CN101769926A - 优生优育五项指标集成检测反应板及试剂盒 - Google Patents

Abstract

为提高TORCH五项指标临床检测的效率，降低检测时间与成本，本发明提供一种用于平行检测优生优育相关五项病毒感染的集成反应板，以及包括该反应板的试剂盒。本发明提供的集成检测反应板，包括基片和阵列式分布于基片上的点样指标，所述的点样指标包括：弓形虫抗原(Strain RH)，风疹病毒抗原(HPV-77)，巨细胞抗原(AD169)，单纯疱疹I型抗原(HSV1)和单纯疱疹II型抗原(HSV2)。使用本发明进行优生优育五项病原体抗体的检测，具有样品量少、省时、省力、准确度高的特点。

Description

优生优育五项指标集成检测反应板及试剂盒

技术领域

本发明属于体外临床检验和生物芯片技术领域，尤其涉及一种用于优生优育相关五项病毒感染指标检测有关的集成反应板及试剂盒。

背景技术

“TORCH”一词由Nahmias于1971年撰造的，是一组病原微生物的英文名称字头组合，其中TO代表刚地弓形体(Toxoplasma gondi，Toxo)，R代表风疹病毒(Rubella Virus，RV)，C代表巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)，H代表单纯疱疹I型和单纯疱疹II型病毒(HerpesSimplex Virus I and II，HSVI、HSV2)，TORCH的英文词义为“火把、火炬”，将这几种病原微生物缩合为“TORCH”一词的目的是提示其重要意义，以期引起妇产科和儿科医生的重视。

这五种病原体感染的范围广、危害大，孕妇由于内分泌系统的改变导致机体免疫力下降，容易发生原发性感染，以前感染过的孕妇体内潜伏的病毒也容易被激活而发生复发感染。妊娠期感染不仅危害母体，往往还对胎儿和新生儿产生严重不良后果，可以导致流产、早产、死胎或胎儿生长迟缓和发育畸形，通过产道和母乳可以引起新生儿感染，如果累及神经系统，可造成不同程度的智力障碍以及各种瘫痪、失聪、失明等严重后遗症，从而影响人口素质。TORCH感染在围产医学中称之为“TORCH综合征”，已经受到全世界医学界尤其是妇产科和儿科医生的高度重视。欧美等发达国家早在七十年代就将风疹、弓形体、巨细胞病毒等检测列为孕期筛查项目，目前在我国的北京、上海、广东、山东、福建、湖南、江西等地的医疗及计划生育部门也逐步开展了孕早期TORCH检测工作，随着国家优生优育工作的深入进行，人们将更加重视对TORCH感染的检测及预防。

弓形虫感染的危害。该种感染，是一种人畜共患疾病，广泛分布于世界各地。尤其是家庭饲养猫等宠物者。传染给饲养者、接触者的可能性较大。妊娠期初次感染者，弓形虫可通过胎盘感染胎儿，孕早期感染者可引起流产、死胎、胚胎发育障碍；妊娠中、晚期感染者，可引起宫内胎儿生长迟缓和一系列中枢神经系统损害(如无脑儿、脑积水、小头畸形、智力障碍等)、眼损害(如无眼、单眼、小眼等)以及内脏的先天损害(如食管闭锁)等，严重威胁胎儿健康。

风疹病毒的危害。风疹是由风疹病毒引起的，该病毒感染具有严重的危害。不过，儿童感染风疹仅仅是一种症状较轻的出疹性疾病。但若是孕妇感染，特别是在怀孕初期感染风疹病毒，可以经胎盘垂直传播感染胎儿，不仅可以导致孕妇流产、死胎、死产、早产，对存活的胎儿，会导致先天性风疹综合征，表现为先天性白内障、先天性心脏病、神经性耳聋、失明、小头畸形和智力障碍等。

巨细胞病毒感染的危害。CMV感染在人类相当普遍，多数人在儿童或少年期受CMV感染而获免疫。临床观察证实，CMV往往存在于唾液、尿、乳汁、泪液、粪便、阴道、宫颈分泌物、血液、精液中，因此病毒可通过多种途径传播。CMV可通过胎盘感染胎儿，引起早产、胎儿发育迟缓、新生儿畸形、黄疸、肝脾肿大、溶血性贫血、视网膜脉络膜炎等，新生儿死亡率高。

单纯疱疹病毒感染的危害。HSV感染主要引起疱疹性口腔炎、疱疹性角膜结膜炎、疱疹性脑膜炎、疱疹性外阴引导炎、湿诊性疱疹、新生儿疱疹等。孕早期感染HSV者能破坏胚芽而导致流产，妊娠中、晚期感染者虽少发畸胎，但可引起胎儿和新生儿发病。

在临床上对孕妇进行ToRCH感染产前监测，采取相应措施，可减少畸形儿等病儿出生，避免流产、死胎等现象发生。近年来，世界上许多先进的国家已将ToRCH-IgM作为孕期常规筛查项目。

目前ToRCH感染的实验室诊断常采用ELISA、金标、PCR等方法。常规的ELISA检测的是抗体，常检测IgM和IgG抗体，即可判断近期感染(IgM指标)，又可检测人群抗体(免疫力)水平(IgG指标)；但是如果要对弓形虫(Toxopasma)，风疹病毒(Rubella.Virus)，巨细胞(Cytomegalo.Virus)，单纯疱疹I型和单纯疱疹II型(Herpes.Virus)5种病原体进行检测，就需要十几种试剂盒才能将所有的IgG和IgM检测完毕，每次反应只能检测一个指标，速度慢、效率低、费用昂贵、需要样本的量大。且目前市面上所用的试剂盒中的抗原均为病原体培养物的粗提抗原，其病毒含量低，成分复杂，本底较高；病原体之间的交叉反应严重，特异性、敏感性稳定性相差很大；另外实验中所用的底物也是剧毒化学品，对实验人员的健康也有潜在的威胁。

而金标试剂操作简单，适合基层单位使用，但大多特异性不强，灵敏度也不高，不能确诊；PCR具有灵敏度极高的特点，直接检测病原体基因，但是不能判定人群抗体水平，且容易出现假阳性问题，国家卫生部已经下文在临床上禁用。

蛋白芯片(proteinchip)技术是集微电子、微机械、化学物理技术、计算机技术为一体日的一门高新技术，被认为是生命科学中的高效工具，是将各种蛋白质有序地固定于载体上成为检测用的芯片利用蛋白芯片检测仪测定芯片上各点的光强度，分析蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系，由此测定各类蛋白质功能的目的。利用这项技术可同时对多种蛋白质进行平行平行检测分析，使得用常规ELISA技术需上千次才能完成的分析在蛋白质芯片上仅需一次就可以完成，并且检测到的平行数据误差更小，更准确。

发明内容

为提高TORCH五项指标临床检测的效率，降低检测时间与成本，本发明提供一种用于平行检测优生优育相关五项病毒感染的集成反应板，以及包括该反应板的试剂盒。

本发明的技术方案如下：提供一种优生优育五项指标集成检测反应板，包括基片和阵列式分布于基片上的点样指标，所述的点样指标包括：弓形虫抗原(Strain RH)，风疹病毒抗原(HPV-77)，巨细胞抗原(AD169)，单纯疱疹I型抗原(HSV1)和单纯疱疹II型抗原(HSV2)。

所述的基片可以是NC膜，玻璃基片、硅片或PDVF膜。

所述的基片上分隔有1-100个反应孔。

所述的点样指标在基片上有2-10个重复点样。

所述的基片上还包括定位基准点；所述的定位基准点为兔抗人IgG。

本发明还提供一种优生优育五项指标集成检测试剂盒，包括上述的优生优育五项指标集成检测反应板。

所述的优生优育五项指标集成检测试剂盒，还包括：酶标工作液和检测液、阴性对照、阳性对照、浓缩洗涤液、样本稀释液。

所述的优生优育五项指标集成检测试剂盒中，所述的酶标工作液由HRP标记的兔抗人IgG二抗和兔抗人IgM二抗组成；所述的检测液由发光物和过氧化氢二种试剂组成。

所述的优生优育五项指标集成检测试剂盒中，所述的发光物为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物。

所述的优生优育五项指标集成检测试剂盒的又一优选例如下；

所述的浓缩洗涤液可以是PH7.0-PH8.0的中性缓冲液；

所述的阴性对照和样本缓冲液可以是含有1％-5％的BSA(牛血清白蛋白)的PH7.0-PH8.0的中性缓冲液；

所述的阳性对照提供2瓶，分为阳性对照I、阳性对照II；所述的阳性对照I由羊抗鼠IgG与样本稀释液组成；阳性对照II由羊抗鼠IgM与样本稀释液组成。

本发明提供的优生优育五项指标集成检测反应板及试剂盒具有以下优越性：

1.本发明实现了把不同病原体抗原同时点阵于一张芯片上，进行多项指标的同时检测，所需的样本量少(50-100μl)，仅通过一次反应就可得到多指标的反应结果，大大提高了检测速度和效率，可为临床节约人力、物力、财力。

2.可同时在一张芯片上检测多人份样品的IgG和IgM；利用辣根过氧化物酶标记二抗，仅通过一次反应就可得到多种指标的反应结果，简单快速，又降低了检测费用。

3.保留了Elisa技术的高度特异性，监测结果稳定，可靠性强，有利于临床早期的诊断治疗。

4.制作工艺简单，操作安全，实用性强。

总之，使用本发明进行优生优育五项病原体抗体的检测，具有样品量少、省时、省力、准确度高的特点。

附图说明

图1是优生优育五项集成检测反应板的外观图，1为反应区域，底部为点样涂层的基片。

图2是点样阵列示意图，第1行为兔抗人IgG即定位基准点；其余各行分别为蛋白检测指标点样Strain RH、HPV-77、AD169、HSV1和HSV2，第一行Strain RH、HPV-77，第二行AD169、HSV1，第三行HSV2，各有5个重复点样。

图3是优生优育五项指标集成检测反应板试剂盒示意图。2代表浓缩洗涤液；3分别代表1瓶酶标工作液I、II；4代表2瓶配套使用的检测试剂；5代表阳性对照品I、II、阴性对照品；6代表样本稀释液。

图4为检测血清时加样示意图，其中矩形表示所在加样区域为待测样本IgG检测区，五边形表示所在加样区域为待测样本IgM检测区，正方形表示阳性对照孔，椭圆形表示为阴性对照孔。

图5为结果检测为阴性的反应区阵列图，其中左上角阳性信号为定位基准点的信号，其他5项指标无信号。

图6为结果检测为阳性的反应区阵列图，其中左上角阳性信号为定位基准点的信号，弓形虫(Toxopasma)抗体和风疹病毒((Rubella.Virus)抗体为强阳性。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：

一种优生优育五项指标集成检测反应板的制备

其步骤主要是：(1)准备基质硝酸纤维素膜；(2)设计芯片，确定点阵的排列方式和点样位置；(3)点样针从384孔板吸出抗体喷点于硝酸纤维素膜上；(4)装配硝酸纤维素膜，并且进行封闭、干燥、包装、保存。

上述用于检测优生优育五项指标的反应板制备方法具体包括以下步骤：

1.优生优育检测相关五项指标的点样抗原的确定：

购于BioDesign的Toxoplasma gondii Antigen(Strain RH)、Rubella Antigen(HPV-77)、Cytomegalovirus Ag(AD169)、Herpes Simplex VirusI(HSV1)以及Herpes Simplex VirusII(HSV2全病毒抗原。

酶标二抗的确定：

购于BioDesign的酶标记兔抗人IgG二抗和酶标记兔抗人IgM二抗。

2.点样制备具检测指标涂层的膜芯片

(1)用Gesim点样仪喷点，点样针从384孔板吸出抗体喷点于硝酸纤维素膜上，点阵形式为4×4矩形阵列(见图2)，当点直径为0.1mm，点横向间距为0.6mm，抗体阵列的大小为6mm×5mm；

(2)对喷点抗原、阳性对照点的反应板用封闭液进行封闭，每反应孔加封闭液100μl，室温2小时，封闭基片表面非特异性位点；封闭液采用pH7.4的磷酸缓冲液PBS配制的3％BSA、5％海藻糖溶液。

(3)甩干封闭液后，室温放置4小时，进行干燥，最后包装后于4℃保存。

3.优生优育五项指标集成检测反应板组装

用具有分隔反应区域的器具将反应区域固定。组装方式见ZL032298900。组装完成后的示意图如图1。

实施例2：

优生优育五项指标集成检测试剂盒的制备

包括优生优育五项指标集成检测反应板，阴性对照品，阳性对照品I、II，样本稀释液，酶标工作液I、II，浓缩洗涤液，检测液A、B组成；各部分为瓶装，用纸质模板固定于包装盒内(如图3)，不限放置方式，检测时配套使用。以下是各部分的制备方法：

1.优生优育检测蛋白芯片为6×8孔板，由硝酸纤维素膜做为片基，组装方式见ZL032298900。完成后外观图见图1。

2.阴性对照5提供1瓶，每瓶0.4ml；

由3％BSA和0.05％防腐剂(ProclinTM 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)配制而成。提供1瓶，0.4ml。

3阳性对照5提供2瓶，每瓶0.2ml；

阳性对照5分为阳性对照I、阳性对照II。其中阳性对照I由20ng/ml羊抗鼠IgG与样本稀释液组成；阳性对照II由20ng/ml羊抗鼠IgM与样本稀释液组成。

4.样本稀释液6提供1瓶，每瓶9ml；

由3％BSA和0.05％防腐剂(ProclinTM 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)配制而成。提供1瓶，9ml。用于稀释血清样本(体积比1∶1)。

5.酶标工作液3提供2瓶，每瓶6ml；

酶标工作液3分为酶标工作液I和酶标工作液II。由3％BSA和0.05％防腐剂(ProclinTM300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)配成溶液，其中酶标工作液I中含有HRP标记的兔抗人IgG，酶标工作液II中含有HRP标记的兔抗人IgM。提供6ml，各1瓶。

6.浓缩洗涤液2(10×)提供50ml，1瓶；

磷酸盐缓冲液2由以下方法配置而成：磷酸二氢钾6.8g，磷酸氢二钠7.1g，TWEEN-2010ml，溶于1000ml纯化水。各化学物质均为分析纯。

提供50ml，1瓶。使用前用450ml去离子水稀释，混匀。

7.检测液4

检测液4分为A液、B液，使用PIERCE公司的ELISA Femto MaximumSensitivity Substrate作为配套检测液。A液、B液各1瓶，每瓶0.6ml。

实施例3：

优生优育五项指标集成检测试剂盒的应用及检测

本发明所述的用于检测优生优育五项指标集成检测试剂盒的应用，主要采用抗原-抗体-酶标二抗方法检测人血液中的优生优育五项抗体。方法是将人血清加于芯片表面，样本中的抗体分别于固定在芯片上的相对应的抗原结合，甩干后加入酶标二抗反应，洗去未结合的二抗，加入检测液后1分钟，扫描并收集信号，样本点的信号强度与血清中抗体的浓度成正比。

在上述用于检测优生优育五项的蛋白芯片试剂盒的应用中，其抗原抗体反应及检测的具体实施例如下：

(1)在芯片的反应区域，加入经样本稀释液6以1∶20稀释的人血清样品，以及阴性对照5、阳性对照5，(加样方式见示意图4)；每孔加100ul，置于恒温反应仪中37℃，振荡反应1小时，使抗原与抗体充分反应；反应结束后，吸干反应液；

(2)加样：于A、C、E、G列每孔加入酶标工作液I，B、D、F、H列每孔加入酶标工作液II100ul，置于恒温反应仪中37℃，振荡反应30分钟。反应结束后用10倍稀释的浓缩洗涤液在摇床上振荡洗涤三次，每次1分钟；倒去洗涤液；

(3)将PIERCE公司的

ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate的配套使用的检测液A液和B液1∶1混合，加入芯片上各反应区域上，每阵列加60ul，进行化学发光；

(4)用CCD检测仪进行化学发光的扫描并收集信号，依据扫描结果显示分析检测结果。

如图5为结果检测为阴性的阵列图，图6为结果检测为阳性的阵列图。

结果判定：

A.依据不同指标的CutOff值(判断临界值)(见表1)，参考阴性对照，判定样品血清的阴阳性。

IgG项检测	CutOff值	IgM项检测	CutOff值
				Toxo-IgG	阴性对照信号值+58	Toxo-IgM	阴性对照信号值+64
Rv-IgG	阴性对照信号值+34	Rv-IgM	阴性对照信号值+30
				Cmv-IgG	阴性对照信号值+70	Cmv-IgM	阴性对照信号值+68
HsvI-IgG	阴性对照信号值+28	HsvI-IgM	阴性对照信号值+30
				HsvII-IgG	阴性对照信号值+34	HsvII-IgM	阴性对照信号值+37

表1

当所测指标的信号指大于所设CutOff值时，判断结果为阳性；小于CutOff值时，判断结果为阴性。

B.灰区值的设定

灰区值＝CutOff值×(1±10％)，当信号值处于灰区时，需将待测样本再重复测2次，以多次相同测定结果为准。

与此同时，用常规方法对测试的血清样品进行常规检测。结果表明，用本发明的试剂盒得出的测试结果与常规方法相同。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权力要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种优生优育五项指标集成检测反应板，包括基片和阵列式分布于基片上的点样指标，其特征在于，所述的点样指标包括：弓形虫抗原(Strain RH)，风疹病毒抗原(HPV-77)，巨细胞抗原(AD169)，单纯疱疹I型抗原(HSV1)和单纯疱疹II型抗原(HSV2)。

2.如权利要求1所述的优生优育五项指标集成检测反应板，其特征在于，所述的基片可以是NC膜，玻璃基片、硅片或PDVF膜。

3.如权利要求1所述的集成检测反应板，其特征在于，所述的基片上分隔有1-100个反应孔。

4.如权利要求1所述的集成检测反应板，其特征在于，所述的点样指标在基片上有2-10个重复点样。

5.如权利要求1所述的集成检测反应板，其特征在于，基片上还包括定位基准点；所述的定位基准点为兔抗人IgG。

6.一种优生优育五项指标集成检测试剂盒，其特征在于，它包括权利要求1所述的优生优育五项指标集成检测反应板。

7.如权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括：酶标工作液和检测液、阴性对照、阳性对照、浓缩洗涤液、样本稀释液。

8.如权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的酶标工作液由HRP标记的兔抗人IgG二抗和兔抗人IgM二抗组成；所述的检测液由发光物和过氧化氢二种试剂组成。

9.如权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的发光物为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物。

10.如权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，

所述的浓缩洗涤液可以是PH7.0-PH8.0的中性缓冲液；

所述的阴性对照和样本缓冲液可以是含有1％-5％的BSA(牛血清白蛋白)的PH7.0-PH8.0的中性缓冲液；

所述的阳性对照提供2瓶，分为阳性对照I、阳性对照II；所述的阳性对照I由羊抗鼠IgG与样本稀释液组成；阳性对照II由羊抗鼠IgM与样本稀释液组成。

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