CN112114151B - 一种2019-nCoV的IgG、IgM和IgA抗体联合检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种2019-nCoV的IgG、IgM和IgA抗体联合检测试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体公开一种2019‑nCoV的IgG、IgM和IgA抗体联合检测试剂盒及其检测方法。所述2019‑nCoV的IgG、IgM和IgA抗体联合检测试剂盒，包括2019‑nCoV标志蛋白包被板、样品稀释液、洗涤液、抗人IgA抗体酶标工作液、抗人IgG抗体酶标工作液、抗人IgM抗体酶标工作液、显色底物、终止液和阳性对照。本发明的试剂盒可以同时检测2019‑nCoV的IgG、IgM和IgA抗体，解决了单一抗体检测结果存在的准确性差、假阴性结果存在率高的问题，极大提高了检测效率，具有极高的应用价值。

Description

一种2019-nCoV的IgG、IgM和IgA抗体联合检测试剂盒及其检 测方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种2019-nCoV的IgG、IgM和IgA抗体联合检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
酶联免疫吸附测定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)现在已成为目前分析化学领域中常用的方法，是在免疫酶技术(Immunoenzymatic Techniques)的基础上发展起来的一种免疫测定技术。
冠状病毒是一个病毒家族，已知可引起感冒以及中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等疾病。新冠状病毒(2019-nCoV)是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株，属于β属冠状病毒，其基因特征与前述的MERS和SARS有明显的区别。人类感染冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等，以发热、干咳、乏力为主要表现，少数伴有鼻塞、咽痛、肌痛和腹泻等症状，在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。
2019-nCoV的及早诊断和隔离治疗是控制病人病情和阻断病毒传播的重要途径。病毒的诊断分为病原学和血清学检测。病原学检测主要是用RT-PCR技术或NGS方法来检测病毒的核酸，检测的标本为鼻咽拭子、痰液、其他下呼吸道分泌物；血清学检测是检测血清、血浆、全血标本中的抗2019-nCoV抗体IgG和IgM。根据诊疗方案，病毒特异性IgM抗体多在发病3-5天后开始出现阳性，IgG抗体低度恢复期较急性期有4倍及以上增高。如发病7天后2019-nCoV抗体IgM和IgG仍为阴性，可排除疑似病例诊断。因此，2019-nCoV特异性IgM、IgG或IgA抗体作为病原学诊断标准之一。
目前已上市的2019-nCoV抗体检测ELISA试剂盒分为以下几种：①以双抗原夹心法为反应原理的2019-nCoV抗体检测试剂盒，其检测的是2019-nCoV总抗体，存在的缺陷是不能够区分抗体阳性具体是哪些类型的抗体阳性，即不能够区分抗体是IgG、IgM或IgA类型，不能区分是新发病的感染者还是治愈后抗体携带者；②以间接法为反应原理的2019-nCoV抗体检测ELISA试剂盒，均属于单一抗体类型检测试剂盒，要得到样本的IgG、IgM和IgA类型各自阴阳性结果，需要使用个不同的试剂盒进行多次检测。③以捕获法为反应原理的2019-nCoV抗体检测ELISA试剂盒，也属于单一抗体类型检测试剂盒，局限性较大。
目前上市产品能够同时区分IgG、IgM和IgA各抗体亚型的试剂盒均为胶体金免疫层析法原理，胶体金产品为目力判断结果，主观影响较大，结果判断存在较大误差，无法进行精确的定性和定量判断。
发明内容
针对现有2019-nCoV抗体检测试剂盒或其它产品不能够同时对2019-nCoV的IgG、IgM和IgA抗体亚型同时进行准确的定性和定量判断，进而影响2019-nCoV感染的检测结果准确性的问题，本发明提供一种2019-nCoV的IgG、IgM和IgA抗体联合检测试剂盒及其检测方法。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种2019-nCoV的IgG、IgM和IgA抗体联合检测试剂盒，包括2019-nCoV标志蛋白包被板、样品稀释液、洗涤液、抗人IgA抗体酶标工作液、抗人IgG抗体酶标工作液、抗人IgM抗体酶标工作液、显色底物、终止液和阳性对照；
所述阳性对照为抗2019-nCoV标志蛋白的单克隆抗体IgG-人IgA/IgG/IgM抗体的复合物。
相对于现有技术，本发明提供的2019-nCoV的IgG、IgM和IgA抗体联合检测试剂盒可以同时检测2019-nCoV的IgG、IgM和IgA抗体，避免了单一抗体检测结果存在的准确性差、假阴性结果存在率高的缺陷，同时本申请中以抗2019-nCoV标志蛋白的单克隆抗体IgG-人IgA/IgG/IgM抗体的复合物作为阳性对照，结合抗人IgA抗体酶标工作液、抗人IgG抗体酶标工作液和抗人IgM抗体酶标工作液三种酶标工作液的使用，可以有效区分阳性待测样品中的IgA抗体、IgG抗体和IgM抗体亚型，通过选择特定的抗体临界值的计算系数，可以避免阳性待测样品中的IgA抗体、IgG抗体和IgM抗体亚型在检测过程中的相互影响，并分别准确的对待测样品中IgA抗体、IgG抗体和IgM抗体亚型进行定性和定量，避免了2019-nCoV感染的检测结果存在假阴性，极大提高了检测效率，具有极高的应用价值。
同时本申请提供的新型的阳性对照为抗2019-nCoV标志蛋白的单克隆抗体IgG-人IgA/IgG/IgM抗体的复合物，其相比于临床血清(即使灭活后仍不能排除具有较高的安全风险)具有极低生物安全风险，对于生产、运输和使用而言更加安全，可推广使用。
优选的，所述2019-nCoV蛋白包被板的制备方法具体包括以下步骤：
a、抗原蛋白包被：将2019-nCoV标志蛋白用包被液稀释至1-2μg/mL，加入到聚苯乙烯96孔板中，每孔加入量为0.1-0.2mL，封板，37℃包被1.5-2.5h；
b、洗板：甩掉经2019-nCoV标志蛋白包被的所述96孔板中多余的液体，用清洗液洗涤3-4次；
c、封闭：用封闭液封闭经洗板后的所述96孔板，每孔所述封闭液的加入量为0.2-0.3mL，封板，37℃封闭2-3h；
d、干燥：甩掉经封闭后的所述96孔板中的所述封闭液，干燥后得到所述2019-nCoV标志蛋白包被板。
优选的，步骤a中，所述2019-nCoV标志蛋白为质量比为0.8-1.2:1的2019-nCoVS1蛋白和2019-nCoV N蛋白。
上述优选的质量比为0.8-1.2:1的2019-nCoVS1蛋白和2019-nCoV N蛋白作为2019-nCoV标志蛋白可以进一步提高检测结果的准确性，为2019-nCoV抗体的检测提供双重保障，避免出现假阴性的结果。
优选的，步骤a中，所述包被液为pH7.2-7.5的0.01M磷酸盐溶液。
优选的，步骤a中，将所述2019-nCoV标志蛋白用包被液稀释至1-2μg/mL，以每孔0.1-0.2mL的加入量加入到所述聚苯乙烯96孔板中。
优选的，步骤b中，所述清洗液为pH7.2-7.5且含有0.9％(w/v)氯化钠和0.05％(v/v)吐温20的0.1M磷酸钠溶液。
优选的，步骤c中，所述封闭液为含5％(w/v)海藻糖的1％(w/v)BSA溶液。
优选的，步骤c中，所述96孔板中每孔所述封闭液的加入量为0.2-0.3mL。
优选的，步骤d中，所述干燥方法为：在湿度为10-20％的环境下通风干燥1-3h。
优选的，每升所述样品稀释液中含有十二水合磷酸氢二钠2.8-3.0g、二水合磷酸二氢钠0.294-0.298g、氯化钠8.760-8.770g、海藻糖9-11g、BSA9-11g、吐温20 0.4-0.6mL、ProClin300 0.4-0.6mL和余量的纯水；所述样品稀释液的pH为7.2-7.5。
优选的，每升所述洗涤液中含有十二水合磷酸氢二钠2.8-3.0g，二水合磷酸二氢钠0.295-0.297g，氯化钠8.765-8.767g，9-11g海藻糖，BSA 9-11g，吐温20 0.4-0.6mL，ProClin300 0.4-0.6mL和余量的纯水；所述洗涤液的pH为7.2-7.5。
优选的，所述抗人IgA抗体酶标工作液的制备方法为：按照HRP标记试剂盒的标记方法标记羊抗人IgA抗体，得到抗人IgA抗体酶标，用HRP稳定剂稀释所述抗人IgA抗体酶标至其浓度为10-22ng/mL，得到所述抗人IgA抗体酶标工作液；
所述抗人IgG抗体酶标工作液的制备方法为：按照HRP标记试剂盒的标记方法标记羊抗人IgG抗体，得到抗人IgG抗体酶标，用HRP稳定剂稀释所述抗人IgG抗体酶标至其浓度为28-32ng/mL，得到所述抗人IgG抗体酶标工作液；
所述抗人IgM抗体酶标工作液的制备方法为：按照HRP标记试剂盒的标记方法标记羊抗人IgM抗体，得到抗人IgM抗体酶标，用HRP稳定剂稀释所述抗人IgM抗体酶标至其浓度为23-27ng/mL，得到所述抗人IgM抗体酶标工作液。
优选的，每升所述显色底物包含一水合柠檬酸14.23-14.25g、二水合磷酸氢二钠11.44-11.48g、3,3′,5,5′-四甲基联苯胺二盐酸盐0.5-1.7g、3％(v/v)过氧化氢2.5-3.5mL，TritonX-100 0.8-1.2mL，丙三醇0.4-0.6mL和余量的水，所述显色底物的pH为3.5-4.0。
优选的，所述终止液为包含0.1％-1％(w/v)氨基磺酸和0.5％-5％(w/v)柠檬酸的水溶液，其pH＜2.0。
优选的，所述阳性对照的制备方法为：向人IgA、人IgG和人IgM中分别加入1mg/mL的sulfo-SMCC，其中人IgA、人IgG和人IgM与1mg/mL的sulfo-SMCC的质量比均为1000:20-30，于24-28℃反应25-35min，反应产物分别在PBS中透析过夜，得到活化的人IgA、人IgG和人IgM，将所述活化的人IgA、人IgG和人IgM按照1.5-2.5:1:3.5-4.5的质量比混合均匀，作为激活抗体；
向重组兔抗2019-nCoV标志蛋白单克隆抗体中加入0.03mg/mL的Traut'sReagent，其中重组兔抗2019-nCoV标志蛋白单克隆抗体与0.03mg/mL的Traut's Reagent的质量比为1000:1-2，于24-28℃反应25-35min，加入激活抗体，得到抗2019-nCoV标志蛋白的单克隆抗体IgG-人IgA/IgG/IgM抗体的复合物，将所述抗2019-nCoV标志蛋白的单克隆抗体IgG-人IgA/IgG/IgM抗体的复合物稀释至0.4-0.6μg/mL得到阳性对照。
优选的，所述重组兔抗2019-nCoV标志蛋白单克隆抗体由质量比为0.8-1.2:1的重组兔抗2019-nCoVS1蛋白单克隆抗体和重组兔抗2019-nCoV N蛋白单克隆抗体组成。
优选的，所述激活抗体的加入量相当于所述重组兔抗2019-nCoV标志蛋白单克隆抗体质量的2-3倍。
上述优选的阳性对照主要成分为重组兔抗新冠病毒S1蛋白单克隆抗体与人IgA/IgG/IgM的复合物以及重组兔抗新冠病毒N蛋白单克隆抗体与人IgA/IgG/IgM的复合物。因重组兔抗新冠病毒N蛋白单克隆抗体与重组兔抗新冠病毒S1蛋白单克隆抗体均为基因工程来源，非血清基质，因此对于生产、运输、使用而言，更加安全。
本发明还提供利用所述的试剂盒进行2019-nCoV抗体的非诊断目的的检测方法。该检测方法，至少包括以下步骤：
S1、一抗孵育：将待测血清与所述样品稀释液按1:100的体积混合，得到稀释样品，将所述稀释样品加入到所述2019-nCoV标志蛋白包被板的孔中，同时设置阴性对照和阳性对照，封板，37℃孵育25-35min；
S2、第一次洗板：弃去经一抗孵育后的所述2019-nCoV标志蛋白包被板的孔中液体，将洗涤液稀释10倍后洗板3-4次；
S3、酶标孵育：向经第一次洗板后的所述2019-nCoV标志蛋白包被板的孔中分别加入所述抗人IgA抗体酶标工作液、所述抗人IgG抗体酶标工作液和所述抗人IgM抗体酶标工作液，封板，37℃孵育反应25-35min；
S4、第二次洗板：弃去经酶标孵育后的所述2019-nCoV标志蛋白包被板的孔中液体，将洗涤液稀释10倍后洗板3-4次；
S5、显色：向经第二次洗板后的所述2019-nCoV标志蛋白包被板的孔中加入所述显色底物，封板，孵育反应10-20min；
S6、终止显色：向经显色后的所述2019-nCoV标志蛋白包被板的孔中加入所述终止液，终止显色反应；
S7、测OD值：用酶标仪分别读取经终止显色后的所述2019-nCoV标志蛋白包被板的孔中液体在波长为450nm-630nm的OD值；
S8、若所述稀释样品的OD值/相应的抗体临界值CO≥1，则检测结果为阳性，否则为阴性；其中，IgA抗体的临界值CO＝阴性对照OD值+0.18×阳性对照OD值；IgG抗体的临界值CO＝阴性对照OD值+0.13×阳性对照OD值；IgM抗体的临界值CO＝阴性对照OD值+0.21×阳性对照OD值。
相对于现有技术，本发明提供的检测方法，操作简单，一次检测过程可同时检测出2019-nCoV的IgG、IgM和IgA三种抗体亚型，并且对2019-nCoV的IgG、IgM和IgA三种抗体亚型进行有效区分，使待测样品中的IgG、IgM和IgA三种抗体亚型之间的检测结果互不影响，是一种兼具高效率和高准确率的2019-nCoV抗体检测方法。
优选的，所述阴性对照为样品稀释液。
优选的，步骤S1中，所述稀释样品、所述阴性对照和所述阳性对照分别在所述2019-nCoV标志蛋白包被板上重复添加3-4个孔。
优选的，步骤S1中，所述稀释样品加入到所述2019-nCoV标志蛋白包被板的孔中的加入量为0.08-0.12mL。
优选的，步骤S3中，所述抗人IgA抗体酶标工作液、所述抗人IgG抗体酶标工作液和所述抗人IgM抗体酶标工作液分别加入所述2019-nCoV标志蛋白包被板的孔中的加入量为0.08-0.12mL。
优选的，步骤S5中，所述显色底物在所述2019-nCoV标志蛋白包被板的孔中的加入量为0.08-0.12mL。
优选的，步骤S6中，所述终止液在所述2019-nCoV标志蛋白包被板的孔中加入量为0.08-0.12mL。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种2019-nCoV的IgG、IgM和IgA抗体联合检测试剂盒，包括2019-nCoV标志蛋白包被板、样品稀释液、洗涤液、抗人IgA抗体酶标工作液、抗人IgG抗体酶标工作液、抗人IgM抗体酶标工作液、显色底物、终止液和阳性对照；阳性对照为抗2019-nCoV标志蛋白的单克隆抗体IgG-人IgA/IgG/IgM抗体的复合物。
其中，2019-nCoV蛋白包被板的制备方法为：
a、抗原蛋白包被：将2019-nCoVS1蛋白和2019-nCoV N蛋白分别用包被液(0.01M磷酸钠溶液，pH7.4)稀释至1μg/mL，再按照1:1体积比混合后加入到高结合力的聚苯乙烯96孔板中，每孔加入量为0.1mL，封好封板膜，置于37℃恒温箱中包被2h；
b、洗板：甩掉经2019-nCoVS1蛋白和2019-nCoV N蛋白包被的96孔板中多余的液体，用清洗液(0.1M磷酸钠溶液，含有0.9％(w/v)氯化钠和0.05％(v/v)吐温20，pH7.4)洗涤3次；
c、封闭：用封闭液(1％(w/v)的BSA溶液，含5％(w/v)海藻糖)封闭经洗板后的所述96孔板，每孔所述封闭液的加入量为0.2mL，封好封板膜，置于37℃恒温箱中封闭2h；
d、干燥：甩掉经封闭后的所述96孔板中的所述封闭液，在湿度为10-20％的环境下通风干燥2h，包被板装袋封口，作为2019-nCoV标志蛋白包被板。
样品稀释液：称取2.9g十二水合磷酸氢二钠、0.296g二水合磷酸二氢钠、8.766g氯化钠、10g海藻糖、10gBSA、0.5mL吐温20和0.5mLProClin300，混合后加入超纯水900mL搅拌溶解，调节PH至7.4，定容至1L，得到样品稀释液。
洗涤液：称取29g十二水合磷酸氢二钠、2.96g二水合磷酸二氢钠、87.66g氯化钠、0.5mL吐温20和0.5mLProClin300，混合后加入超纯水800mL搅拌溶解，调节PH至7.4，定容至1L，得到洗涤液。
抗人IgA抗体酶标工作液：按照HRP标记试剂盒的标记方法标记羊抗人IgA抗体，具体为，取羊抗人IgA抗体0.4mg，加入0.04mL的Start solution，混匀后加入到0.1mg的HRP试剂瓶中，混匀后反应1h，加入0.04mL的Stop solution，混匀后继续反应30min，得到抗人IgA酶标，加入终浓度为50％的甘油中后保存于零下20℃备用；用HRP稳定剂稀释抗人IgA抗体酶标至其浓度为20ng/mL，得到抗人IgA抗体酶标工作液(即用型)。
抗人IgG抗体酶标工作液：按照HRP标记试剂盒的标记方法标记羊抗人IgG抗体，具体为，取羊抗人IgG抗体0.4mg，加入0.04mL的Start solution，混匀后加入到0.1mg的HRP试剂瓶中，混匀后反应1h，加入0.04mL的Stop solution，混匀后继续反应30min，得到抗人IgG酶标，加入终浓度为50％的甘油中后保存于零下20℃备用；用HRP稳定剂稀释抗人IgG抗体酶标至其浓度为30ng/mL，得到抗人IgG抗体酶标工作液(即用型)。
抗人IgM抗体酶标工作液：按照HRP标记试剂盒的标记方法标记羊抗人IgM抗体，具体为，取羊抗人IgM抗体0.4mg，加入0.04mL的Start solution，混匀后加入到0.1mg的HRP试剂瓶中，混匀后反应1h，加入0.04mL的Stop solution，混匀后继续反应30min，得到抗人IgM酶标，加入终浓度为50％的甘油中后保存于零下20℃备用；用HRP稳定剂稀释抗人IgM抗体酶标至其浓度为25ng/mL，得到抗人IgM抗体酶标工作液(即用型)。
显色底物:称取14.24g的一水合柠檬酸、11.46g二水合磷酸氢二钠、0.6g的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺二盐酸盐和900mL超纯水，搅拌溶解后加入3mL3％(v/v)过氧化氢，1mL的TritonX-100和0.5mL的丙三醇，溶解后用0.22μm的滤膜过滤，调PH至3.7，定容至1L，得到显色底物(TMB底物)，避光保存。
终止液：包含0.51％(w/v)氨基磺酸和2％(w/v)柠檬酸的水溶液，其pH＜2.0。
阳性对照的制备：分别取0.16mg的人IgA、0.08mg的人IgG、0.32mg的人IgM，将所述人IgA、人IgG和人IgM分别加入4.2μL、2.1μL、8.4μL浓度为1mg/mL的sulfo-SMCC中，混匀后25℃反应30min，反应产物分别在PBS(0.1M磷酸钠，含0.15M氯化钠，PH7.2)中透析过夜，得到活化的人IgA、人IgG和人IgM，将所述活化的人IgA、人IgG和人IgM按照2:1:4的质量比混合均匀，作为激活抗体；
分别取0.02mg重组兔抗2019-nCoVS1蛋白单克隆抗体和0.02mg重组兔抗2019-nCoV N蛋白单克隆抗体，各加入1μL浓度为0.03mg/mL的Traut's Reagent，混匀25℃后反应30min，再分别加入0.1mg的激活抗体，得到抗2019-nCoVS1蛋白的单克隆抗体IgG-人IgA/IgG/IgM抗体的复合物和抗2019-nCoVN蛋白的单克隆抗体IgG-人IgA/IgG/IgM抗体的复合物，将抗2019-nCoVS1蛋白的单克隆抗体IgG-人IgA/IgG/IgM抗体的复合物和抗2019-nCoVN蛋白的单克隆抗体IgG-人IgA/IgG/IgM抗体的复合物按照1:1的体积比混合均匀后，稀释至0.5μg/mL，得到阳性对照。
实施例2
利用实施例1中的试剂盒对11份灭活的2019-nCoV抗体阳性血清和31份灭活的2019-nCoV抗体阴性血清进行检测，具体检测方法包括以下步骤：
S1、一抗孵育：将待测的11份阳性血清和31份阴性血清分别与用样品稀释液按1:100的体积混合，得到42份稀释样品，分别取0.1mL上述42份稀释样品加入到2019-nCoV标志蛋白包被板的孔中，每个样品加3个复孔，同时分别设置3组阴性对照和3组阳性对照封好封板膜，置于37℃恒温箱中孵育30min；
S2、第一次洗板：弃去经一抗孵育后的2019-nCoV标志蛋白包被板的孔中液体，将洗涤液稀释10倍后洗板3次；
S3、酶标孵育：向经第一次洗板后的2019-nCoV标志蛋白包被板的孔中分别加入0.1mL抗人IgA抗体酶标工作液、0.1mL抗人IgG抗体酶标工作液和0.1mL抗人IgM抗体酶标工作液，封板，37℃孵育反应30min；
S4、第二次洗板：弃去经酶标孵育后的所述2019-nCoV标志蛋白包被板的孔中液体，将洗涤液稀释10倍后洗板3-4次；
S5、显色：向经第二次洗板后的所述2019-nCoV标志蛋白包被板的孔中加0.1mL的显色底物，封板，孵育反应15min；
S6、终止显色：向经显色后的2019-nCoV标志蛋白包被板的孔中加入0.1mL所述终止液，终止显色反应；
S7、测OD值：用酶标仪分别读取经终止显色后的所述2019-nCoV标志蛋白包被板的孔中液体在波长为450nm-630nm的OD值，42组稀释样品以及3组阴性对照和阳性对照在2019-nCoV标志蛋白包被板上的分布如表1-2所示；
表1
IgG IgA IgM IgG IgA IgM IgG IgA IgM IgG IgA IgM
P1 P1 P1 P9 P9 P9 N6 N6 N6 N14 N14 N14
P2 P2 P2 P10 P10 P10 N7 N7 N7 N15 N15 N15
P3 P3 P3 P11 P11 P11 N8 N8 N8 N16 N16 N16
P4 P4 P4 N1 N1 N1 N9 N9 N9 N17 N17 N17
P5 P5 P5 N2 N2 N2 N10 N10 N10 N18 N18 N18
P6 P6 P6 N3 N3 N3 N11 N11 N11 N19 N19 N19
P7 P7 P7 N4 N4 N4 N12 N12 N12 NC NC NC
P8 P8 P8 N5 N5 N5 N13 N13 N13 PC PC PC
表2
Figure BDA0002642516440000111
Figure BDA0002642516440000121
注：P1-11分别代表11份阳性血清，N1-31分别代表31份阴性血清，NC代表阴性对照，PC代表阳性对照。
42组稀释样品以及3组阴性对照和阳性对照在2019-nCoV标志蛋白包被板上用酶标仪读取的OD450-630的值如表3-4所示；
表3
IgG IgA IgM IgG IgA IgM IgG IgA IgM IgG IgA IgM
1.291 0.412 0.365 0.749 0.466 1.502 0.069 0.068 0.049 0.049 0.05 0.049
0.651 0.555 0.145 0.249 0.23 0.306 0.062 0.065 0.004 0.004 0.038 0.036
0.132 0.103 0.25 0.658 0.051 0.075 0.014 0.18 0.028 0.012 0.006 0.057
0.947 0.261 0.237 0.019 0.005 0.071 0.109 0.061 0.041 0.049 0.035 0.06
1.108 0.988 0.043 0.063 0.084 0.062 0.068 0.059 0.037 0.19 0.018 0.139
0.705 0.261 0.635 0.133 0.1 0.043 0.038 0.058 0.04 0.152 0.043 0.049
0.619 0.091 0.721 0.075 0.079 0.006 0.054 0.039 0.027 0.061 0.033 0.045
2.349 1.237 0.296 0.067 0.085 0.074 0.073 0.037 0.038 1.224 0.875 0.591
表4
IgG IgA IgM IgG IgA IgM
0.098 0.053 0.091 0.04 0.054 0.063
0.041 0.058 0.05 0.083 0.149 0.071
0.071 0.061 0.071 0.037 0.069 0.062
0.063 0.033 0.065 0.079 0.074 0.048
0.068 0.045 0.115 0.059 0.043 0.039
0.032 0.064 0.078 1.231 0.986 0.721
0.067 0.063 0.075 BLANK BLANK BLANK
0.071 0.072 0.063 BLANK BLANK BLANK
S8、若稀释样品的OD值/相应的抗体临界值CO≥1，则检测结果为阳性，否则为阴性；
其中，IgA抗体的临界值CO＝阴性对照OD值+0.18×阳性对照OD值；
IgG抗体的临界值CO＝阴性对照OD值+0.13×阳性对照OD值；
IgM抗体的临界值CO＝阴性对照OD值+0.21×阳性对照OD值；
42组稀释样品的OD值/IgA抗体的临界值、42组稀释样品的OD值/IgG抗体的临界值和42组稀释样品的OD值/IgM抗体的临界值的计算结果如表5-6所示。
表5
IgG IgA IgM IgG IgA IgM IgG IgA IgM IgG IgA IgM
5.86 2.16 2.16 3.40 2.45 8.88 0.31 0.36 0.29 0.22 0.26 0.29
2.96 2.91 0.86 1.13 1.21 1.81 0.28 0.34 0.02 0.02 0.20 0.21
0.60 0.54 1.48 2.99 0.27 0.44 0.06 0.94 0.17 0.05 0.03 0.34
4.30 1.37 1.40 0.09 0.03 0.42 0.50 0.32 0.24 0.22 0.18 0.35
5.03 5.19 0.25 0.29 0.44 0.37 0.31 0.31 0.22 0.86 0.09 0.82
3.20 1.37 3.75 0.60 0.52 0.25 0.17 0.30 0.24 0.69 0.23 0.29
2.81 0.48 4.26 0.34 0.41 0.04 0.25 0.20 0.16 / / /
10.67 6.49 1.75 0.30 0.45 0.44 0.33 0.19 0.22 / / /
表6
IgG IgA IgM IgG IgA IgM
0.45 0.24 0.48 0.18 0.24 0.33
0.19 0.26 0.26 0.38 0.68 0.37
0.32 0.28 0.37 0.17 0.31 0.33
0.29 0.15 0.34 0.36 0.34 0.25
0.31 0.20 0.60 / / /
0.15 0.29 0.41 / / /
0.31 0.29 0.39 / / /
0.32 0.33 0.33 / / /
根据表5-6中的42组稀释样品的IgA抗体的临界值、IgG抗体的临界值和IgM抗体的临界值的计算结果，可知11份灭活的2019-nCoV抗体阳性血清中2019-nCoV抗体检测结果均为阳性，其中，IgG的阳性(稀释样品的OD值/IgA抗体的临界值≥1.0)率为92％，IgA的阳性(稀释样品的OD值/IgG抗体的临界值≥1.0)率为77％，IgM的阳性(稀释样品的OD值/IgM抗体的临界值≥1.0)率为77％。可见若用以间接法为原理的2019-nCoV抗体IgG检测试剂盒进行检测，会存在8％的假阴性结果；若用以间接法为原理的2019-nCoV抗体IgM检测试剂盒进行检测，会存在23％的假阴性结果。31份2019-nCoV抗体阴性血清检测结果均为阴性。可见利用实施例中的检测方法，2019-nCoV抗体检测的准确率为100％，可同时检测出3种2019-nCoV抗体(IgA、IgG和IgM)，且三种2019-nCoV抗体的检测结果之间互不影响。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种2019-nCoV的IgG、IgM和IgA抗体联合检测试剂盒进行2019-nCoV抗体的非诊断目的的检测方法，其特征在于：所述试剂盒包括2019-nCoV标志蛋白包被板、样品稀释液、洗涤液、抗人IgA抗体酶标工作液、抗人IgG抗体酶标工作液、抗人IgM抗体酶标工作液、显色底物、终止液和阳性对照；
所述阳性对照为抗2019-nCoV标志蛋白的单克隆抗体IgG-人IgA/IgG/IgM抗体的复合物；所述阳性对照的制备方法为：向人IgA、人IgG和人IgM中分别加入1mg/mL的sulfo-SMCC，其中人IgA、人IgG和人IgM与1mg/mL的sulfo-SMCC的质量比均为1000:20-30，于24-28℃反应25-35min，反应产物分别在PBS中透析过夜，得到活化的人IgA、人IgG和人IgM，将所述活化的人IgA、人IgG和人IgM按照1.5-2.5:1:3.5-4.5的质量比混合均匀，作为激活抗体；
向重组兔抗2019-nCoV标志蛋白单克隆抗体中加入0.03mg/mL的Traut'sReagent，其中重组兔抗2019-nCoV标志蛋白单克隆抗体与0.03mg/mL的Traut's Reagent的质量比为1000:1-2，于24-28℃反应25-35min，加入激活抗体，得到抗2019-nCoV标志蛋白的单克隆抗体IgG-人IgA/IgG/IgM抗体的复合物，将所述抗2019-nCoV标志蛋白的单克隆抗体IgG-人IgA/IgG/IgM抗体的复合物稀释至0.4-0.6μg/mL得到阳性对照；
所述的试剂盒进行2019-nCoV抗体的非诊断目的的检测方法，包括以下步骤：
S1、一抗孵育：将待测血清与所述样品稀释液按1:100的体积混合，得到稀释样品，将所述稀释样品加入到所述2019-nCoV标志蛋白包被板的孔中，同时设置阴性对照和阳性对照，封板，37℃孵育25-35min；
S2、第一次洗板：弃去经一抗孵育后的所述2019-nCoV标志蛋白包被板的孔中液体，将洗涤液稀释10倍后洗板3-4次；
S3、酶标孵育：向经第一次洗板后的所述2019-nCoV标志蛋白包被板的孔中分别加入所述抗人IgA抗体酶标工作液、所述抗人IgG抗体酶标工作液和所述抗人IgM抗体酶标工作液，封板，37℃孵育反应25-35min；
S4、第二次洗板：弃去经酶标孵育后的所述2019-nCoV标志蛋白包被板的孔中液体，将洗涤液稀释10倍后洗板3-4次；
S5、显色：向经第二次洗板后的所述2019-nCoV标志蛋白包被板的孔中加入所述显色底物，封板，孵育反应10-20min；
S6、终止显色：向经显色后的所述2019-nCoV标志蛋白包被板的孔中加入所述终止液，终止显色反应；
S7、测OD值：用酶标仪分别读取经终止显色后的所述2019-nCoV标志蛋白包被板的孔中液体在波长为450nm-630nm的OD值；
S8、若所述稀释样品的OD值/相应的抗体临界值CO≥1，则检测结果为阳性，否则为阴性；其中，IgA抗体的临界值CO＝阴性对照OD值+0.18×阳性对照OD值；IgG抗体的临界值CO＝阴性对照OD值+0.13×阳性对照OD值；IgM抗体的临界值CO＝阴性对照OD值+0.21×阳性对照OD值。
2.如权利要求1所述的试剂盒进行2019-nCoV抗体的非诊断目的的检测方法，其特征在于：所述2019-nCoV蛋白包被板的制备方法具体包括以下步骤：
a、抗原蛋白包被：将2019-nCoV标志蛋白用包被液稀释至1-2μg/mL，加入到聚苯乙烯96孔板中，封板，37℃包被1.5-2.5h；
b、洗板：甩掉经2019-nCoV标志蛋白包被的所述96孔板中多余的液体，用清洗液洗涤3-4次；
c、封闭：用封闭液封闭经洗板后的所述96孔板，封板，37℃封闭2-3h；
d、干燥：甩掉经封闭后的所述96孔板中的所述封闭液，干燥后得到所述2019-nCoV标志蛋白包被板。
3.如权利要求2所述的试剂盒进行2019-nCoV抗体的非诊断目的的检测方法，其特征在于：步骤a中，所述2019-nCoV标志蛋白为质量比为0.8-1.2:1的2019-nCoV S1蛋白和2019-nCoV N蛋白；和/或
步骤a中，所述包被液为pH7.2-7.5的0.01M磷酸盐溶液；和/或
步骤a中，将所述2019-nCoV标志蛋白用包被液稀释至1-2μg/mL，以每孔0.1-0.2mL的加入量加入到所述聚苯乙烯96孔板中；和/或
步骤b中，所述清洗液为pH7.2-7.5且含有0.9％(w/v)氯化钠和0.05％(v/v)吐温20的0.1M磷酸钠溶液；和/或
步骤c中，所述封闭液为含5％(w/v)海藻糖的1％(w/v)BSA溶液；和/或
步骤c中，所述96孔板中每孔所述封闭液的加入量为0.2-0.3mL；和/或
步骤d中，所述干燥方法为：在湿度为10-20％的环境下通风干燥1-3h。
4.如权利要求1所述的试剂盒进行2019-nCoV抗体的非诊断目的的检测方法，其特征在于：每升所述样品稀释液中含有十二水合磷酸氢二钠2.8-3.0g、二水合磷酸二氢钠0.294-0.298g、氯化钠8.760-8.770g、海藻糖9-11g、BSA9-11g、吐温20 0.4-0.6mL、ProClin3000.4-0.6mL和余量的纯水；所述样品稀释液的pH为7.2-7.5；和/或
每升所述洗涤液中含有十二水合磷酸氢二钠2.8-3.0g，二水合磷酸二氢钠0.295-0.297g，氯化钠8.765-8.767g，9-11g海藻糖，BSA 9-11g，吐温20 0.4-0.6mL，ProClin3000.4-0.6mL和余量的纯水；所述洗涤液的pH为7.2-7.5。
5.如权利要求1所述的试剂盒进行2019-nCoV抗体的非诊断目的的检测方法，其特征在于：所述抗人IgA抗体酶标工作液的制备方法为：按照HRP标记试剂盒的标记方法标记羊抗人IgA抗体，得到抗人IgA抗体酶标，用HRP稳定剂稀释所述抗人IgA抗体酶标至其浓度为10-22ng/mL，得到所述抗人IgA抗体酶标工作液；
所述抗人IgG抗体酶标工作液的制备方法为：按照HRP标记试剂盒的标记方法标记羊抗人IgG抗体，得到抗人IgG抗体酶标，用HRP稳定剂稀释所述抗人IgG抗体酶标至其浓度为28-32ng/mL，得到所述抗人IgG抗体酶标工作液；
所述抗人IgM抗体酶标工作液的制备方法为：按照HRP标记试剂盒的标记方法标记羊抗人IgM抗体，得到抗人IgM抗体酶标，用HRP稳定剂稀释所述抗人IgM抗体酶标至其浓度为23-27ng/mL，得到所述抗人IgM抗体酶标工作液。
6.如权利要求1所述的试剂盒进行2019-nCoV抗体的非诊断目的的检测方法，其特征在于：每升所述显色底物包含一水合柠檬酸14.23-14.25g、二水合磷酸氢二钠11.44-11.48g、3,3′,5,5′-四甲基联苯胺二盐酸盐0.5-1.7g、3％过氧化氢2.5-3.5mL，TritonX-100 0.8-1.2mL，丙三醇0.4-0.6mL和余量的水，所述显色底物的pH为3.5-4.0；和/或
所述终止液为包含0.1％-1％(w/v)氨基磺酸和0.5％-5％(w/v)柠檬酸的水溶液，其pH＜2.0。
7.如权利要求1所述的试剂盒进行2019-nCoV抗体的非诊断目的的检测方法，其特征在于：所述重组兔抗2019-nCoV标志蛋白单克隆抗体由质量比为0.8-1.2:1的重组兔抗2019-nCoV S1蛋白单克隆抗体和重组兔抗2019-nCoV N蛋白单克隆抗体组成；和/或
所述激活抗体的加入量相当于所述重组兔抗2019-nCoV标志蛋白单克隆抗体质量的2-3倍。
8.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述阴性对照为样品稀释液；和/或
步骤S1中，所述稀释样品、所述阴性对照和所述阳性对照分别在所述2019-nCoV标志蛋白包被板上重复添加3-4个孔；和/或
步骤S1中，所述稀释样品加入到所述2019-nCoV标志蛋白包被板的孔中的加入量为0.08-0.12mL；和/或
步骤S3中，所述抗人IgA抗体酶标工作液、所述抗人IgG抗体酶标工作液和所述抗人IgM抗体酶标工作液分别加入所述2019-nCoV标志蛋白包被板的孔中的加入量为0.08-0.12mL；和/或
步骤S5中，所述显色底物在所述2019-nCoV标志蛋白包被板的孔中的加入量为0.08-0.12mL；和/或
步骤S6中，所述终止液在所述2019-nCoV标志蛋白包被板的孔中加入量为0.08-0.12mL。
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