JPS63159760A - 定性免疫クロマトグラフィー方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 （発明の分野） 特定の化合物のアッセイにおいて、その化合物に対応す
る天然のレセプターまたは抗体を使用することが可能で
あるということが、イムノアッセイ研究の発展をもたら
した。各アッセイでは、リガンドおよびレセプター（ア
ンチリガンド）を含む特異的結合対（「ｓｂｐ成分」）
成分の相同対、通例、免疫対を用い、そのｓｂｐの一方
を検出可能なシグナルを発生する標識で標識する。イム
ノアッセイ法を行うと、ｓｂｐ成分の複合体と結合した
シグナル標識および未結合シグナル標識間にシグナル標
識の分布が生じる。結合シグナル標識と未結合シグナル
標識の識別は、未結合シグナル標識から結合シグナル標
識を物理的に分離するか、または結合および未結合シグ
ナル標識の検出可能なシグナルを変調することにより行
うことができる。

通例、イムノアッセイは、臨床研究室において関心の対
象である多種の化合物の定量に供されており、比較的精
巧な装置および慎重な技術を必要とする。イムノアッセ
イは、半定量的または定性的結果を目的とし、測定に非
実験技術者があたる場合（例えば、家庭または病院にお
いて）広くは実用化されていない。臨床研究室において
も、非熟練者でも実施し得る簡単で迅速なスクリーニン
グ試験があれば、多くの費用を節約することができる。

免疫検定法の開発については、考慮すべきことが多い。

その１つは、結合したシグナル標識から発生するシグナ
ルと未結合シグナル標識から発生するシグナルとの実質
的な識別である。また問題の化合物の含有が疑われる試
料中の内在物質からの妨害を最小にすることも考慮しな
ければならない。さらに、シグナルを検出し、関心のあ
る濃度範囲内での濃度の測定を容易にすることら考慮し
なければならない。他の要素としては、試薬調製の容易
さ、試料および試薬溶液の調製および測定に要する正確
さ、試薬の貯蔵安定性、プロトコルに要する操作数およ
び各操作の遂行に要する技術と正確さがある。したがっ
て、非熟練者でも実施し得る検定、例えば、家庭で、法
医学において、または開業医等によって実施し得る検定
の開発においては、プロトコルの実施方法の相異によっ
て影響を受ける結果の変動を最小限にし、そして種々の
操作の実施方法を簡単にすべきである。

一般に、２種またはそれ以上のアナライトの同時測定が
可能な免疫検定法の計画を立てるのは困難であり、実施
された免疫検定法では別々のアナライト類似体に対して
相異なる放射性標識を使用している。

（先行技術の記載） 試料特性の測定用、特に液体試料中の物質の測定用の試
験装置が、米国特許第４０９４６４７号に開示されてい
る。薄層クロマトグラフィー装置およびクロマトグラフ
ィー試験法が、米国特許第４３８４９５８号に開示され
ている。標識抗体を固定化アナライト類似体から排除す
る免疫検定法が、米国特許第４４３４２３６号に記載さ
れている。ミオグロビン検出装置および検出法が、米国
特許第４１８９３０４号に開示されている。液体に溶解
した物質を分析するためのテストストリップが、米国特
許第４４３８０６７号に記載されている。液体試料成分
測定用多層試験装置およびかかる装置の使用法が、米国
特許第４１６０００８号に記載されている。不溶性抗体
を用いた標識抗原による抗原測定法が、日本国昭和４８
年特許出願公開第５９２５号（昭和４８年１月２５日）
に開示されている。

ヘテロジニアス免疫検定における濃縮域法が、米国特許
第４．３６６２４１号に開示されている。

米国特許第４．１６８１４６号は、免疫検定用テストス
トリップを記載している。米国特許第３９９０８５０号
および第４０５５３９４号は、診断テストカードを記載
している。生体液の自動定量分析方法は、米国特許第４
３２７０７３号に記載されている。色素生成支持体免疫
検定法は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ　８３１０　Ｉ　８
８７号に開示されている。

広い範囲の特許および特許出願によって、免疫検定法に
おいて検出可能なシグナルを発生させる多様な技術に関
する文献が提供されている。以下のリストは、この発明
において適用性を示し得るこれらの幾つかの技術の単な
る例示である。以下、米国特許および特許出願並びに使
用される標識の型のリストを示す。米国特許第３６４６
３４６号、放射性標識、同第３６５４０９０号、同第３
７９１９３２号および同第３８１７８．３８号、酵素標
識、同第３９９６３４５号、フルオレッサーークエンチ
ャー標識、同第４０６２７３３号、放射性標識、同第４
０６７９５９号、フルオレッサーまたは酵素標識、同第
４１０４０２９号、化学発光標識、および同第４１６０
６４５号、非酵素触媒標識。米国特許第３９６６８７９
号には抗体域を用いる電気泳動技術が、また同第４１２
０９４５号には標識アナライトを最初に抗体を介して固
体支持体に結合させるＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）
が記載されている。米国特許第４２３３４０２号では酵
素対標識、同第４７２０４５０号では化学誘導蛍光標識
、および同第４２８７３００号では酵素アニオン負荷標
識を使用する。

〔発明の要約〕

この発明の方法および装置は、１種またはそれ以上のア
ナライトの含有が疑われる試料中における予め決定され
た最少検出可能量の複数のアナライトの１種またはそれ
以上の存否の測定に有用である。この装置は毛管移動に
よって少なくとも一方向に試験溶液を浸透させ得る吸収
性材料片である。試験溶液は、試料および各々アナライ
トの１つと類似している、予め決定された量の２種また
はそれ以上の第１　ｓｂｐ成分を含む。吸収性材料は、
少なくとも前記接触部分および接触部分から離れた吸収
性材料片の予め定められた部位の間に実質的に均一およ
び非拡散結合した予め決定された量の複数の第２ｓｂｐ
成分の２種またはそれ以上を含む。第２　ｓｂｐ成分は
各々アナライトの１つおよび対応する第１　ｓｂｐ成分
と結合し得る。予定量の１種またはそれ以上のアナライ
トが存在する場合、類似第１　ｓｂｐ成分は予め定めら
れた部位に移動する。この装置は、これと結合された予
め定められた部位でのみ１種またはそれ以上の第１　ｓ
ｂｐ成分を検出し得る手段を含み得る。

この方法では、予め定められた部位から離れた吸収性材
料片の接触部分と前記試験溶液を接触させると、試験溶
液は毛管移動によって吸収性材料に浸透する。少な（と
も試験溶液の一部を吸収性材料に浸透させる。予め定め
られた部位を第１ｓｂｐ成分の存在について検査するが
、これは通常検出可能なシグナルの存在により示される
。前記シグナルは直接検出され得るか、または予め定め
られた部位を第１　ｓｂｐ成分と相互作用し得るシグナ
ル発生手段に曝して検出可能なシグナルを発生させるこ
とができる。予め定められた部位にシグナルが存在する
ということは、試験溶液中に１個またはそれ以上のアナ
ライトが存在することを示す。

この発明の方法および装置は、使用法が簡単で単一試験
溶液中の複数のアナライトに適用され得るため有利なも
のである。試験溶液中の１種またはそれ以上のアナライ
トの存否は、単−吸収性材料片並びに適当な第１および
第２ｓｂｐ成分を用いることにより容易に行うことがで
きる。

〔実施態様の記載〕

前述したように、この発明は、１８ｉまたはそれ以上の
アナライトの含有が疑われる試料中における予め決定さ
れた最少検出可能量の複数のアナライトの１種またはそ
れ以上の存否を測定する方法および装置に関する。水性
媒質中で試料および予め決定された量の、各々アナライ
トの１つに類似した少なくとも２種またはそれ以上の第
１　ｓｂｐ成分、通常アナライトの１つと標識のコンツ
ユゲートを合わせることにより、試験溶液を調製する。

毛管移動によってこの試験溶液を少なくとも一方向に浸
透させ得る吸収性材料の一部分、ずなわち「接触部分」
、普通は片、通常ストリップの端部を試験溶液と接触さ
せる。吸収性材料は、各々アナライトの１つおよび対応
する第１　ｓｂｐ成分と結合し得る、予め決定された量
の、少なくとも２種またはそれ以上の第２　ｓｂｐ成分
を含む。第２ｓｂｐ成分を少なくとも吸収性材料の接触
部分および接触部分から離れた予め定められた部位間に
実質的に均一および非拡散結合させることにより、予定
量の１種またはそれ以上のアナライトが存在する場合の
み、第１　ｓｂｐ成分は予め定められた部位に移動する
。少なくとも試験溶液の一部を毛管移動によって吸収性
材料に浸透させる。次に、予め定められた部位に結合し
た第１ｓｂｐ成分があればこれが検出される。例えば第
１ｓｂｐ成分を放射性標識で標識すると直接検出され得
るが、また予め定められた部位を光線、熱または標識と
相互作用し得る化学試薬のようなシグナル発生手段に曝
して試験溶液中の１種またはそれ以上のアナライトの量
に応じたシグナルを発生させることにより検出すること
もできる。次いで予め定められた部位で発生したシグナ
ルを検出する。この装置は、これと結合した、予め定め
られた部位でのみ第１　ｓｂｐ成分を検出し得る手段を
有し得る。試料中に１種またはそれ以上のアナライトが
存在する場合、１種またはそれ以上の第１　ｓｂｐ成分
は予め定められた部位に移動する。シグナル発生手段は
第１　ｓｂｐ成分との反応性を示し、１種またはそれ以
上のアナライトが試料中に存在する場合に予め定められ
た部位で検出可能なシグナルを発生させるのに必要な試
薬を含む。

この発明の実施態様の記載をさらに進める曲に、幾つか
の用語を定義する。

アナライト（分析質）・・・抗体に特異的に結合し得る
測定すべき化合物または組成物、通常は抗原または薬剤
。

抗原性および薬剤アナライトの正確な性質および多数の
例は、共にリドマン等による米国特許第４２９９９１６
号、特に１６〜２３欄および米国特許第４２７５１４９
号１７および１８欄に開示されており、それらの記述を
引用して説明の一部とする。

アナライトは、単一結合部位（１価）または複数結合部
位（多価）を有することを特徴とする。通常多価アナラ
イトは、ポリ（アミノ酸）、すなわちポリペプチド類お
よび蛋白質、多糖類、核酸およびそれらの組合わせであ
る。そのような組合わせまたは集合体には、細菌、ウィ
ルス、染色体、遺伝子、ミトコンドリア、核、細胞膜等
がある。

類似構造特性を有する蛋白質、特定の生物機能を有する
蛋白質、特定の微生物、特に病因となる微生物に関連す
る蛋白質等の種類について広範な種類の蛋白質が考えら
れ得る。

モノエピトープリガンドアナライトは、一般に約１００
〜２０００の分子量、さらに普通は１２５〜１０００の
分子量を有する。興味の対象であるアナライトには、薬
剤、中間代謝物、農薬、汚染物質等がある。興味ある薬
剤にはアルカロイド類が含まれる。アルカロイド類には
、モルヒネアルカロイド類、例えばモルヒネ、コディン
、ヘロイン、デキストロメトルファン、それらの誘導体
および中間代謝物、コカインアルカロイド類、例えばコ
カインおよびペンゾイルエクゴニン、それらの誘導体お
よび中間代謝物、麦角アルカロイド類、例えばリゼルギ
ン酸ジエチルアミド、ステロイドアルカロイド類、イミ
ナゾイルアルカロイド類、キナゾリンアルカロイド類、
イソキノリンアルカロイド類、キノリンアルカロイド類
、例えばキニンおよびキニジン、ジテルペンアルカロイ
ド類、それらの誘導体および中間代謝物がある。

次群の薬剤には、ステロイド類、例えばエストロゲン、
アンドロゲン、副腎皮質ステロイド類、胆汁酸、強心性
グリコシド類およびアグリコン類、例えばジゴキシンお
よびジゴキシゲニン、サポニンおよびサボゲニン、それ
らの誘導体および中間代謝物がある。またステロイド擬
似物質例えばジエヂルスチルベストールも含まれる。

次群の薬剤には、５〜６員環を有するラクタム類、例え
ばパルピッエート類、例えばフエノバルビタールおよび
セコバルビクール、ジフェニルヒダントニン、プリミド
ン、エトスクシミドおよびそれらの中間代謝物がある。

次群の薬剤には、２〜３ｇの炭素原子を有するアルキル
を有するアミノアルキルベンゼン類、例えばアンフェタ
ミン類、カテコールアミン類、例えばエフェドリン、Ｌ
−ドーパ、エピネフリン、ナルセイン、パパベリンおよ
びそれらの中間代謝物がある。

次群の薬剤には、ベンゼン複素環類、例えばオキサゼパ
ム、クロロプロマシン、テグレトール、イミブラミン、
それらの誘導体および中間代謝物があり、複素環はアゼ
ピン、ジアゼピンおよびフェノチアジンである。

次群の薬剤には、プリン類、例えばテオフィリン、カフ
ェイン、それらの中間代謝物および誘導体がある。

次群の薬剤には、マリファナ由来の物質、例えばカンナ
ビノールおよびテトラヒドロカンナビノールがある。

次群の薬剤には、ビタミン類、例えばＡＳＢ。

例えばＢ　ｌｔｑ　ｃＳＤ、　Ｅおよびに２葉酸および
チアミンがある。

次群の薬剤にはプロスタグランジンがあり、これらはヒ
ドロキシル化および不飽和の程度および部位により区別
される。

次群の薬剤には、抗生物質、例えばペニシリン、クロロ
マイセチン、アクチノマイセチン、テトラサイクリン、
テラマイシン、それらの中間代謝物および誘導体がある
。

次群の薬剤には、ヌクレオシドおよびヌクレオチド、例
えばＡＴＰｌＮＡＤ、ＦＭＮ、アデノシン、グアノシン
、チミジンおよびシチジンがあり、これらは適当な糖お
よびホスフェート置換基を有する。

次群の薬剤には、種々雑多な個々の薬剤、例えばメタト
ン、メブロバメート、セロトニン、メペリジン、アミト
リブチリン、ノルトリブチリン、リドカイン、ブロカイ
ンアミド、アセチルプロカインアミド、プロプラノロー
ル、グリセオフルビン、パルプロ酸、ブチロフェノン類
、抗ヒスタミン剤、抗コリン作用薬、例えばアトロビン
、それらの中間代謝物および誘導体がある。

疾患状態に関連した中間代謝物には、スペルミン、ガラ
クトース、フェニルピルビン酸およびポルフィリン１型
がある。

次群の薬剤には、アミノグリコシド類、例えばゲンタマ
イシン、カナマイシン、トブラマイシンおよびアミカシ
ンがある。

興味ある農薬には、ポリハロゲン化ビフェニール類、燐
酸エステル類、チオポスフェート類、カーバメート類、
ポリハロゲン化スルフェンアミド類、それらの中間代謝
物および誘導体がある。

レセプターアナライトの場合、分子量は一般にｔ　ｏｏ
ｏｏ〜２ＸＩＯ８、さらに普通は１００００〜１０８の
範囲である。免疫グロブリン類、ＩｇＡ、ＩｇＧＳ　Ｉ
ｇＥおよびＩｇＭの場合、分子量は一般に約１６０００
０〜約ＩＯ８の範囲である。

酵素は普通的１００００〜＋００００００の範囲の分子
量を存する。天然レセプターの場合は広範に変化するが
、一般に少なくとも約２５０００の分子量を有し、１０
Ｂまたはそれ以上の分子量もあり得、例としてはアビジ
ン、ＤＮＡ、ＲＮＡ。

チロキシン結合グロブリン、チロキシン結合プレアルブ
ミン、トランスコルチン等がある。

特異的結合対の成分（「ｓｂｐ成分」）・・・２種の相
異なる分子の一員であって、他方の分子の特定の空間的
および極性構成と特異的に結合するためそれに相補的で
あると定義される領域を表面または空洞部に有する分子
。特異的結合対の成分とはリガンドおよびレセプター（
アンチリガンド）を指す。

これらは普通免疫対、例えば抗原−抗体の成分であり、
他の特異的結合対、例えばビオチン−アビジンホルモン
−ホルモンレセプター、核酸二重らせん、ＩｇＧ−蛋白
質Ａ、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ等も免疫対では
ないがこの定義に含まれる。

リガンド・・・これに対するレセプターが天然に存在す
るかまたは製造され得る有機化合物。

レセプター（アンチリガンド）・・・分子の特定の空間
的および極性構成、例えばエピトープまたは決定部位を
認識し得る化合物または組成物。レセプターの例には、
天然レセプター、例えばチロキシン結合グロブリン、抗
体、酵素、Ｆａｂ断片、レクチン、核酸、蛋白質Ａ、補
体成分Ｃ１ｑ等がある。

標識ｓｂｐ成分・・・第１　ｓｂｐ成分に結合した、一
般に電気化学的検出または電磁放射線の吸収もしくは放
射が可能な標識、触媒、多くの場合酵素。標識ｓｂｐ成
分はシグナル発生系の一員であり、アッセイの特定のプ
ロトコルに従って第１　ｓｂｐ成分を選択して第２　ｓ
ｂｐ成分に結合させる。

抗体・・・他方の分子の特定の空間的および極性構成と
特異的に結合するためそれに相補的であると定義される
領域を表面または空洞部に有する免疫グロブリンまたは
その誘導体もしくはフラグメント。抗体はモノクローナ
ルまたはポリクローナルであり得、当業界でよく知られ
た技術、例えば宿主の免疫化および血清の採取またはハ
イブリッドセルライン技術により製造され得る。

アナライトの抗体・・・アナライトに特異的な抗体。

第１　ｓｂｐ成分・・・第２　ｓｂｐ成分、通常レセプ
ターまたは抗体との結合に関して類似アナライトと競合
し得る修飾アナライトまたはアナライト類似体もしくは
代用物であって、修飾により標識とアナライト類似体を
連結して標識ｓｂｐ成分を提供する手段が得られる。ア
ナライト類似体は、普通ハブまたは標識にアナライト類
似体を連結する結合による１個の水素の置換以上の点で
アナライトとは異なるが、必ずしも断言はできない。ア
ナライト代用物の語は、アナライトの抗体との結合能力
を有する化合物を指す。すなわち、アナライト代用物は
、アナライトに対すると同様にアナライトの抗体に結合
し得る。他方、代用物は例えばアナライトの抗体のイデ
ィオタイプに対する抗体であり得る。

第２　ｓｂｐ成分・・・アナライトおよび第１ｓｂｐ成
分に結合し得るｓｂｐ成分。第２　ｓｂｐ成分はアナラ
イトの決定部位および第１　ｓｂｐ成分の決定部位に結
合し得る。好ましい第２　ｓｂｐ成分は抗体である。

吸収性材料・・・少なくとも０．１μ、好ましくは少な
くとも１．０μの孔を何する多孔質材料であり、毛管作
用に応じて水性媒質を浸透させ得る。

かかる材料は一般に親水性であるか、または親水性とな
り得、例としては、無機質粉末、例えばシリカ、硫酸マ
グネシウムおよびアルミナ、天然ポリマー性材料、特に
セルロース性材料およびセルロース由来の材料、例えば
繊維を含む紙、例えば濾紙、クロマトグラフィー用紙等
、合成または修飾された天然ポリマー、例えばニトロセ
ルロース、酢酸セルロース、ポリ（塩化ビニル）、ポリ
アクリルアミド、架橋デキストラン、アガロース、ポリ
アクリレート等があり、単独または他の材料、セラミッ
ク材料等と組み合わせて使用される。吸収性材料は支持
体に付着され得る。他方、吸収性材料はそれ自体の支持
体を提供し得る。吸収性材料は、多官能性であるかまた
は多官能性化されることにより、レセプターまたは抗体
の共有結合を可能にし、またシグナル発生系の一部を形
成する他の化合物の結合を可能にし得る。

吸収性材料とレセプターおよび抗体の結合は、文献にお
いて一般に使用され得る公知技術により達成され得る。

例えば、「インモビライズド・エンザイムズＪ（［ｍｌ
ｌ１ｏｂｉｌｉｚｅｄ　　Ｅｎｚｙｍｅｓ）、チバタイ
チロウ、ハルステッド・プレス、ニューヨーク（１９７
８年）およびクアトレカサス、「ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリーＪ（Ｊ、　Ｂｉｏ。

Ｃｈｅｍ、）、２４５＋３０５９（１９７０年）参照。

吸収性材料片は、単一構造、例えばストリップに切断さ
れたシートであり得るか、または幾つかのストリップま
たは例えば薄層クロマトグラフィーで見られるように支
持体もしくは固体表面に結合した粒状材料であり得、完
全な部分としてまたは液体接触部に吸収性パッドを有し
得る。また吸収性材料片は、表面にレーンを有するシー
トであり得、またはスポットすることによりレーンが形
成され得るが、各々のレーンにおいて独立した測定を行
うことができる。吸収性材料片は、毛管現象による試験
溶液の浸透方向が少なくとも１つは存在する場合、直角
四辺形、円形、長円形、（ｔｒｉａｇｏｎａｌ）または
他の形状を呈し得る。他の浸透方向は、例えば長円形ま
たは円形片が試験溶液と中央部で接触した場合に生じ得
る。しか１．なから、主として予め定められた部位への
少なくとも１方向の流れが存在するものとする。以下の
記述において、吸収性材料のストリップを具体的に説明
するが、限定するわけではない。

支持体が望ましいかまたは必要な場合、吸収性材料の支
持体は、通常水に不溶性で、非多孔質で堅く、また通常
吸収性ストリップと同じ長さおよび幅を有するが、大き
いかまたは小さい場合もあり得る。支持体がストリップ
の毛管現象を妨げたり、検定成分と非特異結合したり、
シグナル発生系を妨げたりしない限り、天然および合成
材料を含む広範な種類の有機および無機材料およびそれ
らの組合わせを使用することができる。ポリマーの例と
しては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メ
チルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポ
リ（エチレンテレフタレート）、ナイロン、ポリ（ビニ
ルブチレート）、ガラス、セラミック、金属等がある。

吸収性パッドは、親水性吸収性材料、例えば紙、スポン
ジ、フェルト、多孔質ポリマー等であり得る。

標識・・・標識は、シグナル発生に必要とされる第１ｓ
ｂｐ成分に結合した分子であり得る。本発明において、
標識は、不活性であり、単にシグナル発生手段の一員の
結合部位としての役割を果たし得るか、または自発的に
検出可能なシグナルを発生し得るか、またはシグナル発
生手段と協働して検出可能なシグナルを発生し得る。標
識は、同位体または非同位体、好ましくは非同位体であ
り得る。

しかしながら、写真フィルムによるラジオオートグラフ
ィー検査を行う場合、高感度の達成に同位体標識が好ま
れることもあり得る。

シグナル発生手段・・・標識と相互作用して検出可能な
シグナルを発生し得る手段。そのような手段には、例え
ば電磁放射線、熱、化学試薬等がある。

化学試薬を用いる場合、幾つかの化学試薬を顕色液の一
部として含ませることができる。化学試薬には、基質、
補酵素、促進剤、第２酵素、活性剤、コファクター、阻
害剤、スカベンジャー、金属イオン、シグナル発生物質
の結合に必要な特異的結合物質等が含まれ得る。幾つか
の化学試薬、例えば補酵素、酵素生成物、他の酵素およ
び触媒と反応する物質等を吸収性材料に結合させること
もできる。

シグナル発生系・・・シグナル発生系は１種またはそれ
以上の成分を含み得、少なくともｌ成分は標識ｓｂｐ成
分である。シグナル発生系は、標識と相互作用してシグ
ナルを発生させ得るシグナル発生手段を含めて測定可能
なシグナルを発生させるのに必要な試薬をすべて含む。

シグナル発生系は、外的手段、通常電磁放射線の測定、
望ましくは可視的試験により検出され得るシグナルを発
生する。殆どの場合、シグナル発生系は発色性基質およ
び酵素を含み、発色性基質は紫外線または可視光線、燐
光体または蛍光剤の光線を吸収する色素に酵素変換され
る。

シグナル発生系は、標識として少なくとも１種の触媒、
通常少なくとも１種の酵素および少なくとも１種の基質
を含み得、２種またはそれ以上の触媒および複数の基質
を含み得、また一方の酵素の基質が他方の酵素の生成物
である関係の酵素の組合わせを含み得る。シグナル発生
系の作用は、予め定められた部位における標識の存在に
応じて、予め定められた部位に検出可能なシグナルを提
供する生成物を生産することである。

２種の触媒として酵素および非酵素触媒の組合わせまた
は２種の酵素が使用され得るが、２種の触媒は一方の生
成物が他方の基質であるという関係にある。この系では
、触媒により触媒された連続変化を受は得る基質だけが
必要であり、その結果検出可能なシグナルの発生に係る
化合物が得られる。しかしながら、殆どの場合、普通連
続変化における第１酵素の基質および第２化合物が存在
し、後者がシグナル発生に係る化合物の前駆体としての
役割を果たし、通常シグナルを発生する化合物を提供す
る。すなわち、第１酵素の生成物はシグナルを発生する
化合物の前駆体と反応してシグナルを発生する化合物を
生成し得る。

２種の酵素を使用する場合、関与する反応は、殆どの場
合加水分解またはレドックス反応である。

加水分解の場合、加水分解的に不安定な結合を有する誘
導体化色素前駆体、加水分解酵素および放出された色素
前駆体に触媒して色素変換生成物をもたらす酵素は、こ
のタイプの系の一例である。

レドックス反応では、第１酵素は第２酵素に必要な必須
酸化基質を生成し得、第２酵素は酸化基質および色素前
駆体間の反応を触媒する。

２種の酵素を用いる場合、第１酵素反応は加水分解開裂
または基質のレドックス反応を含み得、その結果他方の
酵素の基質である生成物が得られる。第１の状況の例と
して、グルコース−６−ホスフェートをアルカリホスフ
ァターゼによる触媒加水分解によりグルコースを得る反
応を挙げることができ、この場合グルコースはグルコー
スオキシダーゼの基質である。第２の状況の例として、
グルコースをグルコースオキシダーゼにより酸化して過
酸化水素を得、これが白色色素と酵素反応することによ
りシグナル発生物質を生成する場合を挙げることができ
る。

また２種の触媒として酵素および非酵素触媒も使用され
得る。酵素が非酵素触媒により触媒された反応をうける
反応体を生成し得るか、または非酵素触媒が酵素の基質
（補酵素を含む）を生成し得る。広範な種類の使用可能
な非酵素触媒が米国特許第４１６０６４５号（１９７９
年７月ｌＯ日付）に記載されており、適当な部分を引用
して説明の一部とする。

多様な組合わせの酵素を用いてシグナル発生化合物を生
成することができる。特に、ヒドロラーゼの組合わせを
用いて不溶性シグナル発生物質を生成することができる
。別法として、ヒドロラーゼおよびオキシドレダクター
ゼの組合わせによりシグナル発生化合物を生成すること
ができる。また、オキシドレダクターゼの組合わせを用
いて不溶性シグナル発生化合物を生成することができる
。

酵素の組合わせの場合、一方の酵素は吸収性材料と非拡
散結合し得、他方の酵素はアナライトにコンジュゲート
した標識である。さらに、選択された特定のシグナル発
生系または後の特定のプロトコルにより異なるが、１種
またはそれ以上のシグナル発生系の他の成分を吸収性材
料に結合さ仕ることかできる。

検出可能なシグナルを得るためには、予め定められた部
位における標識の存在により発生するシグナルを増幅す
る手段を供給するのが望ましい。

したがって、標識としては、通常触媒または発光性化合
物または放射性同位元素が好ましく、最も好ましくは触
媒である。好ましくは、触媒は、単一標識から多数のシ
グナル発生分子を生成し得る酵素および補酵素である。

生成物を生産することにより所望の増幅をもたらす酵素
または補酵素が使用され、光線を吸収する物質、例えば
色素、または照射すると光線を発する物質、例えば蛍光
剤がある。別法として、触媒反応を直接発光例えば化学
発光に導くこともできる。前記生成物を供給する多数の
酵素および補酵素が、米国特許第４２７５１４９号１９
〜２３欄および米国特許第４３１８９８０号、１０〜１
４欄に記載されており、それらの記載を引用して説明の
一部とする。

幾つかの酵素の組合わせが米国特許第４２７５１４９号
２３〜２８欄に記載されており、これらはこの発明に適
用され得る。この記載を引用して説明の一部とする。

特に興味深いのは、過酸化水素の生成および過酸化水素
を用いた色素前駆体酸化による色素の生成に関与する酵
素である。特定の組合わせには、サツカリドオキシダー
ゼ類、例、グルコースおよびガラクトースオキンダーゼ
、または曳索環オキシダーゼ類、例えばウリカーゼおよ
びキザンチンオキシダーゼを、過酸化水素を用いて色素
的躯体を酸化する酵素、すなわちペルオキシダーゼ例え
ば西洋ワサビペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダー
ゼまたはミクロペルオキシダーゼと組合わせたものがあ
る。さらに別の酵素の組合わせも説明の一部として引用
された内容中に記載されている。単一酵素を標識として
用いる場合、他の酵素、例えばヒドロラーゼ類、トラン
スフェラーゼ類およびオキシドレダクターゼ類、好まし
くはヒドロラーゼ類例えばアルカリホスファターゼおよ
びβ−ガラクトシダーゼも使用され得る。別法として、
ルシフェラーゼ類、例えばほたるルシフエラーゼおよび
細菌性ルシフエラーゼを使用することができる。

使用され得る補酵素の例には、ＮＡＤ［Ｈ］、ＮＡＤＰ
［Ｈ］、ビリドキサル燐酸、ＦＡＤ［Ｉ−ｒ］、ＦＭＮ
［Ｈ］等があり、通常補酵素は閉環反応に関与する。特
に米国特許第４３１８９８０号参照。

酵素反応の生成物は普通色素または蛍光剤である。蛍光
剤の多数の例が米国特許第４２７５１４９号３０および
３１欄に記載されており、その記載を引用して説明の一
部とする。

補助物質・・・この発明によるアッセイでは多様な補助
物質を用いることが多い。例えば、アッセイ媒質には通
常緩衝剤および安定剤が存在する。これらの添加剤に加
えて、多くの場合、追加の蛋白質、例えばアルブミン類
または界面活性剤、特に非イオン性界面活性剤、結合促
進剤、例えばポリアルキレングリコール類等が含まれ得
る。

予め定められた部位でのみ１種またはそれ以上の第１　
ｓｂｐ成分の検出を可能にする、吸収性材料と結合した
手段・・・予め定められた部位以外に１種またはそれ以
上の第１　ｓｂｐ成分を結合させ得る吸収性材料の部分
を隠す封入物の形をとり得る手段。

通常、吸収性材料における接触部分および予め定められ
た部位間の部分は封入物により隠されている。前記封入
物は、吸収性材料を包囲し、予め定められた部位が見え
る開口部または窓を宵し得る。

封入物は、不活性材料、例えばプラスチック、ガラス等
、好ましくはプラスデックにより製作され得る。封入物
の寸法は吸収性材料の寸法により決定される。開口部の
サイズもまた、シグナルが存在するか否かを正確に観察
できる程度に予め定められた部位の充分な面積が見える
ことを第１に考慮した上で吸収性材料の寸法により決定
される。

一般に開口部は、予め定められた部位の配置に対応する
吸収性材料の面に沿って位置する。封入物もまた吸収性
材料片の接触部分またはその付近に開口部を有し、そこ
から試験溶液および他の液体試薬を導入する。

別の聾様において、前記手段は、アッセイを実施する場
合に第１　ｓｂｐ成分と接触し得る予め定められた部位
以外の部位で吸収性材料と結合したシグナル阻害物質で
あり得る。その結果、シグナルは単に予め定められた部
位で生成され、検出される。シグナル阻害物質は使用さ
れたシグナル発生手段に基づいて選択される。シグナル
阻害物質は、シグナル発生手段と相互作用してシグナル
生成をある期間遅らせたり完全にシグナル生成を阻害す
ることかできる。例えば、標識として触媒例えば酵素を
用いる場合、シグナル阻害物質は、前記触媒の別の基質
または触媒生成物および基質と反応する化合物であり得
る。アスコルビン酸またはその塩らしくはエステルが、
ペルオキシダーゼ酵素のシグナル阻害物質として使用さ
れ得る。シグナル阻害物質の他の例には、フェリシアン
化物、尿酸、ヒドロキノン、グルタチオン、ジチオトレ
イトール、亜硫酸ナトリウム等がある。シグナル阻害物
質の量は、アッセイで使用される対応するシグナル発生
系成分の量により決定される。一般に、シグナル阻害物
質の爪は、予め定められた部位でシグナルを検出するの
に充分な期間予め定められた部位以外におけるシグナル
発生を阻害するのに充分な量である。

この発明の方法では、各々試料中に存在する疑いのある
アナライトの１つに類似した少なくとも２Ｎの第１ｓｂ
ｐ成分を水性媒質中で試料と合わせることにより、水性
試験溶液を調製する。第１に、試料および第１ｓｂｐ成
分を含む試験溶液をストリップの接触部分と接触させ、
毛管移動によりストリップに浸透させることを考慮すべ
きである。この浸透は上向き、下向き、水平またはそれ
らの組合わせであり得る。第１ｓｂｐ成分の１個が予め
定められた部位に移動したか否かは、試料中の予め決定
された最少検出可能量を越える量の対応するアナライト
の存在と関連している。

ストリップを試験溶液と接触させ、毛管移動をさせた後
、ストリップをシグナル発生手段に曝す。

標識およびシグナル発生手段により異なるが、曝す方法
には、照射、加熱または化学薬剤との接触が挙げられ得
る。後者の場合、少なくとも予め定められた部位と化学
薬剤を含む顕色液を接触させる。１個またはそれ以上の
第１　ｓｂｐ成分が予め定められた部位に存在する場合
、シグナル発生系は検出可能なシグナルを提供する。

試験溶液および／または顕色液の溶媒は通常水系媒質で
あり、約４０重量％以下の他の極性溶媒、特に１〜６個
の炭素原子、さらに普通は１〜４個の炭素原子を有する
酸素化溶媒、例えばアルコール類、エーテル類等であり
得る。通常、約２０重量％未満の割合で共溶媒が存在す
る。試料の性質によりある程度状況は異なるが、試料自
体が水性媒質の一部または全部を占め得る。

媒質のｐ）（は、通常４−１１．さらに普通は５−１０
の範囲および好ましくは約６−９の範囲である。結合成
分の結合親和力を有する重要な部位およびシグナル発生
系によるシグナルの最適な発生を維持できるようにｐＨ
を選択する。様々な緩衝液を用いて所望のｐＨを達成し
、アッセイの間そのＩ）Ｈを維持することができる。例
えば、はう酸緩衝液、燐酸緩衝液、トリス緩衝液、バル
ビツール等がある。使用する特定の緩衝液は厳密ではな
いが、個々のアッセイにおいて、ある緩衝液の方が別の
緩衝液よりも好ましいことはあり得る。

望ましくは、約０，０５〜０．５重量％の非イオン性デ
タージェントを試料中に含ませる。約２゜Ｏ〜２０００
０ダルトンの様々なポリオキシアルキレン化合物が使用
され得る。

アッセイを実施する場合、通常中程度および望ましくは
実質的に一定の温度を用いる。アッセイおよび検出可能
なシグナルの製造温度は、一般に約４°−５０℃の範囲
、さらに普通は約１０°−４０℃の範囲であり、周囲温
度、すなわち約１５°　−２５℃であることが多い。

測定され得るアナライトの水性試験溶液中における濃度
は、一般に約１０−’〜約ＩＱｊ５モル、さらに普通は
約１Ｏ−８〜１０−”モルの範囲である。問題のアナラ
イトの濃度およびプロトコル等を考慮して通常能の試薬
の濃度を決定する。

試料および試薬溶液中の様々な試薬の濃度は一般にアカ
ライトの関心の対象となる濃度範囲により決定されるが
、各試薬の最終濃度は、普通対象範囲外で測定感度を最
適化するよう経験的に決定される。ある種のプロトコル
の場合、個々の試薬は、測定感度に有害な影響を与えな
ければ実質的過剰量で使用され得る。

ストリップのサイズについては幾つか考慮すべき点があ
る。第１に考慮すべき点は、１種またはそれ以上のアナ
ライトが試験溶液中に存在し、高感度で正確な測定を達
成するに充分なシグナルが発生する場合、充分な量の１
種またはそれ以上の第１　ｓｂｐ成分を予め定められた
部位に移動させることである。毛管の流れが主に上向き
である場合、ストリップの長さおよび厚さによりストリ
ップに沿って通過し得る溶液の量が左右される。大皿の
試・験溶液の移動が望ましい場合、予め定められた部位
の上方のストリップの流体吸収力は、所望の容量に適う
程度に充分でなければならない。ストリップを用いて主
に下向きの流れを与えることにより試験溶液を吸収する
場合、この容量条件は要求されない。さらに、吸収性材
料を試験溶液との接触に使用されていないストリップの
端部と接触させる場合もまた、容量に関する必要条件は
除外される。一般に、上向きの流れのストリップの場合
、流体保持容量は、通常２０μｇより大きく、好ましく
は少なくとも５０−２００μＱである。

下向きの流れのストリップの場合、２−２０μＱの低い
保持容量でも使用され得るが、２０−２００μＱの容量
が好ましい。

ストリップの厚さは厳密ではないが、通常０゜１−２ｍ
ｍ、普通は０．１５−１ｕｊ＋、好ましくは０゜２−０
．７ｓｍである。一般的に、最少限の厚さは材料の強さ
および容易に検出可能なシグナルを生産する必要性によ
り決定されるが、最大幅は操作の便利さおよび試薬の費
用により決定される。

試薬の保存を可能にし、限られたサイズの試料を提供す
るためには、・ストリップの幅は一般的に比較的狭く、
通常２０次ｎ未満、好ましくはＩＯ隷未満である。一般
的に、ストリップの幅は約１．０■未満ではなく、普通
約２ｎ〜１２■ｍ１好ましくは約４ｕ〜８Ｈの範囲であ
る。

ストリップの横断面の寸法については、矩形に関して前
記事項で記載したが、これは説明を目的とするもので限
定ではない。前述のように、他の横断面の形状、例えば
円形、三角形（ｔｒｉａｇｏｎａｌ）、長円形等の場合
も等しくこの発明の範囲内に含まれる。それらの寸法は
、この明細書を参考として当技術分野の熟練者により測
定され得る。

ストリップの長さは、１！またはそれ以上のアナライト
の濃度および実用上考慮すべきこと、例えば操作の容易
さにより異なり、約ｌＧｍ〜４０ｃｍ、普通約２ｃ肩〜
２５ｃｉ、好ましくは約４〜２０ｃｍであるが、実用的
な長さであればよい。ストリップの構造は多様であり得
、微細、中程度に微細、並、中程度に粗大および粗大な
ものを含む。一般に、孔のサイズが小さく材料が微細で
あると、毛管の流れは遅くなりストリップ上の結合コン
ジュゲートの捕獲は効果的となる。当然材料が高多孔質
であると、流れは速くなるが、捕獲の効率は低下する。

材料の多孔性は所定のアッセイにおける成分の結合割合
に従い選択される。

予め定められた部位の位置は、この発明に係る基礎原理
により決定される。接触部分からの最少距離は、その間
の吸収性材料が第２　ｓｂｐ成分と非拡散結合する能力
により決定される。すなわち、結合されなければならな
い各ｓｂｐ成分の最少量は、予め測定された最少検出可
能アナライト量と等しい。アナライトが存在しない場合
、第１ｓｂｐ成分は接触部分からある程度距離をおいた
ストリップの部分で第２ｓｂｐ成分に結合する。アナラ
イトが存在する場合この距離は増すため、明らかに、予
め定められる部位の位置は、不正確な（偽の）陽性測定
結果を避けるために接触端部からさらに距離をあけなけ
ればならない。非常に高感度の検出が要求される場合、
さらに僅かだけ距離をあけて部位を定めるのが望ましい
場合もあり得る。感度が厳密ではない場合、ストリップ
の接触部分と反対のストリップ端部の近くに部位を定め
るのが望ましい。望ましくは、部位をストリップの接触
部分から少なくともＩＯ＋ｕ、好ましくは少なくとも３
０収の部分に定めるべきである。試験溶液が毛管作用に
よって前記部位を通過して未結合筆１　ｓｂｐ成分を捕
らえることができれば、端部との距離をさらに広げるこ
ともあり得る。こうして、部位を前記端部から「離して
」定める。

シグナル発生系の成分である他の試薬の濃度は、特定の
プロトコルおよびシグナル発生におけるそれらの役割に
より大きく変化し得る。第１および第２　ｓｂｐ成分の
量は、試験溶液中に存在するアナライトの予め測定され
た最少検出可能量および予め定められた部位の位置に基
づいて選択される。

通常、試験溶液中の各第１　ｓｂｐ成分の濃度は、試験
溶液が予め測定された最少検出可能量のアナライトを含
有する結果、試験溶液中の対応するアナライトの濃度を
越えることはない。好ましくは第１ｓｂｐ成分の濃度は
対応するアナライト濃度より５〜２０倍低い。一般に、
アナライトが全く存在しない場合に、予め定められた部
位に移動する第１　ｓｂｐ成分が皆無となるように第１
　ｓｂｐ成分の１４を還ぶ。

第２ｓｂｐ成分は実質的に均一にストリップに結合する
。接触部分および予め定められた部位間に結合した各第
２　ｓｂｐ成分の量は、アナライトの予め測定された最
少検出可能量プラス試験溶液中の対応する第１５ｂｌ）
成分の量と大体等しい。従って、前記部位を接触部分か
ら遠くへ動かすことが望ましい場合、ストリップの各第
２ｓｂｐ成分の密度を減らすだけでよい。逆に、ストリ
ップ上の第２ｓｂｐ成分の密度を増やすことにより前記
部位を接触部分の近くへ移動させることができる。

測定を実施するとき、通常プロトコルには水性媒質中に
アナライトの含有が疑われる試料と対応する第１　ｓｂ
ｐ成分を合わせて水性試験溶液を生成することが含まれ
る。試料は、多様な供給源例えば生理的液体、例えば唾
液、血液、血清、血漿、尿、水晶体液、髄液等、食物、
例えばミルクおよびワイン、化学処理流体、食物廃液等
に由来するものであり得る。

通常接触部分を試験溶液中に浸すことにより、ストリッ
プの接触部分、通常端部を試験溶液と接触させる。しか
しながら、吸収性（オ料と試験溶液との接触は、他の技
術、例えば吸収性材料片に試験溶液を滴下することによ
り行うことができる。

この技術は円形、長円形、シート状等の吸収性材料片に
対して特に適している。毛管作用によりストリップを湿
らす場合は、普通少なくとも前記部位が湿るまで続けら
れる。普通、ストリップの大部分を試験溶液で湿らす。

殆どの場合、比較的短時間で試験溶液をストリップに浸
透させることができる。通常、試験溶液がストリップに
浸透する所要時間′は、少なくとも３０秒かつ１時間以
内、普通は約１分〜３０分である。シグナル発生手段に
酵素を用いる場合、一般にシグナル発生の所要時間は３
０秒〜３０分、普通は約３０秒〜５分の範囲である。

液体がストリップに浸透した後、検出可能なシグナルの
存在について予め定められた部位を検査する。シグナル
が放射性標識等の結果である場合、直接シグナルを検出
することができる。化学薬剤が標識を含むシグナル発生
手段の一部を形成する場合、ストリップの接触部分を顕
色液に浸すことにより、ストリップに沿って予め定めら
れた部位まで毛管作用で移動させ得る。別法として、予
め定められた部位を例えばスポツティングにより、顕色
液と直接接触させることができる。

酵素を標識として用いる場合、基質は通常顕色液中に実
質的過剰量で存在するため濃度の制限は生じない（Ｋｍ
より高い濃度）。顕色液は普通酵素系において適度に緩
衝状態を呈している。

前記部位を顕色液と接触させた後、ストリップを顕色液
もしくは試験溶液中に存在しないかまたはストリップ上
に存在するシグナル発生系の残りの成分があればこれと
接触させる。シグナル測定前に充分な時間をおいて必要
量のシグナル発生化合物を生成させる。検出可能なシグ
ナルが発生ずると、試料中のアナライトの少なくとも１
種が予め測定された最少検出可能量またはそれ以上で存
在することが判る。

ストリップを広範な種類の材料で被覆することにより、
強化特性を与えることができる。被覆には蛋白質被覆、
多糖類被覆、合成ポリマー、糖等を挙げることができ、
これらは特にストリップにコンジュゲートした材料の安
定性強化に用いられる。またこれらの化合物を用いて材
料の結合、例えば抗体結合等を改良することができる。

ストリップを反応性官能基で活性化して、例えば米国特
許第４．１６８１４６号に記載されているが（この中の
適切な箇所を引用して説明の一部とする）、共有結合に
より有機材料をストリップにコンジュゲートさせること
ができる。

第２　ｓｂｐ成分、および所望によりシグナル発生系の
成分を共有結合ではなく吸着により結合させることがで
きるが、この結合は非拡散的ではないものとする。この
方法は、材料を含む溶液と吸収性支持体とを接触させて
ストリップと結合さｕ１ストリップを乾燥させることを
必要とする。一般に、この方法は吸収性支持体が比較的
疎水性であるか高い表面電荷を有する場合のみａ用であ
り、蛋白質、デタージエント、多糖類、または非特異的
結合部泣を遮断し得る他の伺ｔ１による後処理が必要と
され得る。

この発明の好ましい態様において、複数の薬剤の１種ま
たはそれ以上を含有する疑いのある試料を１種またはそ
れ以上の薬剤の存在についてスクリーニングすることが
できる。適当な液体媒質中で試料および少なくとも２種
またはそれ以」二の複数の第１　ｓｂｐ成分、例えば各
々薬剤の１つと標識から成るコンジュゲート（ただし、
各コンジュゲートは同一または異なり得る）を−緒に混
合することにより試験溶液を調製する。アッセイの結果
は、例えばスクリーニングアッセイにおいていずれか１
種の薬剤が存在するか否かを示すものであるが、どの薬
剤が存在するかを示すものではない。

例えば、この発明の一態様では、１価の薬剤である２種
のアナライトが存在する。薬剤の含有が疑われる試料を
酵素と各薬剤の１つとの予め測定された量のコンジュゲ
ートと混合して水性試験溶液を生成する。吸収性ストリ
ップには予め測定された量の各薬剤の抗体が均一に結合
している。その結果、接触部分を試験溶液と接触させる
と、試験溶液が予め定められた部位に達する前に予め測
定された最少検出可能量に満たない量の薬剤およびコン
ジュゲートは捕獲される。薬剤が試料中に存在する場合
、薬剤およびコンジュゲートは一緒にストリップに浸透
する。試料中に薬剤が多いとき、コンジュゲートおよび
薬剤は予め定められた部位に向かってさらに移動する。

どちらの薬剤も試料中に存在しない場合、各フンシュゲ
ートは全部薬剤の抗体と結合し、予め定められた部位に
到達する前に捕獲される。予め測定された最少量を越え
た量の薬剤の一方または両方が存在する場合、コンジュ
ゲートの一方または両方は予め定められた部位に移動す
る。酵素基質との接触によるテストストリップの後続の
顕色では、試料中に与えられた１種またはそれ以上の薬
剤の存在は、予め定められた部位におけるシグナルの発
生により示される。

この方法では、毛管作用により試験溶液はストリップの
全体または一部に浸透し得る。試験溶液を予め定められ
た部位を通ってストリップ全体に浸透させる場合、続い
て酵素基質を含む顕色液にストリップを浸すことができ
る。前記態様の変形として、試験溶液の容量をストリッ
プの一部のみに浸透し得る程度の量にすると、ストリッ
プの乾燥部分の液体吸収力を少なくとも接触部分から予
め定められた部位までの部分の液体吸収力と等しくする
ことができる。次にストリップの接触部分を顕色液と接
触させ得る。顕色液は毛管現象によりストリップに沿っ
て移動する。その際、顕色液により試験溶液の残りは予
め定められた部位を通って移動する。１種またはそれ以
上のアナライトが試験溶液中に存在する場合、シグナル
が発生ずる。

便宜上、この発明の装置は、１種または複数のアナライ
トの測定に使用される予め測定された量の試薬をパッケ
ージした組合わせを含むキットとして提供され得る。酵
素が標識として使用される場合、試薬は酵素標識アナラ
イトを含み、顕色液は、酵素の基質または前駆体を含み
、例えばさらに必要な基質、酵素およびコファクター並
びに酵素生成物の反応相手があればそれも含むことによ
り、検出可能な発色団または蛍光団を提供し得る。

さらに、他の添加剤、例えば補助試薬、例えば安定剤、
緩衝剤等も含有され得る。様々な試薬の相対量を広い範
囲で調節することにより、実質的に測定感度を最適化す
る溶液中の試薬濃度を達成することができる。賦形剤を
含めて試薬は、通常凍結乾燥した乾燥粉末として提供さ
れ得、溶解することにより測定の遂行に適した濃度を有
する試薬溶液を調製することができる。

〔実施例〕

以下、実施例によりこの発明をさらに詳しく説明する。

温度は摂氏（℃）である。

実施例１ ＨＲＰのコンジュゲートの製造 反応フラスコ中に８　、１　ｍｇの１−メチル−３−（
３°−カルボキシプロピル）キサンチン、３．８ｚｙの
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、６．７ｍ９
の１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボ
ジイミド（ＥＤＣＩ）および１２５μＱのジメチルホル
ムアミド（Ｄ　Ｍ　Ｆ　）を導入し、混合物を室温で一
夜放置した。

０．１モルの炭酸ナトリウム（ｐＨ９，０）中１−Ｉ　
ＲＰ−オキシアミン（１１９）の１．３ｍＱ試料に上記
で調製したエステルを加えた。このために０．２１７順
のＤＭＦおよび６６μｇの上記エステル調製液を合わせ
、約２時間にわたって８．２５μＱの増量割合で加えた
。加えている量温度を４°に維持し、次いで混合物を４
°で一夜放置した。

次いで反応混合物を標準緩衝液を用いてＧ−２５セフア
デツクス（商標）によるクロマトグラフィーにかけた。

フェノバルビタール、フェニトイン、カルバマゼピンお
よびモルヒネとｌ（ＲＰのコンジュゲートもまた同様の
方法で製造された。

（試薬） ０．１モル燐酸緩衝液、０．２モルＮａＣＱ含有、ｐＨ
７、０ ２、ＯＲｇ／ｍＱうしガンマグロブリン０．１所／Ｉｔ
Ｑグルコースオキンダーゼ００５％トリトンＱＳ１５デ
タージエント（シグマ・ケミカル社、セントルイス、ミ
ズーリ）ＨＲＰ−コンジュゲート、下記の中の１種また
は全部。

０．２５μｇ／ｍＱｌ−ＩＲＰ−テオフィリン０．５０
１ｔｇ／酎１−ｒ　ＲＰ−フェノバルビタール０．１５
μ９／ｚＱＨＵＬＰ−フェニトイン２．００μ９／吋Ｈ
ＲＰ−カルバマゼピン（顕色液） １　、　＋　７９／Ｑ　　Ｎａ１（２Ｐ　Ｏ−０，９０
ｇ／Ｑ　　　　ＮａｔＨＰ　　Ｏ４５０ミリモル　ベー
タＤ−（＋）−グルコース４００　ｕ９／ｍＱ　　４−
りａロー１−ナフト−ル２０μＱ／　ｍＱ　　Ｎ　、　
Ｎ−ジメチルホルムアミド０．０５％トリトンＱＳ−４
４、Ｉ）Ｈ’６　、５（用紙の製造） 溶液 １）浸漬液−ｐＨ９，５ ０，１モル重炭酸ナトリウム緩衝液 ２ｕ／＊Ｑ　　フェニトインに特異的な抗体（またはフ
ェニトイン、フェノバルビタール、テオフィリンおよび
カルバマゼピンの抗体混合物）＋ひつじ免疫グロブリン ２）キャッピング溶液、ｐＨ９，５ ０，３モル　エタノールアミン ０．１５モル　ＨＣｌ２ ３）洗浄溶液 ０．１モル燐酸緩衝液＋０．２モルＮａＣ（２ＳｐＨ７
，０、脱イオン水 ４）保存剤 ０．６％ポリビニルアルコール２０／３０５）手順 カルボニルジイミダゾール活性化ワットマン３ＩＥＴ紙
を浸漬液に浸し、室温で１時間インキュベートした。前
記の紙を室温で一夜キャッピング溶液により処理した。

この紙を燐酸緩衝液で２回および脱イオン水で１回各々
２０分間洗浄した。

前記の紙を約２０分間保存剤に浸すことにより保存した
。この紙をトンネル乾燥４中６５℃で約８分間乾燥した
。

（アッセイプロトコル） １　、　Ｏａｔ（ｌの試験溶液を１６Ｘ１００ｘｍの試
験管に注ぎ、試験アナライト（テオフィリン、フェノバ
ルビタール、フェニトインおよびカルバマゼピン）の１
種または全部を含む１２．０μＣのキャリブレータ−を
加えた。製造された紙の１片（ストリップ）を試験溶液
と一緒に試験管に入れ、室温で１５分間毛管作用により
紙に吸収させた。次いで１ＯＩＩＩＱの顕色液を含む第
２の１６Ｘ１００ｍｍ試験管に前記ストリップを移した
。５分後顧色液からストリップを取り出した。ストリッ
プにおける青色の存在を調べた。

Ａ、単一系・・・試験溶液中に１種のアナライト。

試験溶液はＨＲＰ−フェニトインおよび１２μＱの各フ
ェニトインキャリブレータ−を含んでいた。前記の紙は
フェニトイン特異的抗体のみを含んでいた。

Ｂ、複数系・・・試験溶液中に上記アナライトの全部。

試験溶液は４種のＨＲＰ−アナライトコンジュゲート全
部、および４種のアナライト全部を含有する１２μνの
キャリブレータ−（各々下記第１表に示す濃度）を含ん
でいた。全部の紙は前述の４種の特異的抗体全部を含ん
でいた。

（結果） 第１表 １．５　　　　２３　　　　２３ ７．５　　　　４４　　　　４５ １０．０　　　　４８　　　　４８ ２０．０６０６２ ２５．０６６６７ 単一および複数系は等しい結果をもたらしたが、これは
本発明の装置および方法を用いて試料中の１種またはそ
れ以上のアナライトの存在を測定することができること
を示す。試験溶液中に存在する疑いのある薬剤の特定の
予め測定された最少爪により異なるが、第１表のデータ
を参考にして吸収性材料上に予め部位を定めることがで
きる。

実施例２ 実施例１の記載と同様に製造された試薬および用いられ
た方法を用いて下記第２表に要約されたアッセイを行っ
た。結果は３種の独立した実験の平均であり、下記第２
−５表に記載する。

第２表 １抗体、１酵素コンジユゲート、ｌ薬剤系桑剋　　　　
　　　　　　移動の高さくｘｉ）０μｇｈｎＱ　　　Ｏ
，３μ９／ｆｆｆ２モルヒネ　　　　　　　２４　　　
５９メタトン　　　　　　　２７　　　５４フエノバル
ビタール　　２４　　　５７ベンゾイルエクゴニン　１
５　　　５９テオフイリン　　　　　２１　　　５９第
３表 ５抗体、ｌ酵素コンジュゲート、ｌ薬剤系栗剋　　　　
　　　　　　移動の高さくＢ）θμ９ｈｌ（１０，３μ
ｇ／次ρ モルヒネ　　　　　　　２７　　　６５メタトン　　　
　　　　２６　　　５５フエノバルビタール　　２６　
　　６Ｉベンゾイルエクゴニン　１７　　　６９テオフ
イリン　　　　　１９　　　６０第４表 ５抗体、５酵素コンジユゲート、ｌ薬剤系桑剋　　　　
　　　　　　移動の高さく１肩）０μ９／ＲＱ　　　０
．３μｇ／尺Ｑ モルヒネ　　　　　　　２９　　　６３メタトン　　　
　　　　３１　　　５６フエノバルビタール　　３１　
　　６０ベンゾイルエクゴニン　３０　　　６７テオフ
イリン　　　　　２９　　　５９第５表 ５抗体、５酵索コンジユゲート、１薬剤系Ｕ　　　　　
　　　　　移動の高さくｍπ）０μ９７靜０，３μｇ／
ｍＱ　＊ モルヒネ、メタトン、 フェノバルビクール、　　　２８　　６０−６９ペンゾ
イルエクゴニン、 テオフィリン ＊［各々の薬剤はこの濃度で使用］ 上記のデータから、この発明の方法および装置を用いて
１種またはそれ以上のアナライトの含有が疑われる試料
中における１種またはそれ以上のアナライトの存在の測
定を行い得ることが判る。

試験溶液中に存在する疑いのある薬剤の特定の予め測定
された最少量により異なるが、第２−５表のデータを参
考にして吸収性材料上に予め部位を定めることができる
。

特定の実施例を用いて本発明の詳細な記載を行ったが、
この発明の精神および範囲内で変形および修正が行なわ
れ得ることはいうまでもない。

特許出願人　シンテックス（ニー・ニス・エイ）インコ
ーホレイテッド

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. （１）各々のアナライトがリガンドおよびそれに相補的
   なレセプターから成る特異的結合対（「ｓｂｐ成分」）
   の一員である、１種またはそれ以上の前記アナライトの
   含有が疑われる試料中に予め決定された最少検出可能量
   またはそれ以上の量で存在する複数のアナライトの１種
   またはそれ以上の存在の測定方法であって、 （ａ）前記試料、および各々前記アナライトの１つと類
   似した２種またはそれ以上の第１ｓｂｐ成分の予め決定
   された量を含む試験溶液と、毛管移動によって前記試験
   溶液を少なくとも一方向に浸透させ得る吸収性（ｂｉｂ
   ｕｌｏｕｓ）材料片の接触部分とを接触させ、ただし前
   記吸収性材料には各々前記アナライトおよび第１ｓｂｐ
   成分に結合し得る２種またはそれ以上の第２ｓｂｐ成分
   の予め決定された量が実質的に均一および非拡散結合し
   ているため、予め決定された量の各アナライトが存在す
   る場合、類似第１ｓｂｐ成分は少なくとも前記接触部分
   から離れた吸収性材料片上の予め定められた部位に移動
   し、 （ｂ）毛管移動によって少なくとも試験溶液の一部を前
   記吸収性材料片に浸透させて少なくとも前記の予め定め
   られた部位に到達させ、 （ｃ）予め定められた部位において１種またはそれ以上
   の第１ｓｂｐ成分を検出する ことを含んで成る方法。
2. （２）第１ｓｂｐ成分と相互作用して検出可能なシグナ
   ルを発生し得るシグナル発生手段に吸収性材料を曝すこ
   とにより第１ｓｂｐ成分が検出され、予め定められた部
   位におけるシグナルの存在が試料中における１種または
   それ以上のアナライトの存在を示す、特許請求の範囲第
   １項記載の方法。
3. （３）予め定められた部位における第１ｓｂｐ成分の存
   在が前記予め定められた部位をシグナルの存在について
   検査することにより直接検出される、特許請求の範囲第
   １または２項記載の方法。
4. （４）ストリップが紙のストリップである、特許請求の
   範囲第１、２または３項記載の方法。
5. （５）第２ｓｂｐ成分の各々がそれぞれアナライトの抗
   体である、特許請求の範囲第１〜４項のいずれか１項記
   載の方法。
6. （６）各第１ｓｂｐ成分をそれぞれ標識とコンジュゲー
   トさせる、特許請求の範囲第１〜５項のいずれか１項記
   載の方法。
7. （７）標識が酵素である、特許請求の範囲第６項記載の
   方法。
8. （８）第２酵素が吸収性材料の少なくとも予め定められ
   た部位を含む領域に均一に結合し、酵素間の関係として
   一方の酵素の生成物が他方の酵素の基質である、特許請
   求の範囲第７項記載の方法。
9. （９）アナライトの各々が薬剤であり、第１ｓｂｐ成分
   の各々が標識にコンジュゲートされた対応する薬剤類似
   体であり、各第２ｓｂｐ成分がそれぞれ前記薬剤の１つ
   に対応する抗体である、特許請求の範囲第１〜８項のい
   ずれか１項記載の方法。
10. （１０）（ｂ）段階において試験溶液を前記吸収性材料
    に浸透させて予め定められた部位を通過させる、特許請
    求の範囲第１〜９項のいずれか１項記載の方法。
11. （１１）吸収性材料がこれと結合した予め定められた部
    位においてのみ１種またはそれ以上の第１ｓｂｐ成分を
    検出し得る手段を有する、特許請求の範囲第１〜１０項
    のいずれか１項記載の方法。
12. （１２）前記手段が吸収性材料の前記接触部分および予
    め定められた部位間の部分を視覚から隠している、特許
    請求の範囲第１１項記載の方法。
13. （１３）１種またはそれ以上のアナライトの含有が疑わ
    れる試料中に予め決定された最少検出可能量またはそれ
    以上の量で存在する複数のアナライトの１種またはそれ
    以上の存在の測定方法であって、（ａ）前記試料、およ
    び各々酵素にコンジュゲートされた２種またはそれ以上
    のアナライト類似体の予め決定された量を含む試験溶液
    と、毛管移動によって前記試験溶液を浸透させ得る吸収
    性材料ストリップの端部とを接触させ、ただし前記スト
    リップには予め決定された量の２種またはそれ以上の抗
    体が実質的に均一および非拡散結合しており、各々の抗
    体は前記アナライト類似体およびその対応するアナライ
    トの１つと結合し得、その結果予め決定された量のアナ
    ライトが存在する場合対応するアナライト類似体が少な
    くとも前記端部から離れた予め定められた部位に移動し
    、 （ｂ）少なくとも試験溶液の一部を毛管移動によって前
    記ストリップに浸透させて予め定められた部位を通過さ
    せ、そして （ｃ）１種またはそれ以上の前記アナライト類似体の存
    在について予め定められた部位を検査し、それが存在す
    る場合には試料中に１種またはそれ以上のアナライトの
    存在を示す ことを含んで成る、特許請求の範囲第１項記載の方法。
14. （１４）各アナライトが特異的結合対の一員であり、各
    々がアナライトの１つにそれぞれ類似している２種また
    はそれ以上の第１ｓｂｐ成分の予め決定された量を含む
    試験溶液中に予め決定された最少量またはそれ以上の量
    で存在する複数のアナライトの１種またはそれ以上の存
    在を測定する装置であって、 毛管移動によって前記試験溶液を浸透させ得る、試験溶
    液との接触部分を有する吸収性材料片および 前記吸収性材料に実質的に均一および非拡散結合した、
    各々前記アナライトの１つに相補的である、予め決定さ
    れた量の２種またはそれ以上の第２ｓｂｐ成分（ただし
    前記予め決定された量の前記第２ｓｂｐ成分は前記アナ
    ライトの少なくとも１つの存在下で第１ｓｂｐ成分が前
    記接触部位から離れた吸収性材料片上の予め定められた
    部位に移動するものである）および 予め定められた部位においてのみ１種またはそれ以上の
    第１ｓｂｐ成分を検出し得る、前記吸収性材料に結合し
    た手段 を含んで成る装置。
15. （１５）試験溶液中のアナライトの存在の測定に用いら
    れるキットであって、 （ａ）特許請求の範囲第１４項記載の装置、（ｂ）シグ
    ナル発生系の一部としての２種またはそれ以上の第１ｓ
    ｂｐ成分、 （ｃ）必要な場合には１種またはそれ以上のアナライト
    が存在する場合に検出可能なシグナルを発生させるのに
    役立つシグナル発生系の他の成分、および（ｄ）必要に
    応じた補助物質 をパッケージした組み合わせとして含むキット。