FI87695B - Analyselement med flera avdelningar och med en koncentrationszon foer en detekterbar signal - Google Patents

Description

1 87695

Monivyöhykkeinen analyysiväline, jossa on todettavissa olevan signaalin konsentrointivyöhyke

Esillä oleva keksintö koskee monivyöhykkeistä ana-5 lyysivälinettä nestemäisessä analyysiväliaineessa olevan analyytin määrittämiseksi immunoanalyysin avulla käyttäen immunometristä tai kompetitiivistä menetelmää, johon kuuluu sidoksen muodostaminen (i) analyytin ja analyytin tai sen sidosanalogin leimatun tai immobilisoidun muodon ja 10 (ii) analyytin sidosparin immobilisoidun tai leimatun muodon, vastaavasti, välillä, jolloin analyytin, sen analogin tai sidosparin leimattu muoto on leimattu reagenssi, joka sisältää todettavissa olevan kemiallisen ryhmän, joka reagoi detektanttikoostumuksen kanssa muodostaen todettavissa 15 olevan signaalin.

Moni vyöhykkeisiä analyysivälineitä tai koelaitteita on aikaisemmin tuotu esiin, ja niitä on käytetty sitomis-analyyseissä, esim. immunomäärityksiin, jotka perustuvat vasta-aineen tai antigeenin kykyyn sitoutua spesifiseen 20 analyyttiin analyytin määrittämiseksi nestemäisessä ana lyysiväliaineessa. Sellaisiin määrityksiin kuuluvat ne immunomääritykset, joissa leimattu reagenssi, kuten analyytin leimattu muoto tai sen vasta-aine, osallistuu anti-geeni-vasta-aine-reaktioon, jolloin muodostuu vapaa muoto 25 ja sidottu muoto, joiden avulla leimatun reagenssin määrä toisessa sellaisessa muodossa voidaan korreloida analyytin määrän nestemäisessä analyysiväliaineessa. Periaatteessa sellaisia määrityksiä nimitetään heterogeenisiksi immuno-määritykeiksi, koska vapaa ja sidottu muoto on erotettava . .·. 30 määrityksen saattamiseksi päätökseen.

Nykyään tekniikan tasoon kuuluu monivyöhykkeelli-siä, erityisesti monikerroksellisia analyysivälineitä, jotka luonnostaan suorittavat tarvittavan erotusvaiheen niin, ettei tarvita mitään lisäkäsittelyjä nestemäisen ‘ 35 analyysiväliaineen lisäämisen jälkeen. Yleensä välineet 2 87695 käsittävät useita kerroksia, joissa on tarvittavat rea-genssit immunomäärityksen suorittamiseksi ja välttämättömän, siihen liittyvän erotusvaiheen toteuttamiseksi. Monet sellaiset välineet sisältävät lisäksi detektiokerroksen, 5 josta joko sidotussa tai vapaassa muodossa olevan leimatun aineen tuottama signaali todetaan ja mitataan. Todettavissa olevat signaalit, joita nämä välineet tuottavat, ovat tavallisesti optisia luonteeltaan, kuten värin muutokset, fluoresenssi, tai vastaavat. Vaihtoehtoisesti voidaan de-10 tektio toteuttaa sähkökemiallisilla mittauksilla käyttämällä esimerkiksi potentiometrisiä tai ampometrisiä menetelmiä.

Tällaisia monikerroksisia immunomääritykseen tarkoitettuja analyysivällaineita kuvataan esimerkiksi EP-15 patenttijulkaisussa 97 952 ja saksalaisessa patenttijulkaisussa DE-OS 33 29 728, joissa niihin on sisällytettyinä sidosparin immobilisoitu muoto, kuten antigeenin immobili-soitu vasta-aine, ja todettavissa olevalla aineella leimattu antigeeni. Lisättäessä nestemäistä analyysiväliai-20 netta sellaiseen välineeseen, väliaineen antigeeni kilpailee välineeseen sisällytetyn leimatun antigeenin kanssa sitoutumisesta immobilisoituun vasta-aineeseen. Sidotun muodon eroaminen vapaasta muodosta tapahtuu leimatun antigeenin vapaan muodon siirtyessä pois lmmobilisoidusta vyö-2 5 hykkeestä.

Myös EP-patenttijulkaisut 51 183 ja 66 648 tuovat : esiin sellaisia välineitä, joissa nestemäisessä analyysi- ·:- väliaineessa olevan antigeenin tai vasta-aineen määrittä minen riippuu antigeenin (tai vasta-aineen) kilpailevasta . .·. 30 sitoutumisesta antigeenin (tai vasta-aineen) leimatun muodon kanssa niiden sidosparin immobilisoituun muotoon, kuten immobilisoituun vastaaineeseen (tai antigeeniin).

Muita monikerroksellisia immunomääritykseen tarkoitettuja koelaitteita on myös suunniteltu, kuten sellaisia, 35 joita kuvataan US-patentissa 4 258 001, joihin kuuluu yksi 3 87695 tai useampi kerros koostuen partikkelimaisista, kolmiulotteisista hilarakenteista, jotka muodostuvat lukuisista or-ganopolymeerisista partikkeleista. Partikkelit muodostavat väleihinsä huokostiloja, joiden väitetään huolehtivan 5 suurimolekyylipainoisten analyyttien kuljetuksesta niiden kautta. Vaikka se ei ole edellytyksenä, ehdotetaan, että toisiinsa vaikuttavia koostumuksia, kuten antigeenejä tai vasta-aineita, voidaan immobilisoida partikkelien pinnalle järjestämällä partikkelien pintaan aktiivisia kytkemis-10 tai sitomiskohtia, joihin sellaiset toisiinsa vaikuttavat koostumukset voidaan kovalenttisesti sitoa.

US-patentissa 4 446 232 kuvataan vielä yhtä välinettä, joka perustuu kilpailuperiaatteeseen analyytin sidotun ja vapaan muodon välillä kiinteästä määrästä tunnis-15 tuskohtia entsyymillä leimatun vasta-aineen pinnalla. Koe-näytteessä olevan analyytin määrittäminen riippuu analyytin sitoutumisesta entsyymillä leimattuihin vasta-aineisiin välineen yhdessä vyöhykkeessä, joka analyytti sitten siirtyy välineen toiseen vyöhykkeeseen, jossa analyyttiin 20 sidottujen, entsyymillä leimattujen vasta-aineiden entsyymiaktiivisuus todetaan. Yksi vyöhykkeistä sisältää lisäksi sidottua ja immobilisoitua analyyttiä, joka kilpailee koe-näytteen analyytin kanssa sitoutumisesta entsyymillä leimattuihin vasta-aineisiin, ja joka sitoo ja immobilisoi 25 kaiken sen entsyymillä leimatun vasta-aineen, mikä ei tule sidotuksi koenäytteen analyyttiin.

Sellaisten välineiden erityinen haittapuoli on kuitenkin se, että nesteen takaisinvirtauksen takia reaktio-tuotteet, jotka ovat siirtyneet alempaan tai detektioker-. .·. 30 rokseen, siirtyvät takaisin ylempiin kerroksiin, aiheuttaen kemiallisia vastareaktioita ja kokeen alentunutta reaktiokykyä. Tämän ongelman poistamiseksi on suunniteltu analyyttisiä koevälineitä, joissa yritetään rajoittaa tai muutoin estää reaktiotuotteiden nesteen takaisinvirtausta. 35 EP-patenttijulkaisulssa 51 183 Ja 66 648 ehdotetaan 4 87695 esimerkiksi kerroksia todettavissa olevan reaktiotuotteen keräämiseksi, jotka sisältävät hydrofiilisiä suurimolekyy-lisipainoisia aineita. EP-patenttijulkaisussa 66 648 ehdotetaan lisäksi peittausaineiden sisällyttämistä detek-5 tiokerrokseen, jotka vaikuttavat suuresti todettavissa olevan reaktiotuotteen kanssa tämän keräämiseksi kerrokseen. Sellaisiin peittausaineisiin kuuluvat kationiset polymeerit, anioniset polymeerit ja kvartääriset suolat.

Samalla tavalla tuovat US-patentit 4 144 306 ja 10 4 042 335 esille monikerroksisia analyysvälineitä, jotka sisältävät rekisteröintikerroksen, johon on sisällytetty todettavissa olevan aineen peittausaine, todettavissa olevan aineen keräämiseksi siihen, ja tähän liittyen todettavissa olevan aineen diffuusion tai siirtymisen estämiseksi 15 pois rekisteröintikerroksesta.

Tämän välineen muunnelma tuodaan esille US-paten-tissa 4 459 358, jossa kuvaltaan monikerroksellista välinettä, joka sisältää levityskerroksen, reaktiokerroksen, johon on sisällytetty diffundoituva leimattu vasta-aine, 20 ja rekisteröintikerros, johon on sisällytetty aineita, jotka soveltuvat ei-spesifisesti sitomaan, immobilisoimaan tai peittaamaan vasta-aineita, kuten lateksipartikkelit. Kun nestemäistä analyysiväliainetta lisätään välineeseen, väliaineen analyytti liittyy reaktiokerroksessa olevaan 25 leimattuun vasta-aineeseen ja immunosaostuu siinä. Kaikki se leimattu vastaaine, mikä ei tule sidotuksi analyyttiin, diffundoituu rekisteröintikerrokseen, jossa se immobili-soituu siihen sisällytettyyn peittausaineeseen.

Peittausaineiden käyttäminen voi kuitenkin häiritä 30 välttämättömiä reaktioita, jotka ovat tarpeen todettavis sa olevan reaktiotuotteen muodostumiselle tai vapautumiselle peittausaineen ei-spesifisen sitoutumisen seurauksena. Sellainen häirintä voi tehdä sekä detektiosta että mittaamisesta epäluotettavan, kuin myös alentaa koe-35 välineen herkkyyttä.

5 87695

Yrityksissä voittaa rekisteröintikerroksessa olevien peittausaineiden haittavaikutukset, on ehdotettu muita analyysivälineitä, joissa peittausaineita käytetään muussa kerroksessa kuin rekisteröintikerroksessa, jotta 5 estettäisiin muodostuneen todettavissa olevan reaktiotuotteen siirtyminen muuhun kuin rekisteröinti- tai detektio-kerrokseen, mikä muutoin saattaisi tehdä todettavasta reaktiotuotteesta havaitsemattoman. Tällainen väline esitetään US-patentissa 4 166 093, joka sisältää aineen siirty-10 mistä estävän kerroksen asetettuna säteilyä keräävän kerroksen ja reagenssikerroksen väliin monikerroksisessa analyysivälineessä. Todettavissa olevan aineen siirtymistä estävä kerros on analyyttiä läpäisevä, ja kiinnittää tai muutoin estää merkittävän määrän kaikesta todettavissa 15 olevasta aineesta, kuten väri, joka on muodostunut rea-genssikerroksessa, edelleen siirtymästä ylöspäin säteilyä keräävään kerrokseen. Todettavissa olevan aineen siirtymistä estävä kerros sisältää peittausaineen erityiselle todettavissa olevalle aineelle, joka on muodostunut rea-20 genssikerroksessa. Tällaiseen kerrokseen liittyy kuitenkin yhä peittausaineen aiheuttama haitta, joka aine voi häiritä reaktioita, jotka ovat alkaneet analyytin läsnäollessa, ja estää tai merkittävästi inhiboida todettavissa olevan aineen muodostumista tai vapautumista.

25 Vielä yksi yritys voittaa nesteen käänteisvirtauk- seen liittyvä ongelma monikerroksisissa analyysivälineissä tuodaan esille kansainvälisessä patenttijulkaisussa W0 84/02193, joka koskee immunomääritystä, jossa käytetään kromogeenista alustaa ja jossa immuunikompleksi, joka si-. 30 sältää analyytin sidottuna entsyymillä leimattuun anti- analyyttivasta-aineeseen, kerätään huokoiselle tai mikro-huokoiselle alustamateriaalille. Alusta toimii niin, että se konsentroi kromaattisen signaalin, jonka leimayhdiste on tuottanut reaktion yhteydessä signaalin tuottavien rea-35 genssien kanssa alustamateriaalissa. Kromaattisen signaa- 6 87695

Iin konsentroituminen on seurausta reaktiotuotteen kova-lenttisesta kiinnittymisestä alustaan, ja nesteen takai-sinvirtaukseen liittyvä ongelman tullee voitetuksi tuottamalla yksinkertainen liittyvä ongelman tulleen voitetuk-5 si yksinkertaisen kerroksen avulla. Immunomääritys vaatii kuitenkin joukon inkubointi- ja pesuvaiheita signaalin paikallistamiseksi ja konsentroimiseksi alustalle. Vaikkakin immunomäärityksessä päästään eroon nesteen takaisin-virtauksesta tuottamalla yhden kerroksen alusta, jossa 10 tarvittavat reaktiot kromaattisen signaalin tuottamiseksi tapahtuvat, siihen liittyy edelleen ongelmia johtuen monista inkubointi- ja pesuvaiheista, jotka eivät ole välttämättömiä monikerroksisessa analyysivälineissä.

Tämän keksinnön tarkoituksena on siten välttää 15 edellä mainitut haittapuolet tarjoamalla spesifinen sidosmääritys monivyöhykkeisessä tai monikerroksisessa välineessä, joka konsentroi todettavissa olevan reaktio-tuotteen, joka on muodostunut keskinäisestä reaktiosta kemiallisen leima-aineen ja siihen vaikuttavan todettavis-20 sa olevan reagenssin välillä häiritsemättä määritykseen kuuluvia spesifisiä sidosreaktioita.

Tämän keksinnön tarkoituksena on myös aikaansaada monivyöhykkeisessä tai monikerroksisessa välineessä spesifinen sidosmääritys, jossa määrityksessä on loppukohta, 25 jossa reaktiotuotteen edelleen kulkeutumista ei tapahdu.

'.· Tämän keksinnön kohteena on edelleen tuottaa herk kä spesifinen sidosmääritys nestemäisessä analyysiväliai-neessa olevan analyytin hyvin tarkaksi määrittämiseksi, johon määritykseen liittyy vähän tai ei ollenkaan tausta-.·. 30 signaalia.

Vielä toinen tämän keksinnön tarkoitus on vahvistaa signaalia, jonka on muodostanut todettavissa oleva reaktiotuote, joka on muodostuhut keskinäisestä reaktios- * v ta kemiallisen leima-aineen ja siihen vaikuttavan todetta- *·' ' 35 vissa olevan reagenssin välillä herkän havaitsemisen ai-; * -' kaansaamiseksi.

• · * * * • · » ♦ • · * 7 87695 Tämä keksintö aikaansaa monivyöhykkeisen analyysivälineen analyytin määrittämiseksi nestemäisestä analyysi-väliaineesta perustuen vuorovaikutuksiin analyytin, leimatun reagenssin, immobilisoidun reagenssin, ja leimatulle 5 reagenssille tarkoitetun immobilisoidun detektioreagenssin välillä.

Tämän keksinnön pääasialliset edut johtuvat leimatun reagenssin käytöstä, joka reagenssi tuottaa todettavissa olevan signaalin todettavissa olevan reaktiotuotteen 10 muodossa seurauksena vuorovaikutuksesta leimatun reagenssin ja siihen vaikuttavan detektioreagenssin välillä, ja joka voidaan immobilisoida detektiovyöhykkeessä. Mitään todettavissa olevan tuotteen erillistä kulkeutumista ei esiinny kuten on laita tekniikan tason välineiden osalta, 15 ja todettavissa olevan reaktiotuotteen immobilisointi ja konsentrointi ovat seurausta hyvin spesifisistä kemiallisista vuorovaikutuksista.

Keksintö koskee siten monivyöhykkeistä analyysivälinettä nestemäisessä analyysiväliaineessa olevan analyy-20 tin määrittämiseksi immunoanalyysin avulla käyttäen immu-nometristä tai kompetitiivistä menetelmää, johon kuuluu sidoksen muodostaminen (i) analyytin ja analyytin tai sen sidosanalogin leimatun tai immobilisoidun muodon ja (ii) analyytin sidosparin immobilisoidun tai leimatun muodon, 25 vastaavasti, välillä, jolloin analyytin, sen analogin tai sidosparin leimattu muoto on leimattu reagenssi, joka sisältää todettavissa olevan kemiallisen ryhmän, joka reagoi detektanttikoostumuksen kanssa muodostaen todettavissa olevan signaalin. Keksinnön mukaiselle analyysivälineelle - 30 on tunnusomaista, että se sisältää nestevirtauskosketuk-sessa, (1) reagenssivyöhykkeen, joka käsittää kiinteän, huokoisen matriisin, Johon on sisällytetty analyytin, sen analogin tai sidosparin immobilisoitu muoto ja 35 (2) detektiovyöhykkeen, joka käsittää kiinteän, β 87695 huokoisen matriisin leimatun reagenssin vastaanottamista ja määrittämistä varten, joka reagenssi siirtyy sellaiseen vyöhykkeeseen, ja johon on sisällytetty detektantti-koostumuksen vähintään yhden komponentin immobilisoitu 5 muoto.

Leimattu reagenssi on analyytin sidosparin analyy-tin tai sen sidosanalogin muoto, joka on leimattu kemiallisella ryhmällä, jolla on todettavissa oleva kemiallinen ominaisuus, joka tuottaa todettavissa olevan tuotteen vai-10 kuttaessaan immobilisoidun vuorovaikuttavan detektiorea- genssin kanssa detektiovyöhykkeessä.

Immobilisoitu reagenssi reagenssivyöhykkeessä ja leimattu reagenssi valitaan niin, että ne muodostavat spesifisen sidosparin ja sitoutuvat toisiinsa läsnä olevan 15 analyytin määrästä riippuen. Kun leimattu reagenssi on analyytin tai sen analogin leimattu muoto, immobilisoitu reagenssi on analyytin sidosparin immobilisoitu muoto, ja analyytti ja leimattu reagenssi kilpailevat sitoutumisesta immobilisoituun reagenssiin. Kun leimattu reagenssi on 20 analyytin sidospartin leimattu muoto, immobilisoitu reagenssi on analyytin tai sen analogin immobilisoitu muoto, ja leimattu reagenssi, Joka ei tule sidotuksi analyyttiin tulee immobilisoiduksi sitoutumalla immobilisoituun reagenssiin. Olipa kysymyksessä leimattu analyytti tai leima-. . 25 tut sidosparit, jää osa leimatusta reagenssista jäljelle tai ei tule sidotuksi immobilisoituun reagenssiin riippuen läsnä olevan analyytin määrästä.

Muodostunut leimattu reagenssi, joka jää tai tulee vapaaksi kulkeutumaan reagenssikerroksen sisällä ja siitä 30 ulos, siirtyy sitten detektiokerrokseen, jossa se vaikuttaa (reagoi) detektiovyöhykkeessä olevan immobilisoidun vuorovaikuttavan detektioreagenssin kanssa muodostaen näin todettavissa olevan reaktiotuotteen. Edullisesti syntyvä reaktiotuote immobilisoituu ja on näin estynyt kulkeutu-35 masta detektiovyöhykkeestä ylöspäin reagenssivyöhykkee-seen.

g 87695

Reaktiotuote voi luonnostaan tulla immobilisoiduk-si muodostumalla immobilisoidun, vuorovaikuttavan detek-tioreagenssin tähteeksi tai ollen vapaa mutta liukenematon tuote, tai se voi immobilisoitua immobilisoituun ainee-5 seen, jolla on sidosaffiniteettia reaktiotuotteeseen, silloin kun muodostunut reaktiotuote on liukoisessa muodossa. Reaktiotuote tuottaa todettavissa olevan signaalin detek-tiovyöhykkeessä, joka mitataan ja korreloidaan analyysiväliaineessa olevan analyytin määrään.

10 Kuvio 1 on poikkileikkauskuva monikerroksisesta analyysivälineestä, jossa on reagenssikerros ja detektio-kerros konstruoituina tämän keksinnön mukaisesti.

Kuvio 2 on poikkileikkauskuva monikerroksisesta analyysivälineestä, jossa on kaksi reagenssikerrosta ja 15 detektiokerros konstruoituina tämän keksinnön mukaisesti.

Kuvio 3 on poikkileikkauskuva monikerroksisesta analyysivälineestä, jossa on kaksi reagenssikerrosta, detektiokerros, ja alusta konstruoituina tämän keksinnön mukaisesti.

20 Tämän keksinnön mukainen monivyöhykkeinen analyysi väline tuottaa spesifisen sidosmäärityksen vyöhykkeisessä tai kerroksellisessa koeliuskassa tai -välineessä. Määritys riippuu leimatun reagenssin jakaantumisesta, joka reagenssi joko lisätään välineeseen tai on siihen sisäl-25 lytettynä, niin, että se on pidättyneenä reagenssivyöhyk-keessä ollen sidottu tai immobilisoitu immobilisoituun reagenssiin, ja ollen vapaa kulkeutumaan detektiovyöhyk-keeseen. Leimattu reagenssi, joka siirtyy detektiovyöhyk-keeseen, on vapaa vaikuttamaan immobilisoidun, vuorovai-30 kuttavan detektioreagenssin kanssa, josta on seurauksena todettavissa olevan reaktiotuotteen muodostuminen sinne. Esillä oleva keksintö tarjoaa edullisen tavan todettavissa olevan reaktiotuotteen konsentroimiseksi, joka muodostuu detektiovyöhykkeessä ja siihen liittyen vahvistaa siinä 35 tuotetun signaalin.

10 87695

Kuvauksen yksinkertaistamiseksi tämän keksinnön mukaista analyysivälinettä kuvataan nyt pääasiallisesti kerroksellisen rakenteen käsittävänä. On selvää, että muun tyyppiset vyöhykkeet voivat aikaansaada saman tuloksen.

5 Leimattu reagenssi tullaan myöskin valitsemaan niin, että se on analyytin sidosparin leimattu muoto, ja immobilisoi-tu reagenssi tullaan valitsemaan niin, että se on analyytin immobilisoitu muoto (immobilisoidun analyytin ollessa vaihdettavissa analyytin analogin immobilisoituun muotoon 10 kuten alalla ymmärretään).

Erityisesti, tämän keksinnön mukainen analyysiväline käsittää ainakin yhden reagenssikerroksen ja detektio-kerroksen, ja kuten tämän jälkeen tullaan kuvailemaan yksityiskohtaisemmin, voi lisäksi sisältää toisen reagenssi-15 kerroksen. Reagenssikerrokseen on sisällytetty immobili soitu reagenssi, joka käsittää analyytin immobilisoidun muodon, joka ei kykene liukenemaan tai muutoin poistumaan reagenssikerroksesta kontaktissa koealustaan. Detektioker-rokseen on sisällytetty vuorovaikuttavan detektioreagens-20 sin immobilisoitu muoto leimattua reagenssia varten, joka vuorovaikuttava detektioreagenssi ei sekään ole liuotettavissa tai muutoin poistettavissa detektiokerroksesta. Silloin kun käytetään toista reagenssikerrosta, on ensimmäiseen reagenssikerrokseen sisällytetty leimattu reagenssi, . 25 joka liukenee, kun analyysivälinettä lisätään siihen, ja .toiseen reagenssikerrokseen on sisällytetty analyytin immobilisoitu muoto.

On ymmärettävä, että tämän keksinnön mukaisesti, kerrokset, jotka muodostavat analyysivälineen, ovat neste-30 kontaktissa toisiinsa, minkä ansiosta analyysivälineen *,v kerrokset, jotka ovat liittyneet toisiinsa, sallivat nes teen diffuusion kerrosten sisään ja niiden välillä. Neste-kontakti sallii ainakin nestemäisen näytteen joidenkin komponenttien kulkeutuvan, esim. antigeenit, haptenit, ja/ 35 tai vasta-aineet, välineen kerrosten välillä ja se on 11 87695 edullisesti tasainen kontaktipinnoilla nestekontaktiker-rosten välillä. Näin ollen, lisättäessä nestemäistä ana-lyyslväliainetta ja leimattua reagenssia reagenssikerrokseen, on nestemäisellä analyysivällalneella ja leimatulla 5 reagenssilla mahdollisuus diffundoitua ja tunkeutua rea-genssikerroksen sisään ja sen läpi detektiokerrokseen. Silloin kun välineessä on ensimmäinen ja toinen reagenssi-kerros, sallitaan nestemäisen analyysiväliaineen samaan tapaan diffundoitua ja tunkeutua ensimmäiseen reagenssi-10 kerrokseen ja sen läpi, missä yhteydessä siihen sisällytetty leimattu reagenssi liukenee, ja nestemäinen väliaine ja leimattu reagenssi diffundoituvat edelleen ja tunkeutuvat toiseen reagenssikerrokseen ja sen sisälle, ja detektiokerrokseen ja sen sisälle.

15 Sen jälkeen kun nestemäinen analyysiväliaine ja leimattu reagenssi on lisätty ja ne tunkeutuvat reagenssikerrokseen kuten edellä kuvattiin, jos todettaviksi tarkoitettua analyyttiä on läsnä nestemäisessä väliaineessa, silloin olennaisesti kaikki analyytti, joka on läsnä, jou-20 tuu suoraan nestekontaktiin leimatun reagenssin kanssa ja spesifisesti siihen sidotuksi. Nestevlrtauksen ansiosta reagenssikerroksen ja detektiokerroksen välillä, on syntyvä analyytti-(leimattu reagenssi)-kompleksi, joka siinä muodostuu, vapaa kulkeutumaan reagenssikerroksen sisällä .·. 25 ja siitä ulos detektiokerrokseen. Kuten kuvataan yksityiskohtaisemmin tämän jälkeen, on leimatussa reagenssissa edullisesti vain yksi saatavilla oleva sidospaikka analyysi'; tin sitomiseksi leimattuun reagenssiin. Tästä johtuen, heti kun analyytti on liittynyt saatavilla olevaan sidos-30 paikkaan, analyytti-(leimattu reagenssi)-kompleksi on va-paa siirtymään reagenssikerroksen sisällä ja sieltä ulos tulematta immobilisoiduksi siihen sisällytettyyn immobili-soituun analyyttiin. Vastaavasti, silloin kun välineessä on ensimmäinen ja toinen reagenssikerros, nestemäisen ana-35 lyysiväliaineen lisäämisen yhteydessä ensimmäiseen rea- « ·· * i2 B7 695 gensslkerrokseen, leimattu reagenssi liukenee ja olennaisesti kaikki läsnä oleva analyytti joutuu suoraan neste-kontaktiin leimatun reagenssin kanssa ja spesifisesti siihen sidotuksi. Muodostuvan analyytti-(leimattu reagenssi)-5 kompleksin annetaan kulkeutua ensimmäisen reagenssiker-roksen sisällä ja siitä ulos, toisen reagenssikerroksen läpi, ja detektiokerrokseen. Kaikki se osa leimatusta rea-genssista joka ei tule sidotuksi väliaineen analyyttiin, sitoutuu ja immobilisoituu immobilisoituun analyyttiin 10 reagenssikerroksessa, tai, silloin kun ensimmäinen ja toinen reagenssikerros ovat käytettävissä, se immobilisoituu toisessa reagenssikerroksessa.

Heti kun analyytti-(leimattu reagenssi)-kompleksi siirtyy detektiokerrokseen, kompleksin leimattu reagenssi 15 vuorovaikuttaa siellä olevaan immobilisoituun vuorovaikuttavaan detektioreagenssiin muodostaakseen siinä yhteydessä reaktiotuotteen niiden välisen vuorovaikutuksen (reaktion) seurauksena. Kuten kuvataan paljon yksityiskohtaisemmin tämän jälkeen, voi reaktiotuote luonnostaan tuottaa 20 tosettavissa olevan signaalin, tai se voi tarvita lisävuo-rovaikutusta toisen aineen kanssa todettavissa olevan signaalin tuottamiseksi, riippuen leimatun reagenssin luonteesta. On ymmärrettävä, että tämän keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaisesti muodostunut reaktiotuote on im-25 mobilisoitunut detektiokerroksessa, jotta estettäisiin sen taaksepäin kulkeutuminen detektiokerroksesta ulos. Reaktiotuotteen paikallistaminen ja edullisesti immobilisoi-tuminen detektiokerrokseen mahdollistaa todettavissa olevan reaktiotuotteen täsmällisen ja herkän toteamisen ja 30 mittaamisen, joka voidaan tarkkaan korreloida analyytin määrään analyysiväliaineessa.

Leimattu reagenssi ja detektiosysteemit Tämän keksinnön mukainen leimattu reagenssi käsittää määrityksessä olevan analyytin sidosparin tai analyy-35 tin tai sen sidosanalogin, leimattuna kemiallisella ryh- * * i3 87695 mällä, jossa on todettavissa kemiallinen tai vuorovaikuttava ominaisuus. On ymmärrettävä, että kemiallinen ryhmä ei aikaansaa todettavissa olevaa tuotetta tai muuten tuota todettavissa olevaa signaalia ennen vaikuttamista sopi-5 van vuorovaikuttavan detektioreagenssin kanssa. Näin ollen leimatun reagenssin kemiallisen ryhmän ja vuorovaikuttavan detektioreagenssin luonne riippuu välttämättä niiden toisiinsa vaikuttavista ominaisuuksista, jotka aikaansaavat reaktiotuotteen, joka tuottaa todettavissa olevan signaa-10 Iin, joka on korreloitavissa analyytin määrään nestemäisessä väliaineessa.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti detektiokerrok-seen on sisällytetty vuorovaikuttavan detektioreagenssin immobilisoitu muoto leimattua reagenssiä varten, joka ei 15 ole liuotettavissa tai muutoin poistettavissa detektioker-roksesta kontaktin yhteydessä nestemäiseen analyysiväliai-neeseen tai muihin nestemäisiin reagensseihin. Vuorovaikuttavan detektioreagenssin immobilisointi detektiokerrok-sessa estää vuorovaikuttavan detektioreagenssin kulkeutu-20 misen reagenssikerrokseen, josta olisi seurauksena sen vuorovaikutus siinä immobilisoituneena olevan reagoimattoman leimatun reagenssin kanssa. Sellainen toisiinsa vaikuttaminen synnyttäisi muutoin häiritsevän ja ei-spesifi-sen signaalin. Heti kun sopivat sidosreaktiot on saatu 25 alkamaan, kuten tähän asti on kuvattu, joutuu analyytti-(leimattu reagenssi)-kompleksi, joka kulkeutuu detektio-kerrokseen, suoraan nestekontaktiin siinä immobilisoituneena olevan vuorovaikuttavan detektioreagenssin kanssa. Näin ollen täydellinen toisiinsa vaikuttaminen leimatun 30 reagenssin kemiallisen ryhmän ja vuorovaikuttavan detektioreagenssin välillä on mahdollista vain detektiovyöhyk-keessä. Tässä suhteessa vuorovaikutus kemiallisen ryhmän ;*-J Ja vuorovaikuttavan detektioreagenssin välillä johtaa re- aktiotuotteen muodostumiseen, joka joko luonnostaan tuot-; 35 taa todettavissa olevan signaalin tai vaatii edelleen vuo- i4 87695 rovaikutusta toisen aineen tai toisten aineiden kanssa todettavissa olevan signaalin tuottamiseksi, riippuen leimatun reagenssin ja vuorovaikuttavan detektioreagenssin luonteesta. On ymmärrettävä, että reaktiotuote voi myös 5 luonnostaan olla immobilisoitunut seurauksena leimatun reagenssin ja vuorovaikuttavan detektioreagenssin immobi-lisoinnista, tai se voi muodostua liukoisessa muodossa, joka voidaan immobilisoida immobilisoituun sidosaineeseen detektiokerroksessa, jolla aineella on sidosaffiniteettia 10 reaktiotuotetta kohtaan. Sellainen immobilisoitu sidosaine voi olla myös immobilisoitunut aine, joka on välttämätön todettavissa olevan signaalin muodostamiseksi vuorovaikutuksen yhteydessä reaktiotuotteen kanssa, silloin kun reaktiotuote ei luonnostaan tuota todettavissa olevaa sig-15 naalia, kuten tätä ennen kuvattiin.

Yleensä kemialliset ryhmät, joilla on todettavissa olevia kemiallisia ominaisuuksia, ovat niitä ryhmiä, jotka todetaan niiden oman reaktiivisuuden tai vuorovaikutuksen toiseen aineeseen perusteella, todettavissa olevan 20 signaalin tuottamiseksi, kuten tätä ennen kuvattiin. Tällaisia kemiallisia ryhmiä on hyvin kehitetty immunomääri-tysten alueella, ja useimpia kaikista sellaisista ryhmistä, joita immunomäärityksissä on käytetty voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisessa leimatussa reagenssissa.

25 Edustaviin kemiallisiin ryhmiin kuuluvat esimer kiksi entsymaattisesti aktiiviset ryhmät, kuten entsyymit Y (katso Clin. Chem. (1976) 22:1232, US-patentti 31 006, ja ~·; GB-patentti 2 019 308), entsyymien substraatit (GB-patent- tijulkaisu 1 548 741), entsyymien prosteettiset ryhmät, 30 koentsyymit (US-patentit 4 120 797 ja 4 238 565) ja entsyymien kofaktorit, entsyymi-inhibiittorit ja -aktivaatto-rit, kemiluminesoivat aineet, kemialliset katalysaattorit, ·.· metallikatalysaattorit, entsyymien kanavoinnin jäsenet, fluoroforisammuttajat ja energiansiirtoparit (US-patentit 35 3 996 345; 4 174 384; 4 199 559; ja 4 233 402) ja spesifi- » · is 87695 eesti sidottavissa olevat ligandit kuten biotiini, kelaat-torlt tai haptenl. Kofaktorilla leimattu aine voidaan esimerkiksi todeta lisäämällä entsyymiä, jolle leima on ko-faktori ja substraatti tai substraatit entsyymille. Myös 5 hapteenilla tai muulla spesifisesti sidottavissa olevalla ligandilla (esim. biotiini) leimattu aine voidaan todeta lisäämällä haptenin vasta-ainetta tai proteiinia (esim. avidiini), joka sitoo ligandin, joka on leimattu todettavissa olevalla molekyylillä. Todettavissa oleva molekyyli 10 voi olla molekyyli, jolla on todettavissa oleva fysikaalinen ominaisuus (esim. fluoresenssi tai absorbanssi).

On ymmärrettävä, että näillä kemiallisilla ryhmillä on vuorovaikuttavia ominaisuuksia toisiinsa nähden, mikä myös antaa mahdollisuuden niiden käyttöön tämän keksinnön 15 mukaisena vuorovaikuttavana detektioreagenssina. Esimerkiksi, silloin kun leima-aineen leima on entsyymisubst-raatti, kuten umbelliferonigalaktoosi, immobilisoitu de-tektioreagenssi on entsyymi, Joka pystyy hydrolysoimaan substraatin, kuten β-galaktosidaasi. Vastaavasti, kun lei-20 ma on entsyymin kofaktori, kuten nikotiiniamidiadeniinidi-nukleotidi, immobilisoitu detektloreagenssi on entsyymi, kuten laktaattidehydrogenaasi. Muihin tyypillisiin ryhmiin kuuluvat entsyymien prosteettiset ryhmät, kuten flaviini-adeniinidinukleotidi, ja apoentsyymi, kuten apoglukoosiok-25 sidaasi, ja entsyymi-inhibiittorit, kuten metotreksaatti, ja entsyymi, jota inhiboi entsyymi-inhibiittori, kuten dihydrofolaattireduktaasi. Myös hapteni tai muu spesifisesti sidottavissa oleva ligandin (esim. biotiini) leimattu muoto voidaan havaita haptenin vasta-aineen avulla tai 30 proteiinin avulla (esim. avidiini), joka sitoo ligandin, ' joka on leimattu todettavissa olevalla molekyylillä. Sel lainen todettavissa oleva molekyyli voi olla molekyyli, jolla on mitattavissa oleva fysikaalinen ominaisuus (esim. fluoresenssi tai absorbanssi).

35 Edelleen, leimatussa reagenssissa oleva todettavia- 16 87695 sa oleva kemiallinen ryhmä voi olla polymeeritähde, johon on liittyneinä sisäisesti sammutettuja multippeleja fluoresoivia aineita. Oetektiokerroksessa oleva immobllisoitu vuorovaikuttava detektioreagenssi voi olla entsyymi, joka 5 vaikuttaa fluoresoivan polymeeri tähteen kanssa katkalstaen ja irrottaen sammuttamattomia fluoresoivia molekyylejä.

Kuten tätä ennen kuvattiin, voi reaktiotuote, joka muodostuu vuorovaikutuksesta leimatun reagenssin ja vuoro-vaikuttavan detektioreagenssin välillä, (1) luonnostaan 10 tuottaa todettavissa olevan signaalin tai, (2) se voi vaatia vuorovaikutusta toisen aineen kanssa todettavissa olevan signaalin tuottamiseksi. Vuorovaikutus FAD:llä leimatun vasta-aineen ja immobilisoidun apoentsyymidetektiorea-genssin välillä tuottaa esimerkiksi aktiivisen entsyymin, 15 joka reagoi glukoosin kanssa tuottaen vetyperoksidia. Viimeksi mainittu tuote voidaan mitata kytketyssä entsyymire-aktiossa peroksidaasin ja kromogeenin välillä, kuten tet-rametyylibentsidiini.

Muodostuva reaktiotuote voi myös olla liukenemat-20 tomassa muodossa tai liukenevassa muodossa, riippuen leimatun reagenssin ja vuorovaikuttavan detektioreagenssin luonteesta. Kummassakin tapauksessa voi todettavissa oleva signaali olla luontainen tai se voi vaatia vuorovaikutusta toisen aineen kanssa kuten tätä ennen kuvattiin. Silloin 25 kun reaktiotuote kuitenkin muodostuu liukoisessa muodossa, on edullista sisällyttää immobllisoitu sidosaine, jolla on sitomisaffiniteettia reaktiotuotteeseen, detektiokerrok-seen reaktiotuotteen vastakkaisen kulkeutumisen estämiseksi pois detektiokerroksesta reagenssikerrokseen. Silloin 30 kun muodostunut entsyymi tuote on anioninen kromofori, voidaan tuote esimerkiksi immobilisoida sisällyttämällä anioninen hartsi matriisiin. Substraatti voi vaihtoehtoisesti sisältää sokerijohdannaisen, joka on kiinnittynyt kromofo-riin ja on altis reaktioon entsyymileiman kanssa. Vastaa-35 van immobilisoidun lektiinin sisällyttäminen matriisin, i7 87695 tai viereiseen sitomiskerrokseen, johtaa siinä tuotteen sitomiseen tai immobilisointiin.

Joissakin tapauksissa saattaa kuitenkin olla edullista, että vuorovaikutus leimatun reagenssin ja vuorovai-5 kuttavan detektioreagenssin välillä johtaa liukenemattoman reaktiotuotteen muodostumiseen. Saatavilla on mm. joukko entsyymisubstraatteja, jotka muodostavat liukenemattomia tuotteita, kuten naftoli AS-Bl-fosfaatti entsyymille al-kaalinen fosfataasi, tai naftoli-AS-Bl-S-D-galaktopyrano-10 sidi entsyymille β-galaktosidaasi.

Todettavissa oleva signaali mitataan edullisesti kuljettamalla analyysivälinettä vyöhykkeen kautta, joka on varustettu sopivalla välineellä lopullisen optisen signaalin toteamiseksi sellaisten kuin heijastus-, läpäisy- tai 15 fluoresenssifotometrian avulla. Sellainen laite voi esimerkiksi ohjata energianlähteen, kuten valon, analyysivälineen päälle tai sisään. Valo heijastuu sitten elementistä takaisin ilmaisimeen, silloin kun käytetään heijastavaa alustaa, tai kulkee elementin läpi detektoriin läpäisevän 20 detektion ollessa kysymyksessä, jolloin käytetään säteilyä läpäisevää tai läpinäkyvää alustaa. Haluttaessa voidaan käyttää myös tavanomaisia fluoresenssispektrofotometria-tai luminesenssimittaustekniikoita. Tekniikoissa, joissa leimana käytetään sähköisesti aktiivista ainetta, voidaan 25 toteaminen suorittaa ampometrisillä tai potentiometrisillä detektiovälineillä.

Monikerroksisia analyysivälineitä

Kuvioihin viitaten kuvio 1 valaisee tämän keksinnön mukaisen monikerroksisen analyysivälineen yhtä suoritus-30 muotoa, joka käsittää vähintään yhden reagenssikerroksen ja detektiokerroksen, jotka ovat nestekontaktissa toistensa kanssa. Reagenssikerrokseen on sisällytetty analyytin ' immobilisoitu muoto (esitettynä "h An"), ja detektioker- rokseen on sisällytettynä vuorovaikuttavan detektiorea 35 genssin immobilisoitu muoto leimatun reagenssin kemiallis- ie 87695 ta leimaa varten (esitettynä "h Reagenssi") kuten tätä ennen kuvailtiin.

Lisättäessä sekä analyytin sisältävää nestemäistä analyysiväliainetta että leimattua reagenssia reagenssi-5 kerrokseen, analyysiväliainetta ja leimattu reagenssi dif-fundoituvat reagenssikerroksen sisään ja joutuvat siinä nestekontaktiin reagenssikerroksessa olevan immobilisoidun analyytin kanssa. Tässä suoritusmuodossa voidaan leimattu reagenssi ja analyysiväliaine lisätä erikseen tai yhdessä 10 seoksena, viimeksi mainitun ollessa edullista, koska sellainen antaa yhtäläisen kilpailun leimatun reagenssin ja väliaineen analyytin välille sitoutumiselle immobilisoi-tuun analyyttiin. Kaikki nestemäisessä analyysiväliainees-sa läsnäoleva analyytti tulee siten sidotuksi leimatun 15 reagenssin sidospariin analyyttiä varten, ja syntyvä kompleksi, joka siinä yhteydessä muodostuu, on vapaa kulkeutumaan reagenssikerroksen sisällä ja siitä ulos detektio-kerrokseen. Kaikki ylimäärä leimatusta reagenssista, joka ei tule sidotuksi nestemäisen viljelyväliaineen analyyt-20 tiin, tulee sidotuksi immobilisoituun analyyttiin reagenssikerroksessa leimatun reagenssin analyyttiä varten olevan sidosparin kautta, ja sen kulkeutuminen detektiokerrokseen estetyksi.

Kuten alalla tiedetään voidaan vaihtoehtoisesti 25 ennemmin kuin lisätä leimattu reagenssi erillisenä komponenttina, joko lisäämällä se nestemäisen analyysiväliai-neen mukana tai sisällyttämällä erilliseen reagensslvyö-hykkeeseen, kuten kuvataan yksityiskohtaisemmin jäljempänä, voidaan leimattu reagenssi esisitoa immobilisoituun 30 reagenssiin reagenssivyöhykkeessä. Koska sitoutuminen on reversiibeli, tekee analyytin läsnäolo osan sellaisesta . . sitoutumisesta käänteiseksi, jolloin vapautuu todettavissa oleva määrä leimattua reagenssia.

On ymmärrettävä, että tämän keksinnön mukaisesti 35 analyytin sidosparilla on edullisesti vain yksi spesifinen i9 87695 sitomispaikka analyyttiä varten. Sidospari on edullisesti vasta-aineen monovalenttinen osa, joka vasta-aine on muodostettu analyyttiä vastaan, ja joka puhdistetaan tai on peräisin monoklonaalisesta vasta-aineesta.

5 Tällaisia monovalenttisia vasta-aine-fragmentteja voidaan helposti valmistaa hajottamalla normaalia kokonaista IgG-vasta-ainetta proteolyyttisellä entsyymillä, kuten papaiinilla, vasta-ainefragmenttien tuottamiseksi, joita tavallisesti alalla nimitetään Fab-fragmenteiksi. 10 Vaihtoehtoisesti tällaisia monovalenttisia vasta-aine- fragmentteja voidaan myös valmistaa hajottamalla normaalia, kokonaista IgG-vasta-ainetta proteolyyttisellä entsyymillä kuten pepsiini, jota seuraa kemiallinen pelkistäminen vasta-ainefragmenttien tuottamiseksi, joita ta-15 vallisesti nimitetään alalla Fab'-fragmenteiksi.

Myös muita sidospareja voidaan kuitenkin käyttää, joilla on edullisesti tietenkin vain yksi spesifinen, käytettävissä oleva sitomis- tai tunnistuspaikka määrityksessä olevalle analyytille. Muihin sidospareihin kuuluvat 20 kokonaisen vasta-aineen hybridit, reseptorimolekyylit ja vastaavat. Esimerkiksi voidaan käyttää kokonaisen vasta-aineen hybridiä, jota voidaan saada monilla menetelmillä. Hybridejä voidaan valmistaa in vivo monoklonaalisesta so-lulinjasta, joka on tuotettu hybridisaation avulla erittä-25 vän myeloomasolun ja pernasolun välillä, joka erittää kiinnostuksen kohteena olevaa vasta-ainetta. Muodostunut solulinja voi spontaanisti tuottaa hybridimolekyylejä, jotka sisältävät yhden sitomisalayksikön, jolla on kiinnostuksen kohteena oleva spesifisyys, ja toisen alayksi-30 kön, jolla on spesifisyys, jonka määrää myeloomasolukloo-ni. Sellaista vasta-ainetta voidaan eristää alkuoeräisen .·. myelooma-vasta-aineen tai pernasolun homogeenisistä imee- reistä tavanomaisilla proteiinien puhdistusmenetelmillä. Joita alalla tunnetaan. Hybridejä voidaan myös muodostaa 35 kemiallisesti sekoittamalla keskenään anti-analyytti-vas- 20 87695 ta-ainetta toisen vasta-aineen kanssa sopivissa denaturoivissa olosuhteissa, kuten lisäämällä ureaa (8 molaarista) ja pelkistäviä aineita kuten ditiotreitoli, jota seuraa denaturoivan aineen poistaminen, tai sallimalla vasta-ai-5 nehybridien uudelleen muotoutuminen. Osa uudelleen muodostetusta näytteestä sisältää tällöin hybridejä, joilla on sitomiskohta toista kantaja-vasta-ainetta varten, joka voidaan edelleen puhdistaa tavanomaisilla alalla tunnetuilla proteiinien puhdistusmenetelmillä.

10 Näin ollen, heti kun analyysiväliaineen analyytti on tullut sidotuksi leimatun reagenssin monovalenttiseen sidospariin, esim. analyytin vasta-aineen monovalenttiseen vasta-aineen fragmenttiin, estyy muodostuvan kompleksin ei-spesifinen immobilisoituminen immobilisoituun analyyt-15 tiin reagenssikerroksessa sen seurauksena, että leimatussa reagenssissa ei ole käytettävissä sitomiskohtaa immobili-soidulle analyytille. Analyytti-(leimattu reagenssi)-kompleksin kulkeutuessa detektiokerrokseen, leimattu reagenssi reagoi immobilisoidun vuorovaikuttavan detektioreagens-20 sin kanssa. Analyytti-(leimattu reagenssi)-kompleksin reagoiminen immobilisoidun reagenssin kanssa konsentroi tai paikallistaa reaktiotuotteen detektiokerrokseen siinä muodostuvan signaalin toteamiseksi ja mittaamiseksi joko visuaalisesti tai käyttäen sopivaa instrumenttia.

25 Kuten tullaan kuvailemaan paljon yksityiskohtaisem min tämän jälkeen ovat tämän keksinnön mukaiset eri vyöhykkeet tai kerrokset ja alustat säteilyä läpäiseviä useimmissa tapauksissa lukuunottamatta heijastavia kerroksia ja säteilyä kerääviä aineita. Nämä vyöhykkeet tai ker-30 rokset ja alustat sallivat näkyvän valon, fluoresoivan tai luminesoivan emission, radioaktiivisen säteilyn ja niiden kaltaisen, tehokkaan kulkeutumisen. Tietyn säteilyä läpäisevän materiaalin valinta riippuu erityisestä säteilystä, joka on valittu käytettäväksi elementin kanssa, johon ma-35 teriaali on tarkoitus sisällyttää. Todettavissa olevan 2i 87695 signaalin syntyminen laitteen detektiokerroksessa, kuten on esitetty kuviossa 1, antaa näin ollen mahdollisuuden signaalin toteamiselle sopivalla instrumentilla, joka on sijoitettu (suunnattu) joko detektiokerrokseen tai rea-5 genssikerrokseen. On ymmärrettävä, että koska leimattu reagenssi reagenssikerroksessa ei anna havaittavaa signaalia kaiken vuorovaikutuksen puuttumisen johdosta vuorovaikuttavan detektioreagenssin kanssa detektiokerroksessa, reagenssikerroksesta ei tule mitään häiritsevää signaalia 10 kun todetaan todettavissa olevaa signaalia, joka on muodostunut detektiokerroksessa reagenssikerroksesta ja sen kautta.

Signaalin toteaminen, joka on reaktiotuotteen synnyttämä joko reagenssikerroksesta tai detektiokerroksesta, 15 voidaan suorittaa käyttämällä sopivaa instrumenttia, kuten spektrofotometri, reflektometri, fluorometri tai lumi-nometri. Silloin kun toteaminen perustuu absorbanssiin tai fluoresenssiin, ohjataan esimerkiksi instrumentin energianlähde joko reagenssikerrokseen tai sen läpi tai detek-20 tiokerrokseen tai sen läpi. Toisaalta, silloin kun toteaminen perustuu lumlnesenssiin, käytetään hyväksi sopivaa instrumenttia, joka toteaa luminesenssin ilman energianlähteen tarvetta.

Viitaten nyt 2 kuvataan analyysivälinettä, joka on 25 samanlainen kuvion 1 välineen kanssa. Tässä suoritusmuodossa analyysiväline sisältää lisäksi toisen reagenssiker-roksen sijoitettuna ensimmäisen reagenssikerroksen ja de-tektiokerroksen väliin. Lisäreagenssikerros mahdollistaa leimatun reagenssin analyysivälineen liukenevan muodon 30 sisällyttämisen siihen, mikä poistaa tarpeen esisekoittaa nestemäinen väliaine ja leimattu reagenssi ennen näiden lisäämistä analyysivälineeseen, tai niiden riippumattoman lisäämisen kuten kuvattiin kuvion 1 yhteydessä. Erityisesti, ensimmäiseen reagenssikerrokseen on sisällytetty lei-35 matun reagenssin analyysiväliaineeseen liukeneva muoto.

22 8 7 6 9 5 (merkittynä "leimattu reagenssi"), joka liukenee nestekon-taktissa nestemäiseen analyysiväliaineeseen, joka diffun-doituu siihen. Toiseen reagenssikerrokseen on sisällytetty analyytin immobilisoitu muoto (merkittynä " h An", ja de-5 tektiokerrokseen on sisällytettynä vuorovaikuttavan detek-tioreagenssin immobilisoitu muoto (merkittynä "f*Reagenssi"), kuten tätä ennen on kuvattu.

Lisättäessä nestemäistä analyysiväliainetta ensimmäiseen reagenssikerrokseen, nestemäinen analyysiväliaine 10 diffundoituu ensimmäiseen reagenssikerrokseen saattaen kaiken analyytin väliaineesta suoraan nestekontaktiin siinä olevan leimatun reagenssin kanssa, samanaikaisesti liuottaen leimatun reagenssin. Kaikki analyysiväliaineen analyytti tulee näin ollen sidotuksi leimatun reagenssin 15 sidospariinsa, ja siinä muodostuva analyytti-(leimattu reagenssi)-kompleksi kulkeutuu ensimmäisessä reagenssi-kerroksessa ja siitä ulos ja toiseen reagenssikerrokseen. On ymmärrettävä, että kaikki se leimattu reagenssi, mikä ei sitoudu ensimmäisessä reagenssikerroksessa, so. leima-20 tun reagenssin ylimäärä, kulkeutuu myös ensimmäisen rea-genssikerroksen sisällä ja siitä ulos ja toiseen reagenssikerrokseen. Koska leimatun reagenssin monovalentin si-dosparin sitomiskohta analyyttiä varten on täytetty sidoksella analyysivälineen analyyttiin, analyytti-(leimattu 25 reagenssi)-kompleksin sallitaan ollessaan toisessa reagenssikerroksessa kulkea tämän sisällä ja siitä ulos tulematta immobilisoiduksi, ja detektiokerrokseen. Olles-:’r saan detektiokerroksessa leimattu reagenssi reagoi siinä sisällytettynä olevan immobilisoidun vuorovaikuttavan de-30 tektioreagenssin kanssa reaktiotuotteen tuottamiseksi, kuten tätä ennen kuvattiin. Kuitenkin, koska kaikella si-; tomattomalla leimatulla reagenssilla toisessa reagenssi kerroksessa on käytettävissä oleva sitomiskohta immobili-soitua analyyttiä varten toisessa reagenssikerroksessa, • » * 35 leimattu reagenssi tulee sidotuksi siihen ja immobilisoi- 23 8 7 6 9 5 duksi siinä yhteydessä ja estetyksi edelleen siirtymästä detektiokerrokseen. Muodostunut signaali, jonka reaktio-tuote muodostaa detektiokerroksessa, todetaan sitten, mitataan ja korreloidaan testialustan analyytin määrään ku-5 ten aikaisemmin kuvattiin.

Vaikkakin tämän keksinnön mukaisen monikerroksisen välineen eri kerrokset voivat olla itsekantavia, on edullista, että kerrokset päällystetään tai muulla tavoin asetetaan alustaosan päälle. Alustaosa voi olla himmeä, hei-10 jastava tai läpinäkyvä valolle tai muulle energialle. Eri kerroksille valittu alustaosa sopii yhteen signaalin aiotun toteamistavan kanssa. Esimerkiksi, silloin kun analyysivälineessä muodostuu kaasumainen tuote, joka todetaan kaasuherkällä elektrodilla, on alustaosa nesteen läpäise-15 vä kerros nestekontaktissa sellaisen elektrodin kanssa. Edulliset alustaosat sisältävät läpinäkyviä alustamate-riaaleja, jotka kykenevät läpäisemään sähkömagneettista säteilyä, jonka aallonpituus on alueella välillä noin 200 nm ja noin 900 nm. Alustan ei tarvitse tietenkään läpäistä 20 koko 200 - 900 nm alueella, vaikkakin analyyttisten tulosten toteamiseksi fluorometrisesti alustan läpi, on edullista, että alusta läpäisee laajemmalla alueella, tai vaihtoehtoisesti läpäisee toteamiseen käytettävien fluoresoivien materiaalien eksitaatio- ja emissiospektrissä. 25 Saattaa myös olla edullista, että on alusta, joka läpäisee kapealla aallonpituuskaistalla, ja jonka läpäisevyys vähe-nee viereisillä aallonpituuksilla. Tämä voitaisiin suorittaa esimerkiksi kyllästämällä tai päällystämällä alusta yhdellä tai useammalla väriaineella, joilla on sopivat ab-30 sorptio-ominaisuudet.

Todettavissa olevan signaalin muodostumisen jälkeen ; signaali tyypillisesti mitataan sopivalla instrumentilla heijastus-, läpäisy-, fluoresenssi- tai luminesenssispekt- • . .

rofotometriaa varten. Sopivan alustaosan valinta riippuu 35 sen tähden detektiomenetelmästä, so. läpäisevästä tai hei- : jastavasta.

24 8 7 695 Säteilyä läpäisevä tai läpinäkyvä alustaosa sallii energiasäteen, kuten valon, kulkea lävitseen. Säde heijastuu sitten esimerkiksi säteilyä keräävästä kerroksesta takaisin instrumentin tuntoelimeen. Heijastavia pigmenttejä, 5 kuten titaanidioksidi, bariumsulfaatti tai sinkkioksidi, voidaan käyttää tähän tarkoitukseen. Sameita polymeerejä voidaan myös käyttää, joko erikseen tai sisällytettynä heijastavaan pigmenttiin heijastavuuden tai muiden ominaisuuksien lisäämiseksi. Sellaisia säteilyä kerääviä kerrok-10 siä ja aineita tunnetaan alalla, ja niihin kuuluvat ne, joita kuvataan US-patenteissa 4 042 335 ja 4 225 384. Silloin kun käytetään sameaa tai heijastavaa alustaosaa energiasäde johdetaan välineen eri kerrosten läpi, ja se heijastuu heijastavasta kerroksesta takaisin välineen tunto-15 elimeen.

Kuviossa 3 kuvataan esimerkiksi monikerroksista välinettä, jossa on ensimmäinen ja toinen reagenssikerros ja detektiokerros asennettuna tai muuten sijoitettuna alusta-osan päälle. Ensimmäiseen reagenssikerrokseen on sisälly-20 tetty leimattu reagenssi, joka sisältää monoklonaalisen vasta-aineen analyysiväliaineeseen liukenevan monovalent-tisen vasta-ainefragmentin osan, kuten aikaisemmin kuvattiin, Jolla on sidosaffiniteettia määrityksessä olevaan analyyttiin, ja joka on aikaisemmin leimattu entsyymillä, 25 (merkittynä "Fab-Entsyymi"), so. jolla on todettavissa oleva kemiallinen ominaisuus. Toiseen reagenssikerrokseen on sisällytetty analyytin immobilisoitu muoto (merkittynä "h An"), joka sitoo ja siinä yhteydessä immobilisoi kaiken sen leimatun reagenssin, joka ei sitoudu analyysiväliai-30 neen analyyttiin, kuten aikaisemmin kuvattiin. Detektio-kerrokseen on sisällytetty entsyymisubstraatin immobilisoitu muoto (esitettynä "fr"-Substraatti"), jossa analyyt-ti-(leimattu reagenssi)-kompleksi vaikuttaa immobilisoidun substraatin kanssa muodostaen siihen liittyen reaktiotuot-35 teen. Kuten aikaisemmin kuvattiin, voidaan reaktiotuote 25 87695 muodostaa todettavissa olevana aineena, tai se voidaan muodostaa muodossa, joka vaatii lisävaikutusta toisen aineen kanssa, kuten indikaattorin, todettavissa olevan signaalin tuottamiseksi. Jälkimmäisessä tapauksessa on edul-5 lista sisällyttää indikaattorin immobilisoitu muoto siinä yhteydessä tuotetun signaalin paikallistamiseksi detektio-kerrokseen.

On ymmärrettävä, että alustaosa, jota käytetään tämän keksinnön mukaisen monikerroksisen välineen kanssa, 10 voi olla joko heijastava, so. säteilyhimmeä, tai läpinäkyvä, so. säteilyä läpäisevä. Halutun entsyymi-substraatti-reaktion mittaamiseksi silloin kun käytetään heijastavaa alustaosaa, johdetaan esimerkiksi energiasäde ensimmäisen ja toisen reagenssikerroksen ja detektiokerroksen läpi, 15 tässä järjestyksessä, jossa säde sitten heijastuu takaisin instrumentin tuntoelimeen heijastavasta alustaosasta. Eri kerrosten läpi kulkevan ja alustaosasta heijastuvan säteen luonteeseen vaikuttaa todettavissa olevan reaktiotuotteen määrä detektiokerroksessa, missä todettavissa oleva muu-20 tos säteessä korreloidaan analyytin määrän analyysiväliaineessa.

Kääntäen, säteilyä läpäisevä tai läpinäkyvä alustaosa, joka sallii energialähteen kulkevan lävitseen, vaatii että säde heijastuu esimerkiksi säteilyä keräävästä : 25 kerroksesta tai aineesta takaisin instrumentin tuntoeli meen. Näin ollen silloin kun käytetään tällaista läpinäky-;; vää alustaosaa tämän keksinnön mukaisen monikerroksisen välineen kanssa, on ennen kaikkea välttämätöntä sisällyt-: t': tää säteilyä keräävä kerros tai aine välineeseen, edulli- 30 sesti keräävä kerros toisen reagenssikerroksen ja detektiokerroksen väliin tai keräävä aine sisällytettynä toi-. seen reagenssikerrokseen. Sellaisessa välineessä johdetaan halutun entsyymi-substraattireaktion mittaamiseksi energianlähde läpinäkyvän alustaosan läpi detektiokerrokseen, 35 jolloin energiasäde heijastuu takaisin detektiokerroksen 26 87695 ja alustaosan läpi säteilyä keräävän kerroksen tai aineen avulla ja takaisin instrumentin tuntoelimeen. Sellaisen välineen käyttäminen, jossa on läpinäkyvä alustaosa Ja säteilyä keräävä kerros tai aineita on erityisen edullista 5 silloin kun nestemäinen analyysiväliaine sisältää värilli sen aineen, kuten punaiset verisolut kun nestemäinen analyysiväliaine on kokoverta, jossa tapauksessa säteilyä keräävä aine tai kerros estävät punasolujen värin häiritsemistä, joka suodattuisi pois kerroksessa ja jäisi siihen 10 detektiokerroksen yläpuolella.

On ymmärrettävä, että tämän keksinnön mukaisen mo-nikerroksellisen analyysivälineen eri kerrokset eivät rajoitu niihin kerroksiin ja konfiguraatioihin, joita tähän mennessä on kuvattu. Lisäkerroksia, jotka lisäävät ja/tai 15 muokkaavat analyysivälineiden suorituskykyä ja jotka sopi vat käytettäviksi monikerroksisen analyysivälineen kanssa, on kuvattu ja tunnetaan alalla. Esimerkiksi välineeseen voidaan sisällyttää levitysvyöhyke tai -kerros, joka voisi sijaita välittömästi ensimmäisen reagenssikerroksen 20 yläpuolella ja sen vieressä. Levitysvyöhyke mittaa ja jakaa tasaisesti lisättävän nestemäisen näytteen allaolevaan ensimmäiseen reagenssikerrokseen. Sellaisia levitysvyöhyk-keitä tai -kerroksia tunnetaan alalla, ja niihin kuuluvat ne, joita on kuvattu US-patenteissa 3 992 158 ja 25 4 427 632.

Välineeseen voi myös kuulua välivyöhyke tai -kerros eri kerrosten välissä, joka toimii kiinnittävänä tai alaiskerroksena helpottamaan kerrosten välistä kiinnittymistä ja lisäksi helpottamaan kerrosten yhteenliittymistä 30 kiinteään alustaosaan. Voidaan käyttää myös välivyöhykkeitä tai -kerroksia, jotka esimerkiksi sisältävät reagensse-ja häiritsevien aineiden poistamiseksi, jotka voivat estää osan analyytin toteamisen, tai voivat olla säteilyä keräävä vyöhyke tai kerros, jotka peittävät laitteen vyöhyk-35 keitä tai kerroksia häirinnän estämiseksi tuotteen totea- 27 87695 misessa. Myös sellaisia säteilyä kerääviä kerroksia voidaan käyttää, jotka peittävät näytteissä havaittujen eri häiritsevien aineiden läsnäolon, kuten punasolut kokove-ressä.

5 Joskus on myös edullista varata ajoitusvyöhyke tai -kerros, joka säätelee eri reagensslen diffundoitumisno-peutta, jotka on sisällytetty monikerroksiseen analyysivälineeseen, sen eri kerrosten läpi. Sellaiset ajoitusvyö-hykkeet tai -kerrokset sisällytetään analyysivälineeseen 10 kontrolloitujen inkubolntialkojen ja peräkkäisten reaktioiden aikaansaamiseksi ja helpottamaan välineen valmistusta estämään reagensslen vuorovaikutus välineessä.

Tämän keksinnön mukainen väline voi myös olla moni-vyöhykkeinen väline, jossa on reagenssivyöhykkeitä, detek-15 tiovyöhykkeitä, ja vastaavia, koottuina konfiguraatioon, joka erityisesti soveltuu kromatografiseen analyysiin. Sellainen väline sisältäisi absorboivan alueen, joka olisi upotettuna nestemäiseen analyysivällaineeseen, jossa ana-lyysiväliaine diffundoituisi ylöspäin suuntautuen eri vyö-20 hykkeisiin.

Tällaisen monivyöhykkeisen välineen vyöhykkeet voivat olla reagenssityynyjen muodossa, jotka on asetettu muovisen alustaosan päälle soveltuen upotettaviksi tai kastettaviksi nestemäiseen analyysiväliaineeseen. Vyöhyk-25 keitä muodostavat reagenssityynyt sijoitetaan alustaosaan päittäin, jolloin päät ovat nestevirtauskontaktissa toistensa kanssa. Erityisesti reagenssityynyt sisältävät alimman, nestemäistä analyysiväliainetta absorboivan tyynyn tai vyöhykkeen, ensimmäisen ja toisen reagenssityynyn tai 30 vyöhykkeen, tässä järjestyksessä, sijoitettuna sen päälle, ja detektiotyynyn tai vyöhykkeen sijoitettuna toisen rea- genssivyöhykkeen päälle.

On ymmärrettävä, että reagenssi- ja detektiovyöhyk-keet sisältävät monikerroksellisen välineen eri reagensse-35 ja ja suorittavat samoja toimintoja kuin aikaisemmin ku- 28 8 7 6 9 5 vattu väline. Tässä suoritusmuodossa kuitenkin sen sijaan, että lisättäisiin nestemäisen analyysiväliaineen näytettä välineeseen, monikerroksisen välineen alin absorboiva tyyny upotetaan nestemäiseen analyysivällaineeseen. Tällä 5 tavalla, absorboiva tyyny toimii imulangan tavoin väliaineen absorboimiseksi ja sen ylöspäin diffundoimiseksi ensimmäiseen reagenssivyöhykkeeseen, toiseen reagenssivyö-hykkeeseen ja detektiovyöhykkeeseen, vastaavasti. Sellaisilla konfiguraatioilla varustettuja välineitä, joita ku-10 vataan US-patenteissa 4 301 139 ja 4 361 537 ja joissa käytetään kehltysnestettä, voidaan myös soveltaa esillä olevaan keksintöön. Kuten aikaisemmin kuvattiin, analyysi-väliaineen analyytti, joka diffundoituu ensimmäiseen reagenssivyöhykkeeseen, sitoutuu leimattuun reagenssiin, joka 15 on sisällytetty em. vöyhykkeeseen ja siinä yhteydessä muodostunut kompleksi jatkaa kulkeutumista toisen reagenssi-vyöhykkeen läpi detektiovyöhykkeeseen, jossa analyytti-(leimattu reagenssi)-kompleksi vaikuttaa siinä immobili-soituna olevan vuorovaikuttavan detektioreagenssin kanssa 20 muodostaakseen reaktiotuotteen, joka sitten todetaan ja mitataan. Samalla tavalla kaikki se leimattu reagenssi ensimmäisessä reagenssivyöhykkeessä, joka ei sitoudu analyysiväliaineen analyyttiin, kulkeutuu toiseen reagenssivyöhykkeeseen, jossa se immobilisoituu siihen sisällytettyyn 25 analyytin immobilisoituun muotoon.

Tämän keksinnön mukaisesti tässä kuvatut eri kerrokset sisältävät edullisesti huokoisen matriisin, joka on läpäisevä ainakin joillekin nestemäisen näytteen komponenteille, esim. antigeenit, haptenit ja/tai vasta-aineet, 30 sellaisen läpäisevyyden yleensä johtuen huokoisuudesta, kyvystä turvota tai jostain muusta ominaisuudesta. Matrii-- simateriaali voi sisältää erilaisia huokoisia kuitumaisia aineita kuten selluloosa, paperit, vuorivillat, huovat, kudotut kankaat Ja vastaavat, muodostettuina joko luonnon 35 tai synteettisistä materiaaleista. Tällaisia materiaaleja - - m 29 8 7 6 9 5 kuvataan esimerkiksi US-patenteissa 3 802 842, 3 809 605, 3 897 214 ja 3 987 214. Muihin huokoisiin, mutta ei kuitumaisiin materiaaleihin kuuluvat mikrohuokoiset polymeerit, kuten sellaiset, joihin viitataan US-patentissa 3 552 929.

5 Tämän keksinnön mukaisen monikerroksellisen analyysivälineen eri kerroksissa olevat matriisin muodostavat materiaalit ovat edullisesti läpäiseviä materiaaleja kuten gelatiini, agaroosi ja vastaavat. Nämä materiaalit sallivat nesteiden kulkeutua diffundoitumalla, ennemmin kuin kapil-10 laarivirtauksen avulla kuten kuitumaisilla huokoisilla materiaaleilla, kuten paperit tai kudotut materiaalit. Vaikkakin huokoisia kuitumaisia materiaaleja, jolta kuvattiin edellä, voidaan käyttää, gelatiini, agaroosi ja vastaavat ovat erityisen edullisia niiden tasaisen neste!-15 den läpäisevyyden ansiosta, yhtä hyvin kuin niiden kyvyn ansiosta sallia valon tai muun elektromagneettisen säteilyn kulkeutuminen lävitseen. Kun alan ammattimies tuntee analyysissä käytettävän nestemäisen analyysiväliaineen, sopivan materiaalin valinta on ilmeinen asia.

20 Erilaisia alalla tunnettuja menetelmiä on saata villa analyytin immobilisoimiseksi tämän keksinnön mukaisessa analyysivälineessä, tai voidaan valmistaa analyytin johdannainen tai sopiva analogi helpottamaan sen immobi-lisointia välineessä. Vaikkakin analyytin tai sen analogin 25 immobilisointi kovalenttisen kiinnittymisen kautta on edullista, voidaan myös käyttää muita keinoja, joissa sitominen on ei-kovalenttista, kuten ioninvaihto tai adsorptio. Analyytin immobilisaatio voidaan saada aikaan esimerkiksi suoralla liittämisellä välineen kantajamatriisiin, 30 paperin kuten selluloosaan tai kalvojen gelatiiniin tai agaroosiin. Vaihtoehtoisesti analyytin analogi voidaan liittää polymeeriseen kantajaan, joka sitten myöhemmin sisällytetään välineen matriisiin, polymeerin ollessa riittävän kokoinen estääkseen merkittävä diffuusio slto-35 mis- Ja detektiokerrosten välillä. Esimerkiksi gelatiinis- so 87695 sa polymeerit, joiden molekyylipaino on suurempi kuin 10 000, eivät diffundoidu gelatiinimatriisin läpi. Samaten agaroosissa polymeerit, joiden molekyylipaino on suurempi kuin kaksi miljoonaa, ovat estyneet diffundoitumasta 5 matriisin läpi. Analyytti voidaan myös liittää suoraan tai polymeerirungon avulla hyvin pieniin partikkeleihin kuten polystyreenimikropalloihin, jotka sitten voidaan myöhemmin sisällyttää välineen matriiseihin. Sellaisia partikkeleita on helposti saatavissa eri kokoisina ja niihin kuuluvat 10 polystyreeni, mikrokiteinen selluloosa, ristisidotut deks-traanit ja ristisidotut agaroosit, ioninvaihtohartsit ja vastaavat. Saatavilla on suuri määrä kemiallisia menetelmiä aineiden kytkemiseksi kantajaan. Esimerkiksi, veteen liukenevia karbodi-imidejä voidaan käyttää aktivoimaan 15 vapaita karboksyyliryhmiä myöhempää reaktiota varten nuk-leofiilien kanssa mukaanlukien erilaiset amiiniyhdisteet; amiditähteet tai palloset voidaan muuttaa reaktiolla hyd-ratsiinin kanssa hydratsideiksi, joiden voidaan edelleen antaa reagoida bifunktionaalisten reagenssien kanssa, ku-20 ten glutaraldehydi, 1,5-difluorinitrobentseeni, 4,4'-di-fluori-3,3'-dinitrofenyylisulfoni, 2,4-dikloori-6-karbok-simetyyliamino-5-tri-iatsiini, dimetyyliadipimidaatti tai dimetyylisuberimidaatti, ja vastaavat, jota seuraa reaktio amiinien tai muiden nukleofiilien kanssa, jotka ovat liit-25 tyneet kiinnostuksen kohteena olevaan analyyttiin tai sen analogiin; hydratsidit voidaan muuttaa atsidiryhmiksi reaktiossa typpihapon kanssa diatsotisointireaktion kautta; hydratsidien voidaan antaa reagoida meripihkahapon anhyd-ridin kanssa karboksylaattiryhmien liittämiseksi, joilla 30 on välihaara; alifaattisten amiinien tai partikkelien voidaan myös antaa reagoida bifunktionaalisten reagenssien kanssa, analogisesti hydratsidikemian kanssa ja mukaanlukien heterobifunktionaalisten ristikytkijöiden käyttö, jotka sallivat kiinnittymisen amiineihin, joiden funktio-35 naalisilla ryhmillä, joilla on erilaisia erityisominai- 3i 87695 suuksia, kuten maleimidlryhmä, jolla on kohonnut spesifisyys sulfhydryylijohdannaisia kohtaan; hydroksyyliryhmät voidaan aktivoida syanogeenibromidilla, tosyylikloridilla, karbonyylidi-imidatsolilla tai p-nitrofenyyliklooriformaa-5 tiliä; partikkeleita, kuten polystyreeni, voidaan nitrata, nitroryhmät voidaan pelkistää aromaattisiksi amiineiksi ja aromaattiset amiinit voidaan diatsolysoida ennen reaktiota kiinnostuksen kohteena olevan nukleofiili-analyytti/analo-gin kanssa. Nitroselluloosaa, diatsobentsoksimetyyli (DMB)-10 paperia, derivoitua nailonverkkoa, tai paperia, joka on aktivoitu syanogeenibromidilla, p-nitrofenyylikloorifor-maatilla, tai karboksyylidi-imidatsolilla, voidaan myös käyttää nukleofiilisten reagenssien liittämiseksi tai rea-genssien, jotka ovat liittyneet reaktiivisiin polymeerei-15 hin.

Vaihtoehtona sopivan sidosreagenssin suoralle sitomiselle materiaaliin, joka on immobilisoitu reagenssi-kerroksessa, voidaan myös hyödyntää spesifisiä sidospareja tarvittavan immobilisoinnln saamiseksi in situ määrityk-20 sen suorituksen aikana. Immobilisoitava materiaali, so. analyytti tai analogi tai sidosparl, voi sisältää tai voidaan muuttaa sisältäväksi sitomiskohdan erillistä sitomis-ainetta varten, joka vuorostaan voidaan immobilisoida rea-genssikerrokseen. immobilisoitava materiaali voi näin ol-25 Ien sijaita missä tahansa sopivassa paikassa välineessä ja määrityksen suorituksen yhteydessä on seurauksena sopiva inunobilisaatio. Sidoksellisia vuorovaikutuksia, sellaisia kuin aikaisemmin kuvattiin leimatun reagenssin immobili-soimiseksi detektiokerrokseen, voidaan käyttää. Samalla 30 tavalla voidaan myös edellä kuvattuja menetelmiä analyytin immobilisoimiseksi yleisesti soveltaa erilaisten detektio-reagenssien tai niiden johdannaisten immobilisoimiseksi.

Tämän keksinnön mukainen analyysiväline käyttää hyväksi moninaisia reagenssikerroksia, jotka on koottu 35 niin, että vierekkäisten kerrosten välillä on nestekontak- 32 87695 ti, kuten aikaisemmin kuvattiin. Erilaisia kerroksia voidaan valmistaa käyttämällä kalvonmuodostajia päällekkäisten toisiaan seuraavien päällysteiden valmistamiseksi, tai valmistaa kerrostamalla kuitumaista reagenssimatriisia, 5 kuten suodinpaperi, lasikuitu tai kudottu polyesteri. Vaihtoehtoisesti vierekkäiset vyöhykkeet voidaan muotoilla kromatografiamuotoon, niin että kukin vyöhyke kiinnittyy alustanosaan kunkin reaktiovyöhykkeen reunojen ollessa suorassa nestekontaktissa, kuten aikaisemmin kuvattiin.

10 Esimerkiksi useita paperikerroksia voidaan pitää vierekkäin ympäröivän muovikehyksen avulla tai vaihtoehtoisesti nesteen läpäisevän verkkosiivllän avulla tai sisällyttämällä kerrosten väliin vesiliukoinen liima. Monikerroksisten kalvojen valaminen voidaan suorittaa monilla 15 kalvojen valamisen alalla tunnetuilla menetelmillä, mukaanlukien lääkärin lastan, suulakepuristinpinnoittajan, Meyerin sauvan, putlapäällystäjän tai syväpainopäällys-täjän käyttö. Vaihtoehtoisesti multippeleita peräkkäisiä kerroksia voidaan valaa kaskadipäällystäjällä. Kalvoker-20 rokset, jotka on muodostettu edellä kuvatuilla menetelmillä, voidaan peittää kudoksella tai verkkomateriaalilla, joka sisältää reagensseja ja jota inkuboidaan ennalta määrätty ajanjakso.

Analyytti 25 Tässä kuvattua analyysiä voidaan soveltaa minkä tahansa analyytin toteamiseksi, jolle on olemassa sidok-sellinen vastapari. Analyytti on tavallisesti peptidi, polypeptidi, proteiini, hiilihydraatti, glykoproteiini, steroidi, nukleiinihappo tai muu orgaaninen molekyyli, 30 jolle on olemassa sidoksellinen vastapari tai joka on tuotettavissa biologisissa systeemeissä tai voidaan syntetisoida. Analyytti, toiminnallisesti määritettynä, valitaan yleensä ryhmästä, joka käsittää antigeenejä ja niiden vasta-aineita; hapteneja ja niiden vasta-aineita; täydentä-.1. 35 viä polynukleotidisekvenssejä; ja hormoneja, vitamiineja, 33 87695 metaboliitteja ja farmakologisia aineita, ja niiden vastapareja. Analyytti on tavallisesti immunologisesti aktiivinen polypeptidi tai proteiini, jonka molekyylipaino tavallisesti on välillä noin 1000 - noin 10 000 000, kuten vas-5 ta-aine tai antigeeninen polypeptidi tai proteiini, tai hapteni, jonka molekyylipaino on vähintään noin 100, ja tavallisesti vähemmän kuin noin 1500.

Edustavia polypeptidianalyyttejä ovat angiotensiini I ja II, C-peptidi, oksitosiini, vasopressiini, neurofy-10 siini, gastriini, sekretiini, bradykiniini ja glukagoni.

Edustaviin proteiinianalyytteihin kuuluvat prota-miinien luokat, mukoproteiinit, glykoproteiinit, globulii-nit, albumiinit, skleroproteiinit, fosfoproteiinit, histo-nit, lipoproteiinit, kromoproteiinit ja nukleoproteiinit. 15 Esimerkkejä spesifisistä proteiineista ovat prealbumiini, ^-lipoproteiinit, ihmisen seerumin albumiini, c^-hapan glykoproteiini, c^-antitrypsiini, c^-glykoproteiini, transkortiini, tyroksiinia sitova globuliini, haptoglobii-ni, hemoglobiini, myoglobiini, keruloplasmiini, c^-makro-20 globuliini, β-lipoproteiini, erytropoietiini, transferrii-

ni, hemopeksiini, fibrinogeeni, immunoglobuliinit kuten IgG, IgM, IgA, IgD ja IgE, ja niiden fragmentit, esim. F

c ja Fab, komplementtitekijät, prolaktiini, veren hyytymistekijät, kuten fibrinogeeni, trombiini jne., insuliini, 25 melanotropiini, somatotropiini, tyrotropiini, munarakkulaa stimuloiva hormoni, keltarauhashormoni, gonadotropiini, kilpirauhasia stimuloiva hormoni, istukan laktogeeni, intrinsinen tekijä, transkobalamiini, seerumin entsyymit kuten alkaalinen fosfataasi, laktaattidehydrogenaasi, amy-30 laasi, lipaasi, fosfataasit, koliiniesteraasi, glutamiinin oksaloetikkahappotransaminaasi, glutamiinin palorypälehap-potransaminaasi, ja uropepsiini, endorfiinit, enkefalii-nit, protamiini, kudosantigeenit, bakteeriantigeenit, ja virusantigeenit kuten hepatitikseen liittyvät antigeenit 35 (esim. HB Ag, HB Ag ja HB Ag).

s c e 34 87 695

Edustaviin hapteenianalyytteihin kuuluvat lääkeaineiden yleisluokat, metaboliitit, hormonit, vitamiinit, toksiinit ja vastaavat orgaaniset yhdisteet. Hapteenihor-moneihin kuuluvat tyroksiini ja trijodityroniini. Vitamii-5 neihin kuuluvat A, B, esim. B12, C, D, E, ja K, foolihappo ja tiamiini. Lääkeaineisiin kuuluvat antibiootit kuten aminoglykosidit, esim. gentamisiini, tobramysiini, amika-siini, sisomisiini, kanamysiini ja netilmisiini, penisilliini, tetrasykliini, kloromysetiini ja aktinomysetiini; 10 nukleosidit ja nukleotidit kuten adenosiinidifosfaatti (ADP), adenosiinitrifosfaatti (ATP), flaviinimononukleoti-di (FMN), nikotiiniamididinukleotidi (NAD) ja sen fosfaatti johdannainen (NADP), tymidiini, guanosiini ja adenosii-ni; prostaglandiinit; steroidit kuten estrogeenit, esim. 15 estrioli ja estradioli, sterogeenit, androgeenit, digok-siini, digitoksiini, ja adrenokortikaaliset steroidit; ja muut kuten fenobarbitaali, fenytoiini, primidoni, etosuk-simidi, karbamatsepiini, valproaatti, teofylliini, kofeiini, propanololi, prokaiiniamidi, guinidlini, amitryptilii-20 ni, kortisoli, desipramiini, dlsopyramidi, doksepiini, doksorubisiini, nortryptiliini, metotreksaatti, imipramii-ni, lidokaiini, prokaiiniamidi, N-asetyyliprokaiiniamidi, amfetamiinit, katekoliamiinit, ja antihistamiinit. Toksii-neihin kuuluvat asetyyli-T-2-toksiini, aflatoksiinit, ko-25 leratoksiini, sitriniini, sytokalasiinit, stafylokokin enterotoksiini B, HT-2-toksiini ja vastaavat.

Nestemäinen analyysivällaine Määrityksessä olevan analyytin sisältävä nestemäinen analyysiväliaine voi olla luonnossa esiintyvä tai kei-30 notekoisesti muodostettu neste, jonka epäillään sisältävän analyyttiä, ja se on tavallisesti biologinen neste tai sen laimennos. Biologisiin nesteisiin, joista analyytti voidaan määrittää, kuuluvat seerumi, kokoveri, plasma, virtsa, sylki ja lapsivesi- ja selkäydinnesteet.

35 B7 695 Tätä keksintöä kuvataan nyt seuraavilla esimerkeillä, joita ei ole tarkoitettu rajoittaviksi:

Esimerkki 1

Entsyymillä leimatun vasta-aineen valmistaminen 5 Ascites-neste, joka sisältää anti-digoksiini vasta- ainetta (~6mg/ml), laimennetaan viisinkertaisesti 0,1 M sitraattipuskuriin, pH 3,5 ja inkuboidaan 1:50 (w/w) Pepsiini :vasta-aineliuoksen kanssa 48 tuntia 37 eC:ssa. Näyte konsentroidaan jälkeen '5 ml:ksi ultrasuodattamalla Amicon 10 PM 30-membraanin läpi (Amicon Corp., Danvers, MA, USA) ja geelisuodatetaan Sephacryl® s-300 (Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ, USA) -kolonnissa (2,4 x 90 cm), joka on tasapainotettu 10 nM:lla natriumfosfaattia ja 0,15 M: 11a natriumkloridia (pH 7,2) vasta-aineen F(ab'^-fragmentin 15 eristämiseksi. Vasta-aine pelkistetään 10 nM ditiotreito-lilla ja proteiinipiikki kerätään yhteen suolanpoiston jälkeen P-6DG polyakryyliamidigeelihartsilla (Bio-Rad Co., Richmond, CA 94804) juuri ennen reaktiota aktivoidun B-galaktosidaasin kanssa, β-galaktosidaasi (tyyppi IX, Sigma 20 Chemical Co., St. Louis, MO, USA) dialysoidaan 50 nM natriumfosfaattia vastaan, pH 7,4. Liuoksen, pitoisuudessa 10 mg/ml, annetaan reagoida heterobifunktionaalisen risti-sidosaineen kanssa, sukkinimidyyli 4(N-maleimidometyyli)-sykloheksaani-l-karboksylaatti, kaksi tuntia huoneen läm-25 pötilassa, ja tämä materiaali viedään 1 x 60 cm:n P-6DG-kolonniin. Aktivoitu β-galaktosidaasi sekoitetaan vasta-aineen kanssa suhteessa 1:3, ja seoksen annetaan reagoida kaksikymmentä tuntia 4 °C:ssa. Tämä materiaali konsentroidaan noin kymmenkertaisesti ultrasuodatuksella Amicon 30 PM30-membraanin läpi. Konsentraatti viedään 1,5 x 110 cm ACA 22 hartsiin (LKB Instruments, Inc., Gaithersburg, MD, USA) Fab-B-galaktosidaasin erottamiseksi vapaasta vasta-ainefragmentista (Fab) ja Fab:n korkeammista substituoi-duista oligomeereistä ja β-galaktosidaasista. Entsyymin/ 35 vasta-aineen pääfraktiot kerätään yhteen ja viedään affi- 36 87695 niteettipylvääseen, joka sisältää immobilisoitua ouabai-nia. Immobilisoidun ouabainikolonnin valmistamiseksi oua-baini liitetään naudan seerumin albumiiniin samanlaisella menetelmällä, jota kuvaavat Smith et ai. [Biochem. 9: 331-5 337 (1970)]. Ouabain-BSA liitetään Sephadexiin® g-25 (Pharmacia Inc., Piscataway, NJ, USA) perjodaattihape-tuksen jälkeen aikaisemmin kuvatun menetelmän mukaisesti [Wilson, N., ja Nakane, P., J. of Immunol. Methods 12, 171-181, (1976)]. Fab-B-galaktosidaasia sisältävä näyte 10 viedään 1 x 10 cm pylvääseen, jossa on affiniteettihart-sia. Vapaa β-galaktosidaasi eluoidaan pylväästä, ja sitä seuraa eluointi liuoksella, joka sisältää 20 mM ouabainia vastaaine-entsyymi-konjugaatin vapauttamiseksi pylväästä. Pylväs pestään viidellä kolonnitilavuudella ja nesteet 15 kootaan yhteen. Yhdiste konsentroidaan 2 ml:ksi ja dialy-soidaan kaksikymmentä tuntia kymmentä erää vastaan fos-faattisaliinipuskuria (50 mM natriumfosfaattia, 0,1 M nat-riumkloridia, pH 7,4).

Esimerkki 2 20 Whatman 31-ET (Whatman, Inc., Clifton, NJ, USA) -paperi aktivoidaan myöhempää derivointia varten para-nit-rofenyyliklooriforraaatilla (NPCF). Paperiarkit kastetaan viideksitoista minuutiksi tislattuun veteen ja vesi de-kantoidaan sitten ja paperi huuhdellaan kuudella peräkkäi-; 25 sellä tilavuudella asetonia vapaan veden poistamiseksi.

• · Paperi upotetaan sitten NPCF:n 10-%:iseen liuokseen aseto nissa, inkuboidaan kuusi tuntia ja sitten reagoimaton NPCF poistetaan peräkkäisillä asetonihuuhteluilla. Pesuliuoksesta testataan formaatin läsnäolo lisäämällä 100 μΐ IN 30 NaOH:a 300 pl:aan pesuliuosta. Pesua jatketaan kolmella tilavuudella asetonia kunnes ei ole yhtään keltaista väriä . . havaittavissa, minkä jälkeen seuraa pesu 1 1:11a tislattua vettä ja pesu 5 x 100 ml:n tilavuuksilla asetonia, ja liuotin poistetaan ilmakuivauksella.

37 87695

Esimerkki 3

Whatman 31-ET-paperia (3,7 g) inkuboidaan 2 g:n kanssa 1,1'-karbonyylidi-imidatsolia 100 ml:ssa asetonia yksi tunti huoneen lämpötilassa ajoittain sekoittaen. Pa-5 peri pestään 3 x 200 ml:n tilavuuksilla asetonia ja kuivataan 50 eC:ssa suunnilleen kymmenen minuuttia (tai kunnes ei ole havaittavaa asetonin hajua) ja säilytetään piihap-pogeelikuivausaineen kanssa 4 °C:ssa edelleen käyttämiseen saakka. Paperin annetaan myöhemmin reagoida 6-galaktosi-10 daasin substraatin kanssa, joka sisältää aktiivista amiinia, β-galaktosyyli-umbelliferoniaminoheksyyli (katso US-patentti 4 259 233). 50 mg substraattireagenssia liuotetaan 20 ml:aan DMS0:ta ja lisätään 1 g:aan aktivoitua paperia. Viidentoista minuutin kuluttua lisätään 20 ml iso-15 propanolia, ja reaktiota jatketaan kuusi tuntia huoneen lämpötilassa ajoittain sekoittaen. Liuotin dekantoidaan, ja paperi pestään 3 x 100 ml:n tilavuuksilla isopropanolia. 200 ml:n erä isopropanolia, joka sisältää 2 ml etano-liamiinia, lisätään ja annetaan reagoida kolmekymmentä 20 minuuttia huoneen lämmössä, jota seuraa kolme 200 ml:n pesua isopropanolilla. Paperi jätetään yön yli huoneen lämpöön 200 ml:ssa isopropanolia. Seuraavana päivänä liuotin dekantoidaan, ja jäännöslluotin poistetaan kuivaamalla 50 °C:ssa viisitoista minuuttia.

25 Esimerkki 4

Entsyymi-vasta-aine-konjugaattikerros

Whatman 54-paperi kastetaan liuokseen, jossa on 10 mg/ml anti-digoksiini-Fab-B-galaktosidaasia 0,6 M natrium-fosfaattipuskurissa, pH 7,4 ja kuivataan 40 °C:ssa kaksi-30 kymmentä minuuttia.

Esimerkki 5

Monikerroksellisen välineen kokoaminen

Yhdistetty liuskaväline kootaan kolmesta reagenssi-elementistä, joita edellä kuvattiin. Substraattikerros la-35 minoidaan kaksipuolisen tarrateipin päälle (3M Company, 38 B7 695

St. Paul, MN, USA) ja leikataan 1 cm:n leveäksi ja 12,7 cm:n pitkäksi suikaleeksi. Tämä materiaali laminoidaan sitten 8,3 cm leveän ja 12,7 cm pitkän kirkkaan polysty-reenlalustan (Trycite® , Dow Chemical Co., MI, U S A) 5 päälle ja pitkin sen yhden pinnan reunan pituudelta. 1-2 mm:n liuska kaksipuolista tarratelpplä asetetaan pitkin substraattlkerroksen takareunaa ja 1 cm:n leveä reagenssi-paperln kaistale, joka sisältää Immobllisoitua analyytin analogia asetetaan sen päälle liuskalla kaksipuolista tar-10 rateippiä. Edellä oleva menetelmä toistetaan reagenssipa-perlsulkaleen palkoilleen asettamiseksi, joka sisältää entsyymi-vasta-aine-konjugaatin. Syntynyt monikerroksinen väline leikataan 5 mm leveiksi x 8,3 cm pitkiksi reagens-sisuikaleiksi, joissa on eri kerrokset asetettuina niiden 15 päihin.

Esimerkki 6 Välineen toiminta

Normaali ihmisen seeruminäyte laimennetaan injektioruiskussa 5 nM:ksi digoksiinin suhteen. Konsentraatio-20 alue 0,2 - 5,0 nM digoksiinia valmistetaan laimentamalla perusreagenssia normaalilla ihmisen seerumilla. 80 yl:n erä näytettä lisätään analyysivälineeseen kokeen aloittamiseksi. Analyysiväline on asetettu heijastusfotometriin, joka valaisee reagenssityynyn pohjaa vaalealla valolla 25 kuituoptiikkasäteestä asennettuna 45 °C:een kulmassa tyy nyn normaaliin nähden. Heijastuneen valon ilmaisee kuitu-optiikkasäde, joka on asetettu tyynyn normaalin suhteen, joka vie valon 405 nm:n interferenssisuotimelle (3 kammiota, Ditric Optics, Inc., Hudson, MA, U S A) ja siihen 30 liittyneelle detektioelektroniikalle. Heijastuksen muutos ta seurataan ajan funktiona ja se suhteutetaan käytetyn digoksiinin konsentraatioon.

Claims (10)

39 87695

1. Monivyöhykkeinen analyysiväline nestemäisessä analyysiväliaineessa olevan analyytin määrittämiseksi im- 5 munoanalyysin avulla käyttäen immunometristä tai kompeti-tiivistä menetelmää, johon kuuluu sidoksen muodostaminen (i) analyytin Ja analyytin tai sen sidosanalogin leimatun tai immobilisoidun muodon ja (ii) analyytin sidosparin im-mobilisoidun tai leimatun muodon, vastaavasti, välillä, 10 jolloin analyytin, sen analogin tai sidosparin leimattu muoto on leimattu reagenssi, joka sisältää todettavissa olevan kemiallisen ryhmän, joka reagoi detektanttikoostu-muksen kanssa muodostaen todettavissa olevan signaalin, tunnettu siitä, että analyysiväline sisältää, 15 nestevirtauskosketuksessa, (1) reagenssivyöhykkeen, joka käsittää kiinteän, huokoisen matriisin, johon on sisällytetty analyytin, sen analogin tai sidosparin immobilisoitu muoto ja 20 (2) detektiovyöhykkeen, joka käsittää kiinteän, huokoisen matriisin leimatun reagenssin vastaanottamista ja määrittämistä varten, joka reagenssi siirtyy sellaiseen vyöhykkeeseen, ja johon on sisällytetty detektanttikoostumuksen vähintään yhden 25 komponentin immobilisoitu muoto.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen analyysiväline, tunnettu siitä, että detektiovyöhykkeeseen immobilisoitu detektanttikomponentti osallistuu kemialliseen reaktioon leimatun reagenssin kanssa, jolloin muodostuu 30 tuote, joka tuottaa todettavissa olevan signaalin, ja että leimatussa reagenssissä oleva todettavissa oleva kemiallinen ryhmä on entsymaattisesti aktiivinen ryhmä, edullisesti (i) entsyymi tai (ii) entsyymin substraatti tai kofaktori, jolloin immobilisoitu detektanttikomponentti on 35 toinen niistä. 40 87695

3. Jonkin patenttivaatimuksista 1 ja 2 mukainen analyysiväline, tunnettu siitä, että leimatun reagenssin todettavissa oleva kemiallinen ryhmä on entsyymi ja immobilisoitu detektanttikomponentti on entsyy- 5 min kromogeeninen, fluorogeeninen tai kemiluminesoiva substraatti.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen analyysiväline, tunnettu siitä, että leimatun reagenssin todettavissa oleva kemiallinen ryhmä on poly- 10 meeritähde, johon on liittyneinä sisäisesti-sammutettuja multippeleita fluoresoivia aineita, ja immobilisoitu detektanttikomponentti on entsyymi, joka vaikuttaa fluore-soiva-aine-polymeeritähteeseen ja katkaisee ja vapauttaa sammuttamattomia fluoresoivia molekyylejä.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen analyysiväline, tunnettu siitä, että immobilisoitu detektanttikomponentti reagoi kemiallisesti leimatun reagenssin kanssa, jolloin muodostuu immobilisoitu tuote, joka tuottaa todettavissa olevan signaalin.

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen analyysiväline, tunnettu siitä, että todettavissa oleva tuote on liukenematon tai todettavissa oleva tuote on liukoinen, ja detektiovyöhyke lisäksi sisältää liukoisen tuotteen immobilisoivan aineen. : : : 25

7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen analyysiväline, tunnettu siitä, että leimatussa ”· reagenssissa oleva todettavissa oleva kemiallinen ryhmä käsittää fluoresoivan aineen, edullisesti polymeeritäh-... teen, jossa on multippeleita fluoresoivia aineita, ja de- 30 tektanttikomponentti, joka on immobilisoitu detektiovyö-hykkeeseen, on leimatun reagenssin fluoresenssin sammuttaja.

• " 8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen : analyysiväline, tunnettu siitä, että detektant- ;“·*· 35 tikomponentti on immobilisoitu detektiovyöhykkeeseen oi- 4i 87695 Ien kovalenttisesti sidottuna siinä olevaan matriisiin tai ollen kiinnittyneenä suurimolekyylipainoiseen polymeeriseen aineeseen, joka on dispergoitu mainittuun matriisiin.

9. Jonkin patenttivaatimuksista 1-8 mukainen 5 analyysiväline, tunnettu siitä, että analyytin sidospari on vasta-aine tai sen osa.

10. Jonkin patenttivaatimuksista 1-9 mukainen analyysiväline, tunnettu siitä, että reagenssi-ja detektiovyöhykkeet ovat kerroksina nestevirtauskoske- 10 tuksessa, ja analyysiväline käsittää lisäksi reagenssi- kerroksen, joka sisältää kiinteän, huokoisen matriisin, johon on sisällytetty leimatun reagenssin analyysiväliai-neeseen liukenevaa muotoa, ja alustaelementtiin, joka sijaitsee detektiokerroksen vastakkaisella puolella rea-15 genssikerroksesta. 42 87 695