CN113834944A - 一种红细胞中叶酸的量子点荧光检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种红细胞中叶酸的量子点荧光检测方法。叶酸是人体生长发育过程中必不可少的维生素，对于预防新生儿神经管畸形、降低孕妇贫血、先兆子痫等。因此，提供一种操作简便、灵敏可靠的检测方法对于孕妇等人群监控叶酸补充效果具有重要意义。本发明提供了一种红细胞中叶酸的量子点荧光检测方法，为了提高检测准确性，本发明针对检测的预处理及解离步骤进行了优化，实现了红细胞中叶酸的充分破裂和解离。本发明还提供了一种基于量子点检测的固相层析试纸条，基于该试纸条检测叶酸具有良好的精密度及灵敏度，试纸条可适应常温运输，具有理想的市场前景。

Description

一种红细胞中叶酸的量子点荧光检测方法
技术领域
本发明属于血液标志物检测技术领域，具体涉及一种红细胞中叶酸的量子点荧光检测方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
叶酸是一种水溶性B族维生素，是由蝶啶、对氨基苯甲酸和L-谷氨酸结合而成。叶酸也称蝶酰谷氨酸，是一种核酸、胸苷酸、神经递质、磷脂以及激素合成必不可少的维生素类物质，在体内作为一碳单位的载体，参与各种代谢反应。叶酸还是人体必需氨基酸（蛋氨酸）的组成部分，参与基因或非基因编码的甲基化作用。叶酸缺乏时，脱氧胸苷酸，嘌呤核苷酸的形式及氨基酸的互变受阻，细胞内DNA合成减少，细胞的分裂成熟发生障碍，引起巨幼红细胞性贫血。另外，妊娠期叶酸补充对于降低胎儿出生缺陷的发生也具有重要的意义。人体自身缺乏合成叶酸的酶，需要从饮食中摄入，摄入的叶酸主要在十二指肠及近端空肠部位吸收。吸收后的单谷氨酸叶酸，一部分以多谷氨酸叶酸形式贮存在红细胞、肝脏等组织中，一部分以单谷氨酸叶酸形式分布于血浆、组织液、胆汁及尿液中。叶酸缺乏与多种疾病的发生有关，准确检测人体内叶酸水平是评价叶酸营养状态的基础。人体叶酸水平常用血浆叶酸、血清叶酸和红细胞叶酸来衡量。血浆或血清叶酸代表体内循环状态的叶酸水平，但易受到膳食等因素影响。红细胞叶酸与红细胞更新过程有关，反映人体内叶酸的长期变化状态和叶酸储备情况，因此红细胞叶酸检测对反应机体生理状态具有重要的意义。
目前，红细胞中叶酸检测主要为微生物和竞争性放射免疫分析技术两种方法。其中，微生物检测方法操作繁琐，检测结果受微生物敏感度、样品中所含抗叶酸药物或抗生素成分的影响，检测结果缺乏重复性。放射免疫分析技术具有快速、简单的优势，但试剂生产过程中，需使用同位素对活性蛋白进行标记，因此仅有少数厂家能够生产相应试剂，检验设备昂贵；并且不同结合蛋白对各叶酸亚型反应灵敏度各不相同，导致试剂盒之间的检测结果差异很大，故其应用于临床检测的可靠性并不高；相关试剂主要活性成分为蛋白制品，外界温度变化容易导致检测试剂失活，因此竞争性放射免疫分析检测产品对生产、保存及运输环境的要求较高，增加了产品的经济成本，难以在基层医院推广。
发明内容
基于上述技术背景，本发明目的在于提供一种简便、快速、经济的红细胞叶酸检测方法。
基于上述技术目的，本发明主要提供一种红细胞中叶酸的量子点荧光检测方法，所述检测包括对全血样本的预处理、解离，并对解离后样本中的叶酸进行量子点荧光检测，其特征在于，所述预处理试剂为抗坏血酸及硫代甘油的组合；所述解离剂中至少包括三(2-氯乙基)磷酸酯和胶乳微球标记的抗血红蛋白多克隆抗体。
考虑到对红细胞中叶酸的充分提取对保证检测结果的灵敏度和准确性具有重要意义，本发明检测方法首先针对预处理和解离环节进行了优化。在预处理过程需要充分破坏红细胞的膜结构，使细胞内部的叶酸释放至试剂中，在解离剂的作用下将叶酸从游离蛋白上解离成为游离态的叶酸，以便进行后续的免疫学检测。经本发明验证，上述预处理过程中，抗坏血酸盐起到破坏细胞膜的作用，硫代甘油防止红细胞中的叶酸被血浆结合酶分解，两者配合能够很好的保障膜结构裂解过程中，叶酸不被破坏。所述解离剂三(2-氯乙基)磷酸酯作用于蛋白质的二硫键，将叶酸从结合蛋白上解离下来，由结合态变为游离态。
其次，本发明提供了一种基于量子点荧光检测叶酸的试纸条，其特征在于，样品垫前端具有一定截留分子量的滤膜以及检测线前方固定有抗血红蛋白单克隆抗体的血红蛋白拦截线。
优选的，所述试纸条的层析结构按照样品的层析方向依次设置滤膜、样品垫、结合垫、反应膜及吸水材料；上述五种材料相邻部分接壤。
另外，本发明提供的量子点荧光检测体系中，包括量子点标记的叶酸单克隆抗体及叶酸偶联抗原，其中量子点标记的叶酸单克隆抗体固定于结合垫上、叶酸偶联抗原固定于硝酸纤维素膜（NC膜）的检测线位置。将上述解离后的样品加入检测体系中，待测样品中的叶酸会预先与量子点标记叶酸单克隆抗体发生反应，从而使量子点标记的叶酸单克隆抗体与预先包被在检测线上的叶酸偶联抗原结合量减少，检测线的荧光条带减弱或是消失，通过检测光信号的强度实现叶酸浓度的检测。
本发明提供的一种检测方法通过所述试纸条实现，整体检测方法的反应原理如下：全血样本与预处理试剂混匀后，室温或37℃下处理20~35min，预处理剂中的抗坏血酸和硫代甘油的组合，保证细胞膜结构的裂解，而叶酸不受破坏。经预处理剂处理的全血样本与解离剂混合，室温下静置 5min，解离剂中的三(2-氯乙基)磷酸酯作用于蛋白质的二硫键，将叶酸从结合蛋白上解离下来，由结合态变为游离态，其中的胶乳微球标记的血红蛋白多克隆抗体会与样本中的血红蛋白结合，形成大分子聚合物。加样后，样品垫上的特定截留分子量的滤膜会将血红蛋白与微球标记血红蛋白多抗形成的高分子聚合物截留在滤膜处，而不会随样本上行至反应膜处；透过的血红蛋白及其复合物，也会在血红蛋白拦截线处被捕获而固定在试纸条观察窗以下，避免对结果的干扰。
最后，本发明还提供一种红细胞中叶酸的检测试剂盒，所述试剂盒中包括第二方面所述试纸条。
优选的，所述检测试剂盒中，还包括预处理试剂及解离试剂。
以上一种或多种技术方案的有益效果在于：
1、本发明首先针对预处理试剂和解离试剂进行了优化：预处理剂中，抗坏血酸与硫代甘油联合使用达到破膜且避免叶酸被分解的目的，解离完成后的血样无需纯化，可直接用于后续检测。解离剂中的胶乳微球标记血红蛋白多克隆抗体、试纸条的滤膜及NC膜上的血红蛋白拦截线，共同将样本中的血红蛋白拦截，降低血红蛋白自身颜色对判读系统的干扰。这种样品前处理过程的优化很好的保证了本发明检测方法的灵敏度和准确性。
2、本发明提供的红细胞叶酸检测的试纸条，可适应常温运输，可长期稳定保存，能够有效降低保存和运输成本。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1试纸条结构示意图；
1为滤膜，2为样品垫，3为结合垫，4为血红蛋白拦截线，5为检测线（T线），6为质控线（C线），7为吸水纸，8为反应膜（NC膜），9为底板。
图2为实施例4中所述试纸条结构示意图；
其中，10为加样孔，11为观察窗。
图3为标准曲线（其中x=1/X）。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，红细胞中叶酸检测能够反应机体较长一段时间内叶酸储备情况，对于妊娠期女性及部分肿瘤患者具有重要的检测意义。目前红细胞中叶酸的检测方法存在检测成本高、检测精度不足等缺陷。为了解决如上的技术问题，本发明提出了一种红细胞中叶酸的量子点荧光检测方法。
本发明第一方面，提供一种红细胞中叶酸的量子点荧光检测方法，所述检测包括对全血样本的预处理、解离，并对解离后样本中的叶酸进行量子点荧光检测，其特征在于，所述预处理试剂为抗坏血酸及硫代甘油的组合；所述解离剂中至少包括三(2-氯乙基)磷酸酯和胶乳微球标记的抗血红蛋白多克隆抗体。
应当明确的是，上述第一方面所述技术方案中，所述抗坏血酸包括抗坏血酸及其衍生物，所述衍生物包括抗坏血酸药学上可接受的盐；经验证，可行的抗坏血酸盐包括抗坏血酸钠、抗坏血酸钙、抗坏血酸锂、抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸-2-磷酸酯。
进一步的，所述抗坏血酸盐为抗坏血酸钠、抗坏血酸钙，所述抗坏血酸盐的浓度为0.1~0.3%。
进一步的，预处理试剂中，所述硫代甘油的浓度为0.3~0.7%。
进一步的，所述预处理时间为25~35min。
上述优选技术方案的一种实施方式中，所述预处理过程如下：向全血样本中加入20倍体积的预处理试剂，所述预处理试剂中含有0.2%的抗坏血酸钠及0.5%的硫代甘油，室温静置30min。
又一种具体的实施方式中，所述预处理过程如下：向全血样本中加入20倍体积的预处理试剂，所述预处理试剂中含有0.1%的抗坏血酸钠及0.6%的硫代甘油，室温静置35min。
又一种具体的实施方式中，所述预处理过程如下：向全血样本中加入18倍体积的预处理试剂，所述预处理试剂中含有0.3%的抗坏血酸钠及0.4%的硫代甘油，室温静置25min。
优选的，所述解离剂中还包括解离助剂、血红蛋白吸附剂中的一种或其组合。
进一步的，所述解离助剂为醇类有机试剂，为包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇中的一种，优选的方案中，所述解离助剂为甲醇。采用甲醇作为解离助剂的优点在于：叶酸在甲醇中溶解度较小，甲醇的加入可促进解离效果，同时上样样品中含有少量甲醇，有利于改善层析外观，使检测线和质控线显色更加均一，提高层析产品重复性和检测结果准确性。
进一步的，所述血红蛋白吸附剂为血红蛋白抗体，包括单克隆抗体或多克隆抗体，当所述解离剂中具有血红蛋白抗体时，还应当具有缓冲试剂。
更进一步的，所述血红蛋白抗体为胶乳微球标记的抗血红蛋白多克隆抗体。
上述胶乳微球标记的抗血红蛋白多克隆抗体与红细胞释放出的血红蛋白结合，形成大分子聚合物，便于后续步骤中可以通过机械截留方便的去除血红蛋白。
因此，本发明所述解离剂的一种实施方式中，所述解离剂的成分如下：2~4%甲醇,0.03~0.07%三(2-氯乙基)磷酸酯，0.4~0.6mg/mL胶乳微球标记的抗血红蛋白多克隆抗体溶于Tris-HCL缓冲液中，优选的，Tris-HCl缓冲液pH为8.0~9.0，离子强度为20mM~100mM。
发明人发现，该实施方式的优势在于，加入0.5mg/mL胶乳微球标记的抗血红蛋白多克隆抗体，可与样本中的血红蛋白结合，形成大颗粒复合物，上样检测时，胶乳微球标记的血红蛋白多抗与血红蛋白形成的大颗粒能够通过机械截留作用留在样品垫上，不再随样本上行，改善层析背景，降低血红蛋白对检测结果的判读，所述样品垫优选采用玻纤材质。
上述优选技术方案的一种实施方式中，所述解离的具体方式如下：将预处理后的全血样本与解离剂等比例混合，在室温下静置5min，得到待检测样品。
应当明确的是，上述技术方案中所述室温条件并非指代任何条件下的室温，结合本领域技术人员的理解，本申请文件中所述室温条件为一个标准大气压下20~25℃的温度环境。
第一方面所述检测方法中，还包括对解离后的样品进行检测步骤，所述检测采用竞争法，进一步的，通过固相免疫层析的方式进行。
本发明第二方面，提供一种叶酸检测试纸条，其特征在于，具有滤膜对待测样品进行过滤。
优选的，所述试纸条的层析结构按照样品的层析方向依次设置滤膜、样品垫、结合垫、反应膜及吸水材料；上述五种材料相邻部分接壤。
进一步的，所述滤膜、样品垫、结合垫及反应膜依次搭接，所述吸水材料与反应膜接触的部分搭在反应膜上。
更进一步的，所述滤膜覆盖样品垫的部分长度为0.8cm~1.2cm。
更进一步的，所述样品垫覆盖结合垫的部分长度为1.5~2mm。
更进一步的，结合垫覆盖反应膜的部分长度为1.5~2mm。
更进一步的，吸水纸覆盖反应膜的部分长度为1.5~2mm。
所述滤膜不局限于亲水或疏水材料，主要通过机械截留作用过滤待测样品中的血红蛋白成分，可行的滤膜材质包括硝酸纤维素、醋酸纤维素、PVDF等。
所述结合垫为玻璃纤维材质或聚酯纤维材质，结合垫上喷涂有量子点标记叶酸单克隆抗体。
其中所述量子点为CdSe/ZnS量子点，相对于普通荧光物质，激发光谱宽且发射光谱窄，半峰宽小、抗漂白能力强、性能稳定等优点，可有效提高试纸条的灵敏度及检测结果的精密性。
具体的，所述量子点标记叶酸单克隆抗体采用如下制备方法获得：将CdSe/ZnS量子点加入缓冲液中活化量子点羧基后，将其与所述叶酸单克隆抗体的氨基基团连接，并对未结合的羧基进行封闭。
具体的，所述制备方法包括：
将CdSe/ZnS量子点加入 MOPS缓冲液中进行活化，然后向其中加入EDC、NHS，然后加入叶酸单克隆抗体反应2~4h，叶酸单抗与量子点反应完成后，加入封闭剂进行封闭，封闭完成后使用硼酸盐缓冲液进行洗脱离心，复溶后稀释即得。
其中，所述MOPS缓冲液为中性或弱酸性，进一步优选pH为6.0~7.4，离子强度为20~100mM。
所述封闭剂为多羟基化合物，优选为氨基葡萄糖。
所述硼酸盐缓冲液为弱碱性，进一步优选为pH8~9，离子强度为20~100mM。
所述反应膜为硝酸纤维素膜（NC膜）按照层析方向设置血红蛋白拦截线、检测线及质控线；所述血红蛋白拦截线处固定有血红蛋白的特异性吸附物质，所述检测线固定叶酸偶联抗原，所述质控线处固定IgG抗体。
更进一步的，所述血红蛋白拦截线距离反应膜上沿4~6mm，距离检测线3~5mm，检测线与质控线间隔4~6mm。
更进一步的，所述血红蛋白的特异性吸附物质为血红蛋白的抗体，具体的，为血红蛋白的单克隆抗体，使用浓度为0.5~1.5mg/mL，优选为1.0mg/mL。
更进一步的，所述叶酸偶联抗原可以为叶酸-BSA，叶酸-OVA，叶酸-KLH等多种形式，使用浓度为0.5~1.2mg/mL，优选为0.8mg/mL。
更进一步的，所述质控线处固定的IgG抗体为抗鼠IgG抗体，可以为羊抗鼠IgG、兔抗鼠IgG，优选为羊抗鼠IgG，使用浓度为0.1~0.9mg/mL，优选为0.5mg/mL。
进一步的，本领域技术人员可以理解的是，所述吸水材料放置于试纸条的另一端，主要通过吸水材料纤维结构的“虹吸作用”对待测样品进行吸引从而完成检测过程，只要能够实现上述吸水效果的材质均可以应用于所述试纸条，具体的实例包括玻璃纤维、棉浆和棉浆混纺材料等。
进一步的，固相检测试纸条使用方式如下：将解离后的待测叶酸样品滴加在样品垫上，待测样品在吸水材料的作用下，依次流经血红蛋白滤膜、样品垫、检测线及质控线；叶酸与预先包被在结合垫上的量子点标记的叶酸单克隆抗体结合，从而使量子点标记的叶酸单克隆抗体与检测线上的叶酸偶联抗原结合量减少，检测线荧光条带减弱或是消失，获得检测线光信号；样品中未被检测线叶酸偶联抗原拦截的量子点标记叶酸单克隆抗体与质控线上的IgG结合产生荧光，获得质控线光信号，构建检测线光信号强度与质控线光信号强度的比值（T/C）与样本浓度的标准曲线，通过标准曲线计算即可得出待测样品中叶酸浓度。
上述使用方法中，所述荧光强度的检测可通过本领域中常规荧光信号检测装置实现，如流氏细胞检测仪、荧光分光光度计或荧光共聚焦显微镜等。
上述技术方案的一种实施方式中，所述固相检测试纸条还具有底板，所述底板用于承载上述层析结构；所述底板为硬质材料，具体可以为PVC材质。
上述技术方案的又一种实施方式中，所述试纸条还具有辅助观测的装置，所述辅助观测装置为一种卡壳，所述卡壳由上下两部分扣合而成，卡壳上部具有通孔及通槽，所述通孔对应滤膜的位置，设置于样品垫上方，用于向检测试纸加样；所述通槽为观察窗，透过观察窗可观察到检测线及质控线。
本发明第三方面，提供一种红细胞中叶酸的检测试剂盒，所述试剂盒中包括第二方面所述试纸条。
优选的，所述检测试剂盒中，还包括预处理试剂及解离试剂。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
本实施例提供一种基于荧光量子点检测红细胞叶酸的检测方法，包括检测试纸条如图1所示，所述试纸条包括底板9及层析结构，底板9承载层析结构。
所述层析结构自加样端向样品层析方向具有滤膜1、样品垫2、结合垫3、反应膜8及吸水纸7，所述滤膜1、样品垫2、结合垫3、反应膜8依次搭接，所述吸水纸7接触反应膜8的部分搭在反应膜8上。
本实施例中，应用上述检测试纸条的红细胞中叶酸的量子点荧光检测方法，具体操作步骤如下：
1）制备包被膜：取NC膜和PVC板，将NC膜非点样面贴于PVC板的既定位置，取浓度为分别为1.0mg/mL的抗血红蛋白单克隆抗体、0.8mg/mL叶酸-BSA和0.5mg/mL的羊抗鼠IgG应用三维划线喷金仪包被于NC膜的拦截线4，检测线5和质控线6的位置，37℃8h，即得所述的包被膜。
2）制备结合垫
a：取20uL硒化镉量子点，加入到3mL 离子强度为50mM的MOPS缓冲液（pH6.8）中，向其中加入20mg/mLEDC、20mg/mLNHS各20uL，再加入5mg/mL叶酸单克隆抗体100μL，避光反应3h；
b：向步骤a中制备的量子点标记液中，加入终浓度为6mg/mL的氨基葡萄糖，避光反应30min进行封闭；
c：取步骤b中的标记后混合液转移至100KD超滤管中进行离心，以3500g/min离心15min，确保离心后液体体积小于原体积的1/10；用50mM 硼酸盐缓冲液（pH8.4）作为洗脱液，洗脱5次，确保每次离心后液体体积小于原体积的1/10；
d：应用复溶液对步骤c中得到的标记后溶液进行稀释，并混匀，即得到量子点标记的叶酸抗体；
e：应用三维划线喷金仪将步骤d中得到的量子点标记叶酸抗体按3uL/cm喷于玻璃纤维垫上，37℃干燥4h，即可得到所述的结合垫。
3）组装：
将底板上对应位置的粘纸撕去，将吸水纸粘贴在NC膜上方对应位置，覆盖NC膜1.5mm；将结合垫粘贴在NC膜下方，覆盖NC膜1.5mm；将样品垫粘贴在结合垫下方，覆盖结合垫1.8mm；滤膜（硝酸纤维材质）粘贴在样品垫下方，覆盖样品垫1.0cm，即可得到组装好的大板。
4）切条装壳：应用微电脑自动斩切机，设置好试纸条宽度后，进行裁切，即为制备好的试纸条，将试纸条放入铝箔袋袋中密封，即得到单人份红细胞叶酸检测卡。
5）所述试剂盒中还含有预处理剂及解离剂。预处理试剂和解离试剂按照最优配方，其中预处理试剂R1为含有0.02%的抗坏血酸钠和0.5%的硫代甘油的HEPES缓冲液；解离剂R2为含有3%甲醇，0.05%三(2-氯乙基)磷酸酯和0.5mg/mL胶乳微球标记抗血红蛋白多克隆抗体的Tris-HCL溶液。
6）用于检测样本中红细胞叶酸时，向全血样本中加入20倍体积的预处理试剂，室温静置30min；取上述处理后的全血样本加入相同体积的解离剂混合，室温静置5min，得到所述待测样本。
将上述待测样本加入固相检测试纸条，加样后待10min后对检测试纸条上的荧光信号强度进行检测，获得检测线光信号强度与质控线光信号强度的比值（T/C），并对待测样品中叶酸浓度进行计算。
实施例2
本实施例中，提供又一种基于荧光量子点检测叶酸的试纸条，与实施例1不同之处在于，本实施例中，所述滤膜为醋酸纤维素膜，所述血红蛋白拦截线4划线浓度为0.8mg/mL抗血红蛋白单克隆抗体，检测线5划线浓度为1.0mg 叶酸-BSA；
所述滤膜1覆盖样品垫2的部分长度为1.3cm；
样品垫2覆盖结合垫3的部分长度为1.8mm；
结合垫3覆盖反应膜8的部分长度为1.8mm；
吸水纸7覆盖反应膜8的部分长度为1.8mm。
所述血红蛋白拦截线4距离NC膜8上沿5mm，与检测线5距离4mm，检测线5与质控线6间隔4mm。
实施例3
本实施例中，提供又一种基于荧光量子点检测叶酸的试纸条，与实施例1不同之处在于，本实施例中，所述滤膜为PVDF滤膜。
所述滤膜1覆盖样品垫2的部分长度为1.2cm；
样品垫2覆盖结合垫3的部分长度为2mm；
结合垫3覆盖反应膜8的部分长度为2mm；
吸水纸7覆盖反应膜8的部分长度为2mm。
所述血红蛋白拦截线4距离NC膜8上沿6mm，与检测线5距离5mm，检测线与质控线6间隔6mm。
实施例4
本实施例中，提供又一种基于荧光量子点检测叶酸的试纸条，所述试纸条具有实施例1-3中任一项所述试纸条结构，还包括检测结果的辅助观测装置，所述观测装置即为试纸条的卡壳，构造如图2所示，所述卡壳由上下两部分扣合而成，上半部分具有通孔和桶槽，所述通孔为加样孔10，对应滤膜1的位置，所述通槽即观察窗11，透过观察窗11直接观察到检测线5及质控线6。
使用状态下，试纸条装入卡壳中，将待测样品滴加在加样孔10处。
实施例5
本实施例中，提供一种用于红细胞中叶酸含量检测的试剂盒，所述试剂盒中包括预处理试剂、解离剂及固相检测试纸条，所述固相检测试纸条为实施例1或2中所述基于荧光量子点检测叶酸的试纸条。
其中，预处理试剂为抗坏血酸钠（0.2%，w/v）及硫代甘油（0.5%，w/v）的混合水溶液。所述解离剂为3%甲醇,0.05%三(2-氯乙基)磷酸酯，0.5mg/mL胶乳微球标记的抗血红蛋白多克隆抗体和0.05M Tris-HCl缓冲液，pH8.4。
实施例6
本实施例中，提供又一种用于红细胞中叶酸含量检测的试剂盒，所述试剂盒中包括预处理试剂、解离剂及固相检测试纸条，所述固相检测试纸条为实施例1或2中所述基于荧光量子点检测叶酸的试纸条。
其中，预处理试剂为抗坏血酸钠（0.1%，w/v）及硫代甘油（0.6%，w/v）的混合水溶液。所述解离剂为3%乙醇,0.03%三(2-氯乙基)磷酸酯，0.5mg/mL胶乳微球标记的抗血红蛋白多克隆抗体和0.05M HEPES缓冲液，pH7.4。
实施例7
本实施例中，提供又一种用于红细胞中叶酸含量检测的试剂盒，所述试剂盒中包括预处理试剂、解离剂及固相检测试纸条，所述固相检测试纸条为实施例1或2中所述基于荧光量子点检测叶酸的试纸条。
其中，预处理试剂为抗坏血酸钠（0.3%，w/v）及硫代甘油（0.4%，w/v）的混合水溶液。所述解离剂为4%甲醇,0.03%三(2-氯乙基)磷酸酯，0.4mg/mL胶乳微球标记的抗血红蛋白多克隆抗体和0.05M Tris-HCl缓冲液，pH8.4。
对比例1
制备方法同实施例1，区别在于预处理试剂中仅含有0.5%硫代甘油，而未添加抗坏血酸。
对比例2
制备方法同实施例1，区别在于预处理试剂中仅含有0.2%抗坏血酸钠，而未添加硫代甘油。
对比例3
包被膜、结合垫的制备方法同实施例1，区别在于解离剂制备过程中仅含有三(2-氯乙基)磷酸酯，而未添加胶乳微球标记的抗血红蛋白多克隆抗体。
对比例4
包被膜、结合垫的制备方法同实施例1，区别在于试纸条组装过程中，用玻璃纤维材质代替具有特定截留分子量的滤膜。
对比例5
制备方法同实施例1，区别在于量子点标记过程中加1mg/mL氨基葡萄糖进行封闭。
对比例6
制备方法同实施例1，区别在于量子点标记叶酸抗体过程中，缓冲体系为50mM 磷酸盐缓冲液pH7.0。
对比例7
制备方法同实施例1，区别在于检测样本时，全血样本中加入10倍体积的预处理剂，静置30min，取上述处理有的全血样本加入等体积的解离剂混合，室温静置5min，得到待测样本后进行检测。
效果验证
1、将实施例1与对比例1、对比例2平行比对20例临床样本，对20例样本的检测结果进行记录分析。
表1
Figure 696636DEST_PATH_IMAGE001
Figure 42167DEST_PATH_IMAGE002
样本与预处理剂混合过程中，实施例1与对比例1均可在20min内完成红细胞的破膜，对比例2中，部分样本30min时，红细胞依然没有破裂，导致红细胞中的叶酸无法释放检测浓度明显偏低；与实施例1相比，对比例1中，预处理液仅包含硫代甘油，红细胞可快速破膜，但缺乏抗坏血酸的保护作用，导致释放出的叶酸被氧化分解，最终检测结果明显低于赋值浓度。结合数据分析，硫代甘油与抗坏血酸联合使用能同时达到快速裂解红细胞且保护叶酸免于分解，有利于提高检测的灵敏度。
2、将实施例1与对比例3、对比例4平行比对测试20例临床样本，将待测样本用预处理剂与解离剂处理后，滴加到加样孔中并开始计时，记录滤膜对血红蛋白的阻隔效果（加样后多久可在视窗范围内观测到血红蛋白及展板结束后膜面情况），同时对20例样本的检测结果进行记录分析。
表2 对血红蛋白阻隔效果
Figure 599050DEST_PATH_IMAGE003
Figure 397242DEST_PATH_IMAGE004
20例临床样本检测结果如下：
表3
Figure 127301DEST_PATH_IMAGE005
结合实施例1与对比例3、对比例4对血红蛋白的拦截情况及对临床样本的检测结果可知，本发明试剂盒中实施例1中，解离剂中的胶乳微球标记抗血红蛋白与特定截留分子量的滤膜联合使用可有效拦截样本中的血红蛋白，降低血红蛋白对检测系统的干扰，从而具有较高的灵敏度和准确性，对样本的检测结果与赋值结果相比，线性相关系数在0.975以上。单独在解离剂中添加胶乳微球标记的抗血红蛋白多克隆抗体或只使用特定截留分子量的滤膜均无法降低血红蛋白对检测系统干扰。
3、将实施例1与对比例5、对比例6平行比对测试20例临床样本，将待测全血样本用预处理剂、解离剂处理完成后，滴加入加样孔中，10min后记录20份样本的检测结果。
表4
Figure 825873DEST_PATH_IMAGE006
结合上述表中数据可知，本发明试剂盒实施例中使用的标记抗体的缓冲体系和封闭剂用量，是优化后最合适的标记体系，保证了加样后反应的灵敏度和准确性，对样本的检测结果与赋值结果相比较相关系数均在0.975以上，远优于对比例3和对比例4的检测结果。
4、将实施例1与对比例7同时比对检测20例临床样本，将待测全血样本用预处理剂、解离剂处理完成后，滴加入加样孔中，10min后记录20份样本的检测结果及膜面情况。
表5
Figure 350395DEST_PATH_IMAGE007
Figure 635883DEST_PATH_IMAGE008
结合上述表中数据可知，本发明试剂盒实施例中使用的预处理剂和解离剂配比已经达到最优，与样本混合后可对目标检测物质进行充分的解离，保证了加样后样本检测结果的准确性，同时避免了血红蛋白迁移至NC膜处对样本检测结果的干扰，对样本的检测结果与赋值结果相比较相关系数均在0.975以上，远优于对比例7检测结果。
试验例：
将叶酸稀释为1000ng/mL、800ng/mL、600ng/mL、400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL，并同时配制空白溶液；
分别取各浓度的标准品溶液50ul加入到实施例1制备的检测卡的样品垫上，10min后将展板完成的检测卡放入荧光免疫分析仪（山东子峰生物技术有限公司生产）进行判读，获取不同浓度检测线、质控线的荧光值，并记录各浓度标准品的荧光值与标准品浓度之间的对应关系。根据测量结果的荧光信号——标定浓度值，制定标准曲线方程。如图3所示，红细胞叶酸的标准曲线回归方程为：y=129.71/X +0.0767。将标准曲线烧录到ID卡中，制成红细胞叶酸校准卡。
1、空白限：取空白溶液加入到实施例1制备的检测卡中，计算20次结果的T/C平均值（M）及标准差（SD），以M±2SD计算空白限信号值，将该信号值待入标曲进行回算，回算浓度显示，红细胞叶酸的空白限为60ng/mL。
2、准确度：取国际标准品（NIBSC Code:95/528，WHO标准物质）复溶后，按实施例1中给出的操作方法进行预处理及解离，取50uL处理完毕的样本液加入实施例1中制备的试纸条上，10min后上样检测。以相对偏差评估试纸条的准确度。经测试，本发明中提供的红细胞叶酸检测试剂盒检测国际标准品相对偏差在±15%以内
3、重复性：应用企业内部参考品对本发明中提供的红细胞叶酸检测试剂盒精密性进行评估。使用实施例1中提供的试纸条对企业内部参考品重复检测10次，计算均值（M）及标准差SD，以变异系数CV评估试纸条重复性，经验证，试纸条重复性在15%以内。
4、临床样本检测取100例随机临床样本，采用本发明实施例1制备的试剂盒对红细胞叶酸的浓度进行检测，所使用预处理剂和解离剂均采用最优配方，检测方法为：取校准卡插入到荧光免疫分析仪（山东子峰生物技术有限公司生产）中，对仪器进行校准；取50ul样本中加入到1.0mL预处理剂中，混匀后室温下静置30min， 取50ul上述处理液加入到50uL解离剂中，室温下静置5min后，取50ul解离之后的样本液加至样品垫上，展板10min放入荧光免疫分析仪（山东子峰生物技术有限公司生产）中，测得红细胞叶酸的检测结果并记录。表6
Figure 169633DEST_PATH_IMAGE009
Figure 224176DEST_PATH_IMAGE010
由此可见，本试剂盒可以对全血样本进行预处理释放出红细胞中的叶酸，同时实现对红细胞叶酸的直接检测，方便快速，适合在基层医院和体检中心推广和使用。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种红细胞中叶酸的量子点荧光检测方法，其特征在于，所述检测包括对全血样本的预处理、解离，并对解离后样本中的叶酸进行量子点荧光检测，所述全血样本的预处理试剂为抗坏血酸及硫代甘油的组合；所述解离采用的解离剂中包括三(2-氯乙基)磷酸酯和胶乳微球标记的抗血红蛋白多克隆抗体。
2.如权利要求1所述红细胞中叶酸的量子点荧光检测方法，其特征在于，所述抗坏血酸还包括抗坏血酸盐，所述抗坏血酸盐为抗坏血酸钠；所述抗坏血酸盐的浓度为0.1~0.3%；所述硫代甘油的浓度为0.3~0.7%；所述预处理时间为25~35min。
3.如权利要求1所述红细胞中叶酸的量子点荧光检测方法，其特征在于，所述解离剂的成分如下：2~4%甲醇，0.03~0.07%三(2-氯乙基)磷酸酯，0.4~0.6mg/mL胶乳微球标记的抗血红蛋白多克隆抗体溶于Tris-HCL缓冲液中，所述Tris-HCl缓冲液pH为8.0~9.0，离子强度为20mM~100mM。
4.一种基于量子点荧光检测叶酸的试纸条， 其特征在于，具有滤膜对待测样品进行过滤；所述试纸条的层析结构按照样品的层析方向依次设置滤膜、样品垫、结合垫、反应膜及吸水材料，上述五种材料相邻部分接壤；
所述滤膜、样品垫、结合垫及反应膜依次搭接，所述吸水材料与反应膜接触的部分搭在反应膜上；
所述反应膜为硝酸纤维素膜，按照层析方向设置血红蛋白拦截线、检测线及质控线；所述血红蛋白拦截线处固定有血红蛋白的特异性吸附物质，所述检测线固定叶酸偶联抗原，所述质控线处固定IgG抗体。
5.如权利要求4所述基于量子点荧光检测叶酸的试纸条， 其特征在于，所述血红蛋白的特异性吸附物质为血红蛋白的单克隆抗体；
所述滤膜为硝酸纤维素、醋酸纤维素或PVDF；
所述结合垫为玻璃纤维材质或聚酯纤维材质，结合垫上喷涂有量子点标记叶酸单克隆抗体，所述量子点标记叶酸单克隆抗体采用如下方式制备：
将CdSe/ZnS量子点加入缓冲液中活化量子点羧基后，将其与所述叶酸单克隆抗体的氨基基团连接，并对未结合的羧基进行封闭。
6.如权利要求5所述基于量子点荧光检测叶酸的试纸条， 其特征在于，所述试纸条使用方式如下：将解离后的待测叶酸样品滴加在样品垫上，待测样品在吸水材料的作用下，依次流经样品垫、结合垫、检测线及质控线；叶酸与预先包被在结合垫上的量子点标记的叶酸单克隆抗体结合，从而使量子点标记的叶酸单克隆抗体与检测线上的叶酸偶联抗原结合量减少，检测线荧光条带减弱或是消失，获得检测线光信号；样品中未被检测线叶酸偶联抗原拦截的量子点标记叶酸单克隆抗体与质控线上的IgG结合产生荧光，获得质控线光信号，构建检测线光信号强度与质控线光信号强度的比值与样本浓度的标准曲线，通过标准曲线计算待测样品中叶酸浓度。
7.如权利要求6所述基于量子点荧光检测叶酸的试纸条， 其特征在于，所述光信号强度的检测通过流氏细胞检测仪、荧光分光光度计、荧光共聚焦显微镜中的一种进行检测。
8.如权利要求4所述基于量子点荧光检测叶酸的试纸条， 其特征在于，所述试纸条还具有底板，所述底板用于承载层析结构；所述底板为PVC材质；
所述试纸条还具有辅助观测的装置，所述辅助观测装置为一种卡壳，所述卡壳由上下两部分扣合而成，卡壳上部具有通孔及通槽，所述通孔对应滤膜的位置，设置于滤膜上方，用于向检测试纸加样；所述通槽为观察窗，透过观察窗可观察到检测线及质控线。
9.一种红细胞中叶酸的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求4-8任一项所述试纸条；还包括预处理试剂及解离试剂。
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