 항체를 이용하여 구제역 바이러스 진단용 항원을 포획할 필요가 없고, 유전자 재조합 구제역 바이러스 구조단백질을 진단용 항원으로 사용함으로써 종래 차폐시설을 갖춘 실험실에서만 배양이 가능한 구제역 바이러스를 사용하던 방법에 비해 매우 편리하며, 구제역 바이러스 혈청형에 특이적인 단클론항체를 사용하여 각 축종별 이차항체를 따로 사용하는 번거로움 없이 중화항체 검출이 가능하다. 그리고 본 발명의 진단방법은 종래 기술에 비해 검출 민감도와 특이도가 우수하다.
구제역 바이러스, 하이브리도마, 단클론항체, 중화항체, 진단 시약, 진단 키트, 진단방법, 유전자 재조합 구조단백질
Description
본 발명은 구제역 바이러스의 O형, A형 및 Asia 1형에 공통적인 면역반응성을 나타내는 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주, 구제역 바이러스 O형 VP1 사이트 A에 대한 특이적인 면역반응성과 바이러스 중화능을 나타내는 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주, 구제역 바이러스 A형 VP1 사이트 A에 대한 특이적인 면역반응성과 바이러스 중화능을 나타내는 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주, 상기 각 하이브리도마 세포주에 의해 생산되는 단클론항체, 상기 단클론항체를 포함하는 구제역 진단 시약, 상기 구제역 진단 시약을 포함하는 구제역 진단 키트 및 상기 단클론항체를 이용하는 것을 특징으로 하는 구제역 바이러스 중화항체 검출방법 또는 구제역 진단방법에 관한 것이다.
구제역(Foot and mouth disease, FMD)은 소, 돼지, 양, 염소 등 발굽이 둘로 갈라진 유제류에 전염성이 높은 질병으로 국제수역사무국(OIE)에서 정하는 목록 A(List A)질병이며 우리나라에서도 제1종 법정 전염병으로 정하고 있다. 국제수역사무국에서는 청정국 지위를 평가하고 있고, 구제역 발생시 농축산물을 포함한 각종 무역거래 등 국제교역에 제한을 초래한다. 국내에서는 66년 만에 2000년 3월에 발병하여 2,000억 원 이상의 경제적 피해를 기록하였다. 현재 우리나라는 구제역 청정국 지위를 유지하고 있으나 전 세계적 구제역 발생이 증가하고 있고, 특히 인접국인 몽골, 중국에서는 2005년도에 구제역이 발병한 것으로 보고되어 지리적 여건 및 인적 물적 교류의 확대 등으로 인해 구제역 유입 위험이 높아지고 있어 정부에서는 예방을 위해 검역 및 방역에 총력을 기울이고 있다.
구제역 바이러스(FMDV)는 바이러스 혈청형이 다양하여 O형, A형, C형, Asia1형, SAT1형, SAT2형 및 SAT3(Southern African Territories)형의 7개의 혈청형으로 구분되며, 이 주요 혈청형은 80여 가지의 아형으로 나뉜다.
구제역 바이러스의 외형은 20면체의 대칭형의 구조를 가지는 것으로 밝혀져 있다. 구제역 바이러스는 피코르나비르내 아흐토바이러스(Picornavirnae , Aphtovirus)에 속하며 게놈은 1개의 단백질을 발현하고 바이러스 단백질분해효소에 의해서 바이러스 단백질은 절단되어 성숙 단백질로 되는 특징이 있다. 바이러스 외피는 VP1, VP2, VP3, VP4 단백질로 구성되며, 바이러스 복제 및 단백질 성숙에 관여하는 비구조단백질은 L, 3A, 3B, 3C, 3D, 2A, 2B, 2C 등이 있다. 외피 단백 질(Capsid protein) 또는 구조단백질(Structural Protein, SP)은 중화항체를 유도하고, 비구조단백질(Non structural protein, NSP)은 바이러스 복제 및 감염에 가장 중요한 역할을 하지만 중화항체를 유도하지는 않는다고 알려져 있다.
구제역 바이러스에 대한 중화항체를 유발하는 구조단백질 중 가장 중요한 중화 항원 결정부위는 P1단백질에서 유래한 VP1의 "G-H 루프(loop)"라 명명된 141-160 아미노서열로, Strohmaier 등에 의해 1982년에 처음으로 기술되었으며 사이트 A(Site A)로 명명되었다. Kitson등(1990)은 사이트 A가 다른 중화 항원 결정기인 VP2, VP3의 영역보다 아미노산 염기의 동질성이 높은 것으로 보고하였고, Pfaff E 등(1982)은 재조합 VP1 단백질만으로도 기니픽에서 바이러스 감염을 방어할 수 있는 충분한 중화항체를 유발할 수 있는 것으로 보고하였다. 또한, FMDV O1/Kaufbeuren주에 중화능력을 소유하고 있는 것으로 알려진 단클론항체의 특성을 분석한 결과 VP1의 141-160부위의 아미노산 잔기와 반응하는 것으로 확인되었다.
한편, 구제역의 구조단백질에 대한 혈청학적 검사법 중 표준검사법으로는 바이러스 중화시험법(VNT)을 이용하고 있지만, 이를 위해서는 바이러스 배양을 위한 차폐시설이 필요하고 최소 72시간의 검사시간이 소요되며, 특정 혈청에서는 낮은 수준의 비특이 양성반응이 나타나는 단점이 있다. 1980년 중반에 Hambline 등에 의해 개발된 Liquid phase blocking(LPB)-ELISA는 VNT와 높은 상관성을 가지므로 현재 많이 사용되고 있지만, 불활화한 바이러스를 사용해야 하고 검사방법이 매우 복잡하여 검사간 재현성이 낮고 자동화된 대량검사에 적합하지 않은 단점이 있다. 또한 이 검사기술은 Hass 등(1994)에 의하여 비백신 또는 음성지역 혈청에서 약 4%의 의양성반응이 확인되었고, 특정 동물의 혈청에 대해서는 18%의 비특이 반응이 나타나는 문제점이 있다.
이에 K.J. Sorensene등(1992)은 구제역 바이러스 146S를 정제한 항원과 가토혈청의 경쟁반응을 통하여 아프리카 SAT1, 2, 3에 대한 중화항체 검출법을 개발하여 LPB ELISA 결과를 비교하였고, D.K.J. Mackay 등(2001)은 구제역 바이러스 146S 항원과 기니픽 혈청을 이용한 Solid Phase Competition ELISA을 개발하여 백신 항체수준을 평가하였고, G.Chenard 등(2003)에 의하면 불활화 바이러스와 단클론항체를 이용한 대량검사용 중화항체 검사용 ELISA 키트를 개발한 것으로 보고하였다. 하지만, 불활화 바이러스 항원을 사용하고 있어 바이러스 항원을 생산하기 위해서는 특별한 시설에서만 실행해야 하는 어려움이 있었다.
국내에서는 구제역 바이러스 P1과 3C를 유전자재조합 기술을 이용하여 동시에 발현하도록 한 항원을 구제역 바이러스 백신용 항원으로 제공하는 발명에 대해 특허등록(제10-0737446호)되어 있고, 상기 항원을 이용하여 중화항체를 검사할 수 있음이 발표되었다(Vaccine, 25(20), 4112-4121, 2007). 하지만, 이들 기술에는 구제역 바이러스 중화항체를 측정할 수 있는 과학적 근거만 제시되었을 뿐, 사용된 항체들의 항원결정부위에 관한 사항, 유전자재조합 항원을 포획하여 재현성을 유지할 수 있는 조건 등은 불충분하게 제시되어 있을 뿐더러, 특이도와 민감도도 낮은 문제점이 있었다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하고자 착안된 것으로, 구제역 바이러스를 진단함에 있어서, 진단용 항원을 포획하기 위해 구제역 바이러스 O형, A형 및 Asia 1형에 공통적인 면역반응성을 나타내는 단클론항체를 생산하기 위한 하이브리도마 세포주, 구제역 바이러스 O형 VP1 사이트 A에 대한 특이적인 면역반응성과 바이러스 중화능을 나타내는 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주, 구제역 바이러스 A형 VP1 사이트 A에 대한 특이적인 면역반응성과 바이러스 중화능을 나타내는 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주, 상기 각 하이브리도마 세포주에 의해 생산되는 단클론항체를 제공함을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체를 포함하는 구제역 진단 시약, 상기 구제역 진단 시약을 포함하는 구제역 진단 키트 및 상기 단클론항체를 이용하는 것을 특징으로 하는 구제역 바이러스 중화항체 검출방법 또는 구제역 진단방법을 제공함을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 구제역 바이러스 O형, A형 및 Asia 1형에 공통적인 면역반응성을 나타내는 단클론항체를 생산함을 특징으로 하는 하이브리도마 세포주(KCTC 11337BP) 및 상기 하이브리도마 세포주에 의해 생산되는 단클론항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 구제역 바이러스 O형 VP1 사이트 A에 대한 특이적인 면역반응성과 바이러스 중화능을 나타내는 단클론항체를 생산함을 특징으로 하는 하이브리도마 세포주(KCTC 11319BP) 및 상기 하이브리도마 세포주에 의해 생산되는 단클론항체를 제공한다.
그리고, 본 발명은 구제역 바이러스 A형 VP1 사이트 A에 대한 특이적인 면역반응성과 바이러스 중화능을 나타내는 단클론항체를 생산함을 특징으로 하는 하이브리도마 세포주(KCTC 11318BP) 및 상기 하이브리도마 세포주에 의해 생산되는 단클론항체를 제공한다.
나아가, 본 발명은 진단용 항원, 상기 진단용 항원 포획을 위한 단클론항체, 검출표지, 상기 검출표지가 결합되는 단클론항체 및 상기 검출표지의 활성 측정용 시약을 함유하는 구제역 진단 시약에 있어서, 상기 진단용 항원 포획을 위한 단클론항체는 구제역 바이러스 O형, A형 및 Asia 1형에 공통적인 면역반응성을 나타내는 단클론항체인 것을 특징으로 하는 구제역 진단 시약을 제공한다.
본 발명은 상기 구제역 바이러스 O형, A형 및 Asia 1형에 공통적인 면역반응성을 나타내는 단클론항체가 하이브리도마 세포주 KCTC 11337BP에 의해 생산되는 단클론항체인 것을 특징으로 하는 구제역 진단 시약을 제공한다.
본 발명은 상기 검출표지가 결합되는 단클론항체가 구제역 바이러스 O형 VP1 사이트 A에 대한 특이적인 면역반응성과 바이러스 중화능을 나타내는 단클론항체 또는 구제역 바이러스 A형 VP1 사이트 A에 대한 특이적인 면역반응성과 바이러스 중화능을 나타내는 단클론항체인 것을 특징으로 하는 구제역 진단 시약을 제공한 다.
본 발명은 상기 구제역 바이러스 O형 VP1 사이트 A에 대한 특이적인 면역반응성과 바이러스 중화능을 나타내는 단클론항체가 서열목록 1 내지 3의 아미노산 서열로 표시되는 에피토프 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 반응하는 단클론항체인 것을 특징으로 하는 구제역 진단 시약을 제공한다.
본 발명은 상기 구제역 바이러스 O형 VP1 사이트 A에 대한 특이적인 면역반응성과 바이러스 중화능을 나타내는 단클론항체가 하이브리도마 세포주 KCTC 11319BP에 의해 생산되는 단클론항체인 것을 특징으로 하는 구제역 진단 시약을 제공한다.
본 발명은 상기 구제역 바이러스 A형 VP1 사이트 A에 대한 특이적인 면역반응성과 바이러스 중화능을 나타내는 단클론항체가 서열목록 7 내지 9의 아미노산 서열로 표시되는 에피토프 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 반응하는 단클론항체인 것을 특징으로 하는 구제역 진단 시약을 제공한다.
본 발명은 상기 구제역 바이러스 A형 VP1 사이트 A에 대한 특이적인 면역반응성과 바이러스 중화능을 나타내는 단클론항체가 하이브리도마 세포주 KCTC 11318BP에 의해 생산되는 단클론항체인 것을 특징으로 하는 구제역 진단 시약을 제공한다.
본 발명은 상기 진단용 항원이 구제역바이러스를 구성하는 구조단백질 VP1, VP2, VP3 및 VP4를 코딩하는 유전자와 비구조단백질인 3C 유전자를 적어도 포함하는 재조합베큘로바이러스를 숙주세포에 형질전환시켜 제조된 재조합 구제역 바이러 스 구조단백질인 것을 특징으로 하는 구제역 진단 시약을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 구제역 진단 시약을 포함하는 구제역 진단 키트를 제공한다.
그리고, 본 발명은 고체상 지지체에 항원 포획을 위한 단클론항체를 고정시키는 단계; 상기 고체상 지지체에 부착되지 않은 항체들을 세척하여 제거하는 단계; 상기 고체상 지지체에 구제역 바이러스 진단용 항원을 반응시켜 고정시키는 단계; 상기 고체상 지지체에 부착되지 않은 항원들을 세척하여 제거하는 단계; 및 검출표지가 결합된 단클론항체를 고체상 지지체에 고정된 상기 구제역 바이러스 진단용 항원과 반응시키는 단계를 포함하고, 상기 항원 포획을 위한 단클론항체는 구제역 바이러스 O형, A형 및 Asia 1형에 공통적인 면역반응성을 나타내는 단클론항체인 것을 특징으로 하는 구제역 바이러스 중화항체 검출방법을 제공한다.
본 발명은 상기 검출표지가 결합된 단클론항체에 사용되는 단클론항체가 구제역 바이러스 O형 VP1 사이트 A에 대한 특이적인 면역반응성과 바이러스 중화능을 나타내는 단클론항체 또는 구제역 바이러스 A형 VP1 사이트 A에 대한 특이적인 면역반응성과 바이러스 중화능을 나타내는 단클론항체인 것을 특징으로 하는 구제역 바이러스 중화항체 검출방법을 제공한다.
본 발명은 상기 구제역 바이러스 진단용 항원이 구조단백질 VP1, VP2, VP3 및 VP4를 코딩하는 유전자와 비구조단백질인 3C 유전자를 적어도 포함하는 재조합베큘로바이러스를 숙주세포에 형질전환시켜 제조된 재조합 구제역 바이러스 구조단백질인 것을 특징으로 하는 구제역 바이러스 중화항체 검출방법을 제공한다.
본 발명은 상기 재조합 구제역 바이러스 구조단백질이 바이러스 역가가 측정된 구제역 바이러스를 대조군으로 하고, 상기 재조합 구제역 바이러스 구조단백질을 실험군으로 하여, 상기 재조합 구제역 바이러스 구조단백질의 항원활성도를 산출하여 정량적으로 첨가된 것을 특징으로 하는 구제역 바이러스 중화항체 검출방법을 제공한다.
본 발명은 상기 재조합 구제역 바이러스 구조단백질이, 상기 고체상 지지체에 상기 항원 포획을 위한 단클론항체를 고정시킨 다음, 대조군으로 바이러스 역가(T)가 측정된 구제역 바이러스 항원과 반응시켜 항원-항체 복합체를 형성하고, 상기 항원-항체 복합체에 상기 검출표지가 결합된 단클론항체를 반응시켜 상기 대조군의 검출결과값(P)을 측정하고, 실험군으로 상기 바이러스 역가(T)가 측정된 구제역 바이러스 대신 상기 재조합 구제역 바이러스 구조단백질을 일정 희석배수로 희석하여, 상기 고체상 지지체에 상기 항원 포획을 위한 단클론항체를 고정시킨 다음, 상기 희석된 재조합 구제역 바이러스 구조단백질과 반응시켜 항원-항체 복합체를 형성하고, 상기 항원-항체 복합체에 상기 검출표지가 결합된 단클론항체를 반응시켜 상기 실험군의 검출결과값(S)을 측정한 다음, 계산식으로부터 항원활성도(Tx)를 산출하여, 상기 재조합 구제역 바이러스 구조단백질의 희석배수에 따른 상기 항원활성도의 평균값으로부터 상기 재조합 구제역 바이러스 구조단백질의 유효 항원량을 정하여 첨가된 것을 특징으로 하는 구제역 바이러스 중화항체 검출방법을 제공한다.
본 발명에 의하면 불활화 구제역 바이러스 혈청형에 대한 각각의 항체를 이용하여 항원을 포획할 필요가 없어 종래 중화항체 검사의 번거로움을 해소할 수 있다.
또한, 구제역 바이러스 혈청형에 특이적인 단클론항체를 사용하여 각 축종별 이차항체를 따로 사용하는 번거로움 없이 중화항체를 검출할 수 있다.
그리고 본 발명에 의하면, 구제역 바이러스 백신이 접종된 동물과 야외에서 감염된 동물에서 매우 효과적으로 중화항체를 측정할 수 있고, 종에 관계없이 신속하고 간편하게 중화항체를 검사할 수 있다.
본 발명은 유전자 재조합 구제역 바이러스 구조단백질을 진단 항원으로 사용함으로써, 종래 차폐시설을 갖춘 실험실에서만 배양이 가능한 구제역 바이러스를 진단 항원으로 사용하던 방법에 비해 매우 편리하다.
본 발명은 차단효소면역검사법(Blocking ELISA), 경쟁효소면역검사법(Competitive ELISA) 등 다양한 기술에 적용하여 구제역 바이러스에 대한 중화항체를 검사할 수 있는 기술로 종래 기술에 비해 검출 민감도와 특이도가 우수하다.
따라서, 본 발명은 구제역이 발생하거나 백신을 실시하고 있는 지역 및 국가에서 가축의 예찰 검사 등 광범위한 감염동물의 조사나 백신동물의 사후관리에 효과적이며 또한, 구제역 비발생지역이나 발생위험지역에서의 상시 예찰에서도 구제역 예방 및 확산 억제에 기여하고 산업적으로 동물용 진단의약품으로 매우 유용한 기술을 제공한다.
또한, 본 발명의 진단시약 및 진단 키트는 감염성 구제역 바이러스 항원을 이용하고 있는 종래의 구제역 바이러스 중화항체 검사법보다 안전하므로, 국내 및 구제역이 발생하고 있는 유럽, 중남미, 아시아, 러시아 등 세계시장에 수출을 추진할 수 있어 우리나라의 동물 질병 진단시약 및 진단 키트에 대한 기술력을 선양하고 외화를 획득하는데 일조할 수 있는 효과가 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 구제역 바이러스 O형, A형 및 Asia 1형에 공통적인 면역반응성을 나타내는 단클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포주(KCTC 11337BP), 구제역 바이러스 O형 VP1 사이트 A에 대한 특이적인 면역반응성과 바이러스 중화능을 나타내는 단클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포주(KCTC 11319BP), 구제역 바이러스 A형 VP1 사이트 A에 대한 특이적인 면역반응성과 바이러스 중화능을 가지는 단클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포주(KCTC 11318BP)를 제공한다.
한편, 본 발명은 진단용 항원, 상기 진단용 항원 포획을 위한 단클론항체, 검출표지, 상기 검출표지가 결합되는 단클론항체 및 상기 검출표지의 활성 측정용 시약을 함유하는 구제역 진단 시약 및 상기 구제역 진단 시약을 포함하는 구제역 진단 키트를 제공한다.
그리고, 본 발명은 고체상 지지체에 항원 포획을 위한 단클론항체를 고정시키는 단계; 상기 고체상 지지체에 부착되지 않은 항체들을 세척하여 제거하는 단 계; 상기 고체상 지지체에 구제역 바이러스 진단용 항원을 반응시켜 고정시키는 단계; 상기 고체상 지지체에 부착되지 않은 항원들을 세척하여 제거하는 단계; 및 검출표지가 결합된 단클론항체를 고체상 지지체에 고정된 상기 구제역 바이러스 진단용 항원과 반응시키는 단계를 포함하고, 상기 항원 포획을 위한 단클론항체는 구제역 바이러스 O형, A형 및 Asia 1형에 공통적인 면역반응성을 나타내는 단클론항체인 것을 특징으로 하는 구제역 바이러스 중화항체 검출방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다. 또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.
우선, 본 발명은 구제역 진단 또는 구제역 바이러스 중화항체 검출을 위해, 구제역 바이러스 O형, A형 및 Asia 1형에 공통적인 면역반응성을 나타내는 단클론항체를 생산함을 특징으로 하는 하이브리도마 세포주를 제조, 선발하였다. 상기 하이브리도마 세포주는 구제역 3가 백신을 마우스에 면역시키고, 이로부터 분리한 림파세포와 종양세포주인 SP2/O-Ag14(KCTC H38012, 한국생명공학연구원 생물자원센타)와의 융합에 의해 생산된다. 상기 융합세포주는 2008년 5월 21일자로 한국세포주은행에 "미생물에 관한 부다페스트조약"하에 기탁하여 수탁번호 KCTC 11337BP을 받았다.
상기 하이브리도마 세포주 KCTC 11337BP에 의해 생산되는 단클론항체는 구제역 바이러스 O형, A형 및 Asia 1형에 공통적인 면역반응성을 나타내고, 면역 글로불린 아형이 IgG1이다. 상기 하이브리도마 세포주 KCTC 11337BP에 의해 생산되고, 구제역 바이러스 O형, A형 및 Asia 1형에 공통적인 면역반응성을 나타내는 단클론항체는 구제역 바이러스 O형, A형 및 Asia 1형의 구조단백질 P1에 공통으로 반응하므로, 구제역 진단 시약에서 진단용 항원을 포획하는 데 이용될 수 있다.
한편, 구제역 바이러스 O형의 진단에 적용하기 위해, 구제역 바이러스 O형 VP1 사이트 A에 대한 특이적인 면역반응성과 바이러스 중화능을 나타내는 단클론항체를 생산함을 특징으로 하는 하이브리도마 세포주를 제조, 선발하였다. 상기 하이브리도마 세포주는 구제역 바이러스 O형의 VP1 사이트 A 펩타이드를 마우스에 면역시키고, 이로부터 분리한 림파세포와 종양세포주인 SP2/O-Ag14(KCTC H38012, 한국생명공학연구원 생물자원센타)와의 융합에 의해 생산된다. 상기 융합세포주는 2008년 4월 23일자로 한국세포주은행에 "미생물에 관한 부다페스트조약"하에 기탁하여 수탁번호 KCTC 11319BP를 받았다.
상기 하이브리도마 세포주 KCTC 11319BP에 의해 생산되는 단클론항체는 구제역 바이러스 O형의 구조단백질 VP1의 사이트 A에 대하여 특이적으로 반응하고 면역 글로불린 아형이 IgG2a이다. 상기 하이브리도마 세포주 KCTC 11319BP에 의해 생산되고, 구제역 바이러스 O형의 구조단백질 VP1의 사이트 A에 대하여 특이적으로 반응하는 단클론항체는 구제역 진단 시약에서 구제역 바이러스 O형을 중화시키므로 구제역 바이러스 O형의 중화항체를 검출하는 데 이용될 수 있다.
한편, 구제역 바이러스 A형의 진단에 적용하기 위해, 구제역 바이러스 A형 VP1 사이트 A에 대한 특이적인 면역반응성과 바이러스 중화능을 나타내는 단클론항체를 생산함을 특징으로 하는 하이브리도마 세포주를 제조, 선발하였다. 상기 하이브리도마 세포주는 구제역 바이러스 A형의 VP1 사이트 A 펩타이드를 마우스에 면역시키고, 이로부터 분리한 림파세포와 종양세포주인 SP2/O-Ag14(KCTC H38012, 한국생명공학연구원 생물자원센타)와의 융합에 의해 생산된다. 상기 융합세포주는 2008년 4월 23일자로 한국세포주은행에 "미생물에 관한 부다페스트조약"하에 기탁하여 수탁번호 KCTC 11318BP을 받았다.
상기 하이브리도마 세포주 KCTC 11318BP에 의해 생산되는 단클론항체는 구제역 바이러스 A형의 구조단백질 VP1의 사이트 A에 대하여 특이적으로 반응하고 면역 글로불린 아형이 IgG2b이다. 상기 하이브리도마 세포주 KCTC 11318BP에 의해 생산되고, 구제역 바이러스 A형의 구조단백질 VP1의 사이트 A에 대하여 특이적으로 반응하는 단클론항체는 구제역 진단 시약에서 구제역 바이러스 A형을 중화시키므로 구제역 바이러스 A형의 중화항체를 검출하는 데 이용될 수 있다.
본 발명은 진단용 항원, 상기 진단용 항원 포획을 위한 단클론항체, 검출표지, 상기 검출표지가 결합되는 단클론항체 및 상기 검출표지의 활성 측정용 시약을 함유하는 구제역 진단 시약을 제공한다.
이때, 상기 진단용 항원 포획을 위한 단클론항체는 구제역 바이러스 O형, A형 및 Asia 1형에 공통적인 면역반응성을 나타내는 단클론항체임이 바람직하다. 구제역 바이러스 O형, A형 및 Asia 1형에 공통적인 면역반응성을 나타내므로, 구제역 바이러스 혈청형에 대한 각각의 항체를 이용하여 항원을 포획할 필요가 없게 되어 종래 중화항체 검사의 번거로움을 해소할 수 있기 때문이다. 그리고, 구제역 바이러스 O형, A형 및 Asia 1형에 공통적인 면역반응성을 나타내는 단클론항체는 상기 하이브리도마 세포주 KCTC 11337BP에 의해 생산된 단클론항체임이 바람직하다.
한편, 상기 진단용 항원으로는 불활화 구제역 바이러스와 유전자 재조합 구제역 바이러스를 이용할 수 있다. 그러나, 진단용 항원으로 불활화 구제역 바이러스를 이용하기보다는 유전자 재조합 구제역 바이러스 구조단백질을 이용함이 바람직하다. 불활화 구제역 바이러스를 이용하기 위해서는 차폐시설을 갖춘 실험실에서만 구제역 바이러스를 배양할 수 있기 때문이다. 상기 유전자 재조합 구제역 바이러스 구조단백질은 구제역 바이러스를 구성하는 구조단백질 VP1, VP2, VP3 및 VP4를 코딩하는 유전자와 비구조단백질인 3C 유전자를 적어도 포함하는 재조합베큘로바이러스를 숙주세포에 형질전환시켜 제조된 재조합 구제역 바이러스임이 바람직하다. 이는 유전자 조작에 의하여 감염성이 없는 구조단백질로 구성되는 소단위체 제조를 가능하게 하는 재조합베큘로바이러스를 이용하여 안전하기 때문이다. 본 발명의 유전자 재조합 구제역 바이러스 구조단백질은 특허 제10-0737446호에 개시된 방법에 따라 제조될 수 있다.
그리고, 상기 검출표지가 결합되는 단클론항체는 구제역 바이러스 O형 VP1 사이트 A에 대한 특이적인 면역반응성과 바이러스 중화능을 나타내는 단클론항체 또는 구제역 바이러스 A형 VP1 사이트 A에 대한 특이적인 면역반응성과 바이러스 중화능을 나타내는 단클론항체를 이용할 수 있다. 구제역 바이러스 O형에 대한 중 화항체의 검출 또는 O형 구제역 진단을 위해서는 구제역 바이러스 O형 VP1 사이트 A에 대한 특이적인 면역반응성과 바이러스 중화능을 나타내는 단클론항체를 이용하고, 구제역 바이러스 A형에 대한 중화항체의 검출 또는 A형 구제역 진단을 위해서는 구제역 바이러스 A형 VP1 사이트 A에 대한 특이적인 면역반응성과 바이러스 중화능을 나타내는 단클론항체를 이용한다.
상기 구제역 바이러스 O형 VP1 사이트 A에 대한 특이적인 면역반응성과 바이러스 중화능을 나타내는 단클론항체는 서열목록 1 내지 3의 아미노산 서열로 표시되는 에피토프 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 반응하는 단클론항체일 수 있다. 이때, 상기 구제역 바이러스 O형 VP1 사이트 A에 대한 특이적인 면역반응성과 바이러스 중화능을 나타내는 단클론항체는 상기 하이브리도마 세포주 KCTC 11319BP에 의해 생산되고, 구제역 바이러스 O형 VP1 사이트 A에 대한 특이적인 면역반응성과 바이러스 중화능을 나타내는 단클론항체임이 바람직하다.
그리고, 상기 구제역 바이러스 A형 VP1 사이트 A에 대한 특이적인 면역반응성과 바이러스 중화능을 나타내는 단클론항체는 서열목록 7 내지 9의 아미노산 서열로 표시되는 에피토프 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 반응하는 단클론항체일 수 있다. 이때, 상기 구제역 바이러스 A형 VP1 사이트 A에 대한 특이적인 면역반응성과 바이러스 중화능을 나타내는 단클론항체는 상기 하이브리도마 세포주 KCTC 11318BP에 의해 생산되고, 구제역 바이러스 A형 VP1 사이트 A에 대한 특이적인 면역반응성과 바이러스 중화능을 나타내는 단클론항체임이 바람직하다.
상기 검출표지와 상기 검출표지의 활성 측정용 시약은 반응에 의해 발색, 형광, 발광 특성 중 어느 하나를 나타내어 이를 측정하기 위함으로 일반적인 면역측정법에 사용되는 각종 검출표지와 각 검출표지에 따른 활성 측정용 시약을 사용할 수 있다.
본 발명의 구제역 진단 시약은 상기 진단용 항원, 상기 진단용 항원 포획을 위한 단클론항체, 검출표지, 상기 검출표지가 결합되는 단클론항체 및 상기 검출표지의 활성 측정용 시약 외에 일반적인 면역측정법에 사용되는 시약이 추가로 포함될 수 있다. 보다 구체적으로는, 항체 고정용액, 항원 고정용액, 블로킹 용액, 가검시료 희석제, 혈청 반응 및 항체의 비특이 반응을 제거하기 위한 세척액, 테스트의 유효성을 검증하기 위한 양성 및 음성 대조시약, 상기 검출표지의 활성 측정을 위한 반응을 정지시키기 위한 정지액 등이 포함될 수 있다. 또한, 일반적인 면역측정법에 사용되는 각종 고체상 지지체, 즉, 플레이트, 마이크로플레이트 웰, 플라스틱 시험관, 유리 비드, 플라스틱 비드 등도 포함될 수 있다.
본 발명의 구제역 진단 키트는 상기 본 발명의 구제역 진단 시약을 포함하여 이루어지는 키트일 수 있다.
본 발명의 구제역 진단 또는 구제역 바이러스 중화항체 검출방법은 효소면역분석법(Enzyme immunoassay, EIA) 또는 방사선면역분석법(Radio immunoassay, RIA)을 사용하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 효소면역항체분석법을 사용한다. 그러나, 상기 검출방법에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 구제역 바이러스 중화항체 검출용 단클론항체, 진단용 항원 포획용 단클론항체와 진단용 구제역 바 이러스 항원의 복합체 및 피검체로부터 채취한 가검시료를 반응시켜 항원-항체 반응을 검출할 수 있는 방법이라면 어느 방법도 사용가능하다.
상기 가검시료는 피검체로부터 채취한 생물학적인 시료를 의미한다. 세포간 체액이나 혈청을 사용하는 것이 바람직하고, 구제역 바이러스의 항원 또는 상기 구제역 바이러스에 대한 자가 항체가 정제되도록 처리한 시료를 채취하여 사용한다.
보다 구체적인 본 발명의 구제역 진단 방법은 고체상 지지체에 항원 포획을 위한 단클론항체를 고정하는 단계; 상기 고체상 지지체에 부착되지 않은 항체들을 세척하여 제거하는 단계; 상기 고체상 지지체에 구제역 바이러스 진단용 항원을 반응시키는 단계; 상기 고체상 지지체에 부착되지 않은 항원들을 세척하여 제거하는 단계; 및 검출표지가 결합된 단클론항체를 고체상 지지체에 고정된 상기 구제역 바이러스 진단용 항원과 반응시키는 단계를 포함하고, 상기 진단용 항원 포획을 위한 단클론항체는 하이브리도마 세포주 KCTC 11337BP에 의해 생산되고, 구제역 바이러스 O형, A형 및 Asia 1형에 공통적인 면역반응성을 나타내는 단클론항체를 사용한다.
경쟁적 효소결합면역분석법을 이용한 본 발명의 구제역 진단 방법은 플레이트에 진단용 항원 포획을 위한 단클론항체를 고정시키는 제 1 단계; 상기 제 1 단계의 플레이트에 부착되지 않은 항체들을 세척하여 제거하는 제 2 단계; 상기 제 2 단계의 플레이트에 유전자 재조합 구제역 바이러스 구조단백질 항원을 정량하여 첨가한 후 반응시켜 고정시키는 제 3 단계; 상기 제 3 단계의 플레이트에 부착되지 않은 구제역 항원을 세척하여 제거하는 제 4 단계; 상기 제 4 단계의 플레이트에 가검 시료를 첨가하여 반응시키는 제 5 단계; 상기 제 5 단계의 플레이트에 고정된 구제역 항원과 특이적으로 결합하지 않은 가검 시료를 세척하여 제거하는 제 6 단계; 상기 제 6 단계의 플레이트에 검출표지가 결합된 효소와 결합된 구제역 바이러스 중화항체 검출용 단클론항체를 첨가하여 반응시키는 제 7 단계; 상기 플레이트에 고정된 구제역 항원과 결합하지 않은 구제역 바이러스 중화항체 검출용 단클론항체를 세척하여 제거하는 제 8 단계; 및 상기 제 8 단계의 플레이트에 상기 효소와 검출반응을 하는 기질을 첨가하여 가검 시료의 구제역 바이러스에 대한 중화항체의 수준을 평가하는 단계를 포함하여 이루어질 수 있다.
또한, 상기 재조합 구제역 바이러스 구조단백질은 바이러스 역가가 측정된 구제역 바이러스를 대조군으로 하고, 상기 재조합 구제역 바이러스 구조단백질을 실험군으로 하여, 상기 재조합 구제역 바이러스 구조단백질의 항원활성도를 산출하여 정량적으로 첨가될 수 있다. 유전자 재조합 항원은 발현된 목적 단백질의 양을 측정하는 것이 불가능하고, 항원의 활성을 정량적으로 측정하는 것이 어려워 재현성 있는 고정화를 위해서는 재조합 구제역 바이러스 구조단백질 항원을 정량하여 첨가하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명에서는 바이러스 역가가 측정된 구제역 바이러스를 대조군으로 하여, 재조합 구제역 바이러스 구조단백질의 항원활성도를 측정한 후, 이에 따른 유효 항원량을 정량하여 첨가하고자 하였다.
보다 바람직하게는, 상기 재조합 구제역 바이러스 구조단백질은, 상기 고체상 지지체에 상기 항원 포획을 위한 단클론항체를 고정시킨 다음, 대조군으로 바이러스 역가(T)가 측정된 구제역 바이러스 항원과 반응시켜 항원-항체 복합체를 형성 하고, 상기 항원-항체 복합체에 상기 검출표지가 결합된 단클론항체를 반응시켜 상기 대조군의 검출결과값(P)을 측정하고, 실험군으로 상기 바이러스 역가(T)가 측정된 구제역 바이러스 대신 상기 재조합 구제역 바이러스 구조단백질을 일정 희석배수로 희석하여, 상기 고체상 지지체에 상기 항원 포획을 위한 단클론항체를 고정시킨 다음, 상기 희석된 재조합 구제역 바이러스 구조단백질과 반응시켜 항원-항체 복합체를 형성하고, 상기 항원-항체 복합체에 상기 검출표지가 결합된 단클론항체를 반응시켜 상기 실험군의 검출결과값(S)을 측정한 다음, 하기의 식 1로부터 항원활성도(Tx)를 산출하여, 상기 재조합 구제역 바이러스 구조단백질의 희석배수에 따른 상기 항원활성도의 평균값으로부터 상기 재조합 구제역 바이러스 구조단백질의 유효 항원량을 정하여 첨가될 수 있다.
[식 1]
이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러가지로 변형 또는 수정될 수 있음은 이 분야에서 당업자에게 명백한 것이다.
[
실시예
1]
단클론항체를
생산하는
하이브리도마의
작성
단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주는 코헬 G와 밀스테인 C(Kohler G and Milstein C., Nature 256, 495-497, 1975)의 방법에 의하여 획득하였으며, 이하 그 과정을 간략히 기술하면 다음과 같다.
종양세포주(Myeloma cell line)인 SP2/O-Ag14(KCTC H38012, 한국생명공학연구원 생물자원센타)를 10% 우태아 혈청이 첨가된 DMEM(GibcoBRL, USA)배지를 이용하여 5% 탄산가스가 공급되는 배양기에서 37℃로 배양하였다.
구제역 바이러스 O형의 VP1 사이트 A 펩타이드(서열번호 3, PVTNRGDLQVLTQKAARTLP, (주)페트론, 한국), 구제역 바이러스 A형의 VP1 사이트 A 펩타이드(서열번호 7, PGAGRRGDLGPLAARTAAQLPA, (주)페트론, 한국) 및 구제역 3가 백신을 각각 6주령의 BALB/c 마우스(오리엔트, 한국)의 근육에 접종하였다. 면역 후 마우스의 비장을 무균적으로 채취하여 마쇄한 후 림프구만을 회수하였다. 분리한 림파구와 종양세포를 PEG 1500(Sigma, USA)을 사용하여 림파세포가 종양세포와 융합되도록 유도하였다. 융합 2주 후 상층액을 검사하고 양성반응이 있는 세포주를 희석하여 96웰의 조직 배양플레이트에서 클로닝하였고, 선발과정을 간략히 기술하면 다음과 같다.
불활화 구제역 바이러스 항원을 카르보네이트 비카보네이트 완충액(Carbonate bicaonate buffer, Sigma USA)에 적당량 희석하여 엘라이자 플레이트(Greiner, Germany)에 흡착시켜 고정시킨 후, 상기에서 제작한 잡종세포 상층액을 각각 1시간 동안 반응을 시켰다. 그 후, 인산 완충액으로 4회 세척하고, 항 마우스 HRP 콘주게이트(KPL,Germany)를 1시간 동안 반응시켰다. 인산 완충액으로 4회 세척하고 TMB(3',3',5',5'- Tetramethyl benzidine, Moss Inc, USA) 발색제를 첨가 하여 10분간 발색반응을 시키고 반응정지액(0.5M H2SO4, Sigma, USA)을 첨가하여 발색반응을 정지시킨 후, 판독기(ELISA Reader, EMAX, Molecular device, USA)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 구제역 바이러스 O형, A형에 각각 반응하는 잡종 세포주와 구제역 바이러스 O형, A형, Asia 1형에 모두 반응하는 세포주를 선발하여 클로닝하였다(표 1 참조).
표 1과 같이, 불활화 구제역 바이러스 O형 항원에 특이적으로 반응하고, 면역 글로불린 아형 IgG2a인 단클론항체 76.5E를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포주를 선발하여 2008년 4월 23일자로 한국세포주은행에 "미생물에 관한 부다페스트조약"하에 기탁하여 수탁번호 KCTC 11319BP를 받았다.
그리고, 불활화 구제역 바이러스 A형 항원에 특이적으로 반응하고, 면역 글로불린 아형 IgG2b인 단클론항체 6G43을 생산할 수 있는 하이브리도마 세포주를 선발하여 2008년 4월 23일자로 한국세포주은행에 "미생물에 관한 부다페스트조약"하에 기탁하여 수탁번호 KCTC 11318BP를 받았다.
또한, 불활화 구제역 바이러스 O형, A형, Asia 1형에 공통으로 반응하고, 면역 글로불린 아형 IgG1인 단클론항체 70.17을 생산할 수 있는 하이브리도마 세포주를 선발하여 2008년 5월 21일자로 한국세포주은행에 "미생물에 관한 부다페스트조약"하에 기탁하여 수탁번호 KCTC 11337BP을 받았다.
| 면역항원 | 단클론 항체 | 불활화 구제역 바이러스 항원 (O.D. 450nm) | 아형 | |||
| O | A | Asia 1 | Control | |||
| FMDV O VP1 Site A peptide(VP1-3) | 76.5E | 2.338 | 0.081 | 0.070 | 0.048 | IgG2a |
| FMDV A VP1 Site A peptide(VP1-4) | 6G43 | 0.081 | 3.779 | 0.084 | 0.068 | IgG2b |
| FMDV Vaccine | 70.17 | 0.811 | 1.072 | 0.915 | 0.091 | IgG1 |
FMDV O VP1 Site A peptide : 구제역 바이러스 VP1 O형 사이트 A 펩타이드, FMDV O/SKR/2002 (Amino Acid-PVTNRGDLQVLTQKAARTLP, 서열번호 3)
FMDV A VP1 Site A peptide : 구제역 바이러스 VP1 A형 사이트 A 펩타이드, FMDV A22/India/1/7/77(Amino Acid-PGAGRRGDLGPLAARTAAQLPA, 서열번호 7)
[
실시예
2]:
단클론항체의
특이 항원 결정부위 분석
본 발명의 단클론항체의 항원 결정부위를 확인하기 위하여 구제역 바이러스 타입별(O형, A형, Asia1형) VP1 항원 결정부위와 VP2, VP3, VP4를 오브알부민이 결합된 합성펩타이드로 제작(페트론, 한국)하여 반응성을 확인한 결과, 하기 표 2와 같이 본 발명의 단클론항체 76.5E는 구제역 바이러스 O형의 VP1의 사이트 A의 특정 항원 결정기에 반응하는 것을 알 수 있었다.
또한, 단클론항체 6G43은 구제역 바이러스 A형의 VP1의 사이트 A의 특정 항원 결정기에 반응하는 것을 알 수 있었다.
그리고, 단클론항체 70.17은 구제역 바이러스 구조단백질의 주요 면역 항원 결정부위에 반응하지 않는 특징이 있음을 알 수 있었다.
| 단클론항체 | 구제역 바이러스 합성펩타이드 엘라이자(ELISA) | OVA | |||||||||||
| O형 | A형 | Asia1형 | |||||||||||
| VP1-1 | VP1-2 | VP1-3 | VP2 | VP3 | VP4 | VP1-4 | VP1-5 | VP1-6 | VP1-7 | VP1-8 | VP1-9 | ||
| 76.5E | 2.960 | 1.094 | 2.869 | 0.044 | 0.045 | 0.048 | 0.045 | 0.047 | 0.048 | 0.052 | 0.067 | 0.047 | 0.051 |
| 6G43 | 0.054 | 0.054 | 0.062 | 0.054 | 0.055 | 0.061 | 2.374 | 1.084 | 0.067 | 0.056 | 0.077 | 0.063 | 0.068 |
| 70.17 | 0.047 | 0.049 | 0.050 | 0.046 | 0.054 | 0.054 | 0.047 | 0.046 | 0.051 | 0.049 | 0.064 | 0.049 | 0.080 |
1) VP1-1: FMDV O1/Kaufbeuren (서열번호 1: AVPNLRGDLQVLAQKVATLP)
2) VP1-2: FMDV O1/Manisa/Turkey/69 (서열번호 2: VANVRGDLQVLAQKAARALP)
3) VP1-3: FMDV O/SKR/2002 (서열번호 3: PVTNRGDLQVLTQKAARTLP)
4) VP2: FMDV O/SKR/2002 (서열번호 4: DKKTEETTLLEDRIL)
5) VP3: FMDV O/SKR/2002 (서열번호 5: PPGMPPKTPEAAAH)
6) VP4: FMDV O/SKR/2002 (서열번호 6: GSTDTTSTHTTNTQN)
7) VP1-4 : FMDV A22/India/1/7/77(서열번호 7: PGAGRRGDLGPLAARTAAQLPA)
8) VP1-5 : FMDV A24/Cruz/Brazil/55(서열번호 8: GGSGRRGDMGSLAARVVKQLPA)
9) VP1-6 : FMDV Asia1/Vaccine (서열번호 9: TGPTRRGDLAVLAQRVSNRLP)
10) VP1-7 : FMDV Asia1/Taiwan (서열번호 10: ETTTRRGDLAAIAQRVNRQLPTS)
11) VP1-8: FMDV Asia1/Mongolia/2005 (서열번호 11: EESSRRGDLAALARRVNNRLP)
12) VP1-9: FMDV Asia1/Shamir (서열번호 12: ETTSRRGDMAALAQRLSARLP)
13) OVA: Ovalbumin
[
실시예
3] :
단클론항체의
바이러스
중화능
분석
구제역 바이러스에 대한 단클론항체의 바이러스 중화능(Virus Neutralization)을 확인하기 위하여 국제수역사무국(OIE)의 Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals(2004)의 방법에 따라 바이러스 중화 시험(Virus Neutralizing Test: VNT)을 실행하여 단클론항체의 바이러스 중화 역가를 측정하였다.
본 발명에 의해 제작된 단클론항체를 16배부터 2진 계단 희석 후 100 TCID50의 농도로 희석된 바이러스 4종(FMDV O/SKR/2002, FMDV O/SKR/2000, FMDV A22/Shamir, FMDV Asia1/Mongolisa/2005)과 동량으로 혼합하였고, 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 IBRS 세포에 접종하고 2 ~ 3일간 배양하였다. 바이러스 중화 역가는 세포변성이 관찰되지 않는 최대 희석배수의 농도의 역수를 산출하였다.
또한, 교차반응성을 확인하기 위해 돼지 수포병 바이러스(Swine Vesicular Disease Virus, SVDV), 수포성 구염 바이러스(Vesicular Stomatitis Virus, VSV)와 동일한 방법으로 바이러스 중화능을 평가하였다.
그 결과, 표 3과 같이 본 발명의 단클론항체 76.5E는 구제역 바이러스 O형에 대해서만 중화능이 있는 것으로 확인되었고, 구제역 바이러스 A형, Asia1형, SVDV, VSV와는 교차 반응성이 없는 것으로 확인되었다.
또한, 본 발명의 단클론항체 6G43은 구제역 바이러스 A형에 대해서만 중화능이 있는 것으로 확인되었고, 구제역 바이러스 O형, Asia1형, SVDV, VSV와는 교차 반응성이 없는 것으로 확인되었다.
그리고, 본 발명의 단클론항체 70.17은 구제역 바이러스 O형, A형, Asia1형, SVDV, VSV에 대해 중화능이 없는 것으로 확인되었다.
| 단클론항체 | 바이러스 중화 역가 | |||||
| 구제역 바이러스 혈청형 | ||||||
| O/SKR/2000 | O/SKR/2002 | A22/Shamir | Asia1/Mongolisa/2005 | SVDV | VSV | |
| 76.5E | 256 | 724 | <16 | <16 | <16 | <16 |
| 6G43 | <16 | <16 | 64 | <16 | <16 | <16 |
| 70.17 | <16 | <16 | <16 | <16 | <16 | <16 |
[
실시예
4]: 진단용 항원 포획용
단클론항체
선발
구제역 바이러스 진단용 항원을 포획할 수 있는 단클론항체를 선발하기 위하여 불활화 바이러스 3종(O형, A형, Asia 1형)을 단클론항체가 고정화된 플레이트에 첨가한 후 구제역 3가 백신을 접종한 소 혈청을 첨가하여 반응성을 확인한 결과 단클론항체 70.17이 가장 반응성이 높고 바이러스 혈청형에 관계없이 일정량의 항원을 포획하는 것을 알 수 있었다(표 4).
따라서, 구제역 바이러스 진단용 항원을 포획할 수 있는 단클론항체로 70.17을 선발하였다.
| 단클론항체 | 불활화 구제역 바이러스 항체(O.D.450nm) | |||
| O/SKR/2000 | O1 Manisa | A Iraq | Asia1/Shamir | |
| 76.5E | 0.719 | 0.775 | 0.299 | 0.305 |
| 6G43 | 0.314 | 0.289 | 1.024 | 0.987 |
| 70.17 | 1.140 | 1.569 | 1.167 | 1.159 |
[
실시예
5]: 유전자 재조합 구제역 바이러스
구조단백질
생산
특허 제10-0737446호의 p-FastBacDual P13C의 재조합 배큘로바이러스 제작방법과 동일하게 구제역 바이러스 A/Iraq의 P1유전자를 클로닝하여 p-FastBacDual A P13C 재조합 배큘로바이러스를 제작하였다.
각각의 유전자 재조합 구제역 바이러스 구조단백질(r-FMDV O P13C, r-FMDV A P13C)을 생산하기 위하여 재조합 배큘로바이러스를 SF-9 세포에 0.1m.o.i로 접종한 후 4 ~ 6일간 배양하면서 세포변성효과가 90% 이상 출현하였을 때 세포를 얼렸다 녹이는 과정을 3회 반복하였고, 3,000rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액을 수확하였다. 사용 전까지 -20℃에 보관하였다.
[
실시예
6]: 유전자 재조합
구조단백질의
포획 및 고정화
(1) 유전자 재조합 구조단백질 정량법 설정
유전자 재조합 항원의 경우, 발현된 단백질의 3차 구조를 바이러스 구조와 유사하게 합성되도록 유도하기 위하여 정제를 위한 퓨전 단백질이 포함되어 있지 않아서 발현된 목적 단백질의 양을 측정하는 것이 불가능하고 항원의 활성을 정량적으로 측정하는 것이 어려우므로, 재현성 있는 고정화 기술을 확립하기 위해서 단백질 활성을 측정할 수 있는 정량검사법을 설정하고자 하였다.
이를 위해, 단클론항체 70.17을 2ug/㎖의 농도로 플레이트에 고정화하고 단클론항체 76.5E-양고추냉이 퍼록시다제(horseradish peroxidase, HRP) 콘쥬게이트(conjugate)를 사용한 Double Antibody Sandwich ELISA(DAS ELISA)를 정량법으로 설정하였다.
즉, 바이러스 역가가 측정된 구제역 바이러스 항원을 표준시료로 설정하고, 상기 유전자 재조합 항원을 희석하여 반응시킨 후 단클론항체 76.5E-HRP 콘쥬게이트를 반응시켜 흡광도를 판독하였다.
이때, 바이러스 역가(T) 105.0TCID50/㎖에서의 흡광도값(P)을 유효 항원량의 기준으로 삼아 1.0 Unit으로 정하고, 상기 유전자 재조합 항원의 흡광도값(S)을 측정하여 흡광도값 비율(S/P)를 계산하였다. 산출된 상기 흡광도값 비율(S/P)에 유전자 재조합 항원의 희석배수(Dilution factor)를 곱하여 Unit 단위로 환산하였다(식 1 참조).
희석 정도를 반영한 상기 유전자 재조합 항원의 Unit값으로부터 평균을 구하여 유전자 재조합 구조단백질의 유효 항원량을 정량하였다. 유효 항원량이 1.0 Unit이 되도록 유전자 재조합 구조단백질을 희석하여 진단용 항원으로 사용하였다(표 5).
| Dilution factor | 유전자 재조합 구제역 바이러스 SP 항체(Batch 0501-01) | ||
| O.D. | S/P | Unit | |
| 20 | 0.988 (S) | 1.01 | 20.3 |
| 40 | 0.561 (S) | 0.57 | 23.0 |
| 60 | 0.390 (S) | 0.40 | 24.0 |
| 80 | 0.286 (S) | 0.29 | 23.5 |
| Virus(105.0TCID50/㎖)-대조군 | 0.975 (P) | 1.00 | 1.0 |
즉, 표 5에서와 같이 역가(T)가 105.0TCID50/㎖인 구제역 바이러스를 대조군으로 하여 반응시킨 결과, 흡광도(P)가 0.975로 나타났고, 이를 유효 항원량 1.0Unit으로 정하였다.
상기 유전자 재조합 구조단백질을 20배, 40배, 60배, 80배 희석하여 반응시킨 다음 흡광도를 측정한 결과, 각각 S값이 각각 0.988, 0.561, 0.390, 0.286으로 나타나, S/P값은 각각 1.01, 0.57, 0.40, 0.29로 나타났으며, 여기에 희석배수를 곱하여 유효 항원량을 계산하였다.
그 결과, 상기 유전자 재조합 구조단백질의 유효 항원량이 20.3 Unit, 23.0 Unit, 24.0 Unit, 23.5 Unit으로 나타나, 유전자 재조합 구조단백질의 평균 유효 항원량은 22.7 Unit인 것으로 측정되었다.
이로부터 유효 항원량이 1.0 Unit이 되도록 상기 유전자 재조합 구조단백질을 희석하여 진단용 항원으로 사용하였다.
2) 유전자 재조합 구조단백질의 포획 및 고정화
도 1은 진단용 항원 포획을 위한 단클론항체를 이용하여 유전자 재조합 구제역 바이러스 구조단백질 항원을 고체상 지지체(항체 고정용 플레이트)에 고정하는 단계를 나타낸 모식도로서, 이와 같은 순서로 구제역 바이러스 구조단백질의 포획 및 고정화를 실시하였다.
즉, 구제역 바이러스 구조단백질을 진단용 항원으로 포획할 수 있는 단클론항체 70.17을 1 ~ 4㎍/㎖농도로 희석하여 표 6의 항체고정용액에 첨가하여 실온에서 3시간 이상 교반하여 균질화한 후, ELISA 플레이트 또는 고정용 장치에 적량 분주하였고, 4 ~ 10℃에서 18시간 이상 반응시켜 상기 단클론항체를 플레이트에 고정화하였다.
반응 후 고정화되지 않은 항체를 제거하기 위하여 표 6의 세척액으로 세척하고, 비부착부위를 차단하기 위해 표 6의 블로킹용액을 가한 후 실온에서 2시간 반응시킨 후 세척액을 사용하여 세척하였다.
이후 상기 유전자 재조합 구조단백질을 1 Unit이 되도록 표 6의 항원 고정용액에 희석하여 첨가한 후, 실온에서 2시간 반응시켜 고정화한 후, 고정되지 않은 유전자 재조합 항원은 세척액으로 제거하고 37℃에서 1시간 건조한 후 실리카겔과 함께 밀봉하여 4 ~ 8℃에 보관하였다.
| 완충액 | 시약 조성 |
| 항체고정용액 | 1.0 M 비카보네이트(Bicarbobate); 0.5M 카보네이트(Carbonate); pH 9.0 |
| 세척액 | NaCl 0.137M; KH2PO4 1.4mM; Na2HPO4 7H2O 8.1mM; KCl 2.7mM; Detergent 0.05%, pH 7.4 |
| 블로킹 용액 | Tris- HCl 17.8mM; Tris-Base 2.2mM; NaCl 0.15M, Bovine Serum Albumin 5%; Gelatin 1%; Detergent 0.05%; pH 8.0 |
| 항원고정용액 | NaCl 0.137M; KH2PO4 1.4mM; Na2HPO4 7H2O 8.1mM; KCl 2.7mM; Bovine Serum Albumin 1%; pH 7.4 |
[
실시예
7]: 구제역 진단 시약의 구성
우선, 상기 실시예 3에서 선발된 단클론항체 76.5E 및 6G43을 퍼옥시다제 콘쥬게이션 키트(Roche, Germany)의 사용매뉴얼에 따라 단클론항체와 콘쥬게이션한 후, 50 ~ 500ng의 농도로 희석하여 검출용 시약으로 제작하였다.
또한, 시료 희석용 완충액(Tris-base 20mM: Bovine Serum Albumin 1%; Triton X-100, 0.1%; EDTA 0.1%; Tween 20 0.1%, pH 7.5)은 시료 중의 중화항체가 고정화된 구제역 바이러스 유전자 재조합 항원에 가장 강하게 반응할 수 있는 조건을 탐색하여 조성하였다.
또한, 검사의 유효성 검정에 사용될 양성 대조로는 구제역 바이러스에 대한 중화항체 역가 90이상의 혈청을, 음성 대조로는 중화항체 역가가 0인 혈청을 제공하였다.
발색시약으로는 미국의 MOSS사로부터 구입한 TMB를 사용하였고, 반응정지액은 0.5M H2SO4을 사용하였다.
도 2는 본 발명의 구제역 바이러스 중화항체를 검사하는 진단 시약 및 이를 포함하는 진단 키트의 구성을 나타내는 사진이다.
[
실시예
8]: 판정기준의 설정
결과 판정기준은 흡광도 판독기를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 가검혈청의 흡광도(S)와 음성 대조 흡광도(N) 비율값(SN Ratio Value)을 하기 식 2에 의해 산출하였다. S/N값이 0.6 이하이면 양성으로, 0.6 보다 크면 음성으로 판정하였다.
[식 2]
SN ratio Value(SN)= [가검 시료의 평균 흡광도 / 음성 대조의 평균 흡광도]
[
실시예
9]: 구제역 바이러스 중화항체 측정능력 검사
상기 진단 시약을 이용하여 구제역 바이러스 O형에 대하여 검사한 결과 양성그룹에 대해서는 98.1%의 민감도를 나타내었고, 음성 혈청에 대해서는 98.7%의 특이도를 나타내었다. 또한, 축종에 상관없이 유사한 결과가 나타나 본 발명의 구제역 바이러스 중화항체 측정능력이 매우 우수함을 알 수 있었다(표 7).
| 그룹 | 축종 | FMDV O AB ELISA | 민감도 | 특이도 | ||
| 양성혈청 | 음성혈청 | 계 | (%) | (%) | ||
| 양성 (N=154) | 소 | 106 | 1 | 107 | 99.1 | |
| 돼지 | 19 | 1 | 20 | 95.0 | ||
| 염소 | 21 | 1 | 22 | 95.5 | ||
| 양 | 3 | 0 | 3 | 100.0 | ||
| 기타 | 2 | 0 | 2 | 100.0 | ||
| 계/평균 | 151 | 3 | 154 | 98.1 | ||
| 음성 (N=384) | 소 | 1 | 127 | 128 | 99.2 | |
| 돼지 | 0 | 149 | 149 | 100.0 | ||
| 염소 | 0 | 65 | 65 | 100.0 | ||
| 양 | 4 | 27 | 31 | 87.1 | ||
| 사슴 | 0 | 11 | 11 | 100.0 | ||
| 계/평균 | 5 | 379 | 384 | 98.7 | ||
구제역 바이러스 O형에 대하여 본 발명의 진단 시약을 시판 제품(CEDI)과 비교 시험해 본 결과, 표 8과 같이 본 발명이 검출민감도에서 0.7%, 특이도에서 1.6% 더 높은 것으로 확인되어 기존의 방법보다 우수함을 알 수 있었다.
| 그룹 | 축종 | CEDI FMDV O AB ELISA | 민감도 | 특이도 | ||
| 양성혈청 | 음성혈청 | 계 | (%) | (%) | ||
| 양성 (N=76) | 소 | 29 | 0 | 29 | 100.0 | |
| 돼지 | 18 | 2 | 20 | 90.0 | ||
| 염소 | 22 | 0 | 22 | 100.0 | ||
| 양 | 3 | 0 | 3 | 100.0 | ||
| 기타 | 2 | 0 | 2 | 100.0 | ||
| 계/평균 | 74 | 2 | 76 | 97.4 | ||
| 음성 (N=34) | 소 | 0 | 13 | 13 | 100.0 | |
| 돼지 | 0 | 4 | 4 | 100.0 | ||
| 염소 | 0 | 11 | 11 | 100.0 | ||
| 양 | 1 | 5 | 6 | 83.3 | ||
| 계/평균 | 1 | 33 | 34 | 97.1 | ||
그리고, 표 9와 같이 구제역 백신지역 혈청을 검사한 결과, 본 발명에 의한 구제역 진단 시약의 항체 검출율이 종래 구제역 바이러스 O형에 대한 표준시험법(VNT)보다 16.3%, 시판 제품(CEDI® FMDV Type O ELISA)보다 6.4% 더 우수함을 알 수 있었다.
| 그룹 | 중화항체 역가 | FMDV O AB ELISA | CEDI FMDV Type O ELISA | ||||||
| 양성 | 음성 | 계 | 양성 | 음성 | 계 | 양성 | 음성 | 계 | |
| Positive | 113 | 0 | 113 | 112 | 1 | 113 | 34 | 1 | 35 |
| Cut-off | 0 | 40 | 40 | 26 | 14 | 40 | 28 | 11 | 39 |
| Total | 113 | 40 | 153 | 138 | 15 | 153 | 62 | 12 | 74 |
| %Positive | 73.9 | 90.2 | 83.8 | ||||||
Positive: 중화항체 역가 45배 이상 혈청
Cut-off:중화항체 역가 45배 미만 8배 이상 혈청
한편, 엄 등(Vaccine, 2007, 25(20), 4112-4121)에 의해 발표된 진단법에 따르면 표 10과 같이, 구제역 백신을 접종한 돼지 혈청 4개 시료 중 1개 시료를 음성으로 판정하였으며, 양성으로 확인된 시료의 S/N 분포는 0.25에서 0.57로 나타났다. 그러나 본 발명에 의하면, 4개 시료를 모두 양성으로 판정하고 있으며, S/N도 모두 0.30 이하인 것으로 나타나, 민감도 및 특이도가 우수함을 알 수 있었다.
| Serum | SNT against FMDV O | 엄 등에 의한 방법 | FMDV O AB ELISA (본 발명) | ||||
| OD | SN | 결과 | OD | SN | 결과 | ||
| SM01 | 512 | 0.291 | 0.25 | 양성 | 0.086 | 0.10 | 양성 |
| SM02 | 512 | 0.371 | 0.32 | 양성 | 0.086 | 0.10 | 양성 |
| ST01 | 128 | 0.672 | 0.57 | 양성 | 0.213 | 0.24 | 양성 |
| ST02 | 128 | 2.072 | 1.76 | 음성 | 0.273 | 0.30 | 양성 |
| PC | 0.111 | 0.09 | 0.1035 | 0.11 | |||
| NC | 1.176 | 1.00 | 0.9045 | 1.00 | |||
SNT : 혈청 중화 역가(Serum Neutralizing Titer)
SM01, SM02 : 구제역 1가 백신(O1 Manisa) 접종 돼지 혈청
ST01, ST02 : 구제역 3가 백신(O1 Mannisa, Asia1 Shamir, A Iraq) 접종 돼지 혈청
PC : 양성 대조
NC : 음성 대조
그리고, 표 11과 같이 구제역 바이러스 A형에 대한 항혈청에서의 중화항체 역가와 반비례적으로 S/N값이 상승하는 것으로 나타나 A형에 대한 중화항체 역가 측정도 가능함을 알 수 있었다.
| FMDV A AB ELISA | SNT against FMDV A Serotype | ||||||||
| 1024 | 512 | 256 | 128 | 64 | 32 | 16 | 8 | 0 | |
| OD | 0.116 | 0.155 | 0.254 | 0.472 | 0.859 | 1.141 | 1.381 | 1.535 | 1.617 |
| S/N | 0.07 | 0.10 | 0.16 | 0.29 | 0.53 | 0.71 | 0.85 | 0.95 | 1.00 |
SNT: 혈청 중화 역가(Serum Neutralizing Titer)
따라서 본 발명에 의한 검사방법은 구제역 바이러스 O형과 A형에 대한 항체 검사뿐만 아니라 C형, Asia1형 등에도 적용될 수 있어, 향후 개발될 수 있는 여러 형태의 진보된 모든 검사기술에서 본 발명이 사용될 수 있다.
한편, 전술한 개시에 대해서 일정 범위의 수정, 변화 및 치환이 가능하며, 어떤 경우에는 본 발명의 특징 중 일부만이 사용될 수도 있다. 따라서, 첨부된 청구항들이 넓게, 또한 본 발명의 사상과 범위에 부합되게 해석되어야 한다.
도 1은 진단용 항원 포획을 위한 단클론항체를 이용하여 유전자 재조합 구제역 바이러스 구조단백질 항원을 고체상 지지체(항체 고정용 플레이트)에 고정하는 단계를 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 구제역 진단 키트의 구성을 나타내는 사진이다.
<110> JENOBIOTECH Inc.
National Veterinary Research and Quarantine Service
<120> Hybridoma cell lines, monoclonal antibodies produced from the
hybridoma cell lines, Foot-and-mouth disease virus(FMDV)
detection reagents, FMDV detection kits and detection method for
FMDV neutralizing antibodies
<130> PA08-017
<160> 12
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> FMDV O1/Kaufbeuren
<400> 1
Ala Val Pro Asn Leu Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Val
1 5 10 15
Ala Thr Leu Pro
20
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> FMDV O1/Manisa/Turkey/69
<400> 2
Val Ala Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala
1 5 10 15
Arg Ala Leu Pro
20
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> FMDV O/SKR/2002
<400> 3
Pro Val Thr Asn Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Thr Gln Lys Ala Ala
1 5 10 15
Arg Thr Leu Pro
20
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> FMDV O/SKR/2002
<400> 4
Asp Lys Lys Thr Glu Glu Thr Thr Leu Leu Glu Asp Arg Ile Leu
1 5 10 15
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> FMDV O/SKR/2002
<400> 5
Pro Pro Gly Met Pro Pro Lys Thr Pro Glu Ala Ala Ala His
1 5 10
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> FMDV O/SKR/2002
<400> 6
Gly Ser Thr Asp Thr Thr Ser Thr His Thr Thr Asn Thr Gln Asn
1 5 10 15
<210> 7
<211> 22
<212> PRT
<213> FMDV A22/India/1/7/77
<400> 7
Pro Gly Ala Gly Arg Arg Gly Asp Leu Gly Pro Leu Ala Ala Arg Thr
1 5 10 15
Ala Ala Gln Leu Pro Ala
20
<210> 8
<211> 22
<212> PRT
<213> FMDV A24/Cruz/Brazil/55
<400> 8
Gly Gly Ser Gly Arg Arg Gly Asp Met Gly Ser Leu Ala Ala Arg Val
1 5 10 15
Val Lys Gln Leu Pro Ala
20
<210> 9
<211> 21
<212> PRT
<213> FMDV Asia1/Vaccine
<400> 9
Thr Gly Pro Thr Arg Arg Gly Asp Leu Ala Val Leu Ala Gln Arg Val
1 5 10 15
Ser Asn Arg Leu Pro
20
<210> 10
<211> 23
<212> PRT
<213> FMDV Asia1/Taiwan
<400> 10
Glu Thr Thr Thr Arg Arg Gly Asp Leu Ala Ala Ile Ala Gln Arg Val
1 5 10 15
Asn Arg Gln Leu Pro Thr Ser
20
<210> 11
<211> 21
<212> PRT
<213> FMDV Asia1/Mongolia/2005
<400> 11
Glu Glu Ser Ser Arg Arg Gly Asp Leu Ala Ala Leu Ala Arg Arg Val
1 5 10 15
Asn Asn Arg Leu Pro
20
<210> 12
<211> 21
<212> PRT
<213> FMDV Asia1/Shamir
<400> 12
Glu Thr Thr Ser Arg Arg Gly Asp Met Ala Ala Leu Ala Gln Arg Leu
1 5 10 15
Ser Ala Arg Leu Pro
20
Claims (20)
- 구제역 바이러스 O형, A형 및 Asia 1형에 공통적인 면역반응성을 나타내는 단클론항체를 생산함을 특징으로 하는 하이브리도마 세포주(KCTC 11337BP).
- 제 1 항의 하이브리도마 세포주에 의해 생산되는 단클론항체.
- 구제역 바이러스 O형 VP1 사이트 A에 대한 특이적인 면역반응성과 바이러스 중화능을 나타내는 단클론항체를 생산함을 특징으로 하는 하이브리도마 세포주(KCTC 11319BP).
- 제 3 항의 하이브리도마 세포주에 의해 생산되는 단클론항체.
- 구제역 바이러스 A형 VP1 사이트 A에 대한 특이적인 면역반응성과 바이러스 중화능을 나타내는 단클론항체를 생산함을 특징으로 하는 하이브리도마 세포주(KCTC 11318BP).
- 제 5 항의 하이브리도마 세포주에 의해 생산되는 단클론항체.
- 진단용 항원, 상기 진단용 항원 포획을 위한 단클론항체, 검출표지, 상기 검출표지가 결합되는 단클론항체 및 상기 검출표지의 활성 측정용 시약을 함유하는 구제역 진단 시약에 있어서,상기 진단용 항원 포획을 위한 단클론항체는 구제역 바이러스 O형, A형 및 Asia 1형에 공통적인 면역반응성을 나타내는 단클론항체인 것을 특징으로 하는 구제역 진단 시약.
- 제 7 항에 있어서,상기 구제역 바이러스 O형, A형 및 Asia 1형에 공통적인 면역반응성을 나타내는 단클론항체는 제 2 항의 단클론항체인 것을 특징으로 하는 구제역 진단 시약.
- 제 7 항에 있어서,상기 검출표지가 결합되는 단클론항체는 구제역 바이러스 O형 VP1 사이트 A 에 대한 특이적인 면역반응성과 바이러스 중화능을 나타내는 단클론항체 또는 구제역 바이러스 A형 VP1 사이트 A에 대한 특이적인 면역반응성과 바이러스 중화능을 나타내는 단클론항체인 것을 특징으로 하는 구제역 진단 시약.
- 제 9 항에 있어서,상기 구제역 바이러스 O형 VP1 사이트 A에 대한 특이적인 면역반응성과 바이러스 중화능을 나타내는 단클론항체는 서열목록 1 내지 3의 아미노산 서열로 표시되는 에피토프 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 반응하는 단클론항체인 것을 특징으로 하는 구제역 진단 시약.
- 제 9 항에 있어서,상기 구제역 바이러스 O형 VP1 사이트 A에 대한 특이적인 면역반응성과 바이러스 중화능을 나타내는 단클론항체는 제 4 항의 단클론항체인 것을 특징으로 하는 구제역 진단 시약.
- 제 9 항에 있어서,상기 구제역 바이러스 A형 VP1 사이트 A에 대한 특이적인 면역반응성과 바이 러스 중화능을 나타내는 단클론항체는 서열목록 7 내지 9의 아미노산 서열로 표시되는 에피토프 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 반응하는 단클론항체인 것을 특징으로 하는 구제역 진단 시약.
- 제 9 항에 있어서,상기 구제역 바이러스 A형 VP1 사이트 A에 대한 특이적인 면역반응성과 바이러스 중화능을 나타내는 단클론항체는 제 6 항의 단클론항체인 것을 특징으로 하는 구제역 진단 시약.
- 제 9 항에 있어서,상기 진단용 항원은 구제역바이러스를 구성하는 구조단백질 VP1, VP2, VP3 및 VP4를 코딩하는 유전자와 비구조단백질인 3C 유전자를 적어도 포함하는 재조합베큘로바이러스를 숙주세포에 형질전환시켜 제조된 재조합 구제역 바이러스 구조단백질인 것을 특징으로 하는 구제역 진단 시약.
- 제 7 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 구제역 진단 시약을 포함하는 구제역 진단 키트.
- 고체상 지지체에 항원 포획을 위한 단클론항체를 고정시키는 단계;상기 고체상 지지체에 부착되지 않은 항체들을 세척하여 제거하는 단계;상기 고체상 지지체에 구제역 바이러스 진단용 항원을 반응시켜 고정시키는 단계;상기 고체상 지지체에 부착되지 않은 항원들을 세척하여 제거하는 단계; 및검출표지가 결합된 단클론항체를 고체상 지지체에 고정된 상기 구제역 바이러스 진단용 항원과 반응시키는 단계를 포함하고,상기 항원 포획을 위한 단클론항체는 구제역 바이러스 O형, A형 및 Asia 1형에 공통적인 면역반응성을 나타내는 단클론항체인 것을 특징으로 하는 구제역 바이러스 중화항체 검출방법.
- 제 16 항에 있어서,상기 검출표지가 결합된 단클론항체에 사용되는 단클론항체는 구제역 바이러스 O형 VP1 사이트 A에 대한 특이적인 면역반응성과 바이러스 중화능을 나타내는 단클론항체 또는 구제역 바이러스 A형 VP1 사이트 A에 대한 특이적인 면역반응성과 바이러스 중화능을 나타내는 단클론항체인 것을 특징으로 하는 구제역 바이러스 중화항체 검출방법.
- 제 17 항에 있어서,상기 구제역 바이러스 진단용 항원은 구조단백질 VP1, VP2, VP3 및 VP4를 코딩하는 유전자와 비구조단백질인 3C 유전자를 적어도 포함하는 재조합베큘로바이러스를 숙주세포에 형질전환시켜 제조된 재조합 구제역 바이러스 구조단백질인 것을 특징으로 하는 구제역 바이러스 중화항체 검출방법.
- 제 18 항에 있어서,상기 재조합 구제역 바이러스 구조단백질은,바이러스 역가가 측정된 구제역 바이러스를 대조군으로 하고, 상기 재조합 구제역 바이러스 구조단백질을 실험군으로 하여, 상기 재조합 구제역 바이러스 구조단백질의 항원활성도를 산출하여 정량적으로 첨가된 것을 특징으로 하는 구제역 바이러스 중화항체 검출방법.
- 제 18 항에 있어서,상기 재조합 구제역 바이러스 구조단백질은,상기 고체상 지지체에 상기 항원 포획을 위한 단클론항체를 고정시킨 다음, 대조군으로 바이러스 역가(T)가 측정된 구제역 바이러스 항원과 반응시켜 항원-항체 복합체를 형성하고, 상기 항원-항체 복합체에 상기 검출표지가 결합된 단클론항체를 반응시켜 상기 대조군의 검출결과값(P)을 측정하고,실험군으로 상기 바이러스 역가(T)가 측정된 구제역 바이러스 대신 상기 재조합 구제역 바이러스 구조단백질을 일정 희석배수로 희석하여, 상기 고체상 지지체에 상기 항원 포획을 위한 단클론항체를 고정시킨 다음, 상기 희석된 재조합 구제역 바이러스 구조단백질과 반응시켜 항원-항체 복합체를 형성하고, 상기 항원-항체 복합체에 상기 검출표지가 결합된 단클론항체를 반응시켜 상기 실험군의 검출결과값(S)을 측정한 다음,하기의 계산식으로부터 항원활성도(Tx)를 산출하여, 상기 재조합 구제역 바이러스 구조단백질의 희석배수에 따른 상기 항원활성도의 평균값으로부터 상기 재조합 구제역 바이러스 구조단백질의 유효 항원량을 정하여 첨가된 것을 특징으로 하는 구제역 바이러스 중화항체 검출방법.
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