JPS587560A - 銅，亜鉛−ス−パ−オキシドディスムタ−ゼ測定用試薬 - Google Patents
銅，亜鉛−ス−パ−オキシドディスムタ−ゼ測定用試薬Info
- Publication number
- JPS587560A JPS587560A JP10507581A JP10507581A JPS587560A JP S587560 A JPS587560 A JP S587560A JP 10507581 A JP10507581 A JP 10507581A JP 10507581 A JP10507581 A JP 10507581A JP S587560 A JPS587560 A JP S587560A
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- Japan
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- sod
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-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発ＩｐｌＦｉヒト体液中の銅、亜鉛−スーパーオキシ
ドディスムターゼ（以下Ｃｕｅ Ｚｌｌ −ＳＯＤ
と称す）をサンドウィッチ法によるｌｌ撫免疫学的方法
により測定する試薬に関する。
ドディスムターゼ（以下Ｃｕｅ Ｚｌｌ −ＳＯＤ
と称す）をサンドウィッチ法によるｌｌ撫免疫学的方法
により測定する試薬に関する。
ヒト組織中にＣｖＡ、 Ｚｓ −ＳＯＤが広く分布する
こと蝶、すてに本発明者らが報告している（Ｊ。
こと蝶、すてに本発明者らが報告している（Ｊ。
Ｐｈａｒａ Ｄｙｅ、 ４ｅ ２３５〜２４４ ｅ
１９８１ ）ｏしかしながら、血清、尿などの体液中に
分泌されるＣｕ。
１９８１ ）ｏしかしながら、血清、尿などの体液中に
分泌されるＣｕ。
ｚｍ ＋ ５ｏＤＯ＠定法は、その含量が微量であるた
め診断の確実な指標となし得る程度に高感度。
め診断の確実な指標となし得る程度に高感度。
高精度に行≠得る方法として、未だ確立されていない。
一方、従来から、体液中の微ｉｌ成分を測定する手段と
して、抗原の検索を免疫学的に測定する方法（ゲル内免
疫拡散法、補体結合法、赤血球凝集反応など）が広く使
用されて−るが、測定感度の向上の面から放射性免疫測
定法（ラジオイムノアッセイ）が用いられるようｋなっ
てきた。しかしながら、放射性免疫測定法轢放射性物質
による環境汚染１人体への影響という面で満足の行くも
のではない。
して、抗原の検索を免疫学的に測定する方法（ゲル内免
疫拡散法、補体結合法、赤血球凝集反応など）が広く使
用されて−るが、測定感度の向上の面から放射性免疫測
定法（ラジオイムノアッセイ）が用いられるようｋなっ
てきた。しかしながら、放射性免疫測定法轢放射性物質
による環境汚染１人体への影響という面で満足の行くも
のではない。
本発明に係る酵素免疫測定法は、抗原−抗体結合反応を
利用して、酵素で標識した抗原もしくは抗体を使用し、
抗原−抗体結合物を生威せしめ、優られた物質の酵素活
性を測定することＫより、未知抗原量もしくは抗体量を
判定しようとするものであって、サンドウィッチ法もそ
の一つである。このサンドウィッチ法は複数の抗原基を
有する抗原に１懐数の抗体が結合することを利用し、抗
体−抗ａｔｍｉｓ＋抗体のサンドウィッチ型結合物を生
成させ、その４１縁抗体の酵素活性を測定することＫよ
シ、抗原量を判断しようとする方法であって、他の免疫
学的Ｉｌ走法に比幀し、５０〜１０，０００倍感度が高
い。
利用して、酵素で標識した抗原もしくは抗体を使用し、
抗原−抗体結合物を生威せしめ、優られた物質の酵素活
性を測定することＫより、未知抗原量もしくは抗体量を
判定しようとするものであって、サンドウィッチ法もそ
の一つである。このサンドウィッチ法は複数の抗原基を
有する抗原に１懐数の抗体が結合することを利用し、抗
体−抗ａｔｍｉｓ＋抗体のサンドウィッチ型結合物を生
成させ、その４１縁抗体の酵素活性を測定することＫよ
シ、抗原量を判断しようとする方法であって、他の免疫
学的Ｉｌ走法に比幀し、５０〜１０，０００倍感度が高
い。
そこで、本発明者らは各櫨疾患におけるＣｕ。
Ｚｎ −８０Ｄの変動を検索すべく、ヒト体液中のＣｕ
。
。
Ｚｎ −ＳＯＤの酵素免疫測定法に関し、鋭意に研究を
重ね、本発明物質を得ることに成功した。
重ね、本発明物質を得ることに成功した。
本発明の試薬は、次のように製造することができる。即
ち、ヒトのＣｕ 、 Ｚｎ −ＳＯＤを家兎に愚作して
抗Ｃｕ、 Ｚｎ −ＳＯＤ抗体を作製し、っき゛にこの
抗体をポリスチレンビーズ、ガラスピーズ。
ち、ヒトのＣｕ 、 Ｚｎ −ＳＯＤを家兎に愚作して
抗Ｃｕ、 Ｚｎ −ＳＯＤ抗体を作製し、っき゛にこの
抗体をポリスチレンビーズ、ガラスピーズ。
ナイロンビーズなどの不溶性担体と処理し、抗Ｃｕ 、
Ｚｍ −８０Ｄ抗体の結合した不溶化抗体を得る。
Ｚｍ −８０Ｄ抗体の結合した不溶化抗体を得る。
一方で、先と同様に製造し曳航Ｃｕ 、 Ｚｎ −８０
Ｄ抗体に、使用する酵素に最適な化合物（例えば、β−
ガンクトシダーゼに対しｍ−マレインイミドベンゾイル
−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル、パーオキシ
ダーゼに対しグルタルアルデヒドなど）、ついで酵素を
順次反応させて酵素標識抗Ｃｕ、 Ｚｎ−８ＯＤ抗体を
得る。この場合、化合物と酵素を先に反応させて後、抗
体を結合させてもよ−。
Ｄ抗体に、使用する酵素に最適な化合物（例えば、β−
ガンクトシダーゼに対しｍ−マレインイミドベンゾイル
−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル、パーオキシ
ダーゼに対しグルタルアルデヒドなど）、ついで酵素を
順次反応させて酵素標識抗Ｃｕ、 Ｚｎ−８ＯＤ抗体を
得る。この場合、化合物と酵素を先に反応させて後、抗
体を結合させてもよ−。
このようにして得られた抗Ｃｕ 、 Ｚｍ −８０Ｄ抗
体結合担体と酵素標謙抗Ｃｕ 、 Ｚｌｌ −ＳＯＤ抗
体を用い、腎疾患の血清および尿中の（ｕ 、 ７．＊
−８０Ｄを測定したところ、両者とも健常人に比べ、
特異的に上昇することが判明し九。
体結合担体と酵素標謙抗Ｃｕ 、 Ｚｌｌ −ＳＯＤ抗
体を用い、腎疾患の血清および尿中の（ｕ 、 ７．＊
−８０Ｄを測定したところ、両者とも健常人に比べ、
特異的に上昇することが判明し九。
したがって、本発明−質は腎疾患の診断に有用である。
次に実施例をあげて更に詳細にｍ明する。
ＪｕＥ性
（１） Ｃｕ ｅ Ｚｎ −８０Ｄ抗体の作製家兎１匹
に対してＣｕ、 Ｚｎ−８ＯＤ ｌ城を含む溶液ｌ−を
Ｆｒ＠ｕｎｄのコンプリート・アジ為パント（ｃｏｍｐ
ｌ＠ｔ＠ａｄＪｓ１ｖａｎｔ ） １−混合して作製
した乳剤を背中の皮下および四肢の爪の間に注射する０
ａ８１回目の免疫から２週間後に第１圓目と同様の乳剤
を家兎の皮下に注射した。
に対してＣｕ、 Ｚｎ−８ＯＤ ｌ城を含む溶液ｌ−を
Ｆｒ＠ｕｎｄのコンプリート・アジ為パント（ｃｏｍｐ
ｌ＠ｔ＠ａｄＪｓ１ｖａｎｔ ） １−混合して作製
した乳剤を背中の皮下および四肢の爪の間に注射する０
ａ８１回目の免疫から２週間後に第１圓目と同様の乳剤
を家兎の皮下に注射した。
同様な免疫操作を２〜３回繰り返した後、家兎の頚動脈
より血液を採取し、３７℃、３０分間の加温後、３．０
０Ｏｒｐｍ、 １５分遠心を行い血清を得る。この血清
につｌＡ３６℃、３０分の熱処理を行−１袖体の非動化
を行−１２０ｍＭ ＩＪン酸緩衡液（ｐＨ８，０）を血
清と同量加えて、血清と同容量の飽和硫酸アンモニウム
を加えて３３襲飽和とし、そこで析出する沈殿を１２ｅ
０００ｒｐ＋ｎ、１５分の遠心により集め、少量の同上
緩衝液に溶解後、同緩衝液を用いて透析を行い、硫酸ア
ンモニウムを完全に除く。
より血液を採取し、３７℃、３０分間の加温後、３．０
０Ｏｒｐｍ、 １５分遠心を行い血清を得る。この血清
につｌＡ３６℃、３０分の熱処理を行−１袖体の非動化
を行−１２０ｍＭ ＩＪン酸緩衡液（ｐＨ８，０）を血
清と同量加えて、血清と同容量の飽和硫酸アンモニウム
を加えて３３襲飽和とし、そこで析出する沈殿を１２ｅ
０００ｒｐ＋ｎ、１５分の遠心により集め、少量の同上
緩衝液に溶解後、同緩衝液を用いて透析を行い、硫酸ア
ンモニウムを完全に除く。
ここで得られた一分を２０ｍＭ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ８
，０）により緩衝化された〇ＥＡＩＣ−セルロースカラ
ム（２，５Ｘ１５国）に添加し、力２ムに吸着せず同上
ｌｌｌ液液より流出する一分を集め、２いも−のタンパ
ク蓋になるように同上緩衝液により、希釈し、これを抗
Ｃｕ ａ Ｚｌｌ−ＳＯＤ抗体とし、それぞれを分注し
、凍結乾燥し一３０℃で保存する。
，０）により緩衝化された〇ＥＡＩＣ−セルロースカラ
ム（２，５Ｘ１５国）に添加し、力２ムに吸着せず同上
ｌｌｌ液液より流出する一分を集め、２いも−のタンパ
ク蓋になるように同上緩衝液により、希釈し、これを抗
Ｃｕ ａ Ｚｌｌ−ＳＯＤ抗体とし、それぞれを分注し
、凍結乾燥し一３０℃で保存する。
（２）抗Ｃｕ 、 Ｚｎ −ＳＯＤ抗体結合ポリスチレ
ンビーズの御飯 凍結乾燥した抗体４０ｒ４を５０ｍＭ塩化ナトリウムを
含む０．１Ｍリン酸ナトリウムＩＩ衝’＊（ｐＨ７−０
）４０ｗｔに溶解し、この溶液中に、十分洗浄（強力な
洗剤等による）し九ポリスチレンビーズ（直径約３．２
ｍ）を１，０００〜１０，０００個加え、３０℃で２時
間縁とうする。抗体溶液を除いた後、０．１％ウシ血清
アルブミンを含む同上緩衝液でビーズを洗浄後、同緩衝
液を加え、さらに３０℃で２時間縁とうする〇さらに同
緩衝液で洗浄後、アジ化ナトリウム濃度が０．１％にな
るように加え、同−ｌ１ｌ１１１櫃中にビーズを保存す
る。
ンビーズの御飯 凍結乾燥した抗体４０ｒ４を５０ｍＭ塩化ナトリウムを
含む０．１Ｍリン酸ナトリウムＩＩ衝’＊（ｐＨ７−０
）４０ｗｔに溶解し、この溶液中に、十分洗浄（強力な
洗剤等による）し九ポリスチレンビーズ（直径約３．２
ｍ）を１，０００〜１０，０００個加え、３０℃で２時
間縁とうする。抗体溶液を除いた後、０．１％ウシ血清
アルブミンを含む同上緩衝液でビーズを洗浄後、同緩衝
液を加え、さらに３０℃で２時間縁とうする〇さらに同
緩衝液で洗浄後、アジ化ナトリウム濃度が０．１％にな
るように加え、同−ｌ１ｌ１１１櫃中にビーズを保存す
る。
（３）抗Ｃｕ 、 Ｚｍ−８０Ｄ抗体結合ガラスピーズ
の調鯛ガラスピーズ（直径約４ ｍ） ５，０００”１
０，０００個を１０％ｒ−アミノグロビル・トリエトオ
シシランを含むトルエンａｐ＆２００−に加え３０分ｉ
ｊ！室温で反応後、上記溶鍛をガラスフィルターにて＃
失し、トルエンにて十分洗浄後、アルキルアミン化ガラ
スピーズを乾燥し九後、０・２％抗Ｃｖｓ 、 Ｚｎ
−ＳＯＤ抗俸を含有する２０ｍＭＶ ／ａ［液液（ｐＨ
７，４） ５００−中に加えた後、よく攪拌しながらグ
ルタルアルデヒドを終湯＆０．１〜１％になるように加
え、４℃にて１２時間振とう反応させる。ここで得られ
た抗８０Ｄ担体結合ガラスピーズを０．１％ウシ血清ア
ルブミンを含有する０、１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（
ｐＨ７，０）にて十分に洗浄後、０．１蝿アジ化ナトリ
ウムを含む同上緩衝液５００ｍ中に４℃にて保存する◎ （４） 抗Ｃｕ 、 Ｚｎ −８００抗体結合ナイロン
ビーズの調製ナイロンビーズ（直径約３１ｍ）１．ｏｏ
ｏ〜１０．０００個を１２．５％Ｆリエチル争オ命ンニ
ウム・テトラフルオロボレートを含むジクロルメタン溶
ｆｉ１００ＷＩｌに加え２５℃で１５分間反応後、水素
化カルシウムで水分を除いえジクロルメタン５００−に
て洗浄する。上記〇−アルキル化ナイロ／ビーズをジア
ミノメタン１０〇−中に加えて、室温で２時間反応後、
０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，５） Ｋて５０〇−に
て洗浄後、５％グルタルアルデヒドを含む同上緩衝液１
ｏ〇−中に加えて室温で１５分反応させる。このビーズ
をさらに２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）
５００−で洗浄後、Ｉｎ／ｍの抗体を含む同上緩衝液５
００−中に加え、４℃で一夜反応を行い、０．１％ウシ
血清アルプミ７，０．１−アジ化ナトリウムを含む２０
−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）で十分洗浄した
後、同上緩衝液中で４℃にて保存する。
の調鯛ガラスピーズ（直径約４ ｍ） ５，０００”１
０，０００個を１０％ｒ−アミノグロビル・トリエトオ
シシランを含むトルエンａｐ＆２００−に加え３０分ｉ
ｊ！室温で反応後、上記溶鍛をガラスフィルターにて＃
失し、トルエンにて十分洗浄後、アルキルアミン化ガラ
スピーズを乾燥し九後、０・２％抗Ｃｖｓ 、 Ｚｎ
−ＳＯＤ抗俸を含有する２０ｍＭＶ ／ａ［液液（ｐＨ
７，４） ５００−中に加えた後、よく攪拌しながらグ
ルタルアルデヒドを終湯＆０．１〜１％になるように加
え、４℃にて１２時間振とう反応させる。ここで得られ
た抗８０Ｄ担体結合ガラスピーズを０．１％ウシ血清ア
ルブミンを含有する０、１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（
ｐＨ７，０）にて十分に洗浄後、０．１蝿アジ化ナトリ
ウムを含む同上緩衝液５００ｍ中に４℃にて保存する◎ （４） 抗Ｃｕ 、 Ｚｎ −８００抗体結合ナイロン
ビーズの調製ナイロンビーズ（直径約３１ｍ）１．ｏｏ
ｏ〜１０．０００個を１２．５％Ｆリエチル争オ命ンニ
ウム・テトラフルオロボレートを含むジクロルメタン溶
ｆｉ１００ＷＩｌに加え２５℃で１５分間反応後、水素
化カルシウムで水分を除いえジクロルメタン５００−に
て洗浄する。上記〇−アルキル化ナイロ／ビーズをジア
ミノメタン１０〇−中に加えて、室温で２時間反応後、
０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，５） Ｋて５０〇−に
て洗浄後、５％グルタルアルデヒドを含む同上緩衝液１
ｏ〇−中に加えて室温で１５分反応させる。このビーズ
をさらに２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）
５００−で洗浄後、Ｉｎ／ｍの抗体を含む同上緩衝液５
００−中に加え、４℃で一夜反応を行い、０．１％ウシ
血清アルプミ７，０．１−アジ化ナトリウムを含む２０
−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）で十分洗浄した
後、同上緩衝液中で４℃にて保存する。
（５）β−ガラクトシダーゼ標１抗Ｃｕ 、 Ｚａ −
ＳＯＤ抗体の調製 凍結乾燥した抗体１．５ｍｇを５０−塩化ナトリウムを
含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，５）
１．５ ｓｄＫ溶解し、これに２％ｍ−マレインイミド
ベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ・サクシンイミド・エステ
ル（Ｍｇ２）のジオキサン溶液１５ＩＬｔ加え、３０℃
で１時間反応後、同上５０ｍ１ｌ壌化ｉグネシウム、０
．ＩＭｊＪＩ化ナトリタナトリウム０−リン酸ナトリウ
ム緩衝ｌｌ１（ｐＨ７，５）により緩衝化されたカラム
体を得る。このＭＩＩＳ化抗体濱液にＥ、 Ｃｏ１１産
生β−ガラクトシダーゼ１．５ｗ４Ｉを加えて、３０℃
で１時間反応後、最終濃度１ｍＭになるようにメルカプ
トエタノールを加える。さらにβ−ガラクトシダーゼ４
１１１１Ｉ抗体を０．１％ウシ血清アルプξン、０．１
％アジ化ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、１−塩
化マグネシウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７，０）でｌＩ麹化されたセファロース４Ｂカラ
ム（１，５Ｘ４０５１）に添加し、β−ガラクトシダー
ゼ結合抗体を分離する。β−ガ２クトシダーゼ活性を有
する抗体１分のピークを集め、βガラクトシダーゼ４１
１１１ｉｋ抗体とし４℃で保存する。
ＳＯＤ抗体の調製 凍結乾燥した抗体１．５ｍｇを５０−塩化ナトリウムを
含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，５）
１．５ ｓｄＫ溶解し、これに２％ｍ−マレインイミド
ベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ・サクシンイミド・エステ
ル（Ｍｇ２）のジオキサン溶液１５ＩＬｔ加え、３０℃
で１時間反応後、同上５０ｍ１ｌ壌化ｉグネシウム、０
．ＩＭｊＪＩ化ナトリタナトリウム０−リン酸ナトリウ
ム緩衝ｌｌ１（ｐＨ７，５）により緩衝化されたカラム
体を得る。このＭＩＩＳ化抗体濱液にＥ、 Ｃｏ１１産
生β−ガラクトシダーゼ１．５ｗ４Ｉを加えて、３０℃
で１時間反応後、最終濃度１ｍＭになるようにメルカプ
トエタノールを加える。さらにβ−ガラクトシダーゼ４
１１１１Ｉ抗体を０．１％ウシ血清アルプξン、０．１
％アジ化ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、１−塩
化マグネシウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７，０）でｌＩ麹化されたセファロース４Ｂカラ
ム（１，５Ｘ４０５１）に添加し、β−ガラクトシダー
ゼ結合抗体を分離する。β−ガ２クトシダーゼ活性を有
する抗体１分のピークを集め、βガラクトシダーゼ４１
１１１ｉｋ抗体とし４℃で保存する。
（６） パーオキシダーゼ４１Ｉｗ！抗Ｃｕ、 Ｚｎ−
８ＯＤ抗体の調製西洋ワヤビから精製されたパーオキシ
ダーゼ（ＰＯＤ）４０−を１．２５％グルタルアルデヒ
ドを含む０．１Ｍリン酸！１衡ｔ＆ （ＰＨ７，５）
０．３−に溶解し、室温で１８時間反応する０グルタル
アルテヒド化ＰＯＤを０．１５４Ｍ４化ナトリウムで緩
衝化きれたセファデックスＧ−２５カラム（１，５Ｘ
６０５１） Ｋ添加し、遊離のグルタルアルデヒドを除
く。上記グルタルアルデヒド化ＰＯＤ溶液に抗体１０４
ＩＩＩを溶解、さらＫＩＭｊｉｉ酸６％液（ｐ）Ｉ ９
．５） ０．２ｍ’＆ｔＫｌ、４℃で２４時間反応後、
０．２Ｍ Ｌ−！Ｊシラン加え、室温で２時間反応させ
る。上記反応液を０．１５４Ｍ塩化ナトリウムを含む１
０ａＭリン綾緩衡液（ＰＨ７，２）Ｋより緩衝化させた
セファデックスＧ−２００カラム（１，５Ｘ ７０ａ＊
） ｅｃ添加し、ＰＯＤ Ｉｍ ｍ抗体を得る。ＰＯＤ
活性を有する抗体−分を集め終濃度０．１％になるよう
に１ウシ血清アルブミンおよびアジ化ナトリウムを加え
４℃にて保存する。
８ＯＤ抗体の調製西洋ワヤビから精製されたパーオキシ
ダーゼ（ＰＯＤ）４０−を１．２５％グルタルアルデヒ
ドを含む０．１Ｍリン酸！１衡ｔ＆ （ＰＨ７，５）
０．３−に溶解し、室温で１８時間反応する０グルタル
アルテヒド化ＰＯＤを０．１５４Ｍ４化ナトリウムで緩
衝化きれたセファデックスＧ−２５カラム（１，５Ｘ
６０５１） Ｋ添加し、遊離のグルタルアルデヒドを除
く。上記グルタルアルデヒド化ＰＯＤ溶液に抗体１０４
ＩＩＩを溶解、さらＫＩＭｊｉｉ酸６％液（ｐ）Ｉ ９
．５） ０．２ｍ’＆ｔＫｌ、４℃で２４時間反応後、
０．２Ｍ Ｌ−！Ｊシラン加え、室温で２時間反応させ
る。上記反応液を０．１５４Ｍ塩化ナトリウムを含む１
０ａＭリン綾緩衡液（ＰＨ７，２）Ｋより緩衝化させた
セファデックスＧ−２００カラム（１，５Ｘ ７０ａ＊
） ｅｃ添加し、ＰＯＤ Ｉｍ ｍ抗体を得る。ＰＯＤ
活性を有する抗体−分を集め終濃度０．１％になるよう
に１ウシ血清アルブミンおよびアジ化ナトリウムを加え
４℃にて保存する。
１１１ユ
（１）抗Ｃｍ、 Ｚｎ −８０ｕ抗体結合ポリスチレン
ビーズを用−る方法（方法ｌ） 測定対象試料１０ＩＬＬ あるいは濃度既知標準Ｃｍ
、 Ｚｎ−８０Ｄ溶ｔｅｌ （０、０，０５、０，１０
、０，２０゜０．５０． １．０．２．０．５．０．
１０．Ｏｎ９／１００μｔ）１００襲！とり、最終容量
２００Ａ！になるように０．１囁ウシ血清アルブミン、
０．１−アジ化ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウムｙ
ｌｏｍＭ塩化ナトリウムを含む１０−リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）（バッファーＥ）加えて、前記（２）で得ら
れた抗体結合ポリスチレンビーズをそれぞれ１個加え、
３７℃で２時間反応後、１．５−のバッファーＩＫて２
回洗浄する。このビーズに２００ＭのバッファーΣおよ
び前記（５）のβ−ガラクトシダーゼ橡−抗体濱液５屏
を加え、３７℃で２時間反応させ、１．５Ｗｄのバッフ
ァーＫＫて２回洗浄を行う。洗浄されたビーズを別の試
験管に取り、２００ＩＬｔのバッファーＥを加え、３０
℃で５分間予備加温の後、０．３ｍＭ４−メチルウンベ
リフェリル−β−ガラクトシド溶液１００ｇを加えて３
０ｕで５〜２０分間反応を行い、０．１Ｍグリシン−水
酸化ナトリウム緩衝液（ｐ）１１０．３）を２．５ ｍ
ｇ加えた後、励起波長３６０ ｗｎ ｅ 金光波長４５
０ ｍ Ｋて螢光測定し、β−ガラクトシダーゼの酵素
活性を測定する。第１図ａａ本法によ口Ｃｕ、ｇＢ−Ｂ
ＯＤＣ）＠準曲線を示す◎ （２）抗Ｃｕｅ Ｚｎ−８０ｕ抗体結合ポリスチレンビ
ーズを用−ゐ方法（方法２） 測定対象試料ＩＱ４ある一線濃度既知の標準ＣＩｌ、
Ｚ！Ｉ −８０Ｄ溶液（０，０，０５，０，１０゜０．
２０．０．５０． １．０．２．０． ５．０． １０
．０ｄ／１０Ｑｇ） ｌ Ｑ Ｏ４をとり最終容量２０
０４になるようＫＯ９１％ウシ血清フルブミン。
ビーズを用−る方法（方法ｌ） 測定対象試料１０ＩＬＬ あるいは濃度既知標準Ｃｍ
、 Ｚｎ−８０Ｄ溶ｔｅｌ （０、０，０５、０，１０
、０，２０゜０．５０． １．０．２．０．５．０．
１０．Ｏｎ９／１００μｔ）１００襲！とり、最終容量
２００Ａ！になるように０．１囁ウシ血清アルブミン、
０．１−アジ化ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウムｙ
ｌｏｍＭ塩化ナトリウムを含む１０−リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）（バッファーＥ）加えて、前記（２）で得ら
れた抗体結合ポリスチレンビーズをそれぞれ１個加え、
３７℃で２時間反応後、１．５−のバッファーＩＫて２
回洗浄する。このビーズに２００ＭのバッファーΣおよ
び前記（５）のβ−ガラクトシダーゼ橡−抗体濱液５屏
を加え、３７℃で２時間反応させ、１．５Ｗｄのバッフ
ァーＫＫて２回洗浄を行う。洗浄されたビーズを別の試
験管に取り、２００ＩＬｔのバッファーＥを加え、３０
℃で５分間予備加温の後、０．３ｍＭ４−メチルウンベ
リフェリル−β−ガラクトシド溶液１００ｇを加えて３
０ｕで５〜２０分間反応を行い、０．１Ｍグリシン−水
酸化ナトリウム緩衝液（ｐ）１１０．３）を２．５ ｍ
ｇ加えた後、励起波長３６０ ｗｎ ｅ 金光波長４５
０ ｍ Ｋて螢光測定し、β−ガラクトシダーゼの酵素
活性を測定する。第１図ａａ本法によ口Ｃｕ、ｇＢ−Ｂ
ＯＤＣ）＠準曲線を示す◎ （２）抗Ｃｕｅ Ｚｎ−８０ｕ抗体結合ポリスチレンビ
ーズを用−ゐ方法（方法２） 測定対象試料ＩＱ４ある一線濃度既知の標準ＣＩｌ、
Ｚ！Ｉ −８０Ｄ溶液（０，０，０５，０，１０゜０．
２０．０．５０． １．０．２．０． ５．０． １０
．０ｄ／１０Ｑｇ） ｌ Ｑ Ｏ４をとり最終容量２０
０４になるようＫＯ９１％ウシ血清フルブミン。
０．０１％テオメルサール＊１０ａａ（塩化ナトリウム
を含む１０−リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）（バッファー
Ｐ）を加えて、前記（２）で得られた抗体結合ポリスチ
レンビーズをそれぞれ１個加え、３７℃で２時間反応後
、１．５−のバッフｙ−ｐにて２回洗浄する。このビー
ズに２００ＭのバッファーＰおよび前記（５）のＰＯＤ
標謙標体抗体溶液５ＩＬＬえ、３７℃で２時間反応し、
１．５−のバッファーＰＫて２回洗浄を行つ。
を含む１０−リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）（バッファー
Ｐ）を加えて、前記（２）で得られた抗体結合ポリスチ
レンビーズをそれぞれ１個加え、３７℃で２時間反応後
、１．５−のバッフｙ−ｐにて２回洗浄する。このビー
ズに２００ＭのバッファーＰおよび前記（５）のＰＯＤ
標謙標体抗体溶液５ＩＬＬえ、３７℃で２時間反応し、
１．５−のバッファーＰＫて２回洗浄を行つ。
洗浄されたビーズを別の試験管に取り、０．３襲オルト
フ工ニレンジアミン二ｍａｍ塩、０．０２襲過酸化水素
および０．０１−チオメルナールを含む０．１Ｍクエン
酸−リン酸緩衝液（ｐＨ６，０）０．３−を加えて３０
℃で５〜２０分間反応を行い、ＩＮ塩酸２．５−加え九
後＜４９２ａｍで吸光度測定を行う。ｗ４２図ａａ本法
によるＣｕ 、 Ｚｎ ” ８０Ｄの標準曲線を示す。
フ工ニレンジアミン二ｍａｍ塩、０．０２襲過酸化水素
および０．０１−チオメルナールを含む０．１Ｍクエン
酸−リン酸緩衝液（ｐＨ６，０）０．３−を加えて３０
℃で５〜２０分間反応を行い、ＩＮ塩酸２．５−加え九
後＜４９２ａｍで吸光度測定を行う。ｗ４２図ａａ本法
によるＣｕ 、 Ｚｎ ” ８０Ｄの標準曲線を示す。
実験例２
（１）抗Ｃｕ、 Ｚｎ −８０ｕ抗体結合ガラスピーズ
を用−る方法（方法１） 前記（３）で調製した抗Ｃｗａ 、 Ｚｎ−１１０Ｄ抗
体結合ガラスピーズを使用する以外社実験例１の（１）
と同様に操作を行う。ただし、拳法によゐＣｕ。
を用−る方法（方法１） 前記（３）で調製した抗Ｃｗａ 、 Ｚｎ−１１０Ｄ抗
体結合ガラスピーズを使用する以外社実験例１の（１）
と同様に操作を行う。ただし、拳法によゐＣｕ。
Ｚｍ −ＳＯＤ ＋２）標準白−を第１図すに示し喪。
（２）抗Ｃｖｓ 、 Ｚｎ −８０ｕ抗体結合ガラスピ
ーズを用いる方法（方法２） 前記（３）で調製した抗Ｃｕ ｅ Ｚｎ −ＳＯＤ抗体
結合ガラスピーズを使用する以外蝶実験例１１２１と同
様に操作を行う。ただし、拳法によるＣｕ。
ーズを用いる方法（方法２） 前記（３）で調製した抗Ｃｕ ｅ Ｚｎ −ＳＯＤ抗体
結合ガラスピーズを使用する以外蝶実験例１１２１と同
様に操作を行う。ただし、拳法によるＣｕ。
Ｚｍ −ＳＯＤの標準曲線を１８２１ＷｂＫ示しえ。
皇蓋亘１
（１１抗Ｃｕ 、 Ｚ！１− ＳＯＤ抗体結合ナイロン
ビーズを用−る方法（方法１） 前記（４）でＩｌｌ！した抗Ｃｍ 、 Ｚ！Ｌ −ＳＯ
Ｄ抗俸結合ナイロンビーズを使用する以外は実験例１の
（１）と同様に操作を行う。九だし、拳法によゐＣｍ、
Ｚｎ −８０Ｄ Ｏ標準曲線を第Ｉ ＷＪ ＠に示し
た。
ビーズを用−る方法（方法１） 前記（４）でＩｌｌ！した抗Ｃｍ 、 Ｚ！Ｌ −ＳＯ
Ｄ抗俸結合ナイロンビーズを使用する以外は実験例１の
（１）と同様に操作を行う。九だし、拳法によゐＣｍ、
Ｚｎ −８０Ｄ Ｏ標準曲線を第Ｉ ＷＪ ＠に示し
た。
（２）抗Ｃｕ 、 Ｚｎ−１ｉ０Ｄ抗体結合ナイロンビ
ーズを用−る方法（方法２） 前記（４）で制御した抗Ｃｕ、 Ｚｍ−８０Ｄ抗体結合
ナイロンビーズを使用する以外は実験例１の（２）と四
種Ｋｍ作を行う。ただし、本性によるＣｕ 、 Ｚｔ＋
−８００の標準白−を絡２図Ｃに示した。
ーズを用−る方法（方法２） 前記（４）で制御した抗Ｃｕ、 Ｚｍ−８０Ｄ抗体結合
ナイロンビーズを使用する以外は実験例１の（２）と四
種Ｋｍ作を行う。ただし、本性によるＣｕ 、 Ｚｔ＋
−８００の標準白−を絡２図Ｃに示した。
各実験例における標準Ｃｕ、 Ｚｎ−８００、血清。
尿検における同時再現性および日差羨動を第１表および
８２表に示す。
８２表に示す。
８１表 Ｉ−ガラクトシダーゼ蒙厳抗体を用−たＣ１１
＃ Ｚｎ −８０Ｄ ＯＩＩＩ嵩免疫測定法の再現性−
２表 ＰＯＤ榛除抗体を用いたＣｔＩｔ Ｚｎ−８０
Ｄの酵素免疫測定法のＰ４現性 β−〇ａｌ ｔ β−ガラクトシダーゼ橡餉抗体ＰＯ
Ｄｇ ＰＯＤＩＩ録抗体 １、各検体の同時再現社５ｓの濃度の異なる検体の１０
回繰り返し実験を行った結果である。
＃ Ｚｎ −８０Ｄ ＯＩＩＩ嵩免疫測定法の再現性−
２表 ＰＯＤ榛除抗体を用いたＣｔＩｔ Ｚｎ−８０
Ｄの酵素免疫測定法のＰ４現性 β−〇ａｌ ｔ β−ガラクトシダーゼ橡餉抗体ＰＯ
Ｄｇ ＰＯＤＩＩ録抗体 １、各検体の同時再現社５ｓの濃度の異なる検体の１０
回繰り返し実験を行った結果である。
２、各検体の日差変動Ｆｉ５−の濃度０Ｊ１４なる検体
をｌＯ日日間り返し実験を行った結果である。
をｌＯ日日間り返し実験を行った結果である。
各種疾患患者血清および尿中のＣｍ、 Ｚｍ−１１０Ｄ
。
。
本酵素免疫測定法による濶定結果
各種疾患患者血清中のＣ１Ｉ、 Ｚｍ−１１０Ｄ量を第
３図に、尿中のＣｍ、 Ｚｎ−８０Ｄ 量を第４ＷＩＪ
Ｋ示した。図中、（）内の数字は症例数を表わす。この
結果、血清中および尿中のＣｕ、 Ｚｎ−８０Ｄ量は腎
疾患患者で特異的に上昇して−た。
３図に、尿中のＣｍ、 Ｚｎ−８０Ｄ 量を第４ＷＩＪ
Ｋ示した。図中、（）内の数字は症例数を表わす。この
結果、血清中および尿中のＣｕ、 Ｚｎ−８０Ｄ量は腎
疾患患者で特異的に上昇して−た。
第１図および第２図社本発明の実験例１〜３における既
知濃度標準Ｃｕ 、 Ｚｎ −８０Ｄ量を横軸に対数で
取り、β−ガラクトシダーゼをｍｍｅ素として用い九場
合は酵素活性を、ＰＯＤを用−た場合１１吸光度を縦軸
にとったグラフを示すものである。 第３図および第４８！ｆｆａそれぞれ本発明の試薬を用
い九番ＩＩ疾患患者の血清および尿中のＣｕ。 Ｚａ −８００量を示すグラフである。 １−１−１．１ 第３図 第４図
知濃度標準Ｃｕ 、 Ｚｎ −８０Ｄ量を横軸に対数で
取り、β−ガラクトシダーゼをｍｍｅ素として用い九場
合は酵素活性を、ＰＯＤを用−た場合１１吸光度を縦軸
にとったグラフを示すものである。 第３図および第４８！ｆｆａそれぞれ本発明の試薬を用
い九番ＩＩ疾患患者の血清および尿中のＣｕ。 Ｚａ −８００量を示すグラフである。 １−１−１．１ 第３図 第４図
Claims (1)
- １、精製したヒトの銅、亜鉛−スーパーオキシドディス
ムターゼを抗原として得られる抗銅、亜鉛−スーパーオ
キシドデイスムターゼ抗体を酵素と共有結合により結合
した酵素標識抗体と、該抗ｍ、ｍ鉛−スーパーオキシド
デイスムターゼ抗体を共有結合または物理的吸着により
不溶性担体に結合した不溶化抗体からなるサンドウィッ
チ法によるヒト体液中の銅９Ｍ船−スーパーオ中シトデ
ィスムターゼ測定用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10507581A JPS587560A (ja) | 1981-07-07 | 1981-07-07 | 銅，亜鉛−ス−パ−オキシドディスムタ−ゼ測定用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10507581A JPS587560A (ja) | 1981-07-07 | 1981-07-07 | 銅，亜鉛−ス−パ−オキシドディスムタ−ゼ測定用試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS587560A true JPS587560A (ja) | 1983-01-17 |
Family
ID=14397816
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10507581A Pending JPS587560A (ja) | 1981-07-07 | 1981-07-07 | 銅，亜鉛−ス−パ−オキシドディスムタ−ゼ測定用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS587560A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59143000A (ja) * | 1983-09-07 | 1984-08-16 | トキコ株式会社 | 給油装置 |
| JPS61202162A (ja) * | 1985-03-06 | 1986-09-06 | Fuji Yakuhin Kogyo Kk | ヒト血中のヒトプロリルヒドロキシラーゼの酵素免疫定量法 |
| EP0279705A2 (en) * | 1987-02-20 | 1988-08-24 | Monoclonetics International, Inc. | Screening body fluids for superoxide dismutase (SOD-1) for determining fetal trisomy 21 down syndrome, and antibodies, hybridomas and kits therefor |
| US4910133A (en) * | 1985-08-29 | 1990-03-20 | Ube Industries, Limited | Diagnostic test drug comprising monoclonal antibody to human copper.zinc-superoxide dismutase and diagnostic test method using the same |
-
1981
- 1981-07-07 JP JP10507581A patent/JPS587560A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59143000A (ja) * | 1983-09-07 | 1984-08-16 | トキコ株式会社 | 給油装置 |
| JPS61202162A (ja) * | 1985-03-06 | 1986-09-06 | Fuji Yakuhin Kogyo Kk | ヒト血中のヒトプロリルヒドロキシラーゼの酵素免疫定量法 |
| US4910133A (en) * | 1985-08-29 | 1990-03-20 | Ube Industries, Limited | Diagnostic test drug comprising monoclonal antibody to human copper.zinc-superoxide dismutase and diagnostic test method using the same |
| EP0279705A2 (en) * | 1987-02-20 | 1988-08-24 | Monoclonetics International, Inc. | Screening body fluids for superoxide dismutase (SOD-1) for determining fetal trisomy 21 down syndrome, and antibodies, hybridomas and kits therefor |
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