CN117214445B

CN117214445B - 一种叶酸、维生素b12、铁蛋白联检的量子点荧光检测试剂及其应用

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Publication number: CN117214445B
Application number: CN202311481471.4A
Authority: CN
Inventors: 何长锋; 刘爱玲; 王学士; 谢煜萍; 姚丛丛
Original assignee: Shandong Zifeng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shandong Zifeng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-11-09
Filing date: 2023-11-09
Publication date: 2024-01-26
Anticipated expiration: 2043-11-09
Also published as: CN117214445A

Abstract

本发明属于分析化学和检测技术领域，具体涉及一种叶酸、维生素B12、铁蛋白联检的量子点荧光检测试剂及其应用。本发明通过对叶酸、维生素B12、铁蛋白的检测相关试剂等进行优化组合，从而有效克服目前已知的检测方法存在项目不合并、需多次上样检测的缺陷，同时具有检测灵敏度高、检测限低、线性范围较宽、操作简便且稳定性高，可实现常温运输等优点，对贫血性疾病的诊断和药物疗效评估具有重要的价值。

Description

一种叶酸、维生素B12、铁蛋白联检的量子点荧光检测试剂及其应用

技术领域

本发明属于分析化学和检测技术领域，具体涉及一种叶酸、维生素B12、铁蛋白联检的量子点荧光检测试剂及其应用。

背景技术

叶酸（FA）也称蝶酰谷氨酸，是一种水溶性维生素，在核酸、胸苷酸、神经递质、磷脂以及激素的合成中必不可少，在体内作为一碳单位的载体，参与氨基酸和核酸的代谢，对细胞增殖、组织分化和机体生长发育均具有重要作用。人体缺乏合成叶酸的酶，因此必须依靠外部摄入进行补充。叶酸可用于治疗由叶酸缺乏引起的贫血，也是孕妇的营养素补充剂；超过50%的新生儿神经管缺陷（NTDs）病例与妊娠初期叶酸不足有关，补充叶酸可显著降低NTDs的发生率。长期补充叶酸也有助于降低心脑血管疾病的发生风险。

维生素B12（VB12）又称氰钴氨素，它是唯一含有金属离子的水溶性维生素，也是人体必需的维生素之一。VB12作为甲硫氨酸合酶和甲基丙二酰辅酶 A 变位酶的辅酶，参与叶酸循环、甲硫氨酸循环以及DNA合成。体内维生素B12缺乏时，叶酸代谢受阻，影响DNA合成和幼红细胞分裂而导致恶性贫血。测定血清维生素B12浓度对贫血的辅助诊断及血液系统某些疾病的病情演变和动态观察均有重要意义。

血清铁蛋白（Fer）是机体参与铁代谢的可溶组织蛋白，主要分布在肝、脾、骨髓等。非血红素铁对铁蛋白水平起调节作用：当机体内铁超过生理需求时，铁可与铁蛋白结合进行贮存；当细胞代谢需要铁时，铁蛋白内结合的铁又可释放进行补充机体。铁蛋白在血清中的浓度与体内贮存的铁呈正比，可用于监测体内铁代谢，在临床上测定铁蛋白的含量常用于缺铁性贫血的诊断。铁蛋白在免疫调节活性以及抗感染方面也具有十分积极的作用：正常情况下，铁蛋白在血清中的含量较少，当肝细胞坏死，恶性肿瘤、炎症和某些网状内皮系统相关疾病发生时，可致血浆铁蛋白水平升高。

贫血是由许多不同原因或不同疾病所引起的临床症状，有多种分类依据和原则，其中营养素缺乏导致的贫血是最常见的贫血类型之一，称为营养性贫血。营养性贫血又进一步分为巨幼红细胞贫血与缺铁性贫血；其中叶酸与维生素 B12 缺乏可导致巨幼红细胞性贫血，铁蛋白缺乏可导致缺铁性贫血。联合检测FA、VB12、Fer对贫血性疾病的诊断具有非常大的临床诊断价值。

然而，目前临床上对贫血性疾病诊断主要是对单个项目进行检测，导致在检测效率方面存在一定的局限性；或者临床上采用对不同项目的试剂盒进行多次检测，存在多次采血，样本用量多，检测时间长，且效率低的问题。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种叶酸、维生素B12、铁蛋白联检的量子点荧光检测试剂及其应用。本发明通过对叶酸、维生素B12、铁蛋白的检测相关试剂等进行优化组合，从而有效克服目前已知的检测方法存在项目不合并、需多次上样检测的缺陷，同时具有检测灵敏度高、检测限低、线性范围较宽、操作简便且稳定性高，可实现常温运输等优点，对贫血性疾病的诊断和药物疗效评估具有重要的价值。基于上述研究成果，从而完成本发明。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明提供一种叶酸、维生素B12、铁蛋白联检的量子点荧光检测试剂，所述量子点荧光检测试剂至少包括用于稀释待测样本的稀释液以及用于叶酸、维生素B12、铁蛋白联检的量子点荧光检测试纸条；

其中，所述稀释液包括环糊精、聚乙二醇、非离子型表面活性剂及变性剂。

所述环糊精可采用α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精及其衍生物中的任意一种或多种；进一步优选的，所述环糊精为羟丙基-β-环糊精。

一些实施方案中，所述聚乙二醇的分子量为200~25000，包括聚乙二醇高聚物或聚乙二醇的衍生物；具体的实例中，所述聚乙二醇可采用PEG2000、PEG6000或PEG8000。

一些实施方案中，所述非离子型表面活性剂选自S17，S18，S19，S20，S21，S22，S24中的一种或几种的组合；优选的，所述非离子型表面活性剂为S19。

一些实施方案中，所述变性剂选自盐酸胍、尿素、二硫苏糖醇、巯基乙醇中的一种或几种的组合；进一步优选的，所述变性剂为盐酸胍。

另外，所述稀释液还应当保持与待测样本相似的渗透环境，因此采用生理盐水和/或缓冲液作为溶剂；所述缓冲液的一个具体实例如HEPES缓冲液；上述优选的技术方案的一种实施方式中，所述稀释液的配方如下：0.07~0.13M的HEPES缓冲液（pH7~8）中，含有0.8~1.0%NaCl，2~5%羟丙基-β-环糊精，1~3 % PEG2000，0.3~0.6%S19和0.3~0.7%盐酸胍。

其中，所述待测样本为血液样本，具体可以为全血、血清或血浆样本，在此不做具体限定。

用于叶酸、维生素B12、铁蛋白联检的量子点荧光检测试纸条包括底板，底板上覆盖层析结构，所述层析结构按照样品流动方向依次设置滤血膜、结合垫、包被膜和吸水垫，上述各部件相邻处交叠连接；

其中，所述结合垫上包被有量子点标记叶酸抗体、量子点标记维生素B12抗体、量子点标记铁蛋白抗体和量子点标记鸡IgY抗体的混合物，上述混合物采用复溶液溶解并稀释后喷涂在结合垫上，所述复溶液的配方如下：0.1~0.2M的PBS缓冲液(pH7.0~7.4)中，含有0.8~1.0%酪蛋白、1~3%BSA、10~30%甘油、10~20%海藻糖和0.3~0.6% Proclin300；为了最大程度保证量子点标记抗体的高活性和稳定性，上述结合垫喷涂后采用低温干燥的方式，例如冷冻干燥。

所述包被膜上沿层析方向依次设置检测线（T1线、T2线、T3线）及质控线（C线）；其中，所述T1线包被有叶酸抗原，T2线包被有维生素B12抗原，T3线包被有铁蛋白抗体，C线包被有羊抗鸡IgY抗体。

上述试纸条中，所述滤血膜、结合垫及包被膜依次搭接，所述吸水垫与检测垫接壤部分搭接在检测垫上；进一步优选的方案中，所述滤血膜为玻璃纤维素膜；所述结合垫为聚酯纤维素膜；所述包被膜为硝酸纤维素膜；所述吸水垫为具有良好吸水性能的材料，如玻纤材质、棉浆材质或玻纤和棉浆的混合材质，优选的材质为棉浆材质，或采用市售吸水材料，例如吸水纸或吸水板。

一些实施方案中，所述试纸条中，其底板采用具有一定硬度的疏水材料；进一步的，所述底板为PVC板。

同时，考虑到全血样本中含有45%的血细胞，血细胞（绝大部分为红细胞）若破裂或者流过视窗会对检测结果产生影响，使检测值出现较大偏差，因此，在试纸条加样孔端增加滤血膜（滤血膜经过预处理），截住红细胞，减少对检测结果的不利影响。所述滤血膜中包含抗红细胞抗体（RBC），用于过滤掉全血样本中的红细胞；所述滤血膜的预处理采用喷涂RBC预处理液的方式进行制备，所述预处理液的配方如下：0.07~0.13M的HEPES缓冲液（pH7~8）中，含有1.8~3.0%NH₄Cl、1~3%酪蛋白钠、1~3% PVP-K30和160~240μg/mL抗红细胞抗体(RBC)和0.3~0.6% Proclin300，采用如上配方的预处理液喷涂后干燥得到所述滤血膜；为了保留RBC的活性，上述干燥优选采用低温干燥的方式，如冷冻干燥方式，本发明研究发现，采用预喷涂滤血膜后冻干的方式，不仅能够最大程度保留RBC的活性，还能够封闭滤血膜上的空余位点，避免吸附血液样本中的目标物，从而达到提高灵敏度的目的。

上述检测试剂以血液样本（包括全血、血清及血浆）作为检测对象，基于竞争法、双抗夹心法对样本中的叶酸、维生素B12、铁蛋白分别进行量子点荧光检测。与现有检测方法的显著不同之处在于，本发明将三种待测物质（叶酸、维生素B12、铁蛋白）合并到一张检测卡上进行检测，实现了大分子（铁蛋白）与小分子（叶酸、维生素B12）的同步测定，一次采血检测可出具3个检测结果，提升检测效率。

本发明基于量子点荧光技术的叶酸、维生素B12、铁蛋白检测方法原理如下：

本发明中用于叶酸、维生素B12、铁蛋白联检的量子点荧光检测试纸条的主体反应部分为结合垫和包被膜：结合垫上包被有量子点标记叶酸抗体、量子点标记维生素B12抗体、量子点标记铁蛋白抗体和量子点标记鸡IgY抗体的混合物；包被膜的硝酸纤维素膜（NC膜）上依次设置检测线（T1线、T2线、T3线）及质控线（C线），其中T1线包被有过量的叶酸抗原，T2线包被有过量的维生素B12抗原，T3线包被有过量的铁蛋白抗体，C线包被有过量的羊抗鸡IgY抗体。本试剂盒中叶酸、维生素B12的检测采用竞争法，检测时，加入待检样本后，由于层析作用，结合垫上的标记抗体随着样本溶液沿硝酸纤维素膜向前移动，其中的量子点标记叶酸抗体、量子点标记维生素B12抗体与血液样本中的待测叶酸抗原、VB12抗原结合，未与待测抗原结合的标记抗体被检测线（T1、T2）捕获形成荧光条带，荧光值的强弱与待测抗原的浓度呈反比。而铁蛋白的检测采用双抗夹心法，检测时，加入待检样本后，在层析作用下结合垫上的标记抗体随着样本溶液沿硝酸纤维素膜向前移动，其中的量子点标记Fer抗体与血液样本中的待测Fer抗原结合形成复合物，复合物随溶液继续扩散，被检测线T3（Fer抗体）捕获形成荧光条带，荧光值的强弱与待测抗原的浓度呈正比。未结合的样本溶液继续前移，其中的量子点标记鸡IgY被质控线抗体羊抗鸡IgY捕获，并形成C峰，完成质控校准反应。

展板完毕后将检测卡放入检测仪器，检测线区域的荧光值T1、T2、T3，质控线区域的荧光值C，进一步经软件换算得到T1/C、T2/C、T3/C，通过标准曲线计算即可得出待测样本中叶酸、维生素B12、铁蛋白的含量。

进一步的，所述试纸条采用如下方法制备得到：

1）制备包被膜：将硝酸纤维素膜（NC膜）固定并划线，分别取叶酸抗原、维生素B12抗原、铁蛋白抗体和羊抗鸡IgY分别包被于NC膜的检测线（T1、T2、T3）和质控线（C）的位置并进行冷冻干燥；

2）制备结合垫：将量子点标记叶酸抗体、量子点标记维生素B12抗体、量子点标记铁蛋白抗体和量子点标记鸡IgY混匀，喷于玻璃纤维垫上，干燥后可得到所述的结合垫。

其中，所述量子点标记叶酸抗体、量子点标记维生素B12抗体、量子点标记铁蛋白抗体或量子点标记鸡IgY抗体采用如下方法制备得到：

a：取硒化镉量子点，加入到MES缓冲液中，活化处理；然后向其中加入EDC和NHS，再加入叶酸抗体、维生素B12抗体、铁蛋白抗体或鸡IgY抗体进行避光反应；

b：向步骤a中的量子点标记液中加入酪蛋白和乙醇胺，4℃下避光搅拌反应进行封闭；

c：取步骤b中的标记后混合液离心，并用PBS缓冲液作为清洗液进行清洗；

d：应用复溶液对步骤c中得到的标记后溶液进行复溶，并混匀，即得到量子点标记叶酸抗体、量子点标记维生素B12抗体、量子点标记铁蛋白抗体或量子点标记鸡IgY抗体。

其中，所述复溶液其配方具体为：0.1~0.2M的PBS缓冲液(pH7.0~7.4)中，含有0.8~1.0%酪蛋白、1~3%BSA、10~30%甘油、10~20%海藻糖和0.3~0.6% Proclin300。

进一步的，上述复溶液其配方为：0.2M的PBS缓冲液(pH7.0)中，含有0.8%酪蛋白、1.5%BSA、20%甘油、20%海藻糖和0.3% Proclin300。

3）滤血膜预处理：

a：配制预处理液：0.05~0.15M的HEPES缓冲液（pH7~8）中，含有2-3%NH₄Cl、1-3%酪蛋白钠、2-3% PVP-K30和160-200μg/mL抗红细胞抗体(RBC)和0.3-0.5% Proclin300；

b：应用步骤a中所配制的预处理液，浸泡处理滤血膜；

c：将步骤b中的预处理滤血膜进行冻干处理，即得；

4）组装：

将底板上对应位置的粘纸撕去，将吸水垫粘贴在包被膜的NC膜上方，部分覆盖NC膜；将结合垫粘贴在NC膜下方，部分覆盖结合垫；将滤血膜粘贴在结合垫下方，部分覆盖结合垫，即可得到组装好的大板。

5）切条装壳：设置试纸条宽度后，进行裁切，即为制备好的试纸条。

进一步的，将步骤5）制备的试纸条正向放入卡壳中，压壳封装，即得具有壳体保护的检测卡。

本发明还提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包含上述量子点荧光检测试剂，进一步的，所述检测试剂盒中，所述试纸条外部具有壳体保护。

本发明还提供一种同时检测血液中叶酸、维生素B12、铁蛋白含量的方法，所述方法基于第一方面所述量子点荧光检测试剂或第二方面所述检测试剂盒获得受试者血液样本中叶酸、维生素B12、铁蛋白的浓度。

一些实施方案中，所述检测方法具体步骤如下：取待测血液样本滴加至样本稀释液中，混匀后，滴加至试纸条的滤血膜上，待其展板后，再对检测垫中检测线及质控线处荧光含量进行检测。

一些实施方案中，所述荧光含量检测的方式包括但不限于荧光免疫分析仪、流式、荧光显微镜、共聚焦显微镜、全内反射或双光子显微镜等进行荧光检测，所述荧光检测波长为610nm。

一些实施方案中，所述血液样本展板时间为4~6min。

本发明还提供上述量子点荧光检测试剂、检测试剂盒或检测方法在如下任意一种或多种中的应用：

1）叶酸、维生素B12和/或铁蛋白含量检测；

2）制备营养性贫血诊断或辅助诊断的产品；

3）制备营养贫血性药物疗效评估的产品。

所示产品可以是试剂盒、装置、设备等，在此不做具体限定。

以上一个或多个技术方案的有益技术效果：

1、上述技术方案提供的检测试剂，在现有叶酸、维生素B12、铁蛋白单项目检测的基础上，将大分子检测和小分子检测合而为一，提高了检测效率。

现有检测技术之所以无法将三者合而为一是由于这三种物质中铁蛋白为大分子物质（分子量500KD），而叶酸、维生素B12属于小分子物质（叶酸分子量是441.4D，维生素B12分子量为1355.37D）。大分子物质与小分子物质的差异有很多：首先小分子在人体血液中的存在形式是与大分子蛋白以结合态存在的，因此在检测的时候需要预先将其从大分子蛋白上解离下来，这就使得小分子的稀释液是具有解离作用的，而大分子不需要解离，有的甚至需要避免被解离。其次，大分子物质是完全抗原，既有免疫原性也有抗原性，在体外一般采用双抗夹心法来进行检测，而小分子物质是半抗原，不具有免疫原性但具有抗原性，因此在体外一般采用竞争法进行检测。

因此，要将叶酸、维生素B12、铁蛋白的检测在一张卡上完成，需要考虑的就是稀释液在解离叶酸、维生素B12的同时还能维持铁蛋白的完整性，本试剂盒的稀释液组分中变性剂可用来解离下来叶酸、维生素B12，环糊精类物质则对铁蛋白起到很好的保护作用，使其能维持结构的完整性，二者搭配使用，使得大分子与小分子物质可以在一张卡上完成检测。

2、试纸条加样孔位置设置滤血装置：滤血膜经过含RBC缓冲液预处理后，采用冷冻干燥方式，最大程度保留了RBC的活性，还能够封闭滤血膜上的空余位点，避免其吸附血液样本中的目标物（叶酸、维生素B12、铁蛋白），从而达到有效过滤红细胞的目的，实现了全血样本的检测，且全血样本与血清及血浆样本的检测结果有良好的一致性。

3、小分子的特性就是不稳定，本试剂盒对于抗原、抗体固定化过程中涉及到的划膜、喷垫均采用冷冻干燥的方式进行，最大限度保证了抗原、抗体的稳定性。

另外，本发明提供的检测试纸具有良好的稳定性，可在常温下进行运输和保存，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明试纸条结构示意图；

图2为本发明试纸条外部壳体结构示意图；

其中，1-滤血膜，2-结合垫，3-NC膜，4-吸水垫，5-底板（PVC板），6-检测线，7-质控线，8-加样孔，9-观察窗（视窗）。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

本实施例提供一种叶酸、维生素B12、铁蛋白的量子点荧光检测方法，包括检测试纸条结构如图1所示，所述试纸条包括底板5及层析结构，底板5承载层析结构。

所述层析结构自加样端向样品层析方向具有滤血膜1、结合垫2、NC膜3及吸水垫4，所述滤血膜1、结合垫2、NC膜3依次搭接，所述吸水垫4接触NC膜3的部分搭在NC膜3上。

本实施例中，应用上述检测试纸条的叶酸、维生素B12、铁蛋白的量子点荧光检测方法，具体操作步骤如下：

1）制备包被膜：

（A）包被：将NC膜非点样面固定于划膜喷金仪的既定位置，取浓度为分别为1.2mg/mL的叶酸抗原、维生素B12抗原、铁蛋白抗体和0.9mg/mL的羊抗鸡IgY抗体，应用三维划线喷金仪进行划线，将叶酸抗原、维生素B12抗原、铁蛋白抗体和羊抗鸡IgY抗体分别包被于NC膜的检测线T1、T2、T3和质控线C的位置，冷冻干燥48h。

2）制备结合垫

（A）量子点标记叶酸抗体

a：取50μL硒化镉量子点，加入到4mL 离子强度为50mM的MES缓冲液（pH6.0）中，向其中加入20mg/mL EDC、20mg/mL NHS各100μL，再加入5mg/mL的叶酸抗体250μL，室温下避光反应3h；

b：向步骤a中制备的量子点标记液中，加入终浓度为6mg/mL的酪蛋白和1mg/ml的乙醇胺，4℃下避光搅拌反应4h进行封闭；

c：取步骤b中的标记后混合液转移至离心管中，以12000g/min离心15min，弃上清；用50mM PBS缓冲液（pH7.4）作为清洗液，取4mL加入到上述离心管中，吹打均匀，再次以12000g/min离心15min，弃上清，即为所得标记抗体；

d：应用复溶液对步骤c中得到的标记抗体进行复溶，超声并混匀，即得到纯化后的量子点标记叶酸抗体。

（B）量子点标记维生素B12抗体

a：取50μL硒化镉量子点，加入到4mL 离子强度为50mM的MES缓冲液（pH6.0）中，向其中加入20mg/mL EDC、20mg/mL NHS各100μL，再加入5mg/mL的维生素B12抗体350μL，室温下避光反应3h；

d：应用复溶液对步骤c中得到的标记抗体进行复溶，超声并混匀，即得到纯化后的量子点标记维生素B12抗体。

（C）量子点标记铁蛋白抗体

a：取50μL硒化镉量子点，加入到4mL离子强度为50mM的MES缓冲液（pH6.0）中，向其中加入20mg/mL EDC、20mg/mL NHS各50μL，再加入5mg/mL的铁蛋白抗体300μL，室温下避光反应3h；

d：应用复溶液对步骤c中得到的标记抗体进行复溶，超声并混匀，即得到纯化后的量子点标记铁蛋白抗体。

（D）量子点标记鸡IgY

a：取100μL硒化镉量子点，加入到4mL离子强度为50mM的MES缓冲液（pH6.0）中，向其中加入20mg/mL EDC、20mg/mL NHS各100μL，分别加入5mg/mL的鸡IgY抗体500μL，室温下避光反应3h；

d：应用复溶液对步骤c中得到的标记抗体进行复溶，超声并混匀，即得到纯化后的量子点标记鸡IgY抗体。

上述复溶液配方为：0.2M的PBS缓冲液(pH7.0)中，含有0.8%酪蛋白、1.5%BSA、20%甘油、20%海藻糖和0.3% Proclin300。

（E）喷垫

将复溶后的量子点标记叶酸抗体、量子点标记VB12抗体、量子点标记铁蛋白抗体和量子点标记鸡IgY按1：1：1：1混匀，应用三维划线喷金仪按3μL/cm喷于玻璃纤维垫上，冷冻干燥48h，即可得到所述的结合垫。

3）滤血膜预处理

a：配制预处理液：0.1M的HEPES缓冲液（pH7.5）中，含有2.5%NH₄Cl、2%酪蛋白钠、2.5% PVP-K30和180μg/mL抗红细胞抗体(RBC)和0.4% Proclin300，

b：应用步骤a中所配制的预处理液，浸泡处理滤血膜，室温1h；

c：将步骤b中的预处理滤血膜用冻干机进行干燥，冷冻干燥48h，即得预处理的滤血膜；

4）组装：

将底板上对应位置的粘纸撕去，将吸水垫粘贴在NC膜上方对应位置，覆盖NC膜1mm；将结合垫粘贴在NC膜下方，覆盖结合垫1mm；将滤血膜粘贴在结合垫下方，覆盖结合垫2mm，即可得到组装好的大板。

5）切条装壳：应用微电脑自动斩切机，设置好试纸条宽度后，进行裁切，即为制备好的试纸条，试纸条正向放入卡壳中，压壳封装，即得具有壳体保护的检测卡，将检测卡放入铝箔袋袋中密封，即得到单人份叶酸、维生素B12、铁蛋白的检测卡。

6）配制样本稀释液。按照最优配方，0.1M的HEPES缓冲液（pH7.5）中，含有0.9%NaCl，3.5%羟丙基-β-环糊精，2 % PEG2000，0.5%S19和0.6%盐酸胍。

7）用于检测样本中叶酸、维生素B12、铁蛋白时，所述检测方法包括以下步骤：

a.吸取30μL待测样本（血清/血浆）加入120μL样本稀释液中或吸取20μL待测样本（全血）加入120μL样本稀释液中，混匀备用。

b.向上述检测卡加样孔中加入50μL稀释后样本，展板待5min后，插入荧光免疫分析仪，对检测卡的荧光信号强度进行检测，检测线和质控线的荧光值分别以T1、T2、T3、C表示，最终得到的检测结果以比值形式提供（即T1/C、T2/C、T3/C作为输出结果），将检测结果比值代入到标准曲线中，并对待测样本中叶酸、维生素B12、铁蛋白浓度进行拟合。

对比例1

制备方法同实施例1，区别在于叶酸、维生素B12、铁蛋白检测试剂盒的样本稀释液配制时，未添加变性剂。

对比例2

制备方法同实施例1，区别在于叶酸、维生素B12、铁蛋白检测试剂盒的样本稀释液配制时，未添加环糊精类物质。

对比例3

制备方法同实施例1，区别在于叶酸、维生素B12、铁蛋白检测试剂盒的包被膜、结合垫、滤血膜的干燥采用较为常规的37℃烘干方式，而非冻干方式。

效果验证

1、实施例1检测临床样本

实施例1中检测叶酸、维生素B12、铁蛋白结果与临床检测叶酸、维生素B12、铁蛋白结果的阴阳相符率均可达100%，相关性为：0.992、0.981、0.995。

表1实施例1的检测结果与临床结果比对

2、对比例1检测临床样本

对比例1中检测铁蛋白结果与临床检测铁蛋白结果的阴阳相符率可达100%，相关性在0.993；但是对比例1中叶酸、维生素B12检测结果与临床检测叶酸、维生素B12的阴阳符合率52%、44%，相关性在0.463、0.380。

表2对比例1的检测结果与临床结果比对

3、对比例2检测临床样本

对比例2中叶酸、维生素B12检测结果与临床检测叶酸、维生素B12的阴阳符合率96%、100%，相关性在0.989、0.988；但是对比例1中检测铁蛋白结果与临床检测铁蛋白结果的阴阳相符率可达48%，相关性在-0.292。

表3对比例2的检测结果与临床结果比对

4、对比例3检测临床样本

对比例3中检测叶酸、维生素B12、铁蛋白结果与临床检测叶酸、维生素B12、铁蛋白结果的阴阳相符率可达80%、76%、72%，且低浓度点的灵敏度区分不明显。

表4对比例3的检测结果与临床结果比对

5、本发明中试纸条的技术指标：

准确度：相对偏差不超过±5%；

重复性：CV不超过±5%；

检出限：叶酸检出限不高于0.3ng/mL；维生素B12 检出限不高于50pg/mL；铁蛋白检出限不高于0.1ng/mL；

线性范围：叶酸线性范围[0.5, 50]ng/mL；维生素B12 线性范围[100, 3000]pg/mL；铁蛋白线性范围[0.5, 2000]ng/mL。

6、试纸条稳定性验证

以已知叶酸、维生素B12、铁蛋白浓度分别为7.8ng/mL、408pg/ml、128ng/ml的样本对3个不同批次的试纸条进行测试，结果如下表5所示。

表5试纸条稳定性检测结果

表明其具有良好常温贮藏稳定性，操作简便，可实现常温运输。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种叶酸、维生素B12、铁蛋白联检的量子点荧光检测试剂，其特征在于，所述量子点荧光检测试剂至少包括用于稀释待测样本的稀释液以及用于叶酸、维生素B12、铁蛋白联检的量子点荧光检测试纸条；

其中，所述稀释液的配方如下：0.07~0.13M的HEPES缓冲液中，含有0.8~1.0%NaCl，2~5%羟丙基-β-环糊精，1~3 % PEG2000，0.3~0.6%S19和0.3~0.7%盐酸胍，所述HEPES缓冲液pH为7~8；

所述结合垫上包被有量子点标记叶酸抗体、量子点标记维生素B12抗体、量子点标记铁蛋白抗体和量子点标记鸡IgY抗体的混合物，上述混合物采用复溶液溶解并稀释后喷涂在结合垫上，所述复溶液的配方如下：0.1~0.2M的PBS缓冲液中，含有0.8~1.0%酪蛋白、1~3%BSA、10~30%甘油、10~20%海藻糖和0.3~0.6% Proclin300；所述PBS缓冲液pH为7.0~7.4；

所述包被膜上沿层析方向依次设置检测线T1线、T2线、T3线及质控线C线；其中，所述T1线包被有叶酸抗原，T2线包被有维生素B12抗原，T3线包被有铁蛋白抗体，C线包被有羊抗鸡IgY抗体。

2.如权利要求1所述的量子点荧光检测试剂，其特征在于，所述待测样本为血液样本，包括全血、血清或血浆样本。

3.如权利要求1所述的量子点荧光检测试剂，其特征在于，所述滤血膜、结合垫及包被膜依次搭接，所述吸水垫与检测垫接壤部分搭接在检测垫上；

所述滤血膜为玻璃纤维素膜；所述结合垫为聚酯纤维素膜；所述包被膜为硝酸纤维素膜；所述吸水垫为玻纤材质、棉浆材质、玻纤和棉浆的混合材质、吸水纸或吸水板；

所述底板为PVC板；

所述滤血膜采用喷涂RBC预处理液的方式进行制备，所述预处理液的配方如下：0.07~0.13M的HEPES缓冲液中，含有1.8~3.0%NH₄Cl、1~3%酪蛋白钠、1~3% PVP-K30和160~240μg/mL抗红细胞抗体和0.3~0.6% Proclin300，所述HEPES缓冲液pH为7~8。

4.如权利要求1-3中任一项所述量子点荧光检测试剂，其特征在于，所述试纸条采用如下方法制备得到：

1）制备包被膜：将硝酸纤维素膜固定并划线，分别取叶酸抗原、维生素B12抗原、铁蛋白抗体和羊抗鸡IgY分别包被于NC膜的检测线T1、T2、T3和质控线C的位置并进行冷冻干燥；

2）制备结合垫：将量子点标记叶酸抗体、量子点标记维生素B12抗体、量子点标记铁蛋白抗体和量子点标记鸡IgY混匀，喷于玻璃纤维垫上，干燥后可得到所述的结合垫；

3）滤血膜预处理：

4）组装：

将底板上对应位置的粘纸撕去，将吸水垫粘贴在包被膜的NC膜上方，部分覆盖NC膜；将结合垫粘贴在NC膜下方，部分覆盖结合垫；将滤血膜粘贴在结合垫下方，部分覆盖结合垫，得到组装好的大板；

5.如权利要求4所述量子点荧光检测试剂，其特征在于，所述量子点标记叶酸抗体、量子点标记维生素B12抗体、量子点标记铁蛋白抗体或量子点标记鸡IgY抗体采用如下方法制备得到：

d：应用复溶液对步骤c中得到的标记后溶液进行复溶，并混匀，即得到量子点标记叶酸抗体、量子点标记维生素B12抗体、量子点标记铁蛋白抗体或量子点标记鸡IgY抗体；

其中，所述复溶液的配方如下：0.1~0.2M的PBS缓冲液中，含有0.8~1.0%酪蛋白、1~3%BSA、10~30%甘油、10~20%海藻糖和0.3~0.6% Proclin300，所述PBS缓冲液pH为7.0~7.4。

6.一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含权利要求1-5任一项所述量子点荧光检测试剂。

7.权利要求1-5任一项所述量子点荧光检测试剂或权利要求6所述检测试剂盒在如下任意一种或多种中的应用：

1）制备营养性贫血诊断或辅助诊断的产品；

2）制备营养性贫血药物疗效评估的产品。