CN117233378B - 用于抗体定量检测的荧光免疫层析试纸条及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于抗体定量检测的荧光免疫层析试纸条及其制备方法。本发明的荧光免疫层析试纸条包括底板和依次搭载在底板上的样本垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，其中硝酸纤维素膜上设有抗体检测线和质控线，抗体检测线由胶乳微球标记的抗原形成。本发明的荧光免疫层析试纸条相比现有技术中抗原直接包被的形式，胶乳微球标记的抗原对待测抗体的特异性捕获效率更高，荧光强度更高，检测灵敏度更高，同时胶乳微球标记的抗原稳定性和重复性性能出色，检测结果更加准确。本发明的荧光免疫层析试纸条作为多抗体联合检测试纸条时，可以保证每个待测抗体检测灵敏度、重复性和特异性，实现快速检测。
Description
技术领域
本发明属于体外诊断生化检测技术领域，具体涉及用于抗体定量检测的荧光免疫层析试纸条及其制备方法。
背景技术
基于荧光免疫层析技术的抗体检测相比酶联免疫法等方法的自动化程度更高，应用前景更广。对于荧光免疫层析试纸条的检测性能的提高主要在于检测灵敏度和重复性的提高，进而提高检测结果准确度，降低漏检率。
另外，在临床中，通常需要结合多个相关抗体水平辅助疾病诊断。例如抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）是指与中性粒细胞及单核细胞胞浆中溶酶体酶发生反应的抗体，是鉴别诊断血管炎的重要标记物，分胞浆型（c-ANCA）和核周型（p-ANCA）两种。髓过氧化物酶（MPO）是p-ANCA的主要靶抗原，蛋白酶3（PR3）是胞浆型ANCA（c-ANCA）的主要靶抗原，抗MPO抗体和抗PR3抗体临床上用于韦格纳肉芽肿（WG）等原发性系统性血管炎的辅助诊断。抗肾小球基底膜抗体（抗GBM抗体）同样作为血管炎鉴定诊断指标之一，在检测抗髓过氧化物酶抗体、抗蛋白酶3抗体的同时，联合检测抗肾小球基底膜抗体，满足同时检测血管炎三项指标可对ANCA相关小血管炎的诊断、治疗和预后判断有重要的临床意义。目前市面上还未见同时检测抗MPO抗体和抗PR3抗体的荧光免疫层析试纸条或同时检测抗MPO抗体、抗PR3抗体和抗GBM抗体的荧光免疫层析试纸条。
在自身免疫性疾病的实际诊断中，由于一种自身免疫性疾病可检测出多种自身抗体，因此临床往往需要参考多种免疫指标才能得出正确的诊断，联合检测可大幅减少因单项检测出现的漏诊问题，然而常规的单抗体检测试纸条一次只能检测一种抗体水平，而多指标检测则需要不同的检测试纸条，成本高，耗时长，样本所需量大。而多抗体荧光免疫层析试纸条，需要同时保证多个抗体的检测灵敏度、特异性和准确度，开发难度更高。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测灵敏度更高、重复性更好的用于抗体定量检测的荧光免疫层析试纸条。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种用于抗体定量检测的荧光免疫层析试纸条，包括底板和依次搭载在所述底板上的样本垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述结合垫上包被有荧光微球标记的抗人IgG抗体和荧光微球标记的DNP-BSA，所述硝酸纤维素膜上设有抗体检测线和质控线，所述抗体检测线由包被在所述硝酸纤维素膜上的胶乳微球标记的抗原形成，所述胶乳微球的粒径为100nm~400nm。
优选地，所述胶乳微球的粒径为135nm~250nm，例如135nm、140nm、145nm、150nm、155nm、160nm、165nm、170nm、175nm、180nm、185nm、190nm、195nm、200nm、205nm、210nm、215nm、220nm、225nm、230nm、235nm、240nm、245nm、250nm。
进一步优选地，所述胶乳微球的粒径为150nm~230nm。
再进一步优选地，所述胶乳微球的粒径为160nm~220nm。
更进一步优选地，所述胶乳微球的粒径为180nm~200nm。
优选地，所述荧光微球为铕螯合荧光微球。
优选地，所述荧光微球的粒径为100nm~300nm，例如100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm、210nm、220nm、230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、290nm、300nm。
进一步优选地，所述荧光微球的粒径为150nm~250nm。
更进一步优选地，所述荧光微球的粒径为180nm~220nm。
优选地，所述硝酸纤维素膜上设有多条互不干涉的抗体检测线，不同抗体检测线上包被的抗原不同。
进一步优选地，所述硝酸纤维素膜上设有2~4条互不干涉的抗体检测线，相邻两条抗体检测线之间的距离为4mm~5mm。
进一步优选地，所述胶乳微球标记的抗原选自胶乳微球标记的MPO抗原、胶乳微球标记的PR3抗原、胶乳微球标记的GBM抗原。
优选地，所述样本垫为包被有酪蛋白、吐温、海藻糖和异嗜性抗体阻断剂的玻璃纤维素膜。
优选地，所述结合垫采用玻璃纤维素膜，其上包被的荧光微球标记的抗人IgG抗体和荧光微球标记的DNP-BSA的体积比为（8~20）:1，进一步优选为（10~15）:1，再进一步优选为（12~15）:1。
优选地，所述质控线由包被在所述硝酸纤维素膜上的DNP抗体形成。
本发明还提供上述用于抗体定量检测的荧光免疫层析试纸条的制备方法，所述制备方法包括：
采用样本垫封闭液处理第一玻璃纤维膜制得样本垫；
将含有荧光微球标记的抗人IgG抗体和荧光微球标记的DNP-BSA的喷金液喷涂到第二玻璃纤维素膜上，经烘干制得所述结合垫；
将胶乳微球标记的抗原包被在硝酸纤维素膜上形成检测线，将DNP抗体包被在硝酸纤维素膜上形成质控线；
将样本垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸以及底板组装得到所述用于抗体定量检测的荧光免疫层析试纸条。
具体地，所述样本垫封闭液的配方为：0.1~0.5wt%酪蛋白、0.5~1.5wt%吐温、3~8wt%海藻糖、0.05~0.2mg/mL异嗜性抗体阻断剂，其余为pH值为8~9、浓度为40~60mM的Tris缓冲液。
根据一些具体实施方式，采用样本垫封闭液浸润第一玻璃纤维膜，然后在30℃~60℃下烘干，制得所述样本垫。
根据一些具体实施方式，在所述喷金液中，所述荧光微球标记的抗人IgG抗体的体积占比为30~50%，所述荧光微球标记的DNP-BSA的体积占比为1~5%。
根据一些具体实施方式，将所述喷金液喷涂到所述第二玻璃纤维膜上，在30℃~60℃下烘干，制得所述结合垫。
根据一些具体实施方式，使用含有2~8wt% 海藻糖和2~8wt% BSA的pH值为7.2~7.8的浓度为8~12mM的 PB缓冲液混合胶乳微球标记的抗原得到胶乳微球标记的抗原包被液，将所述胶乳微球标记的抗原包被液在所述硝酸纤维素膜上划线，在30℃~60℃下烘干，形成所述抗体检测线。
根据一些具体实施方式，使用含有2~8wt% 海藻糖的pH值为7.2~7.8的浓度为8~12mM的 PB缓冲液混合DNP抗体得到DNP抗体包被液，将所述DNP抗体包被液在所述硝酸纤维素膜上划线，在30℃~60℃下烘干，形成所述质控线。
根据一些具体实施方式，所述样本稀释液的配方为：0.15~0.25g/L磷酸二氢钠，1.0~1.5g/L磷酸氢二钠，5~10g/L氯化钠，0.3~0.8wt%防腐剂和0.3~0.8wt%吐温，其余为pH值为7.2~7.6、浓度为5~15mM的PBS缓冲液。
优选样本稀释液中防腐剂为Proclin 300，吐温为吐温-20。
本发明还提供一种基于荧光免疫分析的抗体定量检测系统，所述抗体定量检测系统包括荧光免疫分析仪、上述荧光免疫层析试纸条和样本稀释液，所述荧光免疫层析试纸条上设有ID卡，所述ID卡中存储有标定数据和/或标准曲线。
本发明的抗体定量检测系统的检测方法包括以下步骤：
（1）将所述荧光免疫层析试纸条插入所述荧光免疫分析仪，读取所述ID卡上的标定数据和/或标准曲线，读取完毕后拔下所述荧光免疫层析试纸条；
（2）可选择性地采用样本稀释液稀释待测样本，将未稀释或稀释后的待测样本滴加到所述荧光免疫层析试纸条上，静置反应5min~15min，未稀释或稀释后的待测样本依次经过所述样本垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素膜到达所述吸水纸上；
（3）将静置反应后的荧光免疫层析试纸条再次插入所述荧光免疫分析仪，读取所述抗体检测线和所述质控线的荧光强度，根据所述标定数据和/或标准曲线计算并输出待测样本的待测抗体浓度。
本发明与现有技术相比具有如下优势：
本发明的荧光免疫层析试纸条中硝酸纤维素膜上的检测线由胶乳微球标记的抗原形成，相比现有技术中抗原直接包被的形式，胶乳微球标记的抗原对待测抗体的特异性捕获效率更高，荧光强度更高，检测灵敏度更高，同时胶乳微球标记的抗原稳定性更好，检测重复性更好，检测结果更加准确。本发明的荧光免疫层析试纸条可以是单抗体检试纸条或多抗体联合检测试纸条，作为多抗体联合检测试纸条时，可以在保证每个待测抗体检测灵敏度、重复性和特异性的同时，降低样本所需量，实现快速检测。
附图说明
图1为实施例1中MPO&PR3联合检测试纸条的结构示意图；
图2为实施例6中MPO&PR3&GBM联合检测试纸条的结构示意图，
图中：1、PVC底板；2、样本垫；3、结合垫；4、硝酸纤维素膜；5、吸水纸；6、质控线；7、抗MPO抗体检测线；8、抗PR3抗体检测线；9、抗GBM抗体检测线。
具体实施方式
本发明中的免疫荧光层析试纸条基于免疫荧光间接法，如果待测样本中含有待测抗体，那么待测样本中的待测抗体会与样品垫中的荧光微球标记的鼠抗人IgG结合并通过毛细作用沿着硝酸纤维素膜层析，当达到检测区后，被对应检测线（T线）上固定的抗原捕获，检测线上结合的荧光微球标记的鼠抗人IgG的量分别与样品中待测抗体的量成正比，通过荧光免疫分析仪根据荧光强度和标准曲线计算得到待测样本中待测抗体的含量。提高抗原对待测抗体的捕获效率是提高荧光信号从而提高检测灵敏度的关键，同时提高形成检测线的抗原与硝酸纤维素膜结合的稳定性是提高检测重复性的关键。为此，本申请发明人进行了深入研究和大量实验验证，得以提出能够进一步提高抗体捕获效率并提高结合稳定性的方法，进而开发出检测灵敏度更高、重复性更好、检测结果更准确的免疫荧光层析试纸条。本发明首次将胶乳微球标记的抗原在硝酸纤维素膜上形成检测线，还进一步对胶乳微球的粒径选择进行了研究，发现在一定粒径范围内的胶乳微球对抗原的稳定性及抗体检测灵敏度的提高更明显。
下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
以下实施例和对比例中的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法，所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。
实施例中所用的试剂和仪器设备的来源：荧光免疫分析仪为迪亚莱博（张家港）生物科技有限公司生产的干式荧光免疫分析仪DL300；鼠抗人IgG抗体购自北京博尔西生物科技有限公司，货号B1423；荧光微球为铕螯合荧光微球，粒径为200nm，货号EU0200C1，购自杭州博岳生物技术有限公司；货号ATP02-10的PR3抗原、货号ATM01-10的MPO抗原、货号ATG02-10的GBM抗原均购自AROTEC公司；硝酸纤维素膜购自德国赛多利斯公司；玻璃纤维素膜购自奥斯龙公司，货号1UN14ER100025NT；胶乳微球均购自北京博尔迈生物技术有限公司；异嗜性抗体阻断剂购自宝德康体（北京）生物科技有限公司，货号3KC028；二硝基苯酚偶联牛血清白蛋白（DNP-BSA），货号T112505R和DNP单克隆抗体，货号T112505M均购自南京拂晓生物科技有限公司。
实施例1
本实施例提供一种MPO&PR3联合检测试纸条（联合检测抗髓过氧化物酶抗体和抗蛋白酶3抗体的荧光免疫层析试纸条），其结构如图1所示，包括底板1和依次搭接在底板1上的样本垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水纸5，其中硝酸纤维素膜4上设置有质控线6、抗MPO抗体检测线7、抗PR3抗体检测线8。底板的材质为PVC，样本垫2和结合垫3的材质均为玻璃纤维素膜。MPO&PR3联合检测试纸条上设置有加样孔（图中未显示），荧光免疫层析试纸条的结构设置包括加样孔的设置都是本领域的常规技术手段，此处不赘述。
本实施例的MPO&PR3联合检测试纸条的制备方法如下：
1.制备样本垫2：
1.1配制样本垫封闭液：0.3wt%酪蛋白、1wt%吐温-20、5wt%海藻糖、0.1mg/mL异嗜性抗体阻断剂，其余为50mM Tris缓冲液（pH值为8.5）。
1.2使用样本垫封闭液均匀湿润玻璃纤维素膜，然后放置在湿度小于30%的环境下，37℃下烘15h，裁切备用。
2.制备结合垫3：
2.1制备荧光微球标记的抗人IgG抗体：在1mL 50mM MES缓冲液（pH 6.0）中加入荧光微球至固含量为0.1%，混匀，离心清洗一次。加入0.5mL 50mM MES缓冲液（pH 6.0），超声混匀后，加入50μL 10mg/mL NHS溶液和25μL 10mg/mL EDC溶液，活化30min，离心去除上清。加入1mL 50mM MES缓冲液（pH 6.0），超声混匀后，离心清洗一次。再次加入0.5mL 50mM MESbuffer，超声混匀后，加入200μg/mL鼠抗人IgG抗体，上摇床，25℃，250r/min，孵育2h。离心去上清，加入0.5mL封闭液（pH值为8.5、浓度为50mmol/L的HEPES缓冲液，其中含有1wt%BSA），上摇床，25℃，250r/min，孵育1h。离心去上清，再次加入0.5mL封闭液离心洗涤得到荧光微球标记的抗人IgG抗体。将荧光微球标记的抗人IgG抗体保存于保存液（pH值为8.5、浓度为50mmol/L的Tris缓冲液，其含有150mmol/L的NaCl、10wt%的海藻糖、0.5wt%的吐温-20和0.5wt%的酪蛋白）中，超声混匀，备用。
2.2制备荧光微球标记的DNP-BSA：制备方法基本同荧光微球标记的抗人IgG抗体，区别仅在于将鼠抗人IgG抗体换成DNP-BSA。
2.3将玻璃纤维素膜裁切得到所需规格。配制喷金液：荧光微球标记的抗人IgG抗体体积占比40%、荧光微球标记的DNP-BSA体积占比3%，保存液体积占比57%。用喷金仪将喷金液按照2μL /cm均匀喷涂到玻璃纤维素膜上，放入37℃烘烤15h，置于干燥箱中待用。
3. 制备硝酸纤维素膜4：
3.1 制备胶乳微球标记的MPO抗原：在1mL 50mM MES缓冲液（pH 6.0）中加入胶乳微球（货号：P0118，粒径：188nm）至固含量为0.1%，混匀，离心清洗一次。加入0.5mL 50mMMES缓冲液（pH 6.0），超声混匀后，加入50μL 10mg/mL NHS溶液和25μL 10mg/mL EDC溶液，活化30min，离心去除上清。加入1mL 50mM MES缓冲液（pH 6.0），超声混匀后，离心清洗一次。再次加入0.5mL 50mM MES buffer，超声混匀后，加入100mg/mL MPO抗原，上摇床，25℃，250r/min，孵育2h。离心去上清，加入0.5mL封闭液（pH值为8.5、浓度为50mmol/L的HEPES缓冲液，其中含有1wt% BSA），上摇床，25℃，250r/min，孵育1h。离心去上清，再次加入1mL封闭液离心洗涤得到胶乳微球标记的MPO抗原。将胶乳微球标记的MPO抗原保存于保存液（pH值为7.4、浓度为10mmol/L的PB缓冲液，其中含5wt% 海藻糖和5wt% BSA）中，超声混匀，备用。
3.2 制备胶乳微球标记的PR3抗原：制备方法基本同胶乳微球标记的MPO抗原，区别仅在于将MPO抗原换成PR3抗原。
3.3 取适量的胶乳微球标记的MPO抗原，使用含有5wt% 海藻糖和5wt% BSA的10mMPB缓冲液（pH 7.4）稀释得到浓度为0.5mg/mL的胶乳微球标记的MPO抗原包被液。
取适量的胶乳微球标记的PR3抗原，使用含有5wt% 海藻糖和5wt% BSA的10mM PB缓冲液（PH 7.4）稀释得到浓度为0.5mg/mL的胶乳微球标记的PR3抗原包被液。
采用含有5wt%海藻糖的10mM PB缓冲液（PH 7.4）稀释DNP抗体得到浓度为2mg/mL的DNP抗体包被液。
采用划膜仪按照1μL /cm分别将DNP抗体包被液、胶乳微球标记的MPO抗原包被液和胶乳微球标记的PR3抗原包被液划线在硝酸纤维素膜上，然后将硝酸纤维素膜放入37℃的烘箱中干燥1h~2h，再转入60℃干燥形成质控线、抗MPO抗体检测线、抗PR3抗体检测线，置于干燥箱中待用。
4.荧光免疫层析试纸条组装：在底板1上的特定位置依次搭接样本垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水纸5，组装好后以3.9mm的固定宽度裁切，得到MPO&PR3联合检测试纸条。
5.制备样本稀释液：0.204 g/L磷酸二氢钠、1.18g/L磷酸氢二钠、9.0g/L氯化钠、0.5wt% Proclin 300、0.5wt%吐温-20，其余为10mM PBS缓冲液（pH值为7.4）。
6.制备ID卡：
6.1 抗MPO抗体标准曲线：
配制抗MPO抗体的6个浓度的校准品，其浓度分别为0AU/mL、10AU/mL、37.5AU/mL、75AU/mL、150AU/mL、300AU/mL，每个浓度校准品重复测试3次，测试方法为：用样本稀释液20倍稀释每一个浓度梯度，分别取80μL加入到加样孔中，计时15min后，用荧光免疫分析仪检测抗MPO抗体检测线的荧光强度值T1值和质控线的荧光强度C值，通过T1/C值拟合抗MPO抗体标准曲线：y=(A-D)/[1+(x/C^B)]+D，其中A=10.54431，B=-1.95053，C=91.05675，D=-0.00914，该方程中y为T1/C值，x为抗MPO抗体的浓度值，r2=0.99979。
6.2抗PR3抗体标准曲线：
配制抗PR3抗体的6个浓度的校准品，其浓度分别为0AU/mL、10AU/mL、25AU/mL、64AU/mL、160AU/mL、400AU/mL，每个浓度校准品重复测试3次，测试方法为：用样本稀释液20倍稀释每一个浓度梯度，分别取80μL加入到加样孔中，计时15min后，用荧光免疫分析仪测抗PR3抗体检测线的荧光强度值T2值和质控线的荧光强度C值，通过T2/C值拟合抗PR3抗体标准曲线：y=(A-D)/[1+(x/C^B)]+D，其中A=10.19725，B=-1.77253，C=153.10147，D=0.06888，该方程中y为T2/C值，X为抗PR3抗体的浓度值，r2=0.99972。
将抗MPO抗体标准曲线和抗PR3抗体标准曲线分别烧录在ID卡中，将ID卡装入MPO&PR3联合检测试纸条中，荧光免疫分析仪的处理器能够读取ID卡的内容并处理样本检测结果。
实施例2
本实施例提供一种MPO&PR3联合检测试纸条，其结构同实施例1，其制备方法基本同实施例1，区别在于胶乳微球标记的MPO抗原和胶乳微球标记的PR3抗原中使用的胶乳微球的粒径为141nm（胶乳微球货号为P0112）。
实施例3
本实施例提供一种MPO&PR3联合检测试纸条，其结构同实施例1，其制备方法基本同实施例1，区别在于胶乳微球标记的MPO抗原和胶乳微球标记的PR3抗原中使用的胶乳微球的粒径为244nm（胶乳微球货号为P0219），标记时使用的NHS浓度和EDC浓度分别为30mg/mL。
实施例4
本实施例提供一种MPO&PR3联合检测试纸条，其结构同实施例1，其制备方法基本同实施例1，区别在于胶乳微球标记的MPO抗原和胶乳微球标记的PR3抗原中使用的胶乳微球的粒径为122nm（胶乳微球货号为P0116）。
实施例5
本实施例提供一种MPO&PR3联合检测试纸条，其结构同实施例1，其制备方法基本同实施例1，区别在于胶乳微球标记的MPO抗原和胶乳微球标记的PR3抗原中使用的胶乳微球的粒径为351nm（胶乳微球货号为P0307），标记时使用的NHS浓度和EDC浓度分别为50mg/mL。
对比例1
本对比例提供一种MPO&PR3联合检测试纸条，其结构同实施例1，其制备方法基本同实施例1，区别在于在制备硝酸纤维素膜4时，MPO抗原和PR3抗原直接包被在硝酸纤维素膜上，MPO抗原包被液和PR3抗原的浓度分别为0.5mg/mL。
对比例2
本对比例提供一种MPO&PR3联合检测试纸条，其结构同实施例1，其制备方法基本同实施例1，区别在于在制备硝酸纤维素膜4时，MPO抗原和PR3抗原直接包被在硝酸纤维素膜上，MPO抗原包被液和PR3抗原的浓度分别为1mg/mL。
性能测试
1.灵敏度测试
取6个浓度的抗MPO抗体校准品和抗PR3抗体校准品，分别使用实施例1~5和对比例1~2的MPO&PR3联合检测试纸条进行信号强度验证。抗MPO抗体校准品浓度为0AU/mL、10AU/mL、37.5AU/mL、75AU/mL、150AU/mL、300AU/mL；抗PR3抗体校准品浓度为0AU/mL、10AU/mL、25AU/mL、64AU/mL、160AU/mL、400AU/mL。每个浓度重复检测2次，记录抗MPO抗体信号强度均值T1、抗PR3抗体信号强度均值T2和质控线的荧光强度均值C，检测方法参见上文实施例1中标准曲线的步骤，具体测试结果见表1。
以上各实施例和对比例的标准曲线见表2。
2.重复性测试
用混合质控品1（抗MPO抗体20AU/mL，抗PR3抗体20AU/mL）和混合质控品2（抗MPO抗体100AU/mL，抗PR3抗体150AU/mL）分别检测实施例1~5和对比例1~2的MPO&PR3联合检测试纸条（分别使用10张试纸条重复检测10次），然后根据表2中标准曲线计算出对应的浓度，然后计算结果的变异系数（CV），结果见表3。
表3显示，对比例1和对比例2的变异系数相较于其他组更大些，其他组的变异系数均小于10%，实施例1和实施例2的重复性明显更好。
3.阴阳性符合率测试：
使用实施例1~5和对比例1~2的MPO&PR3联合检测试纸条和行业认可的欧蒙医学诊断(中国)有限公司的抗MPO抗体IgG检测试剂盒(酶联免疫吸附法)、抗PR3抗体IgG检测试剂盒(酶联免疫吸附法)分别进行血清样本检测，
实施例1~5和对比例1~2的MPO&PR3联合检测试纸条进行血清样本检测的步骤分别为：
（1）将MPO&PR3联合检测试纸条插入荧光免疫分析仪，荧光免疫分析仪读取ID卡中的标准曲线，然后拔出MPO&PR3联合检测试纸条。
（2）使用样本稀释液将血清样本稀释20倍后，取80μL加入MPO&PR3联合检测试纸条的加样孔，静置15min。
（3）再次插入荧光免疫分析仪测试抗MPO抗体检测线荧光强度（T1值）、抗PR3抗体检测线荧光强度（T2值）和质控线荧光强度（C值），荧光免疫分析仪可通过ID卡内的标准曲线信息，自动将T1/C值和T2/C值换算为相对应的抗MPO抗体浓度和抗PR3抗体浓度。
欧蒙医学诊断（中国）有限公司的抗MPO抗体IgG检测试剂盒、抗PR3抗体IgG检测试剂盒的检测方法参考其说明书。
对比检测结果分析实施例1~5和对比例1~2的MPO&PR3联合检测试纸条与抗MPO抗体IgG检测试剂盒、抗PR3抗体IgG检测试剂盒的测试结果的阴阳符合率，测试结果见表4，阴阳符合率见表5。
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实施例6
本实施例提供一种MPO&PR3&GBM联合检测试纸条（联合检测抗髓过氧化物酶抗体、抗蛋白酶3抗体和抗肾小球基底膜抗体的荧光免疫层析试纸条），其试纸条结构见图2，基本同实施例1，区别是在实施例1的试纸条结构基础上增加一条抗GBM抗体检测线9。抗GBM抗体检测线9由胶乳微球标记的GBM抗原，制备方法同实施例1中抗MPO抗体检测线或抗PR3抗体检测线，区别在于将包被的抗原替换为GBM抗原，另外的GBM标准曲线及检测方法同实施例1，标准曲线为方程: y = (A - D) / [1 + (x/C)^B] + D，其中A=15.60307，B=-1.62207，C=147.67356，D=0.03813，r2=0.99964。
使用本实施例制备的MPO&PR3&GBM联合检测试纸条和行业认可的欧蒙医学诊断（中国）有限公司的抗MPO抗体IgG检测试剂盒、抗PR3抗体IgG检测试剂盒、抗GBM抗体IgG检测试剂盒(酶联免疫吸附法)的分别检测血清样本，MPO、PR3及GBM的检测结果和阴阳性符合情况见表6和表7。
以上结果显示，通过将胶乳微球标记的抗原包被至硝酸纤维素膜上形成检测线，可以提高荧光免疫检测的灵敏度，降低漏检风险，在联合检测两种或三种不同抗体时，可以保证每种抗体检测灵敏度，对于需要结合多指标的疾病的快速诊断具有重要意义。进一步地，通过选择合适粒径范围的胶乳微球，可在提高检测灵敏度的同时，进一步提高重复性和准确度。在MPO&PR3联合检测试纸条中，实施例1和实施例2的综合性能相对更好，实施例1的综合性能最好。实施例6的MPO&PR3&GBM联合检测试纸条在确保MPO和PR3性能不变的前提下，额外添加的抗肾小球基底膜抗体检测线同样可以满足GBM的检测需求，可见抗原与胶乳微球偶联后包被至硝酸纤维素膜上形成检测线的工艺对其他项目抗原有一定的普适性，可进一步推广至其他单抗体荧光免疫检测试纸条或多抗体联合荧光免疫检测试纸条。
Claims (12)
1.一种用于抗体定量检测的荧光免疫层析试纸条，包括底板和依次搭载在所述底板上的样本垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，其特征在于，所述结合垫上包被有荧光微球标记的抗人IgG抗体和荧光微球标记的DNP-BSA，所述硝酸纤维素膜上设有抗体检测线和质控线，所述抗体检测线由包被在所述硝酸纤维素膜上的胶乳微球标记的抗原形成，所述胶乳微球的粒径为100nm~400nm。
2.根据权利要求1所述的用于抗体定量检测的荧光免疫层析试纸条，其特征在于，所述胶乳微球的粒径为135nm~250nm。
3.根据权利要求1所述的用于抗体定量检测的荧光免疫层析试纸条，其特征在于，所述荧光微球为铕螯合荧光微球；和/或，所述荧光微球的粒径为100nm~300nm。
4.根据权利要求1所述的用于抗体定量检测的荧光免疫层析试纸条，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上设有多条互不干涉的抗体检测线，不同抗体检测线上包被的抗原不同。
5.根据权利要求1或4所述的用于抗体定量检测的荧光免疫层析试纸条，其特征在于，所述胶乳微球标记的抗原选自胶乳微球标记的MPO抗原、胶乳微球标记的PR3抗原、胶乳微球标记的GBM抗原。
6.根据权利要求1所述的用于抗体定量检测的荧光免疫层析试纸条，其特征在于，所述样本垫为包被有酪蛋白、吐温、海藻糖和异嗜性抗体阻断剂的玻璃纤维素膜；
和/或，所述结合垫采用玻璃纤维素膜，其上包被的荧光微球标记的抗人IgG抗体和荧光微球标记的DNP-BSA的体积比为（8~20）:1；
和/或，所述质控线由包被在所述硝酸纤维素膜上的DNP抗体形成。
7.如权利要求1至6中任一项所述的用于抗体定量检测的荧光免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
采用样本垫封闭液处理第一玻璃纤维膜制得样本垫；
将含有荧光微球标记的抗人IgG抗体和荧光微球标记的DNP-BSA的喷金液喷涂到第二玻璃纤维素膜上，经烘干制得所述结合垫；
将胶乳微球标记的抗原包被在硝酸纤维素膜上形成检测线，将DNP抗体包被在硝酸纤维素膜上形成质控线；
将样本垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸以及底板组装得到所述用于抗体定量检测的荧光免疫层析试纸条。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述样本垫封闭液的配方为：0.1~0.5wt%酪蛋白、0.5~1.5wt%吐温、3~8wt%海藻糖、0.05~0.2mg/mL异嗜性抗体阻断剂，其余为pH值为8~9、浓度为40~60mM的Tris缓冲液；
和/或，采用样本垫封闭液浸润第一玻璃纤维膜，然后在30℃~60℃下烘干，制得所述样本垫。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在所述喷金液中，所述荧光微球标记的抗人IgG抗体的体积占比为30~50%，所述荧光微球标记的DNP-BSA的体积占比为1~5%；
和/或，将所述喷金液喷涂到所述第二玻璃纤维素膜上，在30℃~60℃下烘干，制得所述结合垫。
10. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，使用含有2~8wt% 海藻糖和2~8wt%BSA的pH值为7.2~7.8的浓度为8~12mM的 PB缓冲液混合胶乳微球标记的抗原得到胶乳微球标记的抗原包被液，将所述胶乳微球标记的抗原包被液在所述硝酸纤维素膜上划线，在30℃~60℃下烘干，形成所述抗体检测线；
和/或，使用含有2~8wt% 海藻糖的pH值为7.2~7.8的浓度为8~12mM的 PB缓冲液混合DNP抗体得到DNP抗体包被液，将所述DNP抗体包被液在所述硝酸纤维素膜上划线，在30℃~60℃下烘干，形成所述质控线。
11.一种基于荧光免疫分析的抗体定量检测系统，其特征在于，所述抗体定量检测系统包括荧光免疫分析仪、权利要求1至6中任一项所述的荧光免疫层析试纸条和样本稀释液，所述荧光免疫层析试纸条上设有ID卡，所述ID卡中存储有标定数据和/或标准曲线。
12.根据权利要求11所述的基于荧光免疫分析的抗体定量检测系统，其特征在于，所述样本稀释液的配方为：0.15~0.25g/L磷酸二氢钠，1.0~1.5g/L磷酸氢二钠，5~10g/L氯化钠，0.3~0.8wt%防腐剂和0.3~0.8wt%吐温，其余为pH值为7.2~7.6、浓度为5~15mM的PBS缓冲液。
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