CN111537711B

CN111537711B - 一种快速准确检测腺病毒3型的试剂盒及其制备方法

Info

Publication number: CN111537711B
Application number: CN202010352506.4A
Authority: CN
Inventors: 王玲
Original assignee: BEIJING BEIER BIOENGINEERING CO LTD
Current assignee: BEIJING BEIER BIOENGINEERING CO LTD
Priority date: 2020-04-28
Filing date: 2020-04-28
Publication date: 2021-02-05
Anticipated expiration: 2040-04-28
Also published as: CN111537711A

Abstract

本发明实施例涉及体外检测领域，具体涉及一种快速准确检测腺病毒3型的试剂盒及其制备方法。本发明实施例提供的试剂盒包括：IgM抗体酶标工作液，IgA抗体酶标工作液，IgG抗体酶标工作液，所述IgG抗体酶标工作液包括过氧化物酶标记的抗人IgG抗体，和，包被腺病毒3型重组抗原的酶标板；其中，所述腺病毒3型重组抗原包括重组抗原A、重组抗原B或重组抗原C中的一种或多种。本发明提供的试剂盒(酶联免疫法)弥补了市面上的这一空白；并通过分别检测人血清或血浆中的腺病毒3型IgM、IgG和IgA抗体，将检测结果综合考虑，检测结果相互间形成互补，可靠性高，特异性好，灵敏度高；并可与核酸检测形成互补，适用于临床诊断和流行病学调查。

Description

一种快速准确检测腺病毒3型的试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及体外检测领域，具体涉及一种快速准确检测腺病毒3型的试剂盒及其制备方法。

背景技术

腺病毒(Adenovirus，ADV)是一群分布十分广泛的DNA病毒，是引起人类呼吸道和消化道感染的重要病原之一。病毒感染主要是经上呼吸道和眼结膜侵入人体，引起急性咽炎、流行性角膜结膜炎或病毒性原发性非典型肺炎，已成为暴发流行的常见病原体，尤其对免疫力低下患者。而最常见的分离物是腺病毒1-8型、40型和41型。其中，腺病毒3型和7型是引起人类急性呼吸道感染的常见病原，在我国广泛流行。近年来在我国腺病毒3型和7型引起的疫情时有发生，病例报告的人数和平均发病率有逐年增高的趋势。由于腺病毒3型和7型具有高度传染性，发病率高，并在儿童群体中容易爆发，对儿童和青少年的健康影响严重。因此，对腺病毒进行分型检测对早期预防具有重要意义。

腺病毒的临床检测主要依据三个方面：一是临床表现，二是血清学证据，三是病原学证据。由于腺病毒感染后能引起多系统的病变，且临床的表现也呈多样性，因此腺病毒的血清学检测和病原学检测是目前最主要的依据。可采用组织培养试验、免疫学试验以及分子生物学方法分别进行腺病毒检测。但这些方法普遍操作复杂，准确性低。快速、准确诊断腺病毒感染，是采取积极有效措施防止感染蔓延的重要途径，因此，寻找特异性好、敏感性高的检测方法具有重要意义。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

发明目的

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种快速准确检测腺病毒3型的试剂盒及其制备方法。目前市面上并没有腺病毒3型检测试剂盒(酶联免疫法)，本发明提供的腺病毒3型抗体检测试剂盒(酶联免疫法)弥补了这一空白；通过分别检测人血清或血浆中的腺病毒3型IgM、IgG和IgA抗体，并将检测结果综合考虑，检测结果相互间形成互补，综合结果的可靠性高，特异性好，灵敏度高；通过对部分临床已确诊为腺病毒3型感染阳性(但PCR核酸检测阴性的)患者血样进行复检，该试剂盒组合能检出相当部分阳性，提示可与核酸检测形成互补，适用于临床诊断；且酶联免疫法对实验室要求不高，试验反应时间短，可以对大批量标本进行集中检测，适用于腺病毒流行病学调查。

解决方案

为实现本发明目的，本发明实施例提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：

IgM抗体酶标工作液，所述IgM抗体酶标工作液包括过氧化物酶标记的抗人IgM抗体，

IgA抗体酶标工作液，所述IgA抗体酶标工作液包括过氧化物酶标记的抗人IgA抗体，

IgG抗体酶标工作液，所述IgG抗体酶标工作液包括过氧化物酶标记的抗人IgG抗体，

和，包被腺病毒3型重组抗原的酶标板；

其中，所述腺病毒3型重组抗原包括重组抗原A、重组抗原B或重组抗原C中的一种或多种；

所述重组抗原A的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述重组抗原B的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述重组抗原C的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明提供的腺病毒3型抗体检测试剂盒，包括IgM抗体酶标工作液、IgG抗体酶标工作液和IgA抗体酶标工作液，分别使用各酶标工作液配合包被腺病毒3型重组抗原的酶标板检测人血清或血浆中的腺病毒3型IgM、IgG和IgA抗体，并将检测结果综合考虑，检测结果相互间可形成互补，综合结果的可靠性高，特异性好，灵敏度高。

所述腺病毒3型抗原用于与待测样本中的抗腺病毒3型抗体反应。重组抗原A来源于腺病毒六邻体蛋白的Arg109-Phe577区段，重组抗原B来源于腺病毒六邻体蛋白的Phe228-Lys557区段，重组抗原C来源于腺病毒六邻体蛋白的Gly128-Ser467区段。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，抗人IgM抗体包括鼠抗人IgM抗体、兔抗人IgM抗体或羊抗人IgM抗体中的一种或多种；可选地为鼠抗人IgM抗体。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，抗人IgG抗体包括鼠抗人IgG抗体、兔抗人IgG抗体或羊抗人IgG抗体中的一种或多种；可选地为鼠抗人IgG抗体。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，抗人IgA抗体包括鼠抗人IgA抗体、兔抗人IgA抗体或羊抗人IgA抗体中的一种或多种；可选地为鼠抗人IgA抗体。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，编码重组抗原A的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，编码重组抗原B的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，编码重组抗原C的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，所述腺病毒3型重组抗原为重组抗原A。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，IgM抗体酶标工作液还包括下述组分：氯化钠，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，CaSein，ProCLin300；可选地，IgM抗体酶标工作液包括下述终浓度的组分：氯化钠5-10g/L，磷酸氢二钠2-4g/L，磷酸二氢钠0.1-0.4g/L，CaSein1-3g/L，ProCLin300 0.2-0.8ml/L，和过氧化物酶标记的抗人IgM抗体0.5-2mg/L；进一步可选地，IgM抗体酶标工作液包括下述终浓度的组分：氯化钠8g/L，磷酸氢二钠2.9g/L，磷酸二氢钠0.2g/L，CaSein 2g/L，ProCLin300 0.5ml/L，和过氧化物酶标记的抗人IgM抗体1mg/L。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，IgA抗体酶标工作液还包括下述组分：氯化钠，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，CaSein，ProCLin300；可选地，IgA抗体酶标工作液包括下述终浓度的组分：氯化钠5-10g/L，磷酸氢二钠2-4g/L，磷酸二氢钠0.1-0.4g/L，CaSein1-3g/L，ProCLin300 0.2-0.8ml/L，和过氧化物酶标记的抗人IgA抗体0.5-2mg/L；进一步可选地，IgA抗体酶标工作液包括下述终浓度的组分：氯化钠8g/L，磷酸氢二钠2.9g/L，磷酸二氢钠0.2g/L，CaSein 2g/L，ProCLin300 0.5ml/L，和过氧化物酶标记的抗人IgA抗体1mg/L。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，IgG抗体酶标工作液还包括下述组分：氯化钠，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，CaSein，ProCLin300；可选地，IgG抗体酶标工作液包括下述终浓度的组分：氯化钠5-10g/L，磷酸氢二钠2-4g/L，磷酸二氢钠0.1-0.4g/L，CaSein1-3g/L，ProCLin300 0.2-0.8ml/L，和过氧化物酶标记的抗人IgG抗体0.5-2mg/L；进一步可选地，IgG抗体酶标工作液包括下述终浓度的组分：氯化钠8g/L，磷酸氢二钠2.9g/L，磷酸二氢钠0.2g/L，CaSein 2g/L，ProCLin300 0.5ml/L，和过氧化物酶标记的抗人IgG抗体1mg/L。

辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgM(IgM-HRP)或鼠抗人IgA(IgA-HRP)或鼠抗人IgG抗体(IgG-HRP)为本领域常规产品，本领域通用的标记比例为1mgHRP上标记2mg鼠抗人IgM或鼠抗人IgA或鼠抗人IgG抗体。本发明试剂盒中，IgM-HRP的终浓度以IgM的质量计，即“IgM-HRP 0.5-2mg/L”指以IgM的质量计，酶标工作液中IgM-HRP的终浓度为0.5-2mg/L。IgA-HRP、IgG-HRP的终浓度同理。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，包被腺病毒3型重组抗原的酶标板中，每孔包被腺病毒3型重组抗原0.05-0.3μg；可选地，每孔包被腺病毒3型重组抗原0.1μg。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，所述试剂盒还包括底物液A、底物液B、终止液、浓缩洗涤液、标本稀释液、阳性对照、阴性对照。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，底物液A包括下述组分：无水乙酸钠，吐温20，柠檬酸钠，柠檬酸，乙酸，双氧水和过氧化钠；可选地，底物液A包括下述终浓度的组分：无水乙酸钠10-20g/L，吐温20 50-70mL/L，柠檬酸钠5-10g/L，柠檬酸8-15g/L，乙酸1.0-1.5mL/L，双氧水0.8-1.2mL/L和过氧化钠0.01-0.02g/L；进一步可选地，底物液A包括下述终浓度的组分：无水乙酸钠15g/L，吐温20 60mL/L，柠檬酸钠8g/L，柠檬酸10g/L，乙酸1.25mL/L，双氧水1mL/L和过氧化钠0.015g/L。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，底物液B包括下述组分：TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)，二甲基亚砜，盐酸，甘油和硫代硫酸钠；可选地，底物液B包括下述终浓度的组分：TMB 0.8-1.5g/L，二甲基亚砜4-7mL/L，盐酸1-3mL/L，甘油40-60mL/L和硫代硫酸钠8-12g/L；进一步可选地，底物液B包括下述终浓度的组分：TMB 1g/L，二甲基亚砜5mL/L，盐酸2mL/L，甘油50mL/L和硫代硫酸钠10g/L。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，终止液包括硫酸；可选地，所述终止液包括下述终浓度的组分：质量浓度为95-98％的硫酸60ml/L。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，浓缩洗涤液包括下述组分：氯化钠，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠和吐温20；可选地，浓缩洗涤液包括下述终浓度的组分：氯化钠70-80g/L，磷酸氢二钠45-55g/L，磷酸二氢钠3-5g/L，吐温20 8-15ml/L；进一步可选地，浓缩洗涤液包括下述终浓度的组分：氯化钠75g/L，磷酸氢二钠50g/L，磷酸二氢钠4g/L，吐温20 10ml/L。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，标本稀释液包括下述组分：氯化钠，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，CaSein和ProCLin300；可选地，标本稀释液包括下述终浓度的组分：氯化钠5-10g/L，磷酸氢二钠2-4g/L，磷酸二氢钠0.1-0.4g/L，CaSein 1-3g/L和ProCLin3000.2-0.8ml/L；进一步可选地，标本稀释液包括下述组分：氯化钠8g/L，磷酸氢二钠2.9g/L，磷酸二氢钠0.2g/L，CaSein 2g/L和ProCLin300 0.5ml/L。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，阳性对照包括下述组分：腺病毒3型抗体；可选地，阳性对照包括下述终浓度的组分：腺病毒3型抗体1-5mg/L；进一步可选地，阳性对照包括下述终浓度的组分：腺病毒3型抗体2mg/L。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，阴性对照包括下述组分：腺病毒阴性血清；可选地，阴性对照包括下述终浓度的组分：腺病毒阴性血清50-200ml/L；进一步可选地，阴性对照包括下述终浓度的组分：腺病毒阴性血清100ml/L。

本发明实施例还提供了利用上述试剂盒中的原料制备腺病毒3型抗体检测试剂盒的制备方法。

上述制备方法在一种可能的实现方式中，底物液A的制备方法包括下述步骤：按上述比例称取各组分，分别溶于蒸馏水中，定容，即得；底物液B的制备方法包括下述步骤：按上述比例称取各组分，分别溶于蒸馏水中，定容，即得；终止液的制备方法包括下述步骤：按上述比例称取各组分，分别溶于蒸馏水中，定容，即得；浓缩洗涤液的制备方法包括下述步骤：按上述比例称取各组分，分别溶于蒸馏水中，定容，即得；标本稀释液的制备方法包括下述步骤：按上述比例称取各组分，分别溶于蒸馏水中，定容，即得；酶标工作液的制备方法包括下述步骤：按上述比例称取各组分，分别溶于蒸馏水中，定容，即得。

上述制备方法在一种可能的实现方式中，阳性对照的制备方法包括下述步骤：配制所述浓度的腺病毒3型抗体，即得。

上述制备方法在一种可能的实现方式中，阴性对照的制备方法包括下述步骤：配制所述浓度的腺病毒阴性血清，即得。

上述制备方法在一种可能的实现方式中，包被腺病毒3型重组抗原的酶标板的制备方法包括下述步骤：按上述比例取腺病毒3型重组抗原，溶于包被稀释液中，然后按照0.05-0.3μg/孔的量将腺病毒3型重组抗原分装在酶标板板孔内，37℃条件下2小时后封闭干燥，即得；所述包被稀释液包括下述终浓度的组分：无水碳酸钠1-2g/L，碳酸氢钠2.5-3.5g/L。

本发明实施例还提供了上述试剂盒的使用方法，所述使用方法包括下述步骤：

将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水稀释得洗涤液；

在酶标板的反应孔中加入阴性对照，阳性对照，不加标本稀释液；其他反应孔中加入标本稀释液和待检标本；洗涤液洗板，拍干；每孔中分别加入IgM抗体酶标工作液，洗涤液洗板，拍干；每孔依次加入底物液A、底物液B，混匀，37℃避光显色；每孔加入终止液；用酶标仪双波长450nm和630nm测定各孔A值；

在酶标板的反应孔中加入阴性对照，阳性对照，不加标本稀释液；其他反应孔中加入标本稀释液和待检标本；洗涤液洗板，拍干；每孔中分别加入IgG抗体酶标工作液，洗涤液洗板，拍干；每孔依次加入底物液A、底物液B，混匀，37℃避光显色；每孔加入终止液；用酶标仪双波长450nm和630nm测定各孔A值；

在酶标板的反应孔中加入阴性对照，阳性对照，不加标本稀释液；其他反应孔中加入标本稀释液和待检标本；洗涤液洗板，拍干；每孔中分别加入IgA抗体酶标工作液，洗涤液洗板，拍干；每孔依次加入底物液A、底物液B，混匀，37℃避光显色；每孔加入终止液；用酶标仪双波长450nm和630nm测定各孔A值。

有益效果

(1)腺病毒感染后可检出IgM、IgA和IgG抗体；IgG抗体持续时间最长，量最多；约70％的急性感染患者(包括2岁以内的婴幼儿)会产生较高的IgA抗体滴度；IgM抗体是免疫应答中最先产生的抗体，存在时间短，IgM抗体提示急性期感染。三种抗体的检测均具有重要意义。

本发明的检测原理为：使用腺病毒3型重组抗原包被酶标板，加入待检样本，样本中的抗腺病毒3型抗体与酶标板上的腺病毒3型抗原反应，再与辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgM结合，通过免疫反应形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，该复合物与底物液中的TMB发生反应显色，显色强度与样本中腺病毒3型抗体的含量成正比。通过酶标仪检测吸光度(A值)从而判定样品中是否存在腺病毒3型抗体。IgG抗体和IgA抗体的检测同理。

目前市面上并没有腺病毒3型检测试剂盒(酶联免疫法)，本发明提供的腺病毒3型抗体检测试剂盒(酶联免疫法)弥补了这一空白；通过对部分临床已确诊为腺病毒3型感染阳性(但PCR核酸检测阴性的)患者血样进行复检，该试剂盒组合能检出相当部分阳性，提示可与核酸检测形成互补，适用于临床诊断；且酶联免疫法对实验室要求不高，试验反应时间短，可以对大批量标本进行集中检测，适用于腺病毒流行病学调查。

(2)本发明实施例中提供的试剂盒，特别选择了重组抗原A、重组抗原B和重组抗原C，灵敏度高，特异性好，效果优于市售腺病毒3型细胞培养抗原。

腺病毒为无外壳的双链DNA病毒，属腺病毒科，基因组全长34.7kb，衣壳呈规则的20面体结构，直径80-100nm。核心由双股DNA及蛋白质组成，外有核壳，上有252个颗粒，由240个六邻体和12个五联体组成。六邻体蛋白上具有多种表位，是用作抗原研制腺病毒抗体检测试剂的理想蛋白。

进一步选择发现，使用重组抗原A的试剂盒灵敏度最好，可以为建立快速准确检测腺病毒3型感染的方法提供更好的技术支持。

(3)本发明实施例中提供的试剂盒，对试剂盒的各组分(如底物液A、底物液B、终止液、浓缩洗涤液、标本稀释液、阳性对照、阴性对照等)进行了特定选择，特定组成的各组分与酶标工作液和包被腺病毒3型重组抗原的酶标板搭配使用，进一步提高了腺病毒3型检测的灵敏度、特异性和准确性。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

下述实施例和对比例中：

1.所用的重组抗原A为人腺病毒(Human adenovirus，HADV)3型六邻体蛋白的Arg109-Phe577区段，无突变修饰，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；其通过下述方法制备得到：

针对大肠杆菌表达偏好密码子对其进行密码子优化，得到编码重组抗原A的基因序列，如SEQ ID NO.4所示；按照pET28a(+)载体的多克隆位点序列信息，在重组抗原A的基因序列的上游设计NcoI酶切位点，下游加上6个组氨酸、终止密码子及XhoI酶切位点，化学合成，克隆至原核表达载体pET28a(+)中，转化大肠埃希菌BL21(DE3)，然后将含有重组抗原A基因的大肠杆菌菌株在LB中培养过夜，A600值为0.6-0.9时加入IPTG诱导4小时收集菌体，用含0.1％Tritonx-100的20mmTris(pH8.0)收集菌体；超声后高速离心收集上清进行亲和层析和离子交换层析，分离及收集纯化蛋白抗原，-20℃保存备用。

2.所用的重组抗原B为人腺病毒(Human adenovirus，HADV)3型六邻体蛋白的Phe228-Lys557区段，无突变修饰，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；其通过下述方法制备得到：

针对大肠杆菌表达偏好密码子对其进行密码子优化，得到编码重组抗原B的基因序列，如SEQ ID NO.5所示；按照pET28a(+)载体的多克隆位点序列信息，在重组抗原B的基因序列的上游设计NcoI酶切位点，下游加上6个组氨酸、终止密码子及XhoI酶切位点，化学合成，克隆至原核表达载体pET28a(+)中，转化大肠埃希菌BL21(DE3)，然后将含有重组抗原B基因的大肠杆菌菌株在LB中培养过夜，A600值为0.6-0.9时加入IPTG诱导4小时收集菌体，用含0.1％Tritonx-100的20mmTris(pH8.0)收集菌体；超声后高速离心收集上清进行亲和层析和离子交换层析，分离及收集纯化蛋白抗原，-20℃保存备用。

3.所用的重组抗原C为人腺病毒(Human adenovirus，HADV)3型六邻体蛋白的Gly128-Ser467区段，无突变修饰，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；其通过下述方法制备得到：

针对大肠杆菌表达偏好密码子对其进行密码子优化，得到编码重组抗原C的基因序列，如SEQ ID NO.6所示；按照pET28a(+)载体的多克隆位点序列信息，在重组抗原C的基因序列的上游设计NcoI酶切位点，下游加上6个组氨酸、终止密码子及XhoI酶切位点，化学合成，克隆至原核表达载体pET28a(+)中，转化大肠埃希菌BL21(DE3)，然后将含有重组抗原C基因的大肠杆菌菌株在LB中培养过夜，A600值为0.6-0.9时加入IPTG诱导4小时收集菌体，用含0.1％Tritonx-100的20mmTris(pH8.0)收集菌体；超声后高速离心收集上清进行亲和层析和离子交换层析，分离及收集纯化蛋白抗原，-20℃保存备用。

4.所用的阳性对照腺病毒3型抗体通过下述步骤制备得到：

免疫动物的选择：兔，大耳白，2.5kg左右；

重组抗原A免疫用量：1mg/只；初次免疫用完全福氏佐剂乳化抗原，二次免疫和三次免疫用不完全福氏佐剂乳化；

抗原免疫方法：背部皮下多点注射；

免疫间隔：初免与二免间隔2周，二免和三免间隔3周；二免后7天检测效价；

检测方法：取兔子耳血用PBS稀释不同的浓度进行检测(1000倍、2000倍、4000倍、8000倍、16000倍、32000倍、64000倍)，使用腺病毒3型重组抗原A包被酶标板(0.1ug/孔)，加入稀释后的兔抗血清，37℃反应30分钟后洗板加入羊抗鼠IgG-HRP(供应商：武汉雁达；货号：A011E)，37℃反应30分钟后加入TMB显色，最后使用酶标仪读取吸光度A值，兔抗血清8000倍稀释后检测A值大于1.8合格；

采血方式：颈动脉放血。

腺病毒3型抗体血清的分离：血液放置室温中凝固1小时，然后置4℃过夜；在4℃条件下12000rpm离心20min，取上清液分装，冻存。

腺病毒3型抗体浓度的测定：使用紫外分光光度计检测抗体血清A280的吸光度值，按照下述公式计算浓度：抗体浓度(mg/ml)＝A280×0.77×稀释倍数。

5.可直接商购HRP标记好的鼠单体，也可以商购裸抗体后自行标记HRP。HRP标记鼠单体的方法本领域通用，具体如下：

取4mg HRP，加入1mL水，0.2mL高碘酸钠，避光搅拌30min；加入80μL乙二醇，避光搅拌30min；加入8mg鼠单抗(鼠抗人IgM抗体或鼠抗人IgG抗体或鼠抗人IgA抗体)，混匀后使用50mM的碳酸盐缓冲液透析，4℃避光透析24h；加入硼氢化钠1mg，混匀后静置6h，加入丙三醇2mL，即得；-20℃储存备用。

实施例1

1.一种腺病毒3型检测试剂盒组，所述试剂盒包括：

a.IgM抗体检测试剂盒，所述IgM抗体检测试剂盒包括IgM抗体酶标工作液，所述IgM抗体酶标工作液包括下述终浓度的组分：氯化钠8g/L，磷酸氢二钠2.9g/L，磷酸二氢钠0.2g/L，CaSein 2g/L，ProCLin300 0.5ml/L，过氧化物酶标记的鼠抗人IgM抗体(鼠抗人IgM抗体购自杭州隆基生物技术有限公司，型号为MS00704E)1mg/L；

b.IgA抗体检测试剂盒，所述IgA抗体检测试剂盒包括IgA抗体酶标工作液，所述IgA抗体酶标工作液包括下述终浓度的组分：氯化钠8g/L，磷酸氢二钠2.9g/L，磷酸二氢钠0.2g/L，CaSein 2g/L，ProCLin300 0.5ml/L，过氧化物酶标记的鼠抗人IgA抗体(鼠抗人IgA抗体购自武汉奥科博泰生物科技有限公司，型号为A0051E)1mg/L；

c.IgG抗体检测试剂盒，所述IgG抗体检测试剂盒包括IgG抗体酶标工作液，所述IgG抗体酶标工作液包括下述终浓度的组分：氯化钠8g/L，磷酸氢二钠2.9g/L，磷酸二氢钠0.2g/L，CaSein 2g/L，ProCLin300 0.5ml/L，过氧化物酶标记的鼠抗人IgG抗体(鼠抗人IgG抗体购自珠海启尼亚生物技术有限公司，型号为H)1mg/L；

所述IgM抗体检测试剂盒、IgA抗体检测试剂盒、IgG抗体检测试剂盒还包括：

底物液A，包括下述终浓度的组分：无水乙酸钠15g/L，吐温20 60mL/L，柠檬酸钠8g/L，柠檬酸10g/L，乙酸1.25mL/L，双氧水1mL/L，过氧化钠0.015g/L；

底物液B，包括下述终浓度的组分：TMB 1g/L，二甲基亚砜5mL/L，盐酸2mL/L，甘油50mL/L，硫代硫酸钠10g/L；

终止液，包括下述终浓度的组分：质量浓度98％的硫酸(购自国药集团)60ml/L；

浓缩洗涤液，包括下述终浓度的组分：氯化钠75g/L，磷酸氢二钠50g/L，磷酸二氢钠4g/L，吐温20 10ml/L；

标本稀释液，包括下述终浓度的组分：氯化钠8g/L，磷酸氢二钠2.9g/L，磷酸二氢钠0.2g/L，CaSein 2g/L，ProCLin300 0.5ml/L；

阳性对照，包括下述终浓度的组分：腺病毒3型抗体2mg/L；

阴性对照，包括下述终浓度的组分：腺病毒阴性血清100ml/L；

包被腺病毒3型重组抗原的酶标板：每孔包被腺病毒3型重组抗原A0.1μg。

2.上述试剂盒的制备方法包括下述步骤：

底物液A的制备方法包括下述步骤：按上述比例称取各组分，分别溶于蒸馏水中，定容，即得；

底物液B的制备方法包括下述步骤：按上述比例称取各组分，分别溶于蒸馏水中，定容，即得；

终止液的制备方法包括下述步骤：配制所述浓度的硫酸，即得；

浓缩洗涤液的制备方法包括下述步骤：按上述比例称取各组分，分别溶于蒸馏水中，定容，即得；

标本稀释液的制备方法包括下述步骤：按上述比例称取各组分，分别溶于蒸馏水中，定容，即得；

IgM抗体酶标工作液、IgG抗体酶标工作液、IgA抗体酶标工作液的制备方法包括下述步骤：按上述比例称取各组分，分别溶于蒸馏水中，定容，即得；

阳性对照的制备方法包括下述步骤：配制所述浓度的腺病毒3型抗体，即得；

阴性对照的制备方法包括下述步骤：配制所述浓度的腺病毒阴性血清，即得。

包被腺病毒3型重组抗原的酶标板的制备方法包括下述步骤：按上述比例取重组抗原A，溶于包被稀释液(无水碳酸钠1.6g/L，碳酸氢钠2.9g/L)中，然后按照0.1μg/孔的量将抗原分装在酶标板板孔内，37℃条件下2小时后封闭干燥，即得。

实施例2

1.一种腺病毒3型检测试剂盒组，所述试剂盒同实施例1，区别仅在于：

包被腺病毒3型重组抗原的酶标板：每孔包被重组抗原B 0.1μg。

2.上述试剂盒的制备方法参照实施例1。

实施例3

包被腺病毒3型重组抗原的酶标板：每孔包被重组抗原C 0.1μg。

2.上述试剂盒的制备方法参照实施例1。

对比例1

1.一种腺病毒3型IgM抗体检测试剂盒，所述试剂盒同实施例1的IgM抗体检测试剂盒，区别仅在于：

包被腺病毒3型重组抗原的酶标板上，每孔包被的腺病毒3型细胞培养抗原0.1μg；

所述腺病毒3型细胞培养抗原购自迈迪安Meridian，货号为R02723，浓度为1.2mg/ml，批号为111407，抗原缓冲液为：PBS缓冲液(pH 7.5±0.2)，0.05％NP40(乙基苯基聚乙二醇)。

2.上述试剂盒的制备方法参照实施例1。

对比例2

1.一种腺病毒3型IgG抗体检测试剂盒，所述试剂盒同实施例1的IgG抗体检测试剂盒，区别仅在于：

2.上述试剂盒的制备方法参照实施例1。

对比例3

1.一种腺病毒3型IgA抗体检测试剂盒，所述试剂盒同实施例1的IgA抗体检测试剂盒，区别仅在于：

2.上述试剂盒的制备方法参照实施例1。

试验例1

对实施例1提供腺病毒3型检测试剂盒进行测试，其中，IgM抗体检测试剂盒的测试步骤如下：

将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水稀释20倍得洗涤液，备用；

在酶标板的反应孔中加入阴性对照2孔(100μl/孔)，阳性对照2孔(100μl/孔)，不加标本稀释液；其他反应孔中各加标本稀释液100μl，然后按顺序各加入待检标本10μl，加样时吹打混匀则变色效果更佳；

在酶标板上加盖封板膜，振荡混匀，置37℃温箱中，反应30分钟；将封板膜揭掉，吸干孔内液体，用洗涤液洗板5次，每次浸泡30-60秒，连续洗板5次，最后一次拍干；

每孔加入100μl的IgM抗体酶标工作液；在酶标板上加盖封板膜，置37℃温箱中，反应30分钟；将封板膜揭掉，吸干孔内液体，用洗涤液洗板5次，每次浸泡30-60秒，连续洗板5次，最后一次拍干；

每孔依次加入底物液A、底物液B各50μl，加盖封板膜，振荡混匀，37℃避光显色15分钟；每孔加入终止液各50μl，振荡混匀终止反应；

用酶标仪双波长450nm和630nm测定各孔A值；

IgG抗体检测试剂盒和IgA抗体检测试剂盒试剂盒的测试方法同上。

通过对部分临床已确诊为腺病毒3型感染阳性(但PCR核酸检测阴性的)患者血样进行复检，实施例1提供的试剂盒组合能检出相当部分阳性，提示其可与核酸检测形成互补。实验数据如下表1所示：

表1

测定P1-P10时的A值大于0.15时判断为阳性。由表1结果可以看到，实施例1提供的IgM抗体检测试剂盒能检出5/10阳性，IgG抗体检测试剂盒能检出6/10阳性，IgA抗体检测试剂盒能检出4/10阳性；实施例1提供的IgM抗体检测试剂盒、IgG抗体检测试剂盒和IgA抗体检测试剂盒同时检测，能检出8/10阳性，提示可与核酸检测形成互补。

试验例2

使用在医院收集的腺病毒3型阳性血清10份，阴性血清10份对实施例1提供的IgM抗体检测试剂盒和对比例1提供的试剂盒的性能进行验证；检测方法与试验例1相同。检测结果如表2所示：

表2

测定P11-P20和N1-N10时的A值大于0.15时判断为阳性。从表2结果可以看到，实施例1中提供的IgM抗体检测试剂盒检测阳性血清P11-P20，能检出8/10阳性；对比例1的试剂盒检测阳性血清P11-P20，能检出6/10阳性；即实施例1中提供的IgM抗体检测试剂盒的阳性检出率高于对比例1，说明使用了重组抗原A的试剂盒的灵敏度明显高于使用细胞培养抗原的试剂盒。

同时，实施例1中提供的IgM抗体检测试剂盒检测阴性血清N1-N10的符合率为10/10，对比例1的试剂盒检测阴性血清N1-N10的符合率为9/10；实施例1中提供的IgM抗体检测试剂盒的阴性符合率高于对比例1，说明使用了重组抗原A的试剂盒的特异性好于使用细胞培养抗原的试剂盒。

试验例3

使用在医院收集的腺病毒3型阳性血清10份，阴性血清10份对实施例1中提供的IgG抗体检测试剂盒和对比例2提供的试剂盒的性能进行验证；检测方法与试验例1相同。检测结果如表3所示：

表3

测定P11-P20和N1-N10时的A值大于0.15时判断为阳性。由表3结果可以看到，实施例1中提供的IgG抗体检测试剂盒检测阳性血清P11-P20能检出9/10阳性，对比例2的试剂盒检测阳性血清P11-P20能检出7/10阳性，实施例2的阳性检出率高于对比例2，说明使用了重组抗原A的试剂盒的灵敏度明显高于使用细胞培养抗原的试剂盒。

同时可以看到，实施例1中提供的IgG抗体检测试剂盒检测阴性血清N1-N10的符合率为10/10，对比例2的试剂盒检测阴性血清N1-N10的符合率为8/10，实施例1中提供的IgG抗体检测试剂盒的阴性符合率高于对比例2，说明使用了重组抗原A的试剂盒的特异性好于使用细胞培养抗原的试剂盒。

试验例4

使用在医院收集的腺病毒3型阳性血清10份，阴性血清10份对实施例1中提供的IgA抗体检测试剂盒和对比例3的试剂盒性能进行验证；检测方法与试验例1相同。检测结果如表4所示：

表4

测定P11-P20和N1-N10时的A值大于0.15时判断为阳性。由表4结果可以看到，实施例1中提供的IgA抗体检测试剂盒检测阳性血清P11-P20能检出7/10阳性，对比例3的试剂盒检测阳性血清P11-P20能检出5/10阳性，实施例3的阳性检出率高于对比例3，说明使用了重组抗原A的试剂盒的灵敏度明显高于使用细胞培养抗原的试剂盒。

同时可以看到，实施例1中提供的IgG抗体检测试剂盒检测阴性血清N1-N10的符合率为10/10，对比例3的试剂盒检测阴性血清N1-N10的符合率为9/10，实施例1中提供的IgG抗体检测试剂盒的阴性符合率高于对比例3，说明使用了重组抗原A的试剂盒的特异性好于使用细胞培养抗原的试剂盒。

试验例5

使用在医院收集的腺病毒3型阳性血清10份，阴性血清10份对实施例1中提供的IgM抗体检测试剂盒、实施例2中提供的IgM抗体检测试剂盒和实施例3中提供的IgM抗体检测试剂盒的性能进行验证；检测方法与试验例1相同。检测结果如表5所示：

表5

测定P11-P20和N1-N10时的A值大于0.15时判断为阳性。由表5结果可以看到，实施例1中提供的IgM抗体检测试剂盒检测阳性血清P11-P20能检出8/10阳性；实施例2中提供的IgM抗体检测试剂盒检测阳性血清P11-P20能检出5/10阳性；实施例3中提供的IgM抗体检测试剂盒检测阳性血清P11-P20能检出6/10阳性；三个试剂盒均能检出部分阳性，其中，实施例1中提供的IgM抗体检测试剂盒的阳性检出率高于实施例2和3，说明使用重组抗原A的试剂盒的灵敏度高于使用重组抗原B和C的试剂盒。

对于阴性血清N1-N10的检测，三个试剂盒的检测符合率均为10/10，特异性没有明显区别。

综上，在多种抗原中，使用重组抗原A的试剂盒的灵敏度最好，可以为建立快速准确检测腺病毒3型感染的方法提供技术支持。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京贝尔生物工程股份有限公司

<120> 一种快速准确检测腺病毒3型的试剂盒及其制备方法

<130> 200069F

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 469

<212> PRT

<213> Human adenovirus type 3

<400> 1

Arg Gly Pro Ser Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ser Leu

1 5 10 15

Ala Pro Lys Gly Ala Pro Asn Thr Ser Gln Trp Ile Val Thr Thr Asn

20 25 30

Gly Asp Asn Ala Val Thr Thr Thr Thr Asn Thr Phe Gly Ile Ala Ser

35 40 45

Met Lys Gly Gly Asn Ile Thr Lys Glu Gly Leu Gln Ile Gly Lys Asp

50 55 60

Ile Thr Thr Thr Glu Gly Glu Glu Lys Pro Ile Tyr Ala Asp Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Gln Pro Glu Pro Gln Val Gly Glu Glu Ser Trp Thr Asp Thr Asp

85 90 95

Gly Thr Asn Glu Lys Phe Gly Gly Arg Ala Leu Lys Pro Ala Thr Asn

100 105 110

Met Lys Pro Cys Tyr Gly Ser Phe Ala Arg Pro Thr Asn Ile Lys Gly

115 120 125

Gly Gln Ala Lys Asn Arg Lys Val Lys Pro Thr Thr Glu Gly Gly Val

130 135 140

Glu Thr Glu Glu Pro Asp Ile Asp Met Glu Phe Phe Asp Gly Arg Asp

145 150 155 160

Ala Val Ala Gly Ala Leu Ala Pro Glu Ile Val Leu Tyr Thr Glu Asn

165 170 175

Val Asn Leu Glu Thr Pro Asp Ser His Val Val Tyr Lys Pro Glu Thr

180 185 190

Ser Asn Asn Ser His Ala Asn Leu Gly Gln Gln Ala Met Pro Asn Arg

195 200 205

Pro Asn Tyr Ile Gly Phe Arg Asp Asn Phe Val Gly Leu Met Tyr Tyr

210 215 220

Asn Ser Thr Gly Asn Met Gly Val Leu Ala Gly Gln Ala Ser Gln Leu

225 230 235 240

Asn Ala Val Val Asp Leu Gln Asp Arg Asn Thr Glu Leu Ser Tyr Gln

245 250 255

Leu Leu Leu Asp Ser Leu Gly Asp Arg Thr Arg Tyr Phe Ser Met Trp

260 265 270

Asn Gln Ala Val Asp Ser Tyr Asp Pro Asp Val Arg Ile Ile Glu Asn

275 280 285

His Gly Ile Glu Asp Glu Leu Pro Asn Tyr Cys Phe Pro Leu Asn Gly

290 295 300

Ile Gly Pro Gly His Thr Tyr Gln Gly Ile Lys Val Lys Thr Asp Asp

305 310 315 320

Thr Asn Gly Trp Glu Lys Asp Ala Asn Val Ala Pro Ala Asn Glu Ile

325 330 335

Thr Ile Gly Asn Asn Leu Ala Met Glu Ile Asn Ile Gln Ala Asn Leu

340 345 350

Trp Arg Ser Phe Leu Tyr Ser Asn Val Ala Leu Tyr Leu Pro Asp Val

355 360 365

Tyr Lys Tyr Thr Pro Pro Asn Ile Thr Leu Pro Thr Asn Thr Asn Thr

370 375 380

Tyr Glu Tyr Met Asn Gly Arg Val Val Ser Pro Ser Leu Val Asp Ser

385 390 395 400

Tyr Ile Asn Ile Gly Ala Arg Trp Ser Leu Asp Pro Met Asp Asn Val

405 410 415

Asn Pro Phe Asn His His Arg Asn Ala Gly Leu Arg Tyr Arg Ser Met

420 425 430

Leu Leu Gly Asn Gly Arg Tyr Val Pro Phe His Ile Gln Val Pro Gln

435 440 445

Lys Phe Phe Ala Val Lys Asn Leu Leu Leu Leu Pro Gly Ser Tyr Thr

450 455 460

Tyr Glu Trp Asn Phe

465

<210> 2

<211> 330

<212> PRT

<213> Human adenovirus type 3

<400> 2

Phe Ala Arg Pro Thr Asn Ile Lys Gly Gly Gln Ala Lys Asn Arg Lys

1 5 10 15

Val Lys Pro Thr Thr Glu Gly Gly Val Glu Thr Glu Glu Pro Asp Ile

20 25 30

Asp Met Glu Phe Phe Asp Gly Arg Asp Ala Val Ala Gly Ala Leu Ala

35 40 45

Pro Glu Ile Val Leu Tyr Thr Glu Asn Val Asn Leu Glu Thr Pro Asp

50 55 60

Ser His Val Val Tyr Lys Pro Glu Thr Ser Asn Asn Ser His Ala Asn

65 70 75 80

Leu Gly Gln Gln Ala Met Pro Asn Arg Pro Asn Tyr Ile Gly Phe Arg

85 90 95

Asp Asn Phe Val Gly Leu Met Tyr Tyr Asn Ser Thr Gly Asn Met Gly

100 105 110

Val Leu Ala Gly Gln Ala Ser Gln Leu Asn Ala Val Val Asp Leu Gln

115 120 125

Asp Arg Asn Thr Glu Leu Ser Tyr Gln Leu Leu Leu Asp Ser Leu Gly

130 135 140

Asp Arg Thr Arg Tyr Phe Ser Met Trp Asn Gln Ala Val Asp Ser Tyr

145 150 155 160

Asp Pro Asp Val Arg Ile Ile Glu Asn His Gly Ile Glu Asp Glu Leu

165 170 175

Pro Asn Tyr Cys Phe Pro Leu Asn Gly Ile Gly Pro Gly His Thr Tyr

180 185 190

Gln Gly Ile Lys Val Lys Thr Asp Asp Thr Asn Gly Trp Glu Lys Asp

195 200 205

Ala Asn Val Ala Pro Ala Asn Glu Ile Thr Ile Gly Asn Asn Leu Ala

210 215 220

Met Glu Ile Asn Ile Gln Ala Asn Leu Trp Arg Ser Phe Leu Tyr Ser

225 230 235 240

Asn Val Ala Leu Tyr Leu Pro Asp Val Tyr Lys Tyr Thr Pro Pro Asn

245 250 255

Ile Thr Leu Pro Thr Asn Thr Asn Thr Tyr Glu Tyr Met Asn Gly Arg

260 265 270

Val Val Ser Pro Ser Leu Val Asp Ser Tyr Ile Asn Ile Gly Ala Arg

275 280 285

Trp Ser Leu Asp Pro Met Asp Asn Val Asn Pro Phe Asn His His Arg

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Asn Ala Gly Leu Arg Tyr Arg Ser Met Leu Leu Gly Asn Gly Arg Tyr

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Val Pro Phe His Ile Gln Val Pro Gln Lys

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<210> 3

<211> 340

<212> PRT

<213> Human adenovirus type 3

<400> 3

Gly Ala Pro Asn Thr Ser Gln Trp Ile Val Thr Thr Asn Gly Asp Asn

1 5 10 15

Ala Val Thr Thr Thr Thr Asn Thr Phe Gly Ile Ala Ser Met Lys Gly

20 25 30

Gly Asn Ile Thr Lys Glu Gly Leu Gln Ile Gly Lys Asp Ile Thr Thr

35 40 45

Thr Glu Gly Glu Glu Lys Pro Ile Tyr Ala Asp Lys Thr Tyr Gln Pro

50 55 60

Glu Pro Gln Val Gly Glu Glu Ser Trp Thr Asp Thr Asp Gly Thr Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Gly Gly Arg Ala Leu Lys Pro Ala Thr Asn Met Lys Pro

85 90 95

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100 105 110

Lys Asn Arg Lys Val Lys Pro Thr Thr Glu Gly Gly Val Glu Thr Glu

115 120 125

Glu Pro Asp Ile Asp Met Glu Phe Phe Asp Gly Arg Asp Ala Val Ala

130 135 140

Gly Ala Leu Ala Pro Glu Ile Val Leu Tyr Thr Glu Asn Val Asn Leu

145 150 155 160

Glu Thr Pro Asp Ser His Val Val Tyr Lys Pro Glu Thr Ser Asn Asn

165 170 175

Ser His Ala Asn Leu Gly Gln Gln Ala Met Pro Asn Arg Pro Asn Tyr

180 185 190

Ile Gly Phe Arg Asp Asn Phe Val Gly Leu Met Tyr Tyr Asn Ser Thr

195 200 205

Gly Asn Met Gly Val Leu Ala Gly Gln Ala Ser Gln Leu Asn Ala Val

210 215 220

Val Asp Leu Gln Asp Arg Asn Thr Glu Leu Ser Tyr Gln Leu Leu Leu

225 230 235 240

Asp Ser Leu Gly Asp Arg Thr Arg Tyr Phe Ser Met Trp Asn Gln Ala

245 250 255

Val Asp Ser Tyr Asp Pro Asp Val Arg Ile Ile Glu Asn His Gly Ile

260 265 270

Glu Asp Glu Leu Pro Asn Tyr Cys Phe Pro Leu Asn Gly Ile Gly Pro

275 280 285

Gly His Thr Tyr Gln Gly Ile Lys Val Lys Thr Asp Asp Thr Asn Gly

290 295 300

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325 330 335

Phe Leu Tyr Ser

340

<210> 4

<211> 1407

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

cgtggtccgt ctttcaaacc gtactctggt accgcttaca actctctggc tccgaaaggt 60

gctccgaaca cctctcagtg gatcgttacc accaacggtg acaacgctgt taccaccacc 120

accaacacct tcggtatcgc ttctatgaaa ggtggtaaca tcaccaaaga aggtctgcag 180

atcggtaaag acatcaccac caccgaaggt gaagaaaaac cgatctacgc tgacaaaacc 240

taccagccgg aaccgcaggt tggtgaagaa tcttggaccg acaccgacgg taccaacgaa 300

aaattcggtg gtcgtgctct gaaaccggct accaacatga aaccgtgcta cggttctttc 360

gctcgtccga ccaacatcaa aggtggtcag gctaaaaacc gtaaagttaa accgaccacc 420

gaaggtggtg ttgaaaccga agaaccggac atcgacatgg aattcttcga cggtcgtgac 480

gctgttgctg gtgctctggc tccggaaatc gttctgtaca ccgaaaacgt taacctggaa 540

accccggact ctcacgttgt ttacaaaccg gaaacctcta acaactctca cgctaacctg 600

ggtcagcagg ctatgccgaa ccgtccgaac tacatcggtt tccgtgacaa cttcgttggt 660

ctgatgtact acaactctac cggtaacatg ggtgttctgg ctggtcaggc ttctcagctg 720

aacgctgttg ttgacctgca ggaccgtaac accgaactgt cttaccagct gctgctggac 780

tctctgggtg accgtacccg ttacttctct atgtggaacc aggctgttga ctcttacgac 840

ccggacgttc gtatcatcga aaaccacggt atcgaagacg aactgccgaa ctactgcttc 900

ccgctgaacg gtatcggtcc gggtcacacc taccagggta tcaaagttaa aaccgacgac 960

accaacggtt gggaaaaaga cgctaacgtt gctccggcta acgaaatcac catcggtaac 1020

aacctggcta tggaaatcaa catccaggct aacctgtggc gttctttcct gtactctaac 1080

gttgctctgt acctgccgga cgtttacaaa tacaccccgc cgaacatcac cctgccgacc 1140

aacaccaaca cctacgaata catgaacggt cgtgttgttt ctccgtctct ggttgactct 1200

tacatcaaca tcggtgctcg ttggtctctg gacccgatgg acaacgttaa cccgttcaac 1260

caccaccgta acgctggtct gcgttaccgt tctatgctgc tgggtaacgg tcgttacgtt 1320

ccgttccaca tccaggttcc gcagaaattc ttcgctgtta aaaacctgct gctgctgccg 1380

ggttcttaca cctacgaatg gaacttc 1407

<210> 5

<211> 990

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

ttcgctcgtc cgaccaacat caaaggtggt caggctaaaa accgtaaagt taaaccgacc 60

accgaaggtg gtgttgaaac cgaagaaccg gacatcgaca tggaattctt cgacggtcgt 120

gacgctgttg ctggtgctct ggctccggaa atcgttctgt acaccgaaaa cgttaacctg 180

gaaaccccgg actctcacgt tgtttacaaa ccggaaacct ctaacaactc tcacgctaac 240

ctgggtcagc aggctatgcc gaaccgtccg aactacatcg gtttccgtga caacttcgtt 300

ggtctgatgt actacaactc taccggtaac atgggtgttc tggctggtca ggcttctcag 360

ctgaacgctg ttgttgacct gcaggaccgt aacaccgaac tgtcttacca gctgctgctg 420

gactctctgg gtgaccgtac ccgttacttc tctatgtgga accaggctgt tgactcttac 480

gacccggacg ttcgtatcat cgaaaaccac ggtatcgaag acgaactgcc gaactactgc 540

ttcccgctga acggtatcgg tccgggtcac acctaccagg gtatcaaagt taaaaccgac 600

gacaccaacg gttgggaaaa agacgctaac gttgctccgg ctaacgaaat caccatcggt 660

aacaacctgg ctatggaaat caacatccag gctaacctgt ggcgttcttt cctgtactct 720

aacgttgctc tgtacctgcc ggacgtttac aaatacaccc cgccgaacat caccctgccg 780

accaacacca acacctacga atacatgaac ggtcgtgttg tttctccgtc tctggttgac 840

tcttacatca acatcggtgc tcgttggtct ctggacccga tggacaacgt taacccgttc 900

aaccaccacc gtaacgctgg tctgcgttac cgttctatgc tgctgggtaa cggtcgttac 960

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<210> 6

<211> 1020

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

ggtgctccga acacctctca gtggatcgtt accaccaacg gtgacaacgc tgttaccacc 60

accaccaaca ccttcggtat cgcttctatg aaaggtggta acatcaccaa agaaggtctg 120

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ggtctgatgt actacaactc taccggtaac atgggtgttc tggctggtca ggcttctcag 660

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gacaccaacg gttgggaaaa agacgctaac gttgctccgg ctaacgaaat caccatcggt 960

aacaacctgg ctatggaaat caacatccag gctaacctgt ggcgttcttt cctgtactct 1020

Claims

1.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

和，包被腺病毒3型重组抗原的酶标板；

其中，所述腺病毒3型重组抗原为重组抗原A；

所述重组抗原A的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，抗人IgM抗体为鼠抗人IgM抗体；

和/或，抗人IgG抗体为鼠抗人IgG抗体；

和/或，抗人IgA抗体为鼠抗人IgA抗体。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，编码重组抗原A的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，IgM抗体酶标工作液包括下述终浓度的组分：氯化钠5-10g/L，磷酸氢二钠2-4g/L，磷酸二氢钠0.1-0.4g/L，CaSein 1-3g/L，ProCLin300 0.2-0.8ml/L，和过氧化物酶标记的抗人IgM抗体0.5-2mg/L；

和/或，IgA抗体酶标工作液包括下述终浓度的组分：氯化钠5-10g/L，磷酸氢二钠2-4g/L，磷酸二氢钠0.1-0.4g/L，CaSein 1-3g/L，ProCLin300 0.2-0.8ml/L，和过氧化物酶标记的抗人IgA抗体0.5-2mg/L；

和/或，IgG抗体酶标工作液包括下述终浓度的组分：氯化钠5-10g/L，磷酸氢二钠2-4g/L，磷酸二氢钠0.1-0.4g/L，CaSein 1-3g/L，ProCLin300 0.2-0.8ml/L，和过氧化物酶标记的抗人IgG抗体0.5-2mg/L。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，包被腺病毒3型重组抗原的酶标板中，每孔包被腺病毒3型重组抗原0.05-0.3μg。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括底物液A、底物液B、终止液、浓缩洗涤液、标本稀释液、阳性对照、阴性对照。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，底物液A包括下述终浓度的组分：无水乙酸钠10-20g/L，吐温20 50-70mL/L，柠檬酸钠5-10g/L，柠檬酸8-15g/L，乙酸1.0-1.5mL/L，双氧水0.8-1.2mL/L和过氧化钠0.01-0.02g/L；

底物液B包括下述终浓度的组分：3,3’,5,5’-四甲基联苯胺0.8-1.5g/L，二甲基亚砜4-7mL/L，盐酸1-3mL/L，甘油40-60mL/L和硫代硫酸钠8-12g/L；

终止液包括硫酸；

浓缩洗涤液包括下述终浓度的组分：氯化钠70-80g/L，磷酸氢二钠45-55g/L，磷酸二氢钠3-5g/L，吐温20 8-15ml/L；

标本稀释液包括下述终浓度的组分：氯化钠5-10g/L，磷酸氢二钠2-4g/L，磷酸二氢钠0.1-0.4g/L，CaSein 1-3g/L和ProCLin300 0.2-0.8ml/L；

阳性对照包括下述终浓度的组分：腺病毒3型抗体1-5mg/L；

阴性对照包括下述终浓度的组分：腺病毒阴性血清50-200ml/L。