JPS6140066B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、体液中の抗原性物質の測定試薬及び
測定方法に関する。 健康な人の体液中には存在せず、ある種の疾病
に羅患した人の体液中には検出される抗原性物質
を測定することは、疾病の診断に極めて重要にな
つている。例えば、α−フエトプロテイン（以下
α−FPと記す）は、胎生期に特有な蛋白質で通
常の成人の体液中には検出されないが、ある種の
疾患、特に原発性肝癌、肝炎、肝硬変、転移性肝
癌、異常妊娠等の場合に増加するので、体液中の
α−FP濃度の測定は臨床上極めて重要である。 抗原性物質を測定するため、従来種々の方法が
提案されており、特に、ラジオイムノアツセイ法
及び酵素免疫定量法は高い測定感度を示すと言わ
れている。酵素免疫定量法は、ラジオイムノアツ
セイ法のようにアイソトープ使用による危険性や
高価な設備を要するなどの欠点を有しないが、試
薬の調製が困難であり、未だ満足できる実用的方
法は開発されていない。酵素免疫定量法のうち、
本発明はいわゆるサンドイツチ法に属するが、サ
ンドイツチ法についても、１抗体を不溶性担体に
結合させる方法、２酵素を抗体に標識する方法、
３標識した抗体と抗原との結合の特異性を高める
方法、４酵素標識抗体の酵素活性を測定する試薬
及び方法、５酵素の安定性等の点から改良が望ま
れている。殊に、１の抗体を不溶性担体に結合さ
せる方法の改良は、測定の正確性及び感度を高め
るために、最も重要であり、若干の改良法が提案
されている。例えば、特公昭45−38543号公報
は、担体を臭化シアンで活性化して抗体蛋白質を
結合させる方法を提案している。しかしながらこ
の方法では毒性が強い臭化シアンを使用するた
め、製造上の設備費が高く、取扱いに問題がある
ばかりでなく、臭化シアン化多糖類に結合した免
疫吸着体は抗原−抗体反応以外（非特異）の反応
を多数起すため、測定精度が低い。 本発明は、毒性がなく、取扱い上問題がなく、
しかも安価な原料物質を使用して、限られた量の
担体にできるだけ多量の抗体を失活させることな
く結合させることにより、抗原性物質を高感度
で、正確に測定しうる測定試薬及び測定方法を提
供することを目的とする。 本発明による抗原性物質の測定試薬は、紙片
にエピクロルヒドリン及びｐ−アミノフエノール
を結合させ、更にグルタルアルデヒドと反応さ
せ、測定対象に対する抗体と反応させて成ること
を特徴とする。 本発明において、エピクロルヒドリンによるエ
ポキシ化により、紙片の強度が向上し、ｐ−ア
ミノフエノールによるアミノ化により、担体とグ
ルタルアルデヒドとの反応性が向上する。従つ
て、本発明による抗体結合紙片（測定試薬）
は、多量の抗体蛋白質を結合でき、しかも結合し
た抗体の特異性及び力価も長期間安定である。 本発明による抗原性物質の測定方法は、上記
紙片に測定すべき抗原性物質を固定させ、アルカ
リ性フオスフアターゼで標識した抗体を結合さ
せ、その後、結合又は遊離したフオスフアターゼ
標識抗体の量をその酵素活性により測定すること
を特徴とする。 本発明方法をα−FPの測定を例にとつて以下
に詳述する。 ヒトα−FPに対する抗体蛋白質を結合した
紙片（抗α−FP結合紙片）を被検液中に投入
し、被検液中のα−FPを固定させる。紙片を
取り出し、余剰の被検液を洗浄後、酵素、即ちア
ルカリ性フオスフアターゼ（以下AL−Ｐと記
す）と結合した抗α−FP抗体蛋白（AL−Ｐ結合
抗α−FP）を加えて、インキユベーシヨンす
る。その際、紙片に固定されたα−FPの空い
ている抗原決定基に対し、AL−Ｐ結合抗α−FP
の抗体部分が結合する。余剰のAL−Ｐ結合抗α
−FPを洗浄後、AL−Ｐの酵素活性を測定する。
この酵素活性は固定されたα−FPの量に比例す
るので被検液中のα−FP濃度が求められる。 紙片に結合させる抗体蛋白質は、精度を高め
るため充分精製したものを使用する。その精製
は、例えばα−FPを結合した不溶性担体に抗α
−FP血清を反応させ、洗浄により抗α−FP抗体
蛋白質以外の血清蛋白質を除去し、その後、尿
素、ロダン酸塩又はPH２〜３の水系溶媒によつて
抗α−FP抗体蛋白質を溶出することによつて行
なわれる。不溶性担体としては、紙の他にガラ
ス、プラスチツク及び不溶性炭水化物等を使用し
てもよい。 AL−Ｐ結合抗体は、抗体蛋白とAL−Ｐのフリ
ーアミノ基を二価試薬、例えばグルタルアルデヒ
ドを介して結合させることにより製造されるが、
この場合種々の重合体ができるので、ゲル過に
よりAL−Ｐと抗体がほど良く結合している分画
を選択する。 本発明方法は、α−フエトプロテインばかりで
なく、例えばイムノグロブリン、カルチノエンブ
ロイツクアンチゲン（CEA）等、抗原性を有す
るすべての物質の測定に適用することができる。 本発明方法の利点は、下記のとおりである。 非特異的反応が低いため、試料ブランクは低
くおさえられ、高感度及び高精度が達成される
（第１図参照）。 不溶化抗体の製造において、担体をアミノ化
していない方法と比べて本来の如くｐ−アミノ
フエノールを用いてアミノ化する方法では測定
系に適した抗体結合紙片の製造ができる（第
２図参照）。 担体がエポキシ化されるので多孔性となり強
固になり、安定性が増す。 臭化シアン等の毒性の高い原料を使用しなく
てもよい。 抗体の担体への結合操作が簡単で固相の分離
が容易である。 酵素AL−Ｐ結合抗α−FPの定量的測定は酵
素免疫定量法により多用されているパーオキシ
ターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコー
スオキシダーゼ及びグリコアミラーゼなどに比
較し容易であり、試薬も安価である。またAL
−Ｐは比活性が高く、長期間安定であり、臨床
検査において、多量検体処理システムに取り入
れやすい。 なお、本発明に使用する紙片は、円形、四
角形等任意の形であつてよく、また任意の大き
さであつてもよい。例えば円形の場合には、直
径２〜７mm程度、殊に５〜６mm程の大きさが有
利である。 更に、アミノ化の程度については、紙１ｇ
当りｐ−アミノフエノール濃度0.5〜２モル／
、特に１モル／中で結合させるのが有利で
ある。 次に、実施例に基づいて本発明を詳述する
が、本発明はこれに限定されるものではない。 実施例 １ α−FPの定量 〔Ａ〕 試薬の製造 (1) α−FPに対する抗体の製造 精製されたヒトα−FPの0.5〜１mgを
Freundのコンプリート・アジユバンドと共
にウサギ筋肉又は皮下に注射する。約２週間
毎に２〜３回追加免疫後、採血し血清を分離
する。少量の正常ヒト血清で吸収して特異抗
血清を製造する。この抗血清をヒトα−FP
を固定化した不溶性担体を充填したカラムに
通しPH８の10ｍＭのリン酸緩衝液を含んだ生
理食塩水でこのカラムをもはやウサギ血清蛋
白が検出されなくなるまで洗浄後、3Mロダ
ン酸ナトリウムの少量を通してカラムに結合
した抗α−FP蛋白質を溶出させる。溶出し
た抗α−FPを適当に濃縮して精製抗α−FP
を製造する。 (2) 抗α−FP結合デイスクの製造 デイスク（紙を直径5.5m/mの円型に切
断したもの）１ｇに12ｇのＰ−アミノフエノ
ールを溶解した4M−NaOH水溶液100mlを加
え、更に10mlのエピクロルヒドリンを追加し
て室温にて18〜22時間撹拌する。上澄みを除
きもはやアルカリを検出しなくなるまで紙
デイスクを水で洗浄した後脱水、又は乾燥
後、約20mlのPH12のホウ酸−NaOH緩衝液
（約0.1M）を加え、更に４mlの25％グルタル
アルデヒドを追加して室温で３時間撹拌す
る。未反応のグルタルアルデヒドを生理食塩
水で洗浄後、生理食塩水に溶解した精製抗α
−FPの５〜10mgを加え、０〜10℃で１晩撹
拌する。生理食塩水で未反応抗α−FPを洗
浄後、抗α−FP結合デイスクを適当な保存
剤を含んだ生理食塩水に入れて低温に保存す
るか、又は適当な保護媒質を含んだ液体と共
に凍結乾燥する。 (3) AL−Ｐ結合抗α−FPの製造 仔ウシ腸粘膜由来AL−P0.6mgと精製抗α
−FP0.2mgを生理食塩水0.5mlに溶解し、５％
グルタルアルデヒド水溶液を0.02ml添加し、
０〜10℃で24時間反応後、生理食塩水で透析
し、ゲル過する。溶液の吸光度（λ＝
280nm）及びAL−Ｐ活性を測定して最適分
画を選び約２％ウシ血清アルブミンを含む生
理食塩水で希釈後適当な保存剤を添加して低
温に保存するか、又は適当な保護媒質を添加
して凍結乾燥する。 (4) α−FP標準血清（検量線作製用）の製造 特開昭51−144724号公報に記載した方法に
より製造する。但し、α−FP濃度を400n
ｇ／mlとする。 (5) α−FP測定基質液及び呈色液 「AL−Ｐ測定試薬AL−Ｐローゼシノテス
ト」キツドを利用する（特開昭53−32795号
公報参照）。 (6) α−FP−フリー血清（盲検用）の製造 抗α−FPを結合した不溶性担体を充填し
たカラムにヒト正常血清を通し、血清中のα
−FPを完全に除去し、得られたα−FPフリ
ー血清に適当な保存剤を加えて、低温で保存
するか、又は凍結乾燥する。 〔Ｂ〕 測定法 (1) 検体用、盲検用及び検量線作成用として
各々試験管を準備し、被検血清（α−FP20
mgの正常血清）、盲検用にα−FPフリー血清
及びα−FPフリー血清で適当に希釈したα
−FP標準血清希釈剤（400、200、100、50及
び25nｇ／ml）をそれぞれ0.1ml採取する。次
に、これらの試験管に〔Ａ〕(2)により製造し
た抗α−FP結合デイスクを１枚ずつ投入
し、試験管に施栓後、室温で２時間振盪しな
がら孵置する。 (2) こうしてα−FPを固定した抗α−FP結合
デイスクを２mlの生理食塩水で３回洗浄した
後、〔Ａ〕(3)により製造した濃度１容量％の
AL−Ｐ結合抗α−FP溶液0.2mlを添加し、
試験管に施栓後、室温で24時間振盪しながら
孵置する。再び２mlの生理食塩水でデイスク
（固定されたα−FPにAL−Ｐ結合抗α−FP
が結合している）を３回洗浄する。 (3) こうして処理したデイスクを入れた試験管
に、〔Ａ〕(5)に記載したAL−Ｐ測定試薬、
AL−Ｐローゼ基質液１mlを加え、37℃で30
分間加温した後、AL−Ｐローゼ呈色液１ml
を加える。 発色した液の吸光度を波長505nmで試薬ブ
ランクを対照にして測定する。α−FP標準
血清希釈列に投入したデイスクから得たα−
FP標準液について吸光度を測定し、検量線
を作製する。この検量線より被検血清中のα
−FP濃度を測定する。この検量線を第１図
に示す。 比較のため特公昭45−38543号公報により
製造した臭化シアン活性化デイスクで不溶化
した担体を使用し、上記測定法と同じ操によ
りα−FPを測定した。この場合の検量線も
第１図に示す。 両検量線を対比すれば、本発明の紙デイ
スクの測定によれば非特異反応が極めて少な
く、高い精度が達成されることが明らかに判
る。 上記測定結果を下記の表にまとめて示す。
この表からも、本発明により高い精度が達成
されることが判る。

【表】 実施例 ２ 抗α−FP結合デイスクを製造する際に、ｐ−
アミノフエノールの濃度を種々に変える以外は、
実施例１と同様に操作し、被検液としてα−FP
含有患者血清を使用して、α−FPを測定した。
結果をＰ−アミノフエノール濃度と対応させて、
第２図に示す。この図から、ｐ−アミノフエノー
ルを使用しない場合に比べて、これを使用すると
急激に感度が高くなることが判る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明方法及び臭化シアン活性化デイ
スク法の検量線、第２図はｐ−アミノフエノール
濃度とα−FP測定結果との関係を示す曲線図で
ある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 紙片にエピクロルヒドリン及びｐ−アミノ
   フエノールを結合させ、更にグルタルアルデヒド
   と反応させ、次いで測定対象に対する抗体と反応
   させて成ることを特徴とする抗原性物質の測定試
   薬。 ２ エピクロルヒドリン及びｐ−アミノフエノー
   ルを結合させ、更にグルタルアルデヒドと反応さ
   せ、次いで測定対象に対する抗体と反応させて成
   る紙片に、測定すべき抗原性物質を固定させ、
   アルカリ性フオスフアターゼで標識した抗体を結
   合させ、その後結合又は遊離したフオスフアター
   ゼ標識抗体の量をその酵素活性により測定するこ
   とを特徴とする抗原性物質の測定方法。