CN113999293B - 一种特异性结合新型冠状病毒s蛋白的抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种特异性结合新型冠状病毒S蛋白的抗体及其应用，属于生物技术领域。本发明提供了一种抗原，所述抗原包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽，与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有80%以上同源性，且具有诱发针对SARS‑CoV‑2 S蛋白免疫反应功能的衍生多肽，和/或，与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有80%以上同源性，且具有诱发针对SARS‑CoV‑2 S蛋白免疫反应功能的衍生多肽；使用所述抗原对动物进行免疫可获得能够与SARS‑CoV‑2 S蛋白特异性结合的多克隆抗体。

Description

一种特异性结合新型冠状病毒S蛋白的抗体及其应用
技术领域
本发明涉及一种特异性结合新型冠状病毒S蛋白的抗体及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
新冠肺炎是由新型冠状病毒SARS-CoV-2引起的。SARS-CoV-2是目前已知的第七种可以感染人的冠状病毒。相较于SAR-CoV，SARS-CoV-2在人间的传播能力要强的多；且SARS-CoV-2感染人以后的潜伏期也要远远长于前者；研究还发现，SARS-CoV-2感染的患者的上呼吸道病毒载量高导致患者发病后即有最强传染性。SARS-CoV-2引起的肺炎在临床上主要表现为发热、干咳、乏力等；重症多发生呼吸困难，快速进展为急性呼吸窘迫综合征，脓毒症休克，甚至出现代谢性酸中毒和出凝血功能障碍等。
SARS-CoV-2是一种有囊膜的病毒，病毒粒子呈椭圆形，直径约60-140 nm；其基因组为一条单股的不分节段的正链RNA，大约30 knt，共编码四个结构蛋白，刺突糖蛋白（Spike，S）、包膜蛋白（envelope，E）、膜糖蛋白（membrane glycoprotein，M）、核衣壳（nucleocapsid，N）。
S蛋白是组成病毒粒表面有球棒状的突出部分，属于I型跨膜蛋白。以三聚体的形式突出于病毒粒子表面约20nm，可以被S酶分解为S1和S2两个功能单位。S1用来促进病毒结合到宿主细胞受体，宿主受体互作区（RBD区）与受体结合。这个区域可以与ACE2蛋白结合，如果结合完成，那么新型冠状病毒就会感染人呼吸道上皮细胞，进而导致肺炎。S蛋白是SARS-CoV-2的主要免疫原蛋白，免疫和感染机体后能产生特异性的中和抗体；其中和表位主要集中于RBD区域。M蛋白是通过三个跨膜结构域嵌入病毒包膜里；而E蛋白是典型的跨膜蛋白；N蛋白则以串珠的形式结合到RNA基因组上，形成螺旋对称的核衣壳。
目前尚无有效的治疗新冠肺炎的药物和方法。疫苗免疫被给予厚望。目前已经有诸多技术路线的新冠疫苗推进到了临床试验阶段。毫无疑问，新冠疫苗的核心免疫原是S蛋白，且免疫效果必然与S蛋白的数量和质量相关。因此，能够精准的量化S蛋白将是确保疫苗质量的关键，亟需开发一种能够准确测定SARS-CoV-2的S蛋白的方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种抗原，所述抗原包括：
（a）氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽；
（b）氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽；
（c）与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有80%以上同源性，且具有诱发针对SARS-CoV-2 S蛋白免疫反应功能的衍生多肽；
和/或，（d）与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有80%以上同源性，且具有诱发针对SARS-CoV-2 S蛋白免疫反应功能的衍生多肽。
在本发明的一种实施方式中，所述抗原由以下多肽组成：
（a）氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽；
和/或，（b）氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽。
在本发明的一种实施方式中，所述抗原上偶联有载体蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述载体蛋白与抗原不是来自同一个蛋白，所述载体蛋白包含至少一个T细胞表位，且所述载体蛋白可以增强抗原的免疫原性。
在本发明的一种实施方式中，所述载体蛋白为血蓝蛋白（Keyhole LimpetHemocyanin，KLH）、白喉毒素DT、白喉毒素的跨膜结构域DTT、轮状病毒VP7、利什曼原虫的热休克蛋白、空肠弯曲菌鞭毛蛋白、沙眼衣原体主要外膜蛋白、牛血清白蛋白（Bovine SerumAlbumin，BSA），鸡卵白蛋白（Ovalbumin，OVA）或纤维蛋白原。
在本发明的一种实施方式中，所述载体蛋白的至少一个分子表面氨基酸残基区通过拼接、替换和/或插入与抗原相偶联。
在本发明的一种实施方式中，所述分子表面氨基酸残基区包括loop区、beta-tum区、N末端或C末端。
在本发明的一种实施方式中，所述抗原截取自SARS-CoV-2的S蛋白。
本发明还提供了一种特异性结合SARS-CoV-2 S蛋白的抗体，所述抗体能够与上述抗原特异性结合。
在本发明的一种实施方式中，所述抗体为使用上述的抗原对动物进行免疫而得。
在本发明的一种实施方式中，所述抗体为多克隆抗体。
在本发明的一种实施方式中，所述动物为兔、鼠、羊或猴。
本发明还提供了一种定量测定SARS-CoV-2 S蛋白的检测试剂盒，所述检测试剂盒包含上述抗体。
在本发明的一种实施方式中，所述检测试剂盒为基于双抗体夹心法的酶联免疫检测试剂盒；所述酶联免疫检测试剂盒以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的抗原对动物进行免疫而得的抗体为包被抗体，以氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的抗原对动物进行免疫而得的抗体为检测抗体。
在本发明的一种实施方式中，所述包被抗体的使用浓度为4000倍稀释；所述检测抗体的使用浓度为4000倍稀释。
本发明还提供了一种定量测定SARS-CoV-2 S蛋白的方法，所述方法使用上述检测试剂盒对待测样本进行检测。
在本发明的一种实施方式中，所述待测样品为新冠疫苗样品、血液、唾液、尿液、粘膜液或粪便。
本发明还提供了上述抗体或上述检测试剂盒或上述方法在定量测定SARS-CoV-2S蛋白中的应用。
本发明技术方案，具有如下优点：
1、本发明提供了一种抗原，所述抗原包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽，与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有80%以上同源性，且具有诱发针对SARS-CoV-2 S蛋白免疫反应功能的衍生多肽，和/或，与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有80%以上同源性，且具有诱发针对SARS-CoV-2 S蛋白免疫反应功能的衍生多肽；使用所述抗原对动物进行免疫可获得能够与SARS-CoV-2 S蛋白特异性结合的多克隆抗体，其中，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的抗原和SEQ ID NO.2所示的抗原对动物进行免疫而得的血清的效价分别高达1:128万和1:64万。
2、本发明提供了一种定量测定SARS-CoV-2 S蛋白的检测试剂盒，所述检测试剂盒为基于双抗体夹心法的酶联免疫检测试剂盒；所述酶联免疫检测试剂盒以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的抗原对动物进行免疫而得的抗体为包被抗体，以氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的抗原对动物进行免疫而得的抗体为检测抗体；使用所述检测试剂盒对SARS-CoV-2 S蛋白进行定量测定具有特异性、重复性、稳定性的优势，其中，包被抗体和检测抗体的使用浓度为4000倍稀释时，检测效果最佳。
附图说明
图1：RBD-R1和RBD-R2的效价检测结果。
图2：RBD-R1-pab抗体和RBD-R2-pab抗体的Werstern-Blot结果。
图3：RBD-R1-pab抗体和RBD-R2-pab抗体的间接免疫荧光（IFA）结果。
图4：蔗糖密度梯度超速离心技术纯化SARS-CoV-2后的蛋白带。
图5：SARS-CoV-2病毒收获液经纯化前后的SDS-PAGE鉴定结果。
图6：新冠病毒SARS-CoV-2定量ELISA检测方法的标准曲线。
图7：新冠病毒SARS-CoV-2定量ELISA试剂盒对不同疫苗的特异性检测结果。
图8：新冠病毒SARS-CoV-2定量ELISA试剂盒的4℃稳定性验证结果。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
下述实施例中涉及的缓冲液如下：
PBS缓冲液：先取8.0g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4溶于800mL蒸馏水中，然后用HCl调节pH至7.4，最后加蒸馏水定容至1L，即得0.01M、pH 7.4的PBS缓冲液。
CBS缓冲液：先取1.59g Na2CO3、2.93g NaHCO3溶于800mL蒸馏水中，然后用HCl调节pH至9.6，最后加蒸馏水定容至1L，即得0.05M、pH 9.6的CBS缓冲液。
PBST缓冲液：取0.5mL吐温20溶于1000mL 0.01M、pH 7.4的PBS缓冲液中，即得PBST缓冲液。
TBST缓冲液：先取8.8g NaCl溶于800mL蒸馏水中，然后加入20mL 1M、pH 8.0的Tris-HCL和0.5mL吐温20，最后加蒸馏水定容至1L，即得TBST缓冲液。
下述实施例中涉及的SARS-CoV-2病毒收获液的制备过程如下：
单层Vero细胞的制备：将Vero细胞（购自美国ATCC）复苏至装满DMEM培养基（购自Gibco公司）的T25细胞瓶内，于37℃培养24h后，弃去旧培养基，更换新的DMEM培养基，继续于37℃培养7d，得到长满单层的Vero细胞；用DMEM培养基按照1:6的比例将长满单层的Vero细胞进行放大培养，直至从细胞瓶中放大至10层细胞工厂，细胞工厂内长满单层Vero细胞后用于新冠病毒接种；
新冠病毒病毒液的制备：取培养成致密单层的Vero细胞，废弃细胞上清，用PBS缓冲液冲洗3遍；将新冠病毒（由浙江省疾控中心分离，编号ZJ12）以0.001MOI的接种量接种至单层Vero细胞中，于37℃培养60min后，加入病毒维持液（MEM培养基，购自日本日水公司），于35℃继续培养4天；培养结束后进行收获，得到SARS-CoV-2病毒收获液，该SARS-CoV-2病毒收获液用于SARS-CoV-2标准品的制备。
下述实施例中涉及的新冠病毒灭活疫苗的制备过程如下：
新冠病毒灭活疫苗的制备：将SARS-CoV-2病毒收获液按1:4000（BPL:SARS-CoV-2病毒收获液=1:4000，v/v）加入BPL（β-丙内酯，购自SERVA公司）4℃灭活24 h，37℃水解2 h，得到经灭活的SARS-CoV-2病毒收获液；将经灭活的SARS-CoV-2病毒收获液，于8000rpm、500-800ml/min条件下离心澄清，得到经澄清的SARS-CoV-2病毒收获液；将经澄清的SARS-CoV-2病毒收获液于25000rpm、500mL/min下进行蔗糖密度梯度离心，得到经超离的SARS-CoV-2病毒疫苗原液；在经超离的SARS-CoV-2病毒疫苗原液中加入终浓度为2（v/v）%的人血白蛋白和终浓度为0.5mg/mL的氢氧化铝后，用PBS缓冲液稀释至蛋白含量为80μg/mL，得到新冠病毒灭活疫苗，该新冠病毒灭活疫苗用于Werstern-Blot检测以及SARS-CoV-2 S蛋白检测试剂盒的验证。
下述实施例中涉及的狂犬病毒灭活疫苗的制备过程如下：
细胞制备：将孵化9~11日龄的鸡胚（购自浙江立华公司），去头去内脏，使用剪刀剪成1.5mm3的组织块后，以5mL/枚鸡胚的添加量加入胰酶（购自Gibco公司），于37℃下消化20min，消化后进行吹打，制备成浓度为2.0×106个/mL的鸡胚成纤维细胞悬液；
细胞接种：将狂犬病毒疫苗株Flury（购自美国乔治亚大学）按照0.001MOI的接种量接种至细胞悬液中，再将细胞悬液以200mL/层的添加量加入到细胞工厂（购自美国赛默飞公司）中，于35℃下培养24h；
细胞换液：培养24h后，将细胞工厂中的病毒生长液导入废液罐中，用PBS缓冲液清洗细胞工厂，每层加液200mL，晃动清洗细胞表面后将液体导入废液罐，以上操作重复3遍；细胞表面清洗结束后，将病毒维持液（MEM培养基，购自日本日水公司）注入细胞工厂中，每层加液200mL，于35℃下培养3天；
收获：培养3天后，将细胞工厂中的病毒培养液导出进行第一次收获；第一次收获结束后，继续在细胞工厂中加入病毒维持液，每层加液200mL，于35℃下培养3天；培养3天后，将细胞转瓶中的病毒培养液导出进行第二次收获；将第一次收获得到的病毒培养液与第二次收获得到的病毒培养液合并，即得狂犬病毒病毒收获液；
后处理：将狂犬病毒病毒收获液于8000g、4℃下离心15min，得到经离心的狂犬病毒澄清液；将经澄清的狂犬病毒液用孔径为100KD的超滤膜包进行60倍浓缩过滤，得到经过滤的狂犬病毒浓缩液液；在经过滤的狂犬病毒浓缩液液中按1:4000（BPL:经过滤的狂犬病毒浓缩液=1:4000，v/v）加入BPL（β-丙内酯，购自SERVA公司）4℃灭活24 h，37℃水解2 h，得到经灭活的狂犬病毒灭活液；将经灭活的狂犬病毒液于8000g、500mL/min下进行蔗糖密度梯度离心后，得到狂犬病疫苗原液；在狂犬病疫苗原液中加入终浓度为2（v/v）%的人血白蛋白后，用PBS缓冲液稀释至蛋白含量为80μg/mL，得到狂犬病毒灭活疫苗，该狂犬病毒灭活疫苗用于SARS-CoV-2 S蛋白检测试剂盒的验证。
下述实施例中涉及的轮状病毒灭活疫苗样品制备过程如下：
单层Vero细胞的制备：将Vero细胞（购自ATCC）复苏至装满含8（v/v）%胎牛血清的DMEM培养基（购自Gibco）的T25细胞瓶内，于37℃培养24h后更换新的含8（v/v）%胎牛血清的DMEM培养基，继续于37℃培养7d，得到长满单层的Vero细胞；用含8（v/v）%胎牛血清的DMEM培养基按照1:6的比例将长满单层的Vero细胞进行传代培养，每隔7天传代1次，直至扩大到10层细胞工厂长满单层Vero细胞，用于轮状病毒接种；
轮状病毒的活化：取轮状病毒的病毒液1mL（CDC-9，购自美国CDC），在病毒液中加入终浓度15μg/mL的胰酶（购自Gibco公司）和终浓度为600μg/mL的氯化钙（购自Sigma公司）后，于37℃水浴锅活化1h；
轮状病毒的培养：弃去10层细胞工厂中的细胞上清液，加入DMEM培养基清洗Vero细胞3遍以去除血清；清洗结束后，将轮状病毒活化液以0.01MOI的添加量加入维持液中（含有15μg/mL胰酶的DMEM培养基），得到混合液；将混合液加入细胞工厂，每层加液200mL，于37℃培养4d；培养4d后，将脱落的细胞悬液收获并冻融3次，得到轮状病毒病毒收获液；
轮状病毒的后处理：将轮状病毒病毒收获液于8000g、4℃下离心15min后，用孔径为0.45μm的滤膜过滤，得到经过滤的轮状病毒病毒收获液；在经过滤的轮状病毒病毒收获液中按1:2000（BPL:经过滤的轮状病毒病毒收获液=1:4000，v/v）加入BPL（β-丙内酯，购自SERVA公司）4℃灭活24 h，37℃水解2 h，得到轮状病毒灭活液；用100 kD超滤膜包将轮状病毒灭活液浓缩到原体积的1/10后，于8000g、500mL/min下进行蔗糖密度梯度离心，得到轮状病毒疫苗原液；将轮状病毒疫苗原液用PBS缓冲液稀释至蛋白含量为20μg/mL后，以0.4mg/剂的添加量加入氢氧化铝佐剂（购自Croda），得到轮状病毒灭活疫苗，该轮状病毒灭活疫苗用于用于SARS-CoV-2 S蛋白检测试剂盒的验证。
下述实施例中涉及的腮腺炎减毒活疫苗的制备过程如下：
在狂犬病毒灭活疫苗制备方法的基础上，将毒株替换为腮腺炎疫苗株QS-F-SH2（保藏编号为保藏号CCTCC No:V201950），将收获步骤中的两次替换为三次收获，将离心步骤替换为固定离心力7000g、上样速度800mL/min、4℃下进行连续流离心，去除浓缩过滤、灭活、蔗糖密度梯度离心步骤，得到腮腺炎减毒活疫苗，该腮腺炎减毒活疫苗用于SARS-CoV-2S蛋白检测试剂盒的验证。
下述实施例中涉及的麻疹病毒减毒活疫苗的制备过程如下：
在腮腺炎减毒活疫苗制备方法的基础上，将毒株替换为麻疹疫苗株Schwarzy（购自美国乔治亚大学），其他步骤不变，得到麻疹病毒减毒活疫苗，该麻疹病毒减毒活疫苗用于SARS-CoV-2 S蛋白检测试剂盒的验证。
实施例1：SARS-CoV-2 S蛋白特异性抗体的制备、纯化和鉴定
1.1多肽合成及动物免疫
通过生物信息学手段对SARS-CoV-2的S蛋白进行分析，选择受体结合区域（RBD）区域的2段肽段393-448aa、449-521aa，分别依次标记为R1和R2，氨基酸序列见表1。
通过体外合成的方式，获得R1和R2两段多肽，并于N端通过交联剂偶联血蓝蛋白。体外合成及偶联均由南京金斯瑞公司完成。
将偶联血蓝蛋白的R1和R2分别免疫新西兰兔（雌性，体重2~3kg，购自上海杰思捷公司）。具体免疫程序为：分别于0 d、14 d和21 d共进行3次免疫，第28天采血并分离血清。首次免疫时用0.5mL PBS缓冲液将0.5mg多肽溶解，与等体积弗式完全佐剂（购自SIGMA公司）混合后，于新西兰兔背部皮下多点注射，免疫剂量为0.5mg/只。二、三次免疫时除了佐剂改用弗式不完全佐剂外，其余步骤一致。免疫程序结束后分离血清，其中，R1对应的血清记为RBD-R1，R2对应的血清记为RBD-R2。通过间接ELISA对RBD-R1和RBD-R2的效价进行检测，具体步骤如下：
（1）用CBS缓冲液稀释多肽浓度为10μg/mL，于酶标板中每孔加入100μL，4℃静置16h进行包被；静置结束后，使用PBST缓冲液洗板2次；洗板结束后，每孔加入200μL含3%（v/v）BSA（购自Biofroxx公司）的PBST缓冲液，于37℃封闭2h；
（2）用PBST缓冲液稀释血清，稀释倍数依次为1万、2万、4万、8万、16万、32万、64万、128万；以PBST缓冲液为阴性对照，将稀释后的血清于步骤（1）获得的酶标板板中每孔加入100 μL，37℃孵育1h；孵育结束后，使用PBST缓冲液洗涤4遍；洗涤结束后，每孔加入1:2000（HRP-羊抗兔IgG:PBS=1:2000，v/v）稀释的HRP-羊抗兔IgG（购自博士德生物工程有限公司）100μL，37℃孵育40min；孵育结束后，使用PBST缓冲液洗涤4遍；洗涤结束后，每孔加入TMB显色液（购自碧云天生物技术有限公司）100μL，37℃避光孵育15min；避光孵育结束后，每孔加入浓度为2mol/L的硫酸（购自国药试剂公司）溶液50 μL，置于酶标仪450nm读数。Cut off值取阴性对照A450值的2.1倍。
RBD-R1和RBD-R2的效价检测结果见图1。由图1可知，RBD-R1和RBD-R2的效价分别为1:128万和1:64万。
表1 各肽段氨基酸序列
Figure 918804DEST_PATH_IMAGE001
1.2抗体纯化及鉴定
将1.1获得的RBD-R1和RBD-R2使用亲和层析法进行纯化，得到RBD-R1-pab抗体和RBD-R2-pab抗体。纯化由南京金斯瑞公司完成。RBD-R1-pab抗体和RBD-R2-pab抗体均为多克隆抗体。
分别使用Werstern-Blot和间接免疫荧光（IFA）对纯化后的RBD-R1-pab抗体和RBD-R2-pab抗体进行鉴定。
其中，Werstern-Blot方法为：将新冠病毒灭活疫苗样品煮沸变性后进行SDS-PAGE电泳；转膜后用5%（w/v，g/100mL）脱脂奶粉（购自内蒙古伊利实业集团股份有限公司）水溶液封闭2h；封闭结束后，将膜分别转移到1:4000稀释的RBD-R1-pab抗体（RBD-R1-pab:TBST=1:4000，v/v）和RBD-R2-pab抗体（RBD-R2-pab:TBST=1:4000，v/v）中，37°孵育1h；孵育结束后，使用TBST缓冲液洗膜4次；洗膜结束后，将膜转移到1:3000稀释的HRP-羊抗兔IgG（HRP-羊抗兔IgG:TBST=1:2000，v/v）中，37°孵育40min；孵育结束后，使用TBST缓冲液洗膜4次；洗膜结束后，使用显色液（购自碧云天生物工程有限公司）显色并拍照。Werstern-Blot结果如图2所示。
间接免疫荧光（IFA）方法为：将浓度为2*105cell/ml的Vero-E6细胞悬液（Vero-E6细胞购自ATCC，培养基为购自Gibco的MEM培养基）以每孔100µL的接种量提前铺板至96孔细胞培养板后，于37℃培养至细胞长满单层；培养结束后，于P3环境将新冠病毒（由浙江省疾控中心分离，编号ZJ12）以MOI=0.01的接种量接种至Vero-E6细胞中进行培养；培养18h后，用80（v/v）%丙酮水溶液（购自国药试剂公司）于-20℃固定20min；固定结束后，吸弃丙酮并吹干；吹干后，每孔加入1:400稀释的RBD-R1-pab抗体（RBD-R1-pab:PBS=1:400，v/v）和RBD-R2-pab抗体（RBD-R2-pab:PBS=1:400，v/v）100μL，37℃孵育60min；孵育结束后，使用PBS缓冲液洗板3次；洗板结束后，每孔加入1:400（FITC-羊抗兔IgG:PBS=1:400，v/v）稀释的FITC-羊抗兔IgG（购自博士德生物公司）100μL，37℃避光孵育40min；孵育结束后，使用PBS缓冲液洗板3次；洗板结束后，荧光显微镜观察。间接免疫荧光（IFA）结果如图3所示。
由图2可知，RBD-R1-pab抗体和RBD-R2-pab抗体均识别约170kd大小的条带，与SARS-COV-2 S蛋白单体大小基本一致，说明RBD-R1-pab抗体和RBD-R2-pab抗体均识别S蛋白。
由图3可知，RBD-R1-pab抗体和RBD-R2-pab抗体均为阳性可见病毒荧光灶，阴性对照成立，表明RBD-R1-pab抗体和RBD-R2-pab抗体均可与SARS-COV-2特异性结合。
实施例2：SARS-CoV-2 S蛋白特异性抗体的应用
1、SARS-CoV-2 S蛋白检测方法的建立
1.1 SARS-CoV-2标准品的制备
为了确保检测结果能够量化，先制备SARS-CoV-2标准品。
SARS-CoV-2标准品的制备方法如下：取病毒滴度为6.5 lgCCID50/mL的SARS-CoV-2病毒收获液5 L，按1:4000（BPL:病毒收获液=1:4000，v/v）加入1.25 mL的BPL（β-丙内酯，购自SERVA公司）4℃灭活24 h，37℃水解2 h，然后用连续流离心机澄清，澄清参数为700 mL/min，离心力为8000 g，得到病毒澄清液；将病毒澄清液用100 kD中空纤维将病毒液浓缩到原体积的1/100，通过蔗糖密度梯度超速离心技术纯化病毒，蔗糖水溶液的浓度梯度分别为30%、40%、50%和60%（m/v，g/100mL），转速为30000 rpm，离心2 h；离心结束后，取30~40%蔗糖溶液分界面的蛋白带（具体可见图4），用100 kD截留量的超滤管浓缩除糖，得到SARS-CoV-2标准品；将SARS-CoV-2标准品分装冻存于-80度。
将SARS-CoV-2病毒收获液和SARS-CoV-2标准品通过SDS-PAGE鉴定。SDS-PAGE鉴定结果如图5所示。
由图5可知，SARS-CoV-2病毒收获液中宿主蛋白等杂蛋白含量较多，而SARS-CoV-2病毒收获液纯化而得的SARS-CoV-2标准品中的主要宿主蛋白均已被去除。
使用Lowrry法（药典三部）测得SARS-CoV-2标准品中的蛋白含量为12µg/mL。定义SARS-CoV-2标准品中抗原含量（S）质量与活性单位的换算关系为10ng=1EU，则SARS-CoV-2标准品中抗原含量为1200EU/mL。
检测方法抗体使用浓度的确定
为了筛选出RBD-R1-pab抗体和RBD-R2-pab抗体的使用浓度，将RBD-R1-pab作为包被抗体，将HRP标记后的RBD-R2-pab作为检测抗体，通过方阵滴定对两者最佳使用浓度进行了摸索。HRP标记由南京金斯瑞公司完成。摸索过程如下：
（1）用CBS缓冲液将包被抗体分别稀释1000、2000、4000、6000倍后，以每孔100μL的添加量加入酶标板中，4℃孵育16h；孵育结束后，使用PBST缓冲液洗板2次；洗板结束后，每孔加入200μL含1%（v/v）BSA的PBST缓冲液，于37℃封闭2h；封闭结束后，拍干酶标板中的液体；拍干结束后，以PBST缓冲液作为阴性对照，每孔加入1:10稀释的1.1获得的SARS-CoV-2标准品（标准品:PBST=1:10，v/v）100μL；
（2）用PBST缓冲液稀释检测抗体，稀释倍数依次为1000、2000、4000、6000、8000、10000；将稀释后的检测抗体于步骤（1）获得的酶标板板中每孔加入100 μL，37℃孵育40min；孵育结束后，使用PBST缓冲液洗涤4遍；洗涤结束后，每孔加入TMB显色液（购自碧云天生物公司）100μL，37℃避光孵育15min；避光孵育结束后，每孔加入浓度为2mol/L的硫酸溶液50 μL，置于酶标仪450nm读数。检测结果如表2所示。
从表2中可以看出，RBD-R1-pab抗体的稀释比例为1:4000，HRP标记的RBD-R2-pab抗体的稀释比例1:4000时，阳性孔A450与阴性孔A450的比值（P/N值，阳性值与阴性值之比）最大（1.48/0.074=20），表明此时RBD-R1-pab抗体和RBD-R2-pab抗体的使用浓度为最佳。
表2 方阵滴定摸索抗体使用浓度
Figure 367103DEST_PATH_IMAGE002
1.3 SARS-CoV-2 S蛋白的ELISA检测（定量检测）
（1）包被：用CBS缓冲液将包被抗体（RBD-R1-pab）稀释4000倍后，以每孔100μL的添加量加入酶标板中，4℃孵育16h；孵育结束后，使用PBST缓冲液洗板2次；
（2）封闭：将含1%（v/v）BSA的PBST缓冲液以每孔200μL的添加量加入步骤（1）获得的酶标板中，于37℃封闭2h后弃去孔内液体；
（3）加样：用含10（v/v）%山羊血清的PBST缓冲液将1.1获得的SARS-CoV-2标准品及待检样品稀释到不同倍数后，以每孔100μL的添加量加入步骤（2）获得的酶标板中，37℃孵育1h；孵育结束后，使用PBST缓冲液洗涤4次；
（4）加酶标抗体：用含1%（v/v）BSA的PBST缓冲液将检测抗体（HRP标记后的RBD-R2-pab）稀释至4000倍后，以每孔100μL的添加量加入步骤（3）获得的酶标板中，37℃避光孵育30min；孵育结束后，使用PBST缓冲液洗涤4次；
（5）显色：将TMB显色液（购自碧云天生物公司）以每孔100μL的添加量加入步骤（4）获得的酶标板中，37℃避光孵育15min；
（6）终止：将浓度为2mol/L的硫酸溶液以每孔50 μL的添加量加入步骤（5）获得的酶标板中，置于酶标仪450nm读数；
（7）计算：以不同稀释倍数的SARS-CoV-2标准品测得的吸光度值为X轴，不同稀释倍数的SARS-CoV-2标准品对应的S蛋白含量（SARS-CoV-2标准品中S蛋白含量见1.1）为Y轴作散点图，进行二项式回归（添加趋势线获得），得回归方程Y=aX2+bX+c；回归方程中，a=1.5045，b=10.874，c=-1.1744，相关系数R2>0.99。标准曲线如图6所示。将待检样品的吸光度值带入回归方程即可计算得到待测样本中S蛋白的含量。
、SARS-CoV-2 S蛋白检测试剂盒的验证（特异性、重复性、稳定性）
依据1.3中的检测方法，将所用到的各试剂包装成试剂盒。试剂盒包括1.1中的标准品、预包被RBD-R1-pab的酶标板、样品稀释液(含10（v/v）%山羊血清的PBST）、酶标液（溶液含1：4000稀释的HRP标记RBD-R2-pab，稀释液为含1%（v/v）BSA的PBST）、洗涤液（PBST）、TMB显色液、终止液（2mol/L的硫酸溶液）。为了验证试剂盒的特异性，分别对新冠病毒灭活疫苗、狂犬病毒灭活疫苗、轮状病毒灭活疫苗、腮腺炎病毒灭活疫苗、麻疹病毒减毒活疫苗这几种常见人用疫苗样品及Vero细胞上清、PBS缓冲液进行检测，检测结果如图7所示；其中，检测具体步骤为：
（1）加样：用样品稀释液将标准品和样品稀释到不同倍数后，以每孔100μL的添加量加入酶标板中，37℃孵育1h；孵育结束后，使用PBST缓冲液洗涤4次；
（2）加酶标抗体：将酶标液以每孔100μL的添加量加入步骤（1）获得的酶标板中，37℃避光孵育30min；孵育结束后，使用PBST缓冲液洗涤4次；
（3）显色：将TMB显色液以每孔100μL的添加量加入步骤（2）获得的酶标板中，37℃避光孵育15min；
（4）终止：将浓度为2mol/L的硫酸溶液以每孔50 μL的添加量加入步骤（3）获得的酶标板中，置于酶标仪450nm读数；
（5）分析：根据吸光度A450值分析试剂盒对各样品的特异性。
从图7中可以看出，检测试剂盒对新冠疫苗样品有良好特异性反应，能够准确用于以S蛋白作为抗原的新冠SARS-CoV-2灭活疫苗的检测。
为了验证检测试剂盒的重复性，对3个不同浓度的SARS-CoV-2灭活疫苗原液样品（检测对象为三个不同批次的SARS-CoV-2灭活疫苗原液）分别进行6次的平行检测，结果如表3显示。
从表3中可以看出，检测试剂盒对同一样品检测值的变异系数（CV）均低于15%，说明试剂盒有良好的重复性。
为了验证试剂盒的稳定性，将同一批制备的试剂盒置于4℃保存，并分别于不同的时间点（第0 d、30 d、60 d、120 d、150 d和180 d）取出，取出后，对1.1获得的SARS-CoV-2标准品进行检测，检测结果如图8所示。
从图8中可以看出，随时试剂盒在4℃放置时间的延长，对标准品的检测吸光度值并没有显著的变化，检测结果具有良好的重现性。以上结果说明，试剂盒在4℃条件下能够较长时间的储存而不明显影响检测结果，稳定性良好。
表3 SARS-CoV-2定量ELISA的检测结果重复性（单位Eu/mL）
Figure 412420DEST_PATH_IMAGE003
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 北京赛尔富森生物科技有限公司
<120> 一种特异性结合新型冠状病毒S蛋白的抗体及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 56
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg
1 5 10 15
Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys
20 25 30
Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn
35 40 45
Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
50 55
<210> 2
<211> 73
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
1 5 10 15
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
20 25 30
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
35 40 45
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
50 55 60
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro
65 70

Claims (4)

1.一种抗原，其特征在于，所述抗原由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽组成。
2.权利要求1所述的抗原在制备特异性结合SARS-CoV-2 S蛋白的抗体中的应用。
3.权利要求1所述的抗原在制备定量测定SARS-CoV-2 S蛋白的检测试剂盒中的应用。
4.权利要求1所述的抗原在定量测定SARS-CoV-2 S蛋白中的非疾病的诊断和治疗方面的应用。
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