JPS60146154A - オステオカルシン関連誘導体 - Google Patents
オステオカルシン関連誘導体Info
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- JPS60146154A JPS60146154A JP186084A JP186084A JPS60146154A JP S60146154 A JPS60146154 A JP S60146154A JP 186084 A JP186084 A JP 186084A JP 186084 A JP186084 A JP 186084A JP S60146154 A JPS60146154 A JP S60146154A
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- osteocarcin
- galactosidase
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
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- Pathology (AREA)
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はオステオカルシン関連誘導体、当該誘導体を酵
素標識抗原として使用することを特徴とするオステオカ
ルシンの測定方法および測定試薬に関する。
素標識抗原として使用することを特徴とするオステオカ
ルシンの測定方法および測定試薬に関する。
オステオカルシンは分子中にγ−カルボキシグルタミン
酸残基を含む骨代謝関連の蛋白質である。
酸残基を含む骨代謝関連の蛋白質である。
当該残基の生合成、すなわちグルタミン酸のr位炭素の
カルボキシル化反応にはビタミンにの存在が不可欠であ
ることがわかっている。
カルボキシル化反応にはビタミンにの存在が不可欠であ
ることがわかっている。
またオステオカルシンの抽出方法並びに物理的。
化学的性質についてはすでに知られており、参考として
掲げる下記文献における記述は上記方法並びに性質につ
いての説明として本発明において引用される。
掲げる下記文献における記述は上記方法並びに性質につ
いての説明として本発明において引用される。
1 ) Hauschka、 P、 V、、 Lian
、 J、 B、 & Gauop、 P、 M、 :P
roc、 Nat Acad、 Sci、 USA、
72.3925 (1975)2) Pr1ce、 P
、 A、、 0tsuka、 A、 S、、 Po5e
r、 J、 W、、 Kr1s−taponio、 J
、 & Raman、 N、 : Proc、 Nat
、 Acad、 Sci。
、 J、 B、 & Gauop、 P、 M、 :P
roc、 Nat Acad、 Sci、 USA、
72.3925 (1975)2) Pr1ce、 P
、 A、、 0tsuka、 A、 S、、 Po5e
r、 J、 W、、 Kr1s−taponio、 J
、 & Raman、 N、 : Proc、 Nat
、 Acad、 Sci。
USA、 73.1447 (1976)3) 01s
en、 R,E、 & 5uttie、 J、 W、
: Vitam、 Horm、、 35゜59 (19
77) 4) NishN15hi、 S、 K、、 Pr1c
e、 P、 A、 : J、 Biol、 Ohem、
。
en、 R,E、 & 5uttie、 J、 W、
: Vitam、 Horm、、 35゜59 (19
77) 4) NishN15hi、 S、 K、、 Pr1c
e、 P、 A、 : J、 Biol、 Ohem、
。
254、437 (1979)
5 ) Lian、 J、 B、 & Friedma
n、 P、 A、 : J、 Biol、 Chem、
。
n、 P、 A、 : J、 Biol、 Chem、
。
253、6623 (1978)
6) Pr1ce、 P、 A、、 0tsuka、
A、 S、 &Po5er、 J、 W、 : CCa
−1ciu Binding Proteins an
d Calcium Function(ed、 by
Wasserman、 R,H,et al、)、
p、 338. Else−vier/North H
o1land Inc、、 Amsterdam (1
978)7) Hauschka、 P、 V、 &
Ga1lop、 P、 M、 : CalciumBi
nding Protein and Calcium
Function (ed、 byWasserma
n、 R,H,et al、、 p、 338. El
sovier/NorthHolland Inc、、
Amsterdam (1978)8) Otawa
ra、 Y、、 Ho5oya、 N、、 Moriu
chi、 S、、 Kasai。
A、 S、 &Po5er、 J、 W、 : CCa
−1ciu Binding Proteins an
d Calcium Function(ed、 by
Wasserman、 R,H,et al、)、
p、 338. Else−vier/North H
o1land Inc、、 Amsterdam (1
978)7) Hauschka、 P、 V、 &
Ga1lop、 P、 M、 : CalciumBi
nding Protein and Calcium
Function (ed、 byWasserma
n、 R,H,et al、、 p、 338. El
sovier/NorthHolland Inc、、
Amsterdam (1978)8) Otawa
ra、 Y、、 Ho5oya、 N、、 Moriu
chi、 S、、 Kasai。
H,& Okuyama、 N、 : J、 Nutr
、 Sci、 Vitaminol、。
、 Sci、 Vitaminol、。
26、209 (1980)
9) Lian、 J、 B、、 Hauschka、
P、 V、 & Ga1lop、 P、 M、 :F
ed、 Proc、、 37.2615 (1978)
10) Po5er、 J、児、 Esch、 F、
S、、 Ling、 N、 O,& Pr1ce。
P、 V、 & Ga1lop、 P、 M、 :F
ed、 Proc、、 37.2615 (1978)
10) Po5er、 J、児、 Esch、 F、
S、、 Ling、 N、 O,& Pr1ce。
P、 A、 : J、 Biol、 Chem、、 2
55.8685 (1980)さて血中のオステオカル
シンの増減は骨中のカルシウム量あるいは骨の石灰化と
関連があり、臨床的にはベージェット病、骨転移、原発
性副甲状腺機能冗進症、オステオベニアの診断において
有用な指標となることがわかっている。従って、血中に
おけるオステオカルシンの存在量を測定することは臨床
的に有意義なことである。この目的のため測定方法とし
て現在ラジオイムノアッセイ法が確立され、一般に提示
されている。下記文献にはオステオカルシンの測定の臨
床的な意義並びに上記ラジオイムノアッセイ法について
記述してあり、参考として掲げる。
55.8685 (1980)さて血中のオステオカル
シンの増減は骨中のカルシウム量あるいは骨の石灰化と
関連があり、臨床的にはベージェット病、骨転移、原発
性副甲状腺機能冗進症、オステオベニアの診断において
有用な指標となることがわかっている。従って、血中に
おけるオステオカルシンの存在量を測定することは臨床
的に有意義なことである。この目的のため測定方法とし
て現在ラジオイムノアッセイ法が確立され、一般に提示
されている。下記文献にはオステオカルシンの測定の臨
床的な意義並びに上記ラジオイムノアッセイ法について
記述してあり、参考として掲げる。
11) Pr1ce、 P、 A、 & Baukol
、 S、 A、 : J、 Biol、 Chem、。
、 S、 A、 : J、 Biol、 Chem、。
255、11660(1980)
12)Price、 P、 A、、 Parthemo
re、 J、 G、、 Deftos、 L、 J、
: J。
re、 J、 G、、 Deftos、 L、 J、
: J。
Cl1n、 Invest、、 66、878−883
(1980)ところで、ここに示されているラジオイ
ムノアッセイ法においては、放射性同位元素で標識した
オステオカルシンが不安定であり、またそれによって高
い測定感度がもたらされるとは必ずしも言えず、オステ
オカルシンの測定方法はいまだ満足できる状況に至って
いない。
(1980)ところで、ここに示されているラジオイ
ムノアッセイ法においては、放射性同位元素で標識した
オステオカルシンが不安定であり、またそれによって高
い測定感度がもたらされるとは必ずしも言えず、オステ
オカルシンの測定方法はいまだ満足できる状況に至って
いない。
かかる状況にかんがみ本発明者は特別の手技を要するこ
となく、単純簡便な操作によって実施することができ、
しかも検量性、特異性および感度の高い測定が可能とな
るオステオカルシンの測定方法を提供すべ(検討をおこ
なった。その結果。
となく、単純簡便な操作によって実施することができ、
しかも検量性、特異性および感度の高い測定が可能とな
るオステオカルシンの測定方法を提供すべ(検討をおこ
なった。その結果。
オステオカルシンに架橋剤をもって酵素を標識せしめた
酵素標識抗原を使用して酵素免疫測定法をおこなうこと
により所期の目的が達成されることを知り本発明を完成
するに至った。
酵素標識抗原を使用して酵素免疫測定法をおこなうこと
により所期の目的が達成されることを知り本発明を完成
するに至った。
すなわち本発明の目的は単純簡便な操作によって検量性
、特異性および感度の高い測定が可能となるオステオカ
ルシンの測定方法並びにそのためにあらかじめ準備され
た測定試薬の提供であり。
、特異性および感度の高い測定が可能となるオステオカ
ルシンの測定方法並びにそのためにあらかじめ準備され
た測定試薬の提供であり。
本発明は当該目的の達成のために、オステオカルシンに
架橋剤をもって酵素を標識せしめた酵素標識抗原を使用
する技術手段を開示するものである。
架橋剤をもって酵素を標識せしめた酵素標識抗原を使用
する技術手段を開示するものである。
以下に本発明の構成をさらに詳細に説明する。
本発明酵素標識抗原は物質としては下記式によって示さ
れるオステオカルシン関連誘導体である。ここで式中X
はX−NH,がオステオカルシンである残基を意味して
おり、またYはY−8Hがβ−D−ガラクトシダーゼで
ある残基を意味する。
れるオステオカルシン関連誘導体である。ここで式中X
はX−NH,がオステオカルシンである残基を意味して
おり、またYはY−8Hがβ−D−ガラクトシダーゼで
ある残基を意味する。
さらに具体的に説明すれば次のごとくである。
まず、オステオカルシンは9例えば下記−次槽造式によ
って示されるごとく9分子中にγ−カルボキシグルタミ
ン酸残基(Glaと略記)を含む骨蛋白質であり、動物
種によって多少の変化がある。
って示されるごとく9分子中にγ−カルボキシグルタミ
ン酸残基(Glaと略記)を含む骨蛋白質であり、動物
種によって多少の変化がある。
しかし2本発明においてオステオカルシンは動物種に関
係な(、要は分子中にGlaを2〜3個含有する骨蛋白
質であって1分子量が5,000〜6,000であるも
のについて、これを総称する概念として使用される。
係な(、要は分子中にGlaを2〜3個含有する骨蛋白
質であって1分子量が5,000〜6,000であるも
のについて、これを総称する概念として使用される。
またY−8Hにおいて記載される一8Hはβ−D−ガラ
クトシダーゼ分子中に存在するチオール基を意味してい
る。β−D−ガラクトシダーゼはβ−D−ガラクトサイ
ドの加水分解酵素であり9例えば基質として4−メチル
ウンベリフェリル−β−D−ガラクトサイドを使用した
場合には、4−メチルウンベリフェロンおよびβ−D−
ガラクトースを遊離する。
クトシダーゼ分子中に存在するチオール基を意味してい
る。β−D−ガラクトシダーゼはβ−D−ガラクトサイ
ドの加水分解酵素であり9例えば基質として4−メチル
ウンベリフェリル−β−D−ガラクトサイドを使用した
場合には、4−メチルウンベリフェロンおよびβ−D−
ガラクトースを遊離する。
前記オステオカルシン関連誘導体はオステオカルシンの
抗原活性およびβ−D−ガラクトシダーゼ活性を併有し
ているので、オステオカルシンの酵素免疫測定法におけ
る酵素標識抗原として使用することができる。
抗原活性およびβ−D−ガラクトシダーゼ活性を併有し
ているので、オステオカルシンの酵素免疫測定法におけ
る酵素標識抗原として使用することができる。
本発明オステオカルシン関連誘導体の調製は。
架橋剤として例えばサクシニミジル4−(N−マレイミ
ドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレートを使
用する場合に次のようにおこなえばよい。
ドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレートを使
用する場合に次のようにおこなえばよい。
まず、オステオカルシンにサクシニミジル4−(N−マ
レイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレー
ト(SMCCと略記する)を反応させ。
レイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレー
ト(SMCCと略記する)を反応させ。
オステオカルシンのN末端にN−マレイミドメチルシク
ロヘキサンカルボニル基を導入する。ここでゲル濾過し
て反応生成物と未反応SMCCとを分離する。次に反応
生成物にβ−D−ガラクトシダーゼを反応させ、当該ガ
ラクトシダーゼ中のSH基を介してマレイミド基に附加
せしめる。限外濾過により濃縮後再びゲル濾過し、 2
25nm吸光値並びにβ−D−ガラクトシダーゼ活性を
測定して所定のフラクションを集めればよい。上記調製
によって得られる本発明オステオカルシン関連誘導体は
オステオカルシン関連誘導体の前記式において1(−C
H,−σ)−である誘導体である。この場合において本
発明オステオカルシン関連誘導体をオステオカルシン−
SMCC−β−D−ガラクトシダーゼと略記する。
ロヘキサンカルボニル基を導入する。ここでゲル濾過し
て反応生成物と未反応SMCCとを分離する。次に反応
生成物にβ−D−ガラクトシダーゼを反応させ、当該ガ
ラクトシダーゼ中のSH基を介してマレイミド基に附加
せしめる。限外濾過により濃縮後再びゲル濾過し、 2
25nm吸光値並びにβ−D−ガラクトシダーゼ活性を
測定して所定のフラクションを集めればよい。上記調製
によって得られる本発明オステオカルシン関連誘導体は
オステオカルシン関連誘導体の前記式において1(−C
H,−σ)−である誘導体である。この場合において本
発明オステオカルシン関連誘導体をオステオカルシン−
SMCC−β−D−ガラクトシダーゼと略記する。
架橋剤としてSMCCの代わりにサクシニミジル4−(
p−マレイミドフェニル)ブチレートまたはm−マレイ
ミドベンゾイル’N−ヒドロキシコハク酸イミドエステ
ルを使用する点を除いて上記調製と同様に調製すれば、
やはり本発明オステオカルシン関連誘導体を得ることが
できる。これらの場合において得られるオステオカルシ
ン関連誘導体は前記式においてZがそれぞれ である誘導体である。
p−マレイミドフェニル)ブチレートまたはm−マレイ
ミドベンゾイル’N−ヒドロキシコハク酸イミドエステ
ルを使用する点を除いて上記調製と同様に調製すれば、
やはり本発明オステオカルシン関連誘導体を得ることが
できる。これらの場合において得られるオステオカルシ
ン関連誘導体は前記式においてZがそれぞれ である誘導体である。
次に本発明測定方法について説明する。
本発明測定方法は酵素免疫測定法であって、競合法(固
相)を利用するものである。従って本発明測定方法の一
例として、抗原系としてのオステオカルシン(被検試料
中のオステオカルシン)およびオステオカルシン関連誘
導体(酵素標識抗原ン並びに抗体系としてのオステオカ
ルシン抗体(第一抗体)および固相化抗家兎IgG抗体
ぐ固相化第二抗体)を構成要素とする測定方法がある。
相)を利用するものである。従って本発明測定方法の一
例として、抗原系としてのオステオカルシン(被検試料
中のオステオカルシン)およびオステオカルシン関連誘
導体(酵素標識抗原ン並びに抗体系としてのオステオカ
ルシン抗体(第一抗体)および固相化抗家兎IgG抗体
ぐ固相化第二抗体)を構成要素とする測定方法がある。
特にこの方法について詳細に述べれば次のごとくである
。
。
まずオステオカルシン抗体(第一抗体)としては。
オステオカルシンで免疫した家兎の抗血清を使用すれば
よい。第二抗体としては9例えば家兎IgGで免疫した
ヤギの抗血清をアフィニティークロマトグラフィーでI
gG分割したものを使用する。家兎IgGで免疫したヤ
ギの抗血清としては例えばCappel Lab、より
市販品として入手することのできる凍結乾燥品を使用す
ることができる。アフィニティークロマトグラフィーの
ためのカラムとしては例えばBrCNで活性化したセフ
ァローズ4Bに家兎r−グロブリンをカップリングさせ
た樹脂を充填したものを使用すればよい。アフィニティ
ークロマトグラフィーは9例えば前記凍結乾燥品を0.
1 M Mailを含む50mM Tris−HCI緩
衝液(pH7,8)に溶解してカラムに通し2次に50
mM glycinθ−HC1緩衝液(pH2,3)で
溶出すればよい。
よい。第二抗体としては9例えば家兎IgGで免疫した
ヤギの抗血清をアフィニティークロマトグラフィーでI
gG分割したものを使用する。家兎IgGで免疫したヤ
ギの抗血清としては例えばCappel Lab、より
市販品として入手することのできる凍結乾燥品を使用す
ることができる。アフィニティークロマトグラフィーの
ためのカラムとしては例えばBrCNで活性化したセフ
ァローズ4Bに家兎r−グロブリンをカップリングさせ
た樹脂を充填したものを使用すればよい。アフィニティ
ークロマトグラフィーは9例えば前記凍結乾燥品を0.
1 M Mailを含む50mM Tris−HCI緩
衝液(pH7,8)に溶解してカラムに通し2次に50
mM glycinθ−HC1緩衝液(pH2,3)で
溶出すればよい。
固相化のための固相としては当分野で通常使用されるも
のを使用すればよく9例えばセファロース6MB、シリ
コンピースなどを使用することができる。例えばシリコ
ンピースをよく洗滌した後。
のを使用すればよく9例えばセファロース6MB、シリ
コンピースなどを使用することができる。例えばシリコ
ンピースをよく洗滌した後。
前記第二抗体を加えて撹拌することにより吸着させる。
本発明はオステオカルシン関連誘導体を使用することを
特徴とする測定方法並びに測定試薬であるから、アフィ
ニティークロマトグラフィーのための樹脂および方法あ
るいは固相化のための固相および方法については9本発
明の目的を損わない限りにおいて自由に選択することが
できる。従ってここにおける記述並びに後記実施例は単
に好ましい態様例を示すにすぎず9本発明を限定するも
のではない。
特徴とする測定方法並びに測定試薬であるから、アフィ
ニティークロマトグラフィーのための樹脂および方法あ
るいは固相化のための固相および方法については9本発
明の目的を損わない限りにおいて自由に選択することが
できる。従ってここにおける記述並びに後記実施例は単
に好ましい態様例を示すにすぎず9本発明を限定するも
のではない。
さて、当該測定方法は具体的には次のように実施される
。
。
まず、オステオカルシン抗体(第一抗体)、被検試料お
よび本発明オステオカルシン関連誘導体(酵素標識抗原
)を混合し9例えば4°Cで一夜放置。
よび本発明オステオカルシン関連誘導体(酵素標識抗原
)を混合し9例えば4°Cで一夜放置。
固相化第二抗体を加え、37°Cで2時間インキュベー
トする。固相を分離し、固相に結合した酵素の活性を測
定する。なお酵素活性は次のように測定すればよい。
トする。固相を分離し、固相に結合した酵素の活性を測
定する。なお酵素活性は次のように測定すればよい。
固相に基質溶液(4−メチルウンベリフェリル−β−D
−4ラクトサイド)を加え、37°Cで一定時間反応さ
せた後1反応を停止する。次に生成した4−メチルウン
ベリフェロン量を蛍光分析(励起波長360 nm、蛍
光波長450 nm)によって測定する。
−4ラクトサイド)を加え、37°Cで一定時間反応さ
せた後1反応を停止する。次に生成した4−メチルウン
ベリフェロン量を蛍光分析(励起波長360 nm、蛍
光波長450 nm)によって測定する。
次に本発明測定試薬は酵素標識抗原としてのオステオカ
ルシン関連誘導体を必須の構成成分として含有する試薬
である。従って、前記例示の酵素免疫測定方法に対応す
る試薬の具体的態様を示せば次のごとくである。すなわ
ち9本発明測定試薬はオステオカルシン関連誘導体それ
自体あるいは同誘導体とオステオカルシン抗体(第一抗
体)および/または固相化第二抗体とを組合せたセット
である。
ルシン関連誘導体を必須の構成成分として含有する試薬
である。従って、前記例示の酵素免疫測定方法に対応す
る試薬の具体的態様を示せば次のごとくである。すなわ
ち9本発明測定試薬はオステオカルシン関連誘導体それ
自体あるいは同誘導体とオステオカルシン抗体(第一抗
体)および/または固相化第二抗体とを組合せたセット
である。
ここで固相化第二抗体がその製造原料1例えば抗家兎I
gGヤギ血清あるいはそのIgG分割および/または固
相のままで提供されることは自由である。
gGヤギ血清あるいはそのIgG分割および/または固
相のままで提供されることは自由である。
この場合には測定にあたり製造原料から固相化第二抗体
を用時調製して使用する。また測定操作の便益のために
適当なる希釈用の緩衝液、基質(例えば4−メチルウン
ベリフェリルーβ−D−ガラクトサイド)その他をセ・
ント中に添付することも自由であり、これらは本発明を
限定するものではない。
を用時調製して使用する。また測定操作の便益のために
適当なる希釈用の緩衝液、基質(例えば4−メチルウン
ベリフェリルーβ−D−ガラクトサイド)その他をセ・
ント中に添付することも自由であり、これらは本発明を
限定するものではない。
以下に記載する実験例をもって本発明の詳細な説明する
。
。
実験例1
被検試料ウシオステオカルシンについて後記実施例3に
記載の測定方法によりB/B、 (%)をめ。
記載の測定方法によりB/B、 (%)をめ。
タテ軸にB/Bo(%)を、またヨコ軸にオステオカル
シン濃度をとる検量線を各測定方法ごとに作成した。
シン濃度をとる検量線を各測定方法ごとに作成した。
結果を図1に示す。図1は実施例3に記載の測定方法に
よりめた検量線を示し、抗オステオカルシン家兎血清は
2 X 10’倍希釈、オステオカルシンー8MCC−
β−D−ガラクトシダーゼは500倍希釈、基質は1.
5X10 ’Mである。
よりめた検量線を示し、抗オステオカルシン家兎血清は
2 X 10’倍希釈、オステオカルシンー8MCC−
β−D−ガラクトシダーゼは500倍希釈、基質は1.
5X10 ’Mである。
図1より本発明測定試薬並びに本発明測定方法がそれぞ
れ検量性の高いものであることが判明する。また測定感
度は0.1 ng/mLであり、高い測定感度を示すも
のであることが判明する。
れ検量性の高いものであることが判明する。また測定感
度は0.1 ng/mLであり、高い測定感度を示すも
のであることが判明する。
実験例2
被検試料としてウシオステオカルシン、ヒトオステオカ
ルシン、ラットオステオカルシン、をとりあげ、実施例
3に記載の測定方法によって各被検試料についてのB/
Bo(%)をめ、実験例1におけると同様な検量線を作
成した。
ルシン、ラットオステオカルシン、をとりあげ、実施例
3に記載の測定方法によって各被検試料についてのB/
Bo(%)をめ、実験例1におけると同様な検量線を作
成した。
結果を図2に示す。図中、θ印線はウシオステオカルシ
ンについて、O印線はヒトオステオカルシンについて9
口印線はラットオステオカルシンについての結果を示す
。図2より抗ウシオステオカルシン家兎血清はラットオ
ステオカルシンとは交差反応性を呈さないが、ウシオス
テオカルシンはもとより、ヒトオステオカルシンとも交
差反応性を呈することが判明する。またウシオステオカ
ルシンより調製した実施例2記載の測定試薬および同測
定試薬を使用する実施例3記載の測定方法はウシオステ
オカルシンおよびヒトオステオカルシンに対してよい検
量性を示すものであることが判明する。
ンについて、O印線はヒトオステオカルシンについて9
口印線はラットオステオカルシンについての結果を示す
。図2より抗ウシオステオカルシン家兎血清はラットオ
ステオカルシンとは交差反応性を呈さないが、ウシオス
テオカルシンはもとより、ヒトオステオカルシンとも交
差反応性を呈することが判明する。またウシオステオカ
ルシンより調製した実施例2記載の測定試薬および同測
定試薬を使用する実施例3記載の測定方法はウシオステ
オカルシンおよびヒトオステオカルシンに対してよい検
量性を示すものであることが判明する。
実験例3
被検試料としてヒト血清を後記実施例2に記載の希釈用
緩衝液で10倍、20倍、40倍、80倍に希釈したも
のをとりあげ、実施例3に記載の測定方法により各試料
についてのB/Bo(%)をめた。
緩衝液で10倍、20倍、40倍、80倍に希釈したも
のをとりあげ、実施例3に記載の測定方法により各試料
についてのB/Bo(%)をめた。
結果を図3に示す。図3よりヒトオステオカルシンに対
する抗ウシオステオカルシン家兎血清の交差反応性は血
清中の他の夾雑蛋白質等の影響を受けることが少な(、
血清試料を20倍乃至40倍に希釈しても1本発明測定
試薬並びに本発明測定方法によって血清中ヒトオステオ
カルシンを測定することができることが判明する。
する抗ウシオステオカルシン家兎血清の交差反応性は血
清中の他の夾雑蛋白質等の影響を受けることが少な(、
血清試料を20倍乃至40倍に希釈しても1本発明測定
試薬並びに本発明測定方法によって血清中ヒトオステオ
カルシンを測定することができることが判明する。
以下に記載する実施例をもって本発明をさらに具体的に
説明する。
説明する。
実施例1
まずウシオステオカルシンの抽出精製を以下のごとくお
こなった。ウシ大腿骨を細砕し、水洗後アセトンで脱脂
したものを凍結乾燥して得られた粉末を2096ギ酸で
脱灰することにより、オステオによるゲル濾過ならびに
DEAE−トヨバール650Sによるイオン交換クロマ
トグラフィーを行なって。
こなった。ウシ大腿骨を細砕し、水洗後アセトンで脱脂
したものを凍結乾燥して得られた粉末を2096ギ酸で
脱灰することにより、オステオによるゲル濾過ならびに
DEAE−トヨバール650Sによるイオン交換クロマ
トグラフィーを行なって。
オステオカルシンを精製した。精製したものについては
、アミノ酸分析を行ない。そのアミノ酸組成より、オス
テオカルシンと同定した。
、アミノ酸分析を行ない。そのアミノ酸組成より、オス
テオカルシンと同定した。
次に本発明オステオカルシン関連誘導体を以下のとト<
作製した。ウシオステオカルシン300μgを1 ml
の50mMリン酸buffer (pH7,0)に溶解
した。
作製した。ウシオステオカルシン300μgを1 ml
の50mMリン酸buffer (pH7,0)に溶解
した。
これに、100μtのSMCG (サクシニミジル4=
(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボ
キシレート)−ジオキサン溶液(3mgムL)を加え。
(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボ
キシレート)−ジオキサン溶液(3mgムL)を加え。
室温で1時間反応させた。この反応液を5ephade
xG−25のカラムに通し、未反応のSMCCを除去し
て。
xG−25のカラムに通し、未反応のSMCCを除去し
て。
オステオカルシン−SMCC反応生成物を得た。カラム
の溶出は、 50mMリン酸buffer (pH7,
0)で行なった。
の溶出は、 50mMリン酸buffer (pH7,
0)で行なった。
このカラムクロマトグラフィーを図4に示す。
図中、(工)はオステオカルシン−SMCC反応生成物
。
。
(2)は未反応5M0Cの各ピークを示す。得られたオ
ステオカルシン−SMCC反応生成物の一部(全量の約
1/25)をとり、これに0.5■のβ−D−ガラクト
シダーゼ(E、Co11)を加えることにより、カップ
リングさせた。カップリング反応は、室温で1時間、つ
いで4℃で一晩放置させることで行なった。反応終了後
、 5ephadex G−75のカラムにかけ、 1
50mMNaClおよび1mM MgC1,を含む50
mMリン酸buffer(pH7,0)で溶出し、目的
とするオステオカルシン−SMCC−β−D−ガラクト
シダーゼを採取して。
ステオカルシン−SMCC反応生成物の一部(全量の約
1/25)をとり、これに0.5■のβ−D−ガラクト
シダーゼ(E、Co11)を加えることにより、カップ
リングさせた。カップリング反応は、室温で1時間、つ
いで4℃で一晩放置させることで行なった。反応終了後
、 5ephadex G−75のカラムにかけ、 1
50mMNaClおよび1mM MgC1,を含む50
mMリン酸buffer(pH7,0)で溶出し、目的
とするオステオカルシン−SMCC−β−D−ガラクト
シダーゼを採取して。
本発明オステオカルシン関連誘導体とした。なおこのカ
ラムクロマトグラフィーを図5に示す。得られた。オス
テオカルシン;β−D−ガラクトシダーゼ溶液は、0.
2%BSA、 0.1% NaN3を加えて。
ラムクロマトグラフィーを図5に示す。得られた。オス
テオカルシン;β−D−ガラクトシダーゼ溶液は、0.
2%BSA、 0.1% NaN3を加えて。
4°Cにて保存した。
実施例2
実施例1において得られたオステオカルシン−28M0
O−β−D−ガラクトシダーゼと下記■〜■の試薬とを
組合せてオステオカルシン測定用試薬セットとした。
O−β−D−ガラクトシダーゼと下記■〜■の試薬とを
組合せてオステオカルシン測定用試薬セットとした。
■ 固相化第二抗体(抗家兎IgGヤギ血清のIgG分
劇物をシリコンピースに固相化した固相化IgG)の製
造原料 ■ 抗オステオカルシン家兎血清 ■ 希釈用緩衝液 なお、固相化第二抗体の製造原料から上記■の固相化第
二抗体を以下a、およびす、の二段の操作を経て用時調
製した。
劇物をシリコンピースに固相化した固相化IgG)の製
造原料 ■ 抗オステオカルシン家兎血清 ■ 希釈用緩衝液 なお、固相化第二抗体の製造原料から上記■の固相化第
二抗体を以下a、およびす、の二段の操作を経て用時調
製した。
a、第二抗体の精製
BrCNで活性化したセファロース4B:5.に対して
1100rILの家兎γ−グロブリンをカップリングさ
せた樹脂を用いて、アフィニティークロマトグラフィー
を行なった。
1100rILの家兎γ−グロブリンをカップリングさ
せた樹脂を用いて、アフィニティークロマトグラフィー
を行なった。
ヤギの抗家兎IgG血清の凍結乾燥品(IgGとして約
241ngを含む)を、4iLの0.1M NaC1を
含む50mM Tris−HCi緩衝液(pH7,8)
に溶解し、先の樹脂を充填したカラムに通した。同緩衝
液でカラムを洗い、未吸着のものを除去した後。
241ngを含む)を、4iLの0.1M NaC1を
含む50mM Tris−HCi緩衝液(pH7,8)
に溶解し、先の樹脂を充填したカラムに通した。同緩衝
液でカラムを洗い、未吸着のものを除去した後。
0.1 M NaC1を含む50mM Glycine
−HCI緩衝液(pH2,5)を用いて、家兎r−グロ
ブリンと特異的に結合した抗体を溶出させた。
−HCI緩衝液(pH2,5)を用いて、家兎r−グロ
ブリンと特異的に結合した抗体を溶出させた。
溶出液には、直ちにI M Trisを加えてpH7,
9とした。得られた特異的抗体を第二抗体とした。
9とした。得られた特異的抗体を第二抗体とした。
b、シリコンピースへの第二抗体の吸着シリコンピース
をあらかじめ蒸留水で、つづいて150mMのNa1l
を含む50 mMリン酸緩衝液(pH7,0)で洗浄し
て使用した。
をあらかじめ蒸留水で、つづいて150mMのNa1l
を含む50 mMリン酸緩衝液(pH7,0)で洗浄し
て使用した。
第2抗体5m17を同緩衝液50 mlに溶解させ、こ
れにシリコンピース500個を加えて、室温で2時間撹
拌後、4℃にて数日放置した後測定に使用した。
れにシリコンピース500個を加えて、室温で2時間撹
拌後、4℃にて数日放置した後測定に使用した。
また上記■の血清は以下のようにして得た。
ウシオステオカルシン640μgおよびウシ血清アルブ
ミンrooB、gをL2mLの50mM リン酸buf
fer (pH7,4)に溶解させた後、1−ethy
l−3−(3−dimethylaminopropy
l) −carbodiimidehydro −ch
loride (EDC)、 15 mgを加えて、室
温にて一晩反応させた。
ミンrooB、gをL2mLの50mM リン酸buf
fer (pH7,4)に溶解させた後、1−ethy
l−3−(3−dimethylaminopropy
l) −carbodiimidehydro −ch
loride (EDC)、 15 mgを加えて、室
温にて一晩反応させた。
コノ反応液を150mMのNaC1を含む、10mMリ
ン酸buffer (pH7,4)に対して透析した後
。
ン酸buffer (pH7,4)に対して透析した後
。
等量のFreundA c6mplete adjuv
antを加えて、エマルジョンを作成した。
antを加えて、エマルジョンを作成した。
オステオカルシン約200μg相当量を体重約3hgの
家兎(♂)の背部皮肉数ケ所に注射した。
家兎(♂)の背部皮肉数ケ所に注射した。
追加免疫は、3週間後および、さらにその5週間後に同
量を背部皮肉に注射することで行なった。追加免疫後、
3週間口に採血して。
量を背部皮肉に注射することで行なった。追加免疫後、
3週間口に採血して。
ウシオステカルシンに対する抗血清を得た。
なお、ウシオステオカルシンに対する抗血清はヒトオス
テオカルシンとも免疫学的交差性を示すことが明らかに
されている。
テオカルシンとも免疫学的交差性を示すことが明らかに
されている。
上記■の希釈用緩衝液は50 mM Tris−HC1
緩衝液(pH7,4)に150 mM Na1l、 0
,296BSA (牛血清アルブミン)、 1mM M
gCl、、 250KIU/mL7プロチニンおよび0
.05%Tween 80を含有せしめて調製した。
緩衝液(pH7,4)に150 mM Na1l、 0
,296BSA (牛血清アルブミン)、 1mM M
gCl、、 250KIU/mL7プロチニンおよび0
.05%Tween 80を含有せしめて調製した。
実施例3
被検試料について実施例2記載の試薬セットをもって測
定する。まず、抗オステオカルシン家兎血清を希釈用緩
衝液によって2X10’倍希釈し、この100μ乙に被
検試料100μlを加え、4°Cで6時間インキュベー
トした。これにオステオカルシン−SMCC−4−D−
ガラクトシダーゼを希釈用緩衝液によって500倍希釈
した液100μLを加え,4℃で一夜放置した。実施例
2で用時調製した固相化第二抗体を加え,378Cで2
時間振とうし,シリコンピースをとりだし,希釈用緩衝
液で洗滌し,シリコンピースを集めシリコンピースに結
合しているβ−D−ガラクトシダーゼの酵素活性(B)
を測定した。
定する。まず、抗オステオカルシン家兎血清を希釈用緩
衝液によって2X10’倍希釈し、この100μ乙に被
検試料100μlを加え、4°Cで6時間インキュベー
トした。これにオステオカルシン−SMCC−4−D−
ガラクトシダーゼを希釈用緩衝液によって500倍希釈
した液100μLを加え,4℃で一夜放置した。実施例
2で用時調製した固相化第二抗体を加え,378Cで2
時間振とうし,シリコンピースをとりだし,希釈用緩衝
液で洗滌し,シリコンピースを集めシリコンピースに結
合しているβ−D−ガラクトシダーゼの酵素活性(B)
を測定した。
別に被検試料を除いて,すなわぢ抗オステオカルシン家
兎血清.オステオカルシン−SMCC−β−D−ガラク
トシダーゼを希釈用緩衝液で希釈し。
兎血清.オステオカルシン−SMCC−β−D−ガラク
トシダーゼを希釈用緩衝液で希釈し。
以下上記と同じ操作によりシリコンピースに結合してい
るβ−D−ガラクトシダーゼの酵素活性(Be)を測定
した。
るβ−D−ガラクトシダーゼの酵素活性(Be)を測定
した。
最後に次式によりB/Bo (%)をめた。
B/Bo(96)= − x 100
B。
なお、酵素活性は次のように測定した。
固相に100μ乙の基質溶液(4 − methylu
mbelliferyl−β−p − galacto
sideを1.5 X 10 Mになるように。
mbelliferyl−β−p − galacto
sideを1.5 X 10 Mになるように。
1mMMgCl,を含む,50mMリン酸緩衝液(pH
.7.0)に溶解したもの)を加え,1時間37℃で反
応させた後,2.5mlの0.1 M Glycine
−NaOH ( pH 10.3)を加えて反応を止め
た。
.7.0)に溶解したもの)を加え,1時間37℃で反
応させた後,2.5mlの0.1 M Glycine
−NaOH ( pH 10.3)を加えて反応を止め
た。
生成した4 − methylumbeniferon
e量を蛍光分析した。蛍光は,励起波長360 nm,
蛍光波長450nmで測定した。
e量を蛍光分析した。蛍光は,励起波長360 nm,
蛍光波長450nmで測定した。
図1は実験例1に記載の図1に相応し,タテ軸ニB/B
o (96)、ヨコ軸にウシオステオカルシン濃度をと
った検量線を示す。 図2は実験例2に記載の図2に相応し,タテ軸にB/B
0(96)、ヨコ軸にウシオステオカルシン、ヒトオス
テオカルシン、ラットオステオカルシンの各濃度をとっ
た各検量線を示す。 図3は実験例3に記載の図3に相応し,タテ軸に)37
Ha (96)、ヨコ軸にヒト血清の希釈倍率をとった
検量線を示す。 図49図5は実施例1において記載される図4゜図5に
相応し、それぞれカラムクロマトグラフィーを示す。 特許出願人 工−ザイ株式会社 図1 B/BO (%) オステオカルシン (ng/ ml) 図4 (2) 0 20 40 分 画!l No、(1,67n+1./を曲0)図
面 図5
o (96)、ヨコ軸にウシオステオカルシン濃度をと
った検量線を示す。 図2は実験例2に記載の図2に相応し,タテ軸にB/B
0(96)、ヨコ軸にウシオステオカルシン、ヒトオス
テオカルシン、ラットオステオカルシンの各濃度をとっ
た各検量線を示す。 図3は実験例3に記載の図3に相応し,タテ軸に)37
Ha (96)、ヨコ軸にヒト血清の希釈倍率をとった
検量線を示す。 図49図5は実施例1において記載される図4゜図5に
相応し、それぞれカラムクロマトグラフィーを示す。 特許出願人 工−ザイ株式会社 図1 B/BO (%) オステオカルシン (ng/ ml) 図4 (2) 0 20 40 分 画!l No、(1,67n+1./を曲0)図
面 図5
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (1)式 によって示されるオステオカルシン関連誘導体。 〔ただし式中XはX−NH2がオステオカルシンである
残基を意味し、YはY−8Hがβ−D−ガラクトシダー
ゼである残基を意味する。またZはする〕 (2)式 によって示される架橋剤にX−NH,を反応させてを生
成せしめ、当該生成物にY−8Hを反応させることを特
徴とする式 によって示されるオステオカルシン誘導体の製法。 〔ただしx、 y、zは特許請求の範囲第1項における
ただし書き記載と同一の残基を意味する〕(3)オステ
オカルシンを酵素免疫測定法によって測定するにあたり
、当該測定における酵素標識抗原として特許請求の範囲
第1項記載のオステオカルシン関連誘導体を使用するこ
とを特徴とするオステオカルシンの測定方法 (4)オステオカルシンを酵素免疫測定法によって測定
する試薬であって、当該測定における酵素標識抗原とし
て特許請求の範囲第1項記載のオステオカルシン関連誘
導体が含まれることを特徴とするオステオカルシンの測
定試薬
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP186084A JPS60146154A (ja) | 1984-01-11 | 1984-01-11 | オステオカルシン関連誘導体 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP186084A JPS60146154A (ja) | 1984-01-11 | 1984-01-11 | オステオカルシン関連誘導体 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS60146154A true JPS60146154A (ja) | 1985-08-01 |
Family
ID=11513294
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP186084A Pending JPS60146154A (ja) | 1984-01-11 | 1984-01-11 | オステオカルシン関連誘導体 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS60146154A (ja) |
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS63209596A (ja) * | 1987-02-26 | 1988-08-31 | Takara Shuzo Co Ltd | モノクロ−ナル抗体及びその使用方法 |
EP0314127A2 (en) * | 1987-10-30 | 1989-05-03 | Abbott Laboratories | Heterobifunctional coupling agents |
JPH01160493A (ja) * | 1987-12-18 | 1989-06-23 | Takara Shuzo Co Ltd | モノクローナル抗体及びその使用方法 |
JPH01292252A (ja) * | 1988-05-20 | 1989-11-24 | Takara Shuzo Co Ltd | オステオカルシン代謝異常を伴う疾病の検出方法 |
WO1990009587A1 (fr) * | 1989-02-10 | 1990-08-23 | Teijin Limited | Analyse immunologique de l'osteocalcine humaine, reactif et kit utilises pour ladite analyse, anticorps anti-osteocalcine humaine, hybridome produisant ledit anticorps, et procede de production de cet anticorps |
EP0618192A1 (de) * | 1993-03-29 | 1994-10-05 | Roche Diagnostics GmbH | Homobidentale, trifunktionelle Maleinimid-Linker, und ihre Verwendung in immunologisch aktiven Konjugaten |
US5506111A (en) * | 1989-02-10 | 1996-04-09 | Teijin Limited | Method of immunological assaying of human osteocalcin, reagent and kit therefor, antibody to human osteocalcin, hybridoma producing said antibody, and method of producing it |
JP2021530711A (ja) * | 2018-08-03 | 2021-11-11 | サイトジェン インコーポレーテッドCytogen, Inc. | 癌の骨転移診断用組成物およびこれを含むキット |
-
1984
- 1984-01-11 JP JP186084A patent/JPS60146154A/ja active Pending
Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS63209596A (ja) * | 1987-02-26 | 1988-08-31 | Takara Shuzo Co Ltd | モノクロ−ナル抗体及びその使用方法 |
EP0314127A2 (en) * | 1987-10-30 | 1989-05-03 | Abbott Laboratories | Heterobifunctional coupling agents |
EP0314127A3 (en) * | 1987-10-30 | 1990-10-31 | Abbott Laboratories | Heterobifunctional coupling agents |
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JPH01292252A (ja) * | 1988-05-20 | 1989-11-24 | Takara Shuzo Co Ltd | オステオカルシン代謝異常を伴う疾病の検出方法 |
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EP0618192A1 (de) * | 1993-03-29 | 1994-10-05 | Roche Diagnostics GmbH | Homobidentale, trifunktionelle Maleinimid-Linker, und ihre Verwendung in immunologisch aktiven Konjugaten |
JP2021530711A (ja) * | 2018-08-03 | 2021-11-11 | サイトジェン インコーポレーテッドCytogen, Inc. | 癌の骨転移診断用組成物およびこれを含むキット |
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