JPS5928662A - 酵素クロマトグラフ免疫分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は被検１本を分析づるための新ＭＡな免Ｂ（クロ
マ１−グラフィー法に関ジる。

競争的蛋白質結合分析又は特異的結合分析の分野は、そ
の診断分野にａ＞　ｔプる重要性が認識きれるようにな
って非常に拡張されできた。ある化合物を検知し、それ
を定量的に測定しうろことは、多種類の薬剤の投与の監
視、多種類のホルモンの不均衡の測定、及び病原菌の存
在の診断を可能にしてきた。多段操作の必要の有無、標
識にＪ：つで川向される信号の種類、溶液中又は表面上
Ｃの信号の光生及び定量のための測定法に関しで異なる
技術が知られている。

分析法を聞ｎするｌ　’ｔ＝　、試薬及び工程手順に関
して多くの考Ｉｉ！！すへき点が存在づる。イの１つの
考慮は分析を１１なう１１υ人の偽混の稈ｌ哀τｉｋ＋
る。比較的熟練しくない個人が分析を（ｊない目つ理に
か４ｒった定吊的枯果を与えうろことが望ましい揚台が
多くある、これらの場合に（コ、分析は低重３１中の物
質による干渉が実質的にない、そし乙−環境状態ｔこお
（３る変１ヒに１゛Ｉ′なうバラツキが比較的ない、ま
た測定が容易Ｃあるということが望ましい、、また、洗
）争操作は、非特異的結合物質を残留さけたままの不適
当な洗浄或いは特異的結合の逆転という理由から誤差の
原因どなりつる。

米国時８１第１１１６８１４６号は、ｔｉＬＩホを含む
免疫り（」７１−グラフィーを用い、次いにの免疫り１
」マＩ−クラノを（堂識されＩこ抗体を含む水溶液と接
触きける免疫分析法について記述しＣいる。米国時８Ｔ
第１Ｉ２３３　／Ｉ　Ｏ２号（コ、１゛つの酵素の基質
が他のものの生産物Ｃある酵素の組合せを用いる均−分
（１１法を記；ホしでいる。生産物の高められた生産は
分析媒体中の被検体の昂に関連りる。米国特許第１Ｉ２
７５１／１９号は、酵素の相合は物を用いる、粒子の存
在が２つの酵素間の相互作用を高める、１つの酵素の生
産物が他のものの基質Ｃあるという粒子の使用法を述べ
でいる。特異的結合対置の結合の結果とし゛Ｃ粒子に結
合した２つの酵素の存在のために高められた最終生産物
の生産は分析媒体中の被検体の吊に関係Ｊる。

本発明によれは、定Ｍ的分析が特別な装置を用いずに容
易に行なうことができるという被検体を検知するための
新ＩＲな免疫クロマトグラフィー法が提供される。被検
体は、標識が１種又はそれ以上の酵素を含む酵素による
信号発生系の１０ζ−ある標識された共役体＜　ｃｏｎ
ｊｕｇａｔｅ　）の存在又は不存在下に吸収性の担体で
免疫クロマ１ヘゲラフに供される。被検体をり［」７ト
グラフイー（°処理した後、酵素共役体が８１（判中に
含まれ−（いなかった場合には、このりｕ７トグラフを
、被検体の移動した距離と関連してり（」７トグラフに
結合りる標識された特異的結合対置と接触さける。適当
な訊七；うを７３えることににす、１つの酵素の基質が
他の酵素の生産物Ｃある２つの酵素の場合、検知しつる
信号を与える最終生産物が生成さｔしる。この時被検体
の移動しｌζ距Ｎ１が決定され、−（の距離を試ゎ１中
の被検体の絹と関係り（ノる。

今回、試料中の被検体の存在を決定りるのに用いるため
のｈ法及び組成物が提（ｌＩ−される。本方法は、境界
が免疫りＵ７トクラノの両端間にｉＪ３いでブＬ現され
、境界の免疫クロマ１−グラフの一端からの距１Ｊ１１
が試わ１中の被検体の間と関１系りる免疫り１」７トグ
ラフを含む。

いろいろな■稈手順を用いうるが、決まっＣ免疫り【」
マＩ−グラフをその一端（低利溶液と接触さけ、その）
合液を免疫り１」７１−グラフ（こｔＧって」二昇さＵ
る。次いて被検体が結合した領域及び被検体のない領域
間の【よっきりした輪郭を与える１種又はそれｊメ上の
ｉ！ｉ（桑を引合けることによって種々の技１ｆｉを使
用りることができる。その技術は、被検体が結合してい
る領１或を被検体が存在しない（イ）１或から明確に区
別覆るＩこめに、単一の試共又は組合せた試苅を使用す
ることを含む。これは結合した被検体又は遊離域の被検
体に８５いて、−力の又は他方の域に亘っ−４の検知し
うる信号を与え（２−）領域をＩ区別し、或いは２つの
領域間に区別し−うる境界を発現さＩることを含む。用
いる試苅及び４，１判を適当に選択りることにより、結
合した被検体又は遊離の被検体の領域のいずれかにおい
【或いは主に２つの領域間の境界におい（信号を評生さ
せることがＣきる。本工程手順及び試薬を用いることに
より、洗浄工程を最小にでき、偶然の、定吊的拮架の妨
害物は実質的に回避される。

本分析を行なう場合、配位体と受体からなる特異的結合
対の１員Ｃある被検体が測定される。配位体と受体は、
受体が配位体の極性及び空間的組織に特異的に結合し、
配位体を同様の特性をもつ他の化合物から区別できると
いう点で関係がある。

免疫クロマトグラフは、液体を支持体中の毛筐現客にＪ
：っく°移動Ｕしめる吸収性支持体に無拡ｌｌｌ１的に
結合し・た特異的結合対員の１つをｈりることを特色と
しで使用される。特異的結合対ｎのほかに、信号光生糸
の酵素口も存在リ−る−（’　７％ろう。信号光生糸は
被検１木が結合した又は存在しない領域を正確に決定Ｃ
き、一方非特異的結合を滅するために洗浄父は他の工程
を最小にづる試・匙を含む。

分析を行なう場合には、免疫りＵ７１〜グラフをＡｉｌ
：　）”ｌ含有溶液と接触さ１！る。この試オ′：１倉
有溶液は特異的結合対ｎに結合した信号光生糸の員も含
む。

他に父は更に、いす゛れかの信号発生日以外の信号５芒
生員を、免疫クロマトグラフを一部分（こ１つの又はそ
れ以上の連続した溶液の形Ｃ゛最初添加し’ＵＪ′３い
℃−もよい。臥オ′：１は溶出液又は溶媒の移動によっ
（−免疫り１」７トクラノの領域を横切り、いくつかの
工稈手ｒｔｎでは特異的結合対日の」（役体及び信号光
生糸ｎし免疫り１」７１〜グラフを＠Ｑ］るＣある−）
。

本発明を更に説明するために、本弁明の以Ｆの記）小に
（１３いＣ次の定義を使用する。

定　　義 被検体−配位休ＣあっＣよいモノ−又はポリ−エビ１−
ビック＜ｅｐ：ｔｏｐｉｃン、普通抗原叉はｆｑ着体計
ある測定づへき化合物又は組成物。この化合物の単数父
は複数は少くとも１つの）（通の１ビトビック点或いは
受体を分けあう。

特異的結合対（ｒｍｉ＋）Ｊ　）−分子の−りが他の分
子の特別な空間的及び極性組織に特異的に結合りる領域
を表面又は空洞中に右する２つの異なっ１、：分子。特
異的結合対の員は配位休及び受体（抗配位休）と゛して
言及される。多くの場合、妥体は抗体であろうし、配位
１本は抗原又は１４着対どしく役立つＣあろうし・、そ
の！！ｉ！度ま−Ｃ免疫学的対のｑ’（’　ｊＤる。そ
れ故に、員の各々はｍ　ｌ　ｐどし−（ｎ及される。１
ｍ１ｌ）ＪはづｌＸ、’（の配位休及びリペての受体を
含むことが意図されＣいることが理解されよう。

配置ｌｆ１体−受休受体然に存在Ｊる又はシＩｉ市Ｕ−
さる有機化合物。

受体（抗配位体）−分子の特別な空間及び１仮性組織、
即ち土ビトビック点又は決定点を認識しうる化合物又は
組成物。受体の例（ｊ天然に存在づる受１本例えばヂ１
」キシを結合ダるグｆ−１／リン、抗体、酵素、Ｆａｂ
ノラクメン１〜、レクチン、核酸などを含む。

（１＾（−標識は他の分子又は支持体に其役したいずれ
かの分子ｔ−あっ（よく、２つの分子が包含される場合
には分子が標識であるように任意にｊ■択される。

信＠匠生糸−Ｉｇ月光生系は１っ又１．Ｌそれ以上の成
分を右するが、少くとも１つの成分はｍ　ｉ　ｐに」（
役りる。信号１１生系は外部的手段により、酋通電田照
削の手「９により、望ましく　Ｌｌ肉１１−的検査によ
り検知しうる測定可能な信号を発生ブる。多くの場合、
信号光生糸は光色団及び酵素を含む。この場合ｖＰ、邑
団は票外父は可視域で光を吸収りる染オ毫１、燐光体、
螢光体及び化学光光体を含む。

免疫りａ　ｖ　ｌ−グラフ−被検体及び適当なものどし
て信号光生糸のいジれかの肖を移動さＵつつ液体を移動
せしめる吸収性支持体にある領域Ｃ結合した複数のｍｉ
ｐ、配位休又は受体のいずれかを右す“る。ｍ　ｉ　１
＋は無拡散的に支持体に、共有結合的又は非共有結合Ｊ
ｌ’）に結合ジーる。更に信号光生糸の１つ又はそれ以
−ヒの員は無拡散的に吸収性支持体に、共有結合的又は
非共有結合的に結合づる。

ｈ　　法 本方法は静買固体相と移動液体相を含む吸１１！性支持
（ホＣ行なわれる。静置固体相は連続して異なる溶液中
の複数の試桑と接触させることがＣきる。

この時連続した試薬組成物との接触間−Ｃは洗；争」程
が凹通省略される。

ｍ１１）が無拡散的に吸収性支持体に結合４る領域は免
疫吸着域としで言及される。試料からの被検体は域の前
端を進む溶媒と一緒に運ばれ−Ｃ吸首域を（い１切るＣ
ｄうろう。支持体に結合したｍ　ｌ　＋１にλ１して同
族の又は補足的なｍ１１）である被検体はｍｉｐ複含体
形成を介しＣ支持体に結合重るようになる。

信号光生糸は、被検体が結合づる免疫吸着域の区域がそ
れが存在しない区域と区別（きる・ト）ノζを提１１（
りる。この時免疫クロマ１〜グラフ土の予じめ決められ
！ζ点からの距１’ｌｌｌは試オ゛８１中の被１！ｉｌ
　＋木の量の１つの尺度である。

免疫吸着域を通る試ｆｉ＋の用は、試オ゛；１をＪ当な
溶媒に溶解すること及び溶液を毛管現象によっＣ免疫吸
着域を移動さけることによっ（増加せしめられる。

溶媒は四通水性媒体であり、これは他の極１〕Ｉ：　ｉ
ｎ媒、特にアルコール、１−チルなどを含め４炭素数１
〜６、史に四通には１〜／１の酸素化溶媒を約４０重量
％ま゛Ｃ含有していＣちよい。凹ｊ山、共溶媒は約２０
重間％以下Ｃ存在しＪ：う。

媒体に対づる１１１−１は普通４〜１１、更に前布５〜
１０及び好ましくは約６．５へ・９．５の範囲であろう
。ｐ　ｌ−ｌはｍａｐの結合親和性をかなりのｆ♀洩Ｕ
紐持づるように選択される。所望の叶１を達成し且つ溶
出中にｐ　ｌ−１を維持す゛るために種々の緩ＩＩｊ剤
が使用できる。緩衝剤の例は、ホウ酸塩、ｔｍ　ｔ’ｌ
！ｆ」福、炭酸塩、１〜リス、パルヒタルなどを含む。

（Ｕ′！用りる９Ｍｌｆｆ１Ｊ剤は木光明にとっ−Ｕｌ
ｉａ密Ｃないが、明々の分析に、１３いＣある緩衝剤は
他のちのよりも好適なことがある。

望ましくけ、非イオン性洗剤約０．０５−（、）。

５重量％を試料と共に包含さける。約２００−・・２０
０００クルトンの伸々のポリΔキシ１ルキレン化合物が
使用できる。

分析を行なうためには、適度な、望ましくは実′ｉ４的
に一定の温度が凹通使用される。）ａ出及び検知しうる
信号発生のためのｉ品度は一般に約１０〜５０℃、更に
凹通には約１５〜５０′Ｃの範囲であり、しばしば室温
、即ち約１５〜２５℃Ｃある。

分析しうる被検体の１１１１度は、一般に約１０−４〜
約１０−Ｉｓ　Ｍ、更＋、＝　５１１ｆｆｌ　ニｌｅｔ
　約１０−６〜’Ｉ　Ｏ−１４Ｍ−’Ｃ変わりうる。分
析が定性的、半定性的又は定員内であるかどうかの如き
考慮、用いる検知法、問題の被検体の１ｌｉ１度及び工
程手順は首通曲の試ル１の濃度を）夫定する？：あろう
。

試わ１及び、！ｉ（桑溶液中の種々の試薬の多くの温度
は一般に問題の被検体の濃度範囲にょっ（−決定される
が、ＫＩ（桑の各々の最終濃度は凹通分析の感度を回味
ある範囲に亘っＣ最適化りるために実験的に決定されに
う。しかしながら、ある工程手順の場合、個々の試某は
分析の感度に致命的に影響しないで実！ｑ的な過ψり吊
−Ｃ使用しつる。

免疫吸着域の１法は、実際上の考慮を除いＣ上限がない
。多くの場合に低濃度を分析するがら、免疫１ｖ々着域
σ月１］は比較的狭い１頃向があり、被検体は理にかな
っｌこ距離を閘切り、問題の１ｌＦＩ度に亘って合理的
なη異をノラえうる。一般に、？１ｌＩＪ４σ月ＩＪは
約０．２ｍｍより狭くなく、約２ｃｍより広くなく、一
般に約５〜２　Ｏｎ＋ｍ、りＴましく　ＬＪ約５〜１５
　ｍｍて′ある。複数の四々のｔｌｌｌ　Ｉ！Ｉが使用
しうる。細片の代り（ご、円筒、例え（、玉梓を使用し
Ｃもよい。

免疫吸着域の長さは、望ましくは巾の少くどし約２〜１
０１［ｔ、ｌ’ｊ通少くとｂ約２ｍｍ、更Ｌｊ　’Ｍｌ
　通１．．：は少くとも゛１０制ｎ、好ましくは少くと
も約２３ｍｍ及び高々的１２ｃｍ、１ｍ通高々約１０ｃ
ｍ、　！ｌ１ｏｔ−Ｌ／、、。

は約５〜ｌＱｃｍＣある。（Ｎ１る距自１１は、分４１
７に必要とされる時間の因子゛Ｃあり、これを分析に必
要な時間に影響りる曲の因子と一緒に考慮する。

信号光生糸の員−Ｃある他の試薬は、用いる工程手順及
びその信号発生におりる役割に依存しく広い範囲に貝つ
Ｃ濃度を変えることがＣきる。（りμ識されたｍ１１１
及び被検体間の「真のＪ競争的状態におい（−１酋通標
識されたｍ　ｉ　＋）は、問題の被検体の最高１１度の
１０１０を越えないζ゛あろうし、ＷＪ小淵濃度約０．
５４Ｂより少なくないであろう。多くの他の状態にＪ′
３い（、ｍｌｐ複合体の生成に含３ｊれる他の試薬の量
は被検体の結合当量より実質的に少ない用Ｃ或いは被検
体の結合当量より実質的な過剰量Ｃ存在しつるっ−これ
故に、単純な関係を与えることがＣきない。

分析を行なう場合、工程手順は通帛試料を溶出溶媒に溶
解りることを含む。試料（コ多秤ツ（０の起源、例えは
生理学的液体、例えｔ；Ｊ　＋ｆｉ＋液、血清、血漿、
尿、目のレンズの体液、髄液など、化学工稈流、食品、
殺虫剤、）今染物などに山来しつる。

次いＣクロマ１−グラフの一端を、凹通Ｆｙｌ　ＩＩｉ
された水＋’ｌ媒体Ｃ市つ℃、信号ソ５生系の１種又は
それ以上の員を含有しＣいηよい溶出試料を含む溶媒と
接触さける。信号発生系の員が存在りる重合、少くども
１つの員はｍｉｐに共役しＣｍ１１）−標識共役体を勾
えるであろう。

溶媒のｌＩＯ端が免疫吸着域を完全に横切るのに十分な
時間が必要Ｃ市ろう。この域は十分なｍ　ｉ　ｐをイｊ
していく、被（發１本のすｌ＼てが該１或においＵ　ｌ
古今したｍ１１〕を？肖′Ｒりることなしに該１戟Ｃ結
台するようになることを保証するつ 標識されたｍ　ｌ　＋１は３つの異なる方法で使用しう
る。この方法の２つ（よ（顕職されたｍ１１）を溶出溶
媒中に存在さけるもの′ｃ′ｄウリ、第、′３のｙｊ法
は試料の°溶出後に１史川される試」ト溶液中に標識さ
れたｍ　ｉ　ｐを存在さけることを含む。溶出溶媒を含
む２つの方法は、ｍｌｐ標識が被検体と並流的に免疫吸
″？７　ＩＴＩＭを横切って存在りる結合点に対しで？
！倹休体実際に競合りる、或いはｍ　ｌ　ｐ標識が見か
りの競争を示さす゛に、主に被検体が結合する域を越え
たりくのＩｇに結合しＣいるものｃｉＳる。′１つの場
合には８１℃Ｉｊｌ含有の溶媒と免疫クロマ１〜グラフ
との最初の接触線から延びる域を１９、一方伯の場合に
は被検体が結合りる域ど被検体の存在しない域との間を
（区別りる境稈が生成りる。

第３の方法では、抗原被検体の場合、シｔ　＊、１とＲ
１初に接触さけ、試料が免疫吸着域を横切らＵるために
免疫吸＠域を抗原に結合す°る試料含イｊの標識された
ｍ　ｉ　ｌｌ中にン員すことを含む。この分析法は慣用
的にリーンドウィッチ分析と言われる。勿論ず」着体を
含む場合に１コ、１４着体被検体及びポリ配合体の双方
に共通な）ノ（定点を少数で与えるために、固定された
開のポリ配位体を与えることがＣき、即ち配位体を中心
核に重合さＵる又は共役さＩるごとが−Ｃきる。効果的
には合成抗原の移動の程度がに１（日中のｉ′ｌｌ！倹
休の吊に体）ルするような抗原をＪうえる。免疫りＥ１
７１−グラフを、例え１シ浸）＾、噴霧などにより実質
的に均一に（蹟識されたｍ　ｉ　１＋を含む溶液と接触
さＵる場合、標識されたｍ　ｌ　ｐは抗原の存在りる決
定点に結合し、試料中の被検体の川に関連４る領域を限
定でる検知できる信号を発生づる。

２つの抗体間の慎かけとし−（役立つ抗原を用いるより
もむしろ、１つのｍ１１）を免疫りＬ１マドグラフに対
しＴ：補足的ｍ　ｉ　＋１と共に溶ｉ（すｅ使用りるこ
とがＣきる。被検体を免疫吸着域を横切らｌｌこ後、免
疫吸着域を滑消、噴霧などにより実質的に均一に標識さ
れたｍ１１）の溶液と接触さける。標識されたｎ＋　ｉ
　ｐは免疫吸着域に結合したｍ　ｉｐに対づる補体Ｃあ
り、（？Ａ識され！、：ｍｌｐは被検体のない免疫吸着
域に＋３りる領域を限定ηる存在りる１６合点に結合Ｊ
る。この場合被検休が移１ＦＩＪりる距自１１は被検体
を含む領１或に＋３い（−観察しつる信号がないことＣ
示され、ｊ尭弄はン皮（契ｆ木を含Ｊ・ない領ｊ戎に１
１３（Ｊる（５号の存在で明示される。

用いる工程手順に依存して、洗浄は石川であり又は望ま
しく、或いは全熱ｔｊなわなく　’Ｕ　Ｊ：い。木弁明
は洗浄工程を行なわないことが可能ひある。

好適な工（（ｄ手順はオペレーターの誤差のｉｉＪ能性
を最小にし！、：最小操作数の方法を与える。それ故に
工夫された工程手順は、ｖ５果が測定ｉＱ％によるよう
な測定段階を最小にりべきである。

免疫クロマトグラフが、条件の変化が被検体の移動距１
１１１１を変えうる程度まで標準化され−くいない場合
には、被検体を公知の吊で右する漂Ｉｌｌ的な試料を与
えることがＣさる。被検体試１４１及び標＋ｐ試＄３１
を同時に展開さけ、両試料間で定量的な比較を行なうと
よい。必要ならｃ＊　１ｑ＊以上の標）Ｍ試料を用い、
移動距離を異なる濃度に対しくグラフにし、用いたにｉ
ｔ　ＩＩの定そｌに用いＣちよい。

多くの場合、免疫クロマトグラフは短時間（−湾む。回
通試料の免疫吸着域を通る横切りは、少くとも３０秒で
、高々１時間以内に、更に凹通に（，１約１−、３０分
て起こるＣあろう。１ｇ号のグを生は、一般に３０秒か
ら３０分まで、更１こ佃通には約３０秒から’：’　ｊ
ｊ　乏１：　’７：の範囲で起こる。

信号発生系１．Ｌ少くとも１つの酵素をイ１し、信号Ｒ
生糸の２つ又はそれ以上の他の成分或いｔ、１．ｉつ又
はそれ以−」二の１ル買を有しＣいＣよく、史に補酵素
も自白しうる。信号発生系の員のいり゛れｂが標識とし
く用いてよく、この時免疫りし１７トクラノ上にｉ３り
る標識の存在は標識の１３域にお１ノる信号の実ν′ｉ
的な変化を提供りる。それ故に、１！識は酵素又は補酵
素を含んＣい−（−よいが、基質を含まない。普通標識
は酵素である。

１題識は基質の酵素ターンオーバー′（［旧’ｌｌ０Ｖ
ＱＩ゛）によりぞの近傍にＪ３りる事象を増巾りる。即
ら標識とじで使用される信号発生系の員は酵素的信号Ｊ
（１中体として言及されるであろうし、上述の員ｔご限
定される。

酵素４！？ｉ識の各々又は組合Ｉは広く変えることがＣ
きる。検知しうる信号を′発生づる生成物は染わ１、螢
光体父は１ヒ学光光休であり、１ぬ）に、螢光又は化学
光光の肉ｎｌＱ又の観察により或いは吸光、反ｑ・Ｊ、
螢光又は化学発光の測定に用いる分光学的測定により検
知できる信号を勾える。

イクの場合問題の酵素は酸化還元酵素及び加水分解酵素
であるＣあろう。ｌ味ある酵素は多くが米国特許第４２
７５１４９号に示されＣいる３、酵素の相合は物の揚台
、１つの酵素）沫無拡１１（的に免疫りＵ７１〜グラフ
に結合し、−プ’ｊ　ｌＩ！！の酵素はｍ　ｉ　ｐに共
役する。

試わ１が免疫吸着域を横切った後、標識−ｍ　ｔ　ｌｌ
其共役がｈ八わ１と一緒にならなかった場合には、＜６
疫吸着域を、 標識されたｍ　ｉ　（＋　４（役体の溶液と及び１ｙｌ
！識並びに工程手順に依存しη信号発生系の１つ又（；
してれ以上の他の負と実質的に均〜に接触さＵる。

酵素−ｍ　ｉ　ｐ共役体の場合には、免疫吸１１域を酵
素〜ｍ　ｌ　ｐ共役体及び基質と、随時捕捉剤と一緒に
接触さける。この用台、酵素は１つの基Ｙ′（が他のも
のの生成物℃あることにより、ｍ１１）に結合した酵素
と関連した免疫吸着域にａ３い（免疫り１」マドグラフ
に結合り゛る。酵素〜ｍ　’＋　１）共役体は普通緩衝
された水溶液中に存在するであろうし、存在１６結合点
の実質的な過剰量で存在していＩよい。このときｌ）　
Ｈ範囲及び緩衝剤は予じめ考慮されγいる。酵素−ｍ　
ｌ　１１共役１本が配合体又は受体のいづれかに結合で
る及び邑が発現覆るのに十分な時間の後、溶液から免疫
り（」７１〜グラフを取り出り。

２　ｆｍの酵素を含むことにより、酵ｌｆ＋−ｍｉｐ共
役体及び基質が免疫吸着域との接触に先立つ反応なしに
同一の溶液中Ｃ−緒にできるから］、、程手順の工程が
省略される。

酵素−ｍ　ｉ　ｐ共役体が試料中に存在Ｊることによつ
Ｃ免疫りＵ７１−グラフに結合した後、免疫クロマ１−
グラフを基質溶液中に溌づＣとによつ（光色さＵる。こ
の場合、酵素は免疫り■マｌ−グラフ（こ拮合しでいて
も、いなくでもよい。

酵素４！！ｉ識を用いる場合、現１９ξ剤溶液は普通１
（！「ｙはそ４し以」二の酵素を含４ｉ　シｔ　ｔｌｉ
酵察及び基質を再生ダるであろう。酵素的反応は補酵素
を必要とり−るから、酵素及び基Ｙ９は免疫吸着域と接
触する前のいずれの反応もなく単一の現像剤試桑として
和合けることがＣさる。

基質は酵素と共に変化す”るであろうし、通帛什速にさ
ｔ！ない／ｊめに実質的な過剰量ｒ（Ｋｍより大濃度ぐ
）存在づる。水（液−は賄通酵素系に対しく適当に緩衝
され、他の酵素の基質【ある酵素の生成物に対４る捕捉
剤、例えはウリクース〈旧゛１−ｃａｓｅ）からの過酸
化水素に対づる１３タラ−Ｕを自白しうる。

被検体が結合した免疫吸着域の領域を限定りるために、
十分に検知しうる信号発生化合物を生成づるのに十分な
期間、免疫クロマ１〜グラフを工１を像剤溶液と接触さ
ける。検知しうる信号が光生りると、クロマ１〜グラフ
の１端からの距削が試１１中の被検体の吊の定量的尺度
として測定できる。

境界にＪ５いていくらかのゆがみがち９察（きる（〕れ
ど、殆ｌυとの場合に境界は理にかなつＣ良く限定され
、μす〜ＩＪす範囲の２つ又はそれニスＦの因子の硝石
変化が多種類の被検体で倹知り゛ることができる。即ら
適当な染１’！ｌ　ｎｉｉ駆休を体質どして用いること
にＪ：す、被検体の用は１回の測定（試料）での肉ｌＲ
観察ににっＣ及び妨害に対しく比較的鈍感な２段操作に
ょっ（゛定量的に決定しろる。

劃−１ 本免疫クロア１〜グラノイー法に８５いで用いる成分は
、吸１１Ｍ性支持体、ｍ　ｉ　ｐ共役体（ｍｉｌ＋　及
Ｕ　１ｍ　ＡＩを含む）、免疫吸着域におい−Ｃ吸収性
支持体に結合したｍｌｐ、信号発生系の残りのＩＡ、？
ｔ！！倹休、及体適当なものどじ−Ｃポリ配位（ホ又は
多価受１ホである。

被検体 本弁明の配位体肢検体はモノ」ニビトピック叉はポリ１
ビ１−ビックｃｄうろことが特色であり、一方受体？Ｉ
！！倹体は甲−の父は少数の結合点を右しうる。

ポリｊ−ビトビック被検体は通出ポリ（アミノ酸）、即
Ｉラボリベゾヂト及び蛋白１２、多糖類、核酸及びこれ
らの相合は物である。そのような組合μ物文は合体物は
バクテリヤ、ウィルス、タロモジ−７＼、遺伝子、ミ１
−コントリ丸７、核、細胞膜なと庖含む。

多くの場合、本発明で用いるポリ上げｉ−ピック配位休
被検体は、少くとも約５　（’）　ＯＯ１父は前布少く
とも約ｉ　ｏｏｏｏの分子量を有するＣ゛あろう。

ポリ（アミノ酸）の範らゆうにおいｃ、興味あるポリ（
アミノ酸）は一般に分子量約５００（Ｊ−５０００００
０、更ニ普通ニハ約２ｏＯｏｏ〜１００００００のもの
であり、興味あるホルモンは分子量約５０００〜６００
００のものである。

有用な配位捧の美大な列挙は米国特許第１１２７５１４
９号（閑１２〜１７に見出り′ことがＣき、この開示は
本明細内に参考文献として引用される。

モノ土ビ１−ビック配ＩＱ体被検体は、一般に分子量が
約１００〜２０００．更に普通には約゛１２５・〜１０
００Ｆある。興味ある被検体は薬剤、代用物、殺虫剤、
汚染物などを含む。

多数の被検体は、開示が本明細内に参考文献としＣ引用
される米国特許第４２７５１４９号欄′１７及び１８に
列挙され−Ｃいる。

受体被検体の場合、分子量は一般に約１０’・〜２Ｘｉ
Ｏ’、更に普通には約３ＸＩＯ’−２Ｘ′１０６の範Ｖ
Ｊｌ　ｒある。免疫グ【−１−７リンＩ　＋ｈ△、Ｊ（
ｌＤ、Ｉ（ＩＩＥ、ＪｇＧ及びＩ　ｏ　Ｍの場合１分子
量は一般に約’ＩＧＯＯＯＯ＝約１０　′′？ｌ−変化
するｒ　ｉｔうろう。酵素は前通約″Ｉ　００００〜６
０００００タル１〜ンで変化づる。天然の受体は広く変
化し、一般に分子量が少くとも２５０００であり、１０
６及びイれ以」ニてあってよく、アヒジン（ａＶＩ（ｉ
ｌ＋）　、ブーロキシン結合りｒ」ノリン、ヂｌ−］　
４ニシン帖合ゾレアルグミン、１〜ランスコーヂン、膜
表面蛋白買４１どを含む。

ｌＩＣ位陣が他の分子又は支持（ホに共）９する場合に
は、配置、（Ｌ　１本はし１；Ｌシは改変され（特別な
官能基を特別な点に右ＪるＣあろう。この改変は配（１
７体同族体と１１・Ｐばれる生成物を生成する。米国性
’７．ｒ（第１２７９１　／ｌ　９　ｑ　＋１１１ＶＩ
　１８及び′１９に配位休の美大な記ｊホを含んでいる
。この記述は本明細内に参考文献として引用される。

疫クロマ１〜ノラフ 免疫クロマ１−グラフは、キャピラリーを通しで液体を
移動さける吸収性支持体、無拡散的に結合したｍｉｐ　
、及び更に信号発生系の１種又はそれＬス上のｎを含む
ことができる。

異なった１法、特に厚さ、異なった材質及び界なっＩこ
形態の多様の支持体が使用しつる。多くの＼ 場合、形態は長い、簡便には長方形の細片である。

細片の少くとも１部分は細片に均一に結合したｒｒＩｉ
ｐを有するＣあろう。細片の１法は８５るｆ！ｉ！麿ま
で取り扱いの簡便さによって支配される。また免疫吸着
域は被検体の興味ある潤度範囲にｄ３いＣ存在しうる被
検体のリベ−Ｃを保有し）るに十分１．７　ｉＪ法のも
のでな（）れはならない。工程手順が被検体及び標識さ
れたｍｌ【１の双方の結合を含む場合、免疫吸着域は被
検体及び標識されたｍ　ｌ　＋）の双方に対しＣ能力を
右さねはならない。

天然及び合成場合体材判、持にレルロース１１３１、例
えは糊ＩＩＣを含む紙例えばｖ３紙、クロマ１−グラフ
ィー用の府（など、合成又は改変天然産重合体、例えは
ポリ（Ｊｌ化ビニル）、架橋う２４−ス１−ラン、アク
リレ−１〜などを含み、それ自（木で或いはレラミック
イイ判例えばシリカと相合Ｉ！ｃ使用きれる神々の吸収
性支持体が使用て“きる。

免疫クロア１−グラフの吸収性支持体の厚さは一般に約
０．０５−約２ｍｍ、更に普通には杓ｏ、　　１〜０．
５ｍｍ、好ましく　ハ約０　、　２−ＩＦＪ　Ｏ、／Ｉ
　ｍｍ′Ｃ変わるであろう。紙の構造は広く変えること
ができ、細かい中１スｌに細がい、中程度の、中位に粗
い及び粗い？Ｍ造ＵあっＣよい。−表ｍ１は平滑及び粗
雑の、硬質及び軟Ｖ（どの神々の相合けにより広く変え
ることが′Ｃさる。

免疫りし１７１−グラフは神々の不活性な支持体、例え
ばマイラー（Ｎｌ！Ｖｌａｒ）　、ポリスチレン、ポリ
土ＪレンなどによっＣ支持されＣい゛（よい。この支持
体は免疫クロマｉ・グラフの１幾械的合１４Ｖ（’Ｉを
高めるために免疫クロマ１−グラフがら空間を置い／Ｊ
裏材、端祠又は他の（閃造材どしく使用Ｃきる。

免疫クロマ１−グラフは性質を高めるため（こ５多様の
１１才３１でコーティング覆ることができる。この＝１
−テインク材は特に支持体に共役した物質の安定性を高
めるために使用される蛋白質コーティング、多糖類コー
ティング、砂糖などを含／υてぃてよい。

これらの化合物は免疫りＵマｌ−グラフに結合される物
７１、例えはｍ　ｌ　ｐ又は信号発生館員の結合を改ｐ
Ｊｉツるためにも使用しうる。

免疫りＬ１７］−グラフは反応性官能基で活性化しＣ１
支持体に共役すへき右（幾物賀を共有結合さけることが
Ｃきる。免疫クロマ１〜クラフの吸収性支持体を活性化
づるために使用しうる種々の技法は、アシル基例えば′
カルボニルジイミタソールでの官能基化、シアノグンブ
ロマイド又は２官能性剤１（・りえはクルクルアルデヒ
ド、コハク酸Ｃの処］１１　ｆ、）とを含む。いろいろ
な物質の吸収性支持１木への結合法は文献に見出りこと
がＣきる。参照例え（Ｊ米国待！ｌＴ第４１６ε３１’
１６号。

支持体にｔｉ’ｉ合するｍｌｐの量は、支持体のｘｊ法
及び被検１木のリベＣど必要に応じ（標識されｌこｍ　
ｉＯを結合りるために必要どされる量に依存しＣ変化シ
ョウ。−ＪＱニ＋ｎｌｌ＋　〕ｉ’ｔｌＬＦＪ　１０−
Ｓ〜１０−１４’Ｅ／Ｌ／、、／ｃｍｐ、更に普通には
約１０−フへパ１ｏ−なの七ルアａｍ”の範囲にある。

単位面積当りのモル数は、被検体の横切る距離に対して
興味ある１度範囲を十分に区別り−ることを保６σづる
ｌこめに変化さけられるであろう。

好適な具１木例において、信号光生糸員は吸収性支持体
に無拡散的に結合する。特に酵素は標識された１１）と
相互作用するＣあろう支持体に結合し。

１’５４Ｉ？ｉ識は他の酵素Ｃある。酵素の関係は信号
発生系の記述にＪ３い゛（論議されよう。

＋ｎ　ｌ　１＋及び信号発生館員の双方は共（ｉ結合よ
りもむしろ吸着によっＵ　ｆｌ々の支持体に結合しくい
（よい。これは吸収性支持体を、ｍ　ｉ　１１及び７・
′ヌは１言号光生員を含む溶液と接触さＵ、免疫りＩＪ
７トグラフを溶液から取り出し、そして免疫クロマ１−
グラフを乾燥さけることを含む。曲に溶液を噴霧、塗ｆ
ｌｉ、又は均一性を与える他の技法で適用しくもよい。

一般に、比較的人きいシートを用い、次いでこれを適当
な１法に切断する。

１１ルＬ１ １ｇ同号光糸は多くの場合に電磁前側、特に票外紳及び
可視域、更に特に約４００〜Ｆ３　Ｑ　Ｑ　ｎｍの波長
を右する照射の吸収及び発光を含めＣ検知しうる信号の
発生を含む。免疫クロマ１〜クラフの１９買上、検知し
うる信号を有づるためには、単位面積当りに十分な１度
の標識が存在することが必要（゛ある。それ故に、多く
の場合個々の標識は所望の感度を与えるのに十分でない
′Ｃあろう。その程度まＣ単一の標識されたｍ　ｔ　ｐ
と関連した複数の検知しつる分子を発生さける手段を与
えなりればならない。但しこの場合、そのような発生の
ための手段を与える４Ｍ　ｍは、標識されたｍｌｐが免
疫吸着域を横切る時に標識されたｍ　ｉ　＋１の移動を
妨害しくはなら’Ｊい。それ故に、検知しうる分子を多
数生成りるＩ顕職例えば酵素又は補酵素を使用りる。次
いＣ信号標識の存在によって増Ｉｌｌを（１する。

光を吸収する生成物、例えは染Ｙ３１を生成りることに
よつＣ所望の増Ｉ＋］を与え、或いは照Ｉｎ時又は化学
反応時に光を放射（る、例えば螢光体又は化学ざｔ光体
を与える酵素又は補酵素は使用される。

そのような生成物を与える多くの酵素又は補酵素は、本
明細内に参考文献として引ｍされる米国特許第４２７５
１．／１９号−０）第１９−・２３欄及び米国特許第１
１３１８９８０月の第１０〜１４＋１ｉ１１１こ示され
でいる。

特に興味あるものは、１つの酵素の生成物が他の酵素の
基？（Ｃあることによつ−Ｃ関係づ（〕られ−Ｃいる酵
素の相合ｕ物を用いることｅある。この方）去−Ｃは非
特異的干渉が実質的に減ぜられ、結合した被検体を含む
及び被検体を含まない１或間の境弄が更に効果的に明示
される。

本ずで明において使用づることのでさる多くの酵素組合
Ｕ物は米国特許第４２７５１４９号の第２３　＋１１１
］から第２８欄にかけ−Ｃ示されている。この開示は本
明細内に参；号文献として引用される。

特に興味あるものは、過酸化水素の生成と過ｏ！！化水
幸を用いでの染料前駆体の染料への酸化とを含む酵素で
ある。特別な相白けは、リーツカライ１へ・Ａキシター
ゼ例えばグルコース及びカラク１〜〜スオキシターＵヌ
はＶ１素環Ａキシターゼ例えばウリカーＵ及びキリンヂ
ンオキシターげと過酸化水素を用い−Ｃ染利前駆体を酸
化づる酸素例えばベル７１’　：ｌニジターじ、ミクロ
ベルオキシダーげ及びヂ１〜クロームＣオキシターＵと
の組合−せを含む。この酸化還元酵素の相合けは（１？
ｉ凶Ｃある【）れど、他の酵素例えば゛加水分解酵素、
転移酵素、及び上１ｉＪｉ　Ｊメ外の酸化還元酵素も使
用？ｌｌ−きる、使用しうる補酵素は、ＮＡＤ（１−１
）、ＮΔＤＰ（＋−１）　、ビンディキサル小スフニー
１〜、ト△］）（Ｈ）　、　Ｉ：ＭＮ　＜１−１＞など
、普通酸化ｉ１！　７Ｇ酵素と組合けられる？ＩＯ酵素
を含む。反応をリイクルリ−ることを含む多くの補酵素
に対しＣは、特に米田特８′［第１１３１Ｆ３９　Ｂ　
０号を参照のこと。

酵素反応の生成物は回通染判マは螢光１本であろう。螢
光体の多くの例は、本明細内に参考文献としＣ引用され
る米国１７目′Ｆ第４２−７５　’Ｉ　４９号の第３０
及び３１側に示されている。

適当な１Ｍ作又は標識−ｍ　＋　ｌｌ共役１本、受体、
吸＋１’７１′１支持１本及び分析に用いる条１′１の
選択にＪ：す、被（尖体及び酵素−ｍ　ｉ　１＋を同一
）寥液Ｃ免疫り目７１−グラフに適用づる場合、木光明
の２つの異なる具体例が達成できる。１つの具体例にａ
３い−（、被検体の横切る免疫吸着域の領域（、Ｉ、被
検体が存在する領域に亘つ（検知しうる信号が実質的に
均一に生成りるために観察しうる。１つの具体例にｄ５
い（、検知しつるシグナルは、被検体の占有した免疫吸
着域中の領域と関連し／、：境９ｒφにおいて主にＷ１
２察し−）る。

異なる結果は、被検体と比べ（の標識−ｍ　ｉ　ｐ共役
休の異なる結合定数、移動速度、吸着などと関係するか
も知れない。変化は、標識に結合したｍｉｐ　、　ｔ’
ｊにｆ１＠性の被検体の数を変えることにより、吸収性
支持体に結合する受体の結合！１Ｍ異（’ｌを、例えは
ｆ１着性液被検及び抗原間に１つの連結基を右しく一月
つ標識−１」着性被検体共役体との異なる連結基を用い
て抗体をイミュノジエンに対しく　ｔｌｔ。

備乃ることによって変えることにより、１で［因子を変
えるために溶媒及び／′又は支持体を変えることにより
、或いはその他の技術により達成りることがひきる。

１つの酵素を標識としＣ含む信号光主系に２つの酵素を
用いる結果としで、串柿化された工程手順が使用でき、
また強い検知しうる信号が１９られ、被検１本の前進り
る先端を正確に描写りる。更に、検知しうる信号光生傷
合物を表面に迅速に（」精さＵるために、基質の潤度を
局所的に高＜Ｌ、Ｕ−酵素を免疫９１コマｉ〜グラフに
結合さける。

キット 簡便化のために、免疫り［」７１〜グラノを曲の試薬と
相合１ＩＣ−被検体に対する分析に使用りることがＣき
る。、２つの酵素を含む場合、他の試薬は、酵素で標識
されたｍｌｌ＋、支持体に結合りるｌＩ’ｉｍに対し−
（の基質、いずれか他の基質及び酵素によっ−Ｃ必要と
される共因子及び検知し−）る琵色体又は光螢）に体を
与える染料前駆体を含む（゛あろう。補酵素１１７！識
を用いる場合には、補酵素で標識されｌこｍｇｓ、染わ
１前駆体を含む適当な酵素が包含されよう。更に他の添
加剤例えば安定剤、緩挿１剤なども含まれ（いてよい。

神々の試薬の相対Ｈｉ　ＩＩｌ、　、　５）＋ｔｒの感
度を実質的に最適化り−る８ｊ（桑の溶液中での濃度を
与えるために広く変えることができる。特に、試薬は）
容カフした時に試料と一緒にりるのに適当な濃度を右で
る試苓溶液を与える賦形剤を含んＩど、首通凍結乾燥し
た乾燥粉末としＣＩ！ｉ！供りることができる。

実　　験 次の実施例は例示Ｃあっで、本光明を限定するものでは
ない。

以下次の略号を使用覆る：　ｌ−Ｉ　ＲＰ−西洋１ノリ
じのベルＡキシターＬ’　；　Ｎ　ｌ−Ｉ　Ｓ　−Ｎ−
ヒトロキシリクシニミド：　ＥＤＣ△−エチルジメチル
アミノグＵビルカルボジイミ１き；ｌ）ＭＦ−ジメチル
ｉ１号ル１＾アミド：ＢＳΔ−牛の血清アルブミン。Ｉ
ｇ　Ｉ−ｔＪ　ＩＪ　ＩｆＪｉらない限りレツ氏とし、
部は重呈にＪ：る、１目し液体の混合物は客用によるも
のとりる。

実」Ｕ」１ニー免疫クロマ１〜ノラ゛フの！！ｌ造しオ
フイリンに対づる抗体（抗しオフイ１ノン）及びクルコ
ース；ｔ　＝ｔ＝ジターＩ！は共役させるｌくき物Ｒで
ある。約５５０　ｃｎ＋２のＷ　ｌ＋ａＬｍａｎ３１　
Ｅ　ｔのシー１−を、ノｊルボニルジイミタゾール中０
．２Ｍピリジン１．８１に澄し、混合物を室；晶で１時
間穏やかに撹拌する。他のシー１−も同一の活性化溶液
で活性化り−ることができる。次いで各シー！・を−ア
１〜ラヒド目フラン３００ｍ１ｒ洗浄し、空気ノｊン；
こより約２０秒に亘−）（”空気乾燥４る。次いＣシー
１−を、抗ｔ＝ｉフィリンの４９　ｎＨ、ｙ’　ｍ　ｌ
の溶液５００μｍ、グルコース１キシターＵアミンのｉ
　Ｇ　ｎ＋１．・ｍｌの溶液７９０．５μｌ及び０．１
Ｍプ、Ｆ４　酸す１ヘリウム、１）トｉ　０．２ＭＮａ
　ＣＩ　Ｍｍｙ剤２００　ｍｌの溶液中に浸し、混合物
を室温で４時間穏■か振とうり−る。燐酸基緩衝剤で洗
浄した後、溶液を保存剤としＣ役立つ／１９６水性［）
　ｅｘＨ゛ａ＋＋−１’　１０溶液中（・二浚し、シー
１−を吸い取り、凍結乾燥する。

五糸例２．けオフイリン及びＨＲＰの共役反応フラスコ
中に１−メチル−３−（３−−力ルボキシブしＪビル）
キリンチン８．１ｍｇ、Ｎ　Ｉ−Ｉ　Ｓ３．８ｒ１１（
Ｊ、ＥＤΔＧ６．７１Ｂ及びＤＭＩ口１２５１１Ｉ＠導
入し、混合物を夜通し室温で装置した。

０．１Ｍ炭酸）」・リウム中１−Ｉ　Ｒ１）　−７１キ
シアミン（１ｍ（Ｊ）の、Ｉ）ｌ−１９、０の１．３１
の試１１４つ（こ、上で１！ａ１７　Ｌ、　／こ」−ス
テルをいろいろなｆｆｉ　Ｃｍ　ＪＪ［Ｉし、セメフィ
リンとｌ−Ｉ　Ｒｌ”のモル比を４　＋−）　（、）、
２００．１００及び１００にした調製物を製造した。第
１の反応混合物（モル比／ＩＯ（υ）に、杓？時間に亘
っＵＤＭＦ０．２１　’７ｍｌと上記上ステル６６μｍ
を８．２５μｍす゛って添加した。第２の反応混合物（
モル比２００　＞に、ｌＪＭＦｏ、２３８１１１を添加
し、」−スプル３３ｔ）１を８．２５１１１づ゛っで添
加した。第３の反応混合物（Ｔニル比１００モル）に、
１）ｔｖｌＦｏ、２４ｎ＋ｌを添加し、上スプル１６．
５μｍを８．２μｍずつで添加した。一方最後の反応混
合物（モル比１００）にはＤ　Ｎノ＋　Ｆを添加Ｉ！ｆ
、上ステル８．２５μｍを２．１７１１ずつ添加した。

添加中、濡洩を４℃に保ち、次いＣ混合物を夜通し４℃
で敢首しｌこ。

次いで反応混合物を標準１ガ！ＴＩｊ液を用いるＧ〜２
５ファデックスでのりしコマトゲラフイーにより処理し
た。ｐＯｔｉｎ及びＵＶ分光分析はそれぞれ６゜９．４
．０．１．６及び２．１の１？Δフイリン７′Ｉｎ　Ｒ
ｌ）比を示した。　　。

実施例３．グルコースＡキシターＵ？ミン製３戴／ｆル
］−）、８−！ｒ−シタ＝ｖ　（Ｓ　１ｇ１Ｉ＋ａ、　
ＩＥ　、　Ｃ，１。

’１．３．４＞＠、３〕０１＋５ｉＬｘ十の１上刃ｖ　
、Ａ、　ｍ　＋　ｃｏ＋＋Ｆ）ｆＶＩ　Ｎ　Ｏの膜を用
いることにＪ、す３　（３０ｍｌから６０ｍ１ｌ′ｔ”
ン農１１占しｌこ。このグル１−スオキシクーＵ淵縮物
を／Ｉ　’Ｃの水／１１に対しＣ２回透４１１シ、）濾
過した。これは分光学的ｔこ３２　ｍｇ、１！１１のｉ
装線を有した。タル」−スΔキシターげ溶液５１　、５
　ｎ＋１ｌｃＯ１２〜１過ヨウ素ｉｆｆす１〜リウム５
．１５ｍ１を嫡々（ご添加した。反応は２５分間にＱ−
、）て“起こ゛）／、、。

生成物をｌｌｌ−１／Ｉ　、　５の２　＋ｎ　Ｍ酢０ｑ
す１〜リウム４）１１いる３　ａｌ＋ｌ＋ａ（ｌａｘ　
Ｇ−５０の２　、５　ｘ　６０ｃｍの）Ｊラムクｌｊ　
？　ｌ−グラフィーＺ−！７ｕ理しＩＪ、この）ａ液に
、１１１−１９　、　Ｅ５の０．２１Ｖｌ虜酸す１ヘリ
ウノ、中３Ｍ土チレンジ？ミン６０１１を滴ノＺに添加
し、反応を３時間進行さけた。次いてこの混合物に１０
　ｍｇ、、、１の水素１しホウ素プ１−リウｌ＼約３．
９ｍｌを添ツノ１１シ、ｆｌｕ合物を夜通し保温し、り
１」マ（・クラフィー（こより水素化ホウ素ノー　１〜
リウムを除去しｌこ。

実施例４　、　Ｈｌ（Ｐ−刺キシアミンの製造＋＋Ｉ−
ｌ　／ｌ　、　　５の緩挿ｉ剤５　ｎｔ〜１＾１酸］１
−リウム中１０　ｍ　７０）１の西洋ワリビのベルオキ
シターｊ４５ｍｌｉこ０．２Ｍの過ヨウ素酸すｊ・リウ
ム５０ｍ１を添加し、混合物を３０分間撹拌し、次い’
ＣＧ　−５ＵＳｅ　ｐ　ｂ　ａｔｌ　ｅ　Ｘノコラムで
のりＩｔ　？　ｌ−グラフィー（、二より＋＋Ｈ１５の
２０１〜１酢酸す１ヘリウム緩衝剤（゛流出さけた。蛋
白賀画分を２９ｍ１まで集め、混合物を４℃まで冷却し
、ｐｌ−（９、５の０．５Ｍυｉ　ｌＩ！ｔ　Ｊｌ　１
妥雨液中０．２Ｍ２．２”−オキシ−ビス−１チルアミ
ン２，９１１１１を４℃（添加しＩＪ。混合物の吐をＩ
Ｎ水ｌ１１日（コテ１〜リウムで９．５にｉＰ３１１ｉ
１　シ、２時間撹拌し、／１．ｎｌ　ｇ、−’　ｎｌ　
＋の水素化ホウ素す１〜リウムー水３．５２ｍ１を添加
し、混合物を３時間反応さけ、３　ｐ、ｐｈａ（ｌｅｘ
　Ｇ　−５０のカラムを用いるタ日７１〜グラフィーｒ
処理した。

ＨＲＰ　４００　ｍｇ及び２．２−−オキシ−ビス−１
デルアミン３．５ｇを用いて上記工程を緑３ｈ　シｌζ
。元々のアミン及び約４つの更なるアミン基を右づ−る
改変アミン基間においＣ酵素活性のか４Ｔりの変１Ｌは
認められなかった。

分析を１−７なう場合、実施例１　’ｒ調製したシート
から９０　ｘ　Ｆ３　ｍｍの細ハを準備し、この細片の
端を０　、　１　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｐ　Ｏ４，０、２〜１ｘ
ａＣ１、＋ｉ　１−１７．０及びＢＳ△１ｎｌ（１、／
’　ｍ　ｌ中Ｒ１＜　？４１１　＋＋＋　ｌに浸し１こ
。

この特異なる量のレオフィリンを含有し且つ０゜２％−
ｌ　ｒｌ　ｔｏｎ　ｌ）　Ｎ　−６’　５を含有ηるあ
る数の試わ１を使用した。１２分後、細片を０．２μリ
パｍ１の１−Ｉ　ＲＰ−シ：４フィリン共役体５ｍｌに
浸し、溶液中に浸漬しｒ１０分間放置した。次いＣ酵素
）Ｈ液／Ｊｌら細）１を取り出し、５０＋ｎｈ４クル］
−ス２００μす、／ｍｌの１１−りＣｌルー１−ナフＩ
〜−ルの５１を含／υＣなる現像溶液に浸し、２０分間
放置しｌこ。

中心の最上からの境界の距離を、異なるしＡノｒリン硝
度の試！Ｉｌにス４し、てグラフに由さ次σ）結果を得
た。

第１表 １７１フイリン　　　細片の最上部からσ〕ｎｇ／’ｍ
ｌ　　　　　　境界の距離、Ｉｌｌ　Ｉｌ＋５０　　　
　　　　６６ １００　　　　　　　　　　　　　５５２００　　　　
　　　　　　　　　　　／Ｉ　　７５００　　　　　　
　　　　　　　４　２次の試験では、実施例１の方法を
繰返した。用いた細片は寸法が６５ｘ８ｍｍであった。

用いｌζ工稈手順は、細片の端をｌ−Ｉ　ＲＰ−セオフ
ィリン共役体Ｑ　、　４　μｇ／ｍｌを含有づ°る溶液
０．５μｉ中に浸りこと（あった。この場合、異なる試
料はｔ？Δノイリンをいろいろな１ｌｌｌｒ良で有し、
各試＊１１は０゜２９６丁ｒＢｏｎ　Ｄ　Ｎ　−６５を
含有した。１ｉｌｌ　）”ｉはＩｌｌ（料溶液中に６分
間放置した。この時間の終りに、細片をグルコース−（
４−クロル−１−ナフト−ル）現肖剤溶液中に浸漬し、
次の結果を（ｑだ。

第■表 しＡフィリン　　　細１４の最」二部からのｎｇ、ｌ　
ｍ　ｌ　　　　　　ｊｍ　界０）　距１ｆｉｌ［、ｎｌ
　Ｉｌｌ　”０　　　　　　　　５３ ５０　　　　　　　４６ ＋００　　　　　　　　３８ ２００　　　　　　　　　　　　　ζ３１５００　　　
　　　　　　　　　２６ ※２つの１直のｉｐ均 次の実施例にａ３いＣ１用いたすり（はＳ、Ｓ、５８９
Ｗ　ｌ−１であり、４９６デギス１〜ラン−１１０）容
）１！２を保存剤どして使用した。試わ１溶液は、前述
した緩用剤中に神々の吊の１．７７１フイリン、酵素当
りＳｔ１均約３つのｔ？Δフィリンを右Ｊる廿オフィリ
ン−１」Ｒ［〕共　１貸　（木　０　．４　１１１Ｊ　
　／ｎ１１　　、　０．　　１　　％　ｌ−ｒｉｆｏｎ
　　Ｘ　　−一１００を含有ＪるＱ、５＋＋＋ｌひ（ｂ
−）た。試料溶液が免疫りＵ７１−グラフを横切った１
艷、この免疫りＵ７１−グラフを、前述した現１ｆｔ剤
溶液Ｃ′１０分間現像した。現像した色の殆／νとは境
界においＣ挟い１１）　’ｃあつｔこことを特に記し−
ＣＪ３　＜。次の表は結果を承り。

拓−一町−ｊＬ ｔ？７１フィリン　　　細片の最上部からの１１ｇ／ｍ
１　　　　　　境界の距離、ｎｌ　Ｉｌｌ　”０　　　
　　　　２６．２Ｅ５ ５０　　　　　　　　　　　２１．２３１００　　　　
　　　　　　　１８．１８２００　　　　　　　　　　
　１５．１２５００　　　　　　　　　　　１１　　、
９※２つの異なる分析 上述の結果からは、感度の良い簡単な方法か多種類の被
検体を定量的に決定することは明らか（ある。工程手順
は非特異的干渉を特に含まり”、誤差をもたらり一試剤
の複数の測定を回避し、−ξし４高ｌｌＴｌ１な測定装
置を必要とづることなく肉眼で結果を与えることがひき
る。更に、分析は迅速（′あり、従って患者が病院に）
ｌｔｌ在している時間内に結果を１するＱとがＣきる。

また工程手順は中間での洗浄操作を必要とＵす′、これ
は比較的熟練してない者が分析を行なう場合に特に重要
である。洗浄Ｉｌｌ稈は必要な場合実質的な誤差源とな
る。

木光明は例示の目的でいくらか詳細に及び理解を明１ｉ
１ｆに覆る目的Ｃ実施例により記）ボしてきた（）れと
、ある変化及び改変が特！ｉＴ請求の範囲内−Ｃ（Ｔな
いうろことは明らかであろう。

特許出願人　シバ・カンパニー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（△〉溶媒の移動が可能な多孔質支持体及び該支持
   体に無拡散的に及び均一に結合した工ｕ数の特異的結合
   文・Ｊ員（ｍｌｐ　）を有し且つ該支持体の第１端から
   Ｎ１れる距１ｉＪ１１を延長して免疫吸着域を規定りる
   免疫クロ？トクラフ；及び （Ｂ）（票識されたｍｉｉ＋　、　ｊ旦しこの（票識さ
   れたｍｌｐ　ｌよ、被検体が該被検体を含む疑いのある
   試わ１中にＤ右りる該被検体の吊ど関ｊルした境界を規
   定りるように、情合し−〔いる該免疫吸着域の部分に関
   １）ｔ−該免疫吸１１域に結合づるように選択され、ま
   た該標識は該境界を規定り−る電仔灸照射の検知しうる
   信号を光生する、少くどし１つの酵素を含む信号ｇコ生
   系の１部分である酵素父は補酵素であり、を用いること
   により、該試ｒｌ中の被検体の存在を決定づる方法Ｃあ
   っＣ１ 該免疫り【コマミルグラフを、（１〉該第１端にｄｊい
   ゛（、溶媒の少くとも１部分が該免疫吸着域を移動する
   のに十分な期間、Ｍ利を含む該溶媒と；及び（２）標識
   されたｍ　ｌ　＋）を含む溶媒と接触さけ、その際該標
   識されたｍ１１）は該免疫吸着域にＪ３いＵ結合した被
   検体と関連して該免疫吸着域に１６合しており；及び 信号発生系を用いることにより該標識されたｍ　ｉ　ｐ
   によって規定される境界を、該免疫吸着域を該信号発生
   系の残りの員と接触させることにより決定し、この際焼
   野の位置は該試料中に存在りる被検体の吊ど関連してお
   り：但し 該免疫吸着域を、最初に該試わｌ含有の溶媒と、次いＣ
   該（票識されたｍ１１）含有の溶媒と段階的に接触さけ
   るとき、第２の酵素は該免疫吸着域に、１．ｉいＴ：無
   拡ｔｔｌ（的に及び均一に結合しており、その際２つの
   酵素は１つの酵素の生成物が他の酵素の畢？Ｉ（である
   ことによって関連づけられ′Ｃいる、ことを特徴とづる
   該被検体の存在を決定Ｊる方法。　　　　□２、該標識
   が酵素であり且つ該ｆｆ１２の酵素が該免疫クロマトグ
   ラフに結合し′Ｃいる特ｂ′［５＾３ｐの範囲第１項記
   載の方法。 ３、少くとも１つの酵素が酸化還元酵素Ｃある特８′［
   請求の範囲第２項記載の方法。 ４、該標識されたｍ　ｉ　ｐ及び該試料が同一溶媒中に
   包含されている特許請求の範囲第′１，２又は３項のい
   ずれかに記載の方法。 ５、該標識されたｍ１１）が該被検体よりも遅いｉ！度
   で該免疫吸着域を移動し、被検体を含む領域及び被検体
   を含まない領域間の境界の回りに４５いて濃度が高くな
   る特！！Ｔ請求の範囲第５項記載の方法。 ９、該決定が、電…照ｑ１によつＣ検知しつる生成物に
   酵素的に転化される酵素基質を含む溶液中に該免疫吸着
   域を、浸りことを包含りる特８′［請求の範囲第４項記
   載の方法。 １、該生成物が可視光′Ｊ４域の光を吸収する特Ｍ’Ｆ
   請求の範囲第６１Ｒ１記載の方法。 ８、　？１１！検体を含ｈｒＪる疑いのある試わ１中の
   ｙＪ、検体の存在を決定づ−る方法であっ−Ｃ１ （Δ）溶媒の移動を可能としまた、特異的結合対日（＋
   ’ｎｌ＋ｌＩ　Ｊ　）の複数と第２の酵素の複数とが多
   孔貿支持体ｌ＼の無拡ｌｉｔ＜的に且つ均一に結合りる
   のを可能とりる多孔質支持体を持ち、且つ該支持体の第
   １端から離れる距離を延長しＣ免疫吸Ｎ１或を規定して
   いる免疫クロマトクラフ；及び（Ｂ）第１の酵素で標識
   された１１）、但しこの際該第１及び第２酵素が、１つ
   の酵素の生成物が他の酵素の基質であることによって関
   係があり且一 つ標識されたｍ　ｉ　ｐが該免疫吸着域の部分に関して
   該免疫吸着域に結合づるように選択さｆｌ、但し該被検
   体は該免疫吸着域において被検体の量に関ｉ’ｔ！し°
   Ｃ境界を規定してｄ５す、そして該酵素Ｊ３よび該支持
   体に結合り−る染＊３１を生成づる基質とが信号１１生
   系の員である、 を用いる該Ｉう法にｄ″３いて、 該免疫クロア１〜グラフを、該第１端にｄ′３い’Ｔ：
   　ｉｉｌ；利及び第１の酵素標識ｍ　ｌ　ｐを含む溶液
   と、該溶液の少くとも１部分が該免疫吸着域を横ＩＪＪ
   るのに十分な時間接触させ、その際該酵糸標識ｍ１１）
   は該免疫吸着域に結合した被検体と関ｊルしく該免疫吸
   着域にＪ′３いＣ結合し； 該免疫吸着域を基マ（含有溶液中で接触さｌ′ｃ、被検
   体が結合している領域を規定する該支持体上の該第２の
   酵素の環境に該染料を（１着さμ；そし該領域の境界で
   ある該免疫りし１７１〜グラフの１端からの距離を該試
   料中の被検１本の吊と間係づ（］る、 該被検１本の存在を決定づる該り法。 ９、該第１及び第２の酵素が酸化還元酵素である特許請
   求の範囲第８項記載の方法。 １０、該第１の酵素がベルΔキシターゼＣあり、該第２
   の酵素が過酸化水素を生成づる特許請求の範囲第９項記
   載の方法。 １１、該第２の酵素がＡキシターＵである特許請求の範
   囲第１０項記載の方法。 １２、該！４￥判が主に該境界に（＝Ｊ　Ｗ　する特訂
   乙ｉ′ｉ求の範囲第８項記載の方法。 １３、該染わ１が被検体が結合した該領域に亘っ乙イ」
   着する特許請求の範囲第８項記載の方法。