JPS62258399A

JPS62258399A - Ｃ−反応性蛋白質の精製方法

Info

Publication number: JPS62258399A
Application number: JP10117386A
Authority: JP
Inventors: Shii Riii Wai; ワイ・シー・リィー; Yoshitaro Kawaguchi; 川口　吉太郎; Seiichi Koda; 甲田　誠一; Isamu Kokawara; 高河原　勇
Original assignee: KOKUSAI SHIYAKU KK; Oriental Yeast Co Ltd
Current assignee: KOKUSAI SHIYAKU KK; Oriental Yeast Co Ltd
Priority date: 1986-05-02
Filing date: 1986-05-02
Publication date: 1987-11-10
Anticipated expiration: 2010-07-26
Also published as: JPH0768269B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、Ｃ−反応性蛋白質を高純度に精製する方法に
関するものである。

（産業上の利用分野）一般に、Ｃ−反応性蛋白質（Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｐ
ｒｏｔｅｉｎ。

以下ＣＲＰという）は各種感染症や炎症性疾患の患者血
中には正常人と比較して多量に含まれているため、臨床
検査の分野では、これら病気の診断によく測定される項
目の一つになっている。

また、各種の癌でも血中ＣＲＰ量が増加することがわか
フており、癌の診断、特に手術後の予後のモニターリン
グに測定されるようになってきている。

しかしながら、血中のＣＲＰの含量は少なく、酵素のよ
うにそれ自体の活性により分析できるものではないため
に、ＣＲＰと特異的に結合する抗体もしくは抗血清を用
いて毛細管法、−次元免疫拡散法、免疫比濁法、ラテッ
クス凝集反応法等で測定されることが多い。

これらＣＲＰ定量法で用いる抗体や抗血清は、特異性の
高いものが要求される。

そして、特異性の高い抗体、抗血清を作るためには、高
純度の抗原、即ち、高純度のＣＲＰが必要となるのであ
る。

従来、ＣＲＰの単離方法としては、讐。Ｏｄらの方法（
Ｗｏｏｄ、　Ｈ，Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９５４）　
Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、。

１０、７１）やＰｅｐｙｓらの方法（Ｐｅｐｙｓ、　Ｍ
、　Ｂ、、　（１９７７）Ｌａｎｃｅｔ、　１．１０２
９）が知られているが、いずれの方法も夾雑蛋白質の混
入を防ぐことが出来ず、高純度のＣＲＰ標品を単離・精
製することが困難である。

その他の精製法として、ＣＲＰはカルシウム存在下でホ
スホリルコリン（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ
。

以下、ＰＣと略記することもある）と特異的に結合する
という知見より、ＰＣをリガンドとして固定化した高分
子担体（以下、ＰＣ−固化担体と略記することもある）
のアフィニティークロマトグラフィーによってＣＲＰを
単離する方法も提案されている（Ｏｌｉｖｅｉｒａ、　
Ｅ、　Ｂ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８０）　Ｊ、　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ、。

１２４、１３９６）、これらのＰＣ−固定化担体による
ＣＲＰの精製法には、精製工程の簡略化と、夾雑蛋白質
の混入を防止し、高純度のＣＲＰを得ることが出来ると
いう利点がある。しかし、従来のこれらのｐｃ−固定化
担体の製造法は、非常に複雑で反応ステップも多いこと
から多大の労力が必要とされ。

最終生成物の収量も低いという問題点がある。

本発明者らは、ＣＲＰの有効な精製方法を求めて鋭意研
究した結果、可溶性蛋白質をスペーサーとして結合させ
たアフィニティー担体を使用することによって解決する
ことができた。

本発明は、ホスホリルコリン類をリガンドとし、可溶性
蛋白質をスペーサーとして結合させたアフィニティー担
体を用いてＣ−反応性蛋白質を吸着、溶離せしめること
を特徴とするＣ−反応性蛋白質の精製方法である。

本発明の大きな特色は、アルブミンに代表される様な水
溶性蛋白質をスペーサーとして用いることによって、Ｃ
ＲＰ以外の夾雑蛋白質の非特異的吸着を防止することに
なり、精製されるＣＲＰの純度がきわめて高くなること
である。

本発明のもう一つの特色は、一旦リガントであるホスホ
リルコリン類をスペーサーである水溶性蛋白質に多量に
結合させてからさらにこの結合物を担体に固定化するた
めに、多量のリガンドを導入でき、ひいては、アフィニ
ティー担体の親和力も強くなり、同時に、担体当りの精
製目的物質、即ちＣＲＰの結合量が著しく増加すること
である。

本発明においてスペーサーに用いる可溶性蛋白質は、血
清アルブミン、卵白アルブミン、カゼインなどの比較的
安価で高純度のものであって多量に入手しえるものが適
している。しかし、γ−グロブリンや補体系の蛋白質は
、可溶性蛋白質ではあるけれども、スペーサー自体が種
々の成分との結合性をもつために適さない。

これら可溶性蛋白質には、多くのアミノ基、カルボキシ
ル基、少量のＳＨ基があり、これらの基をリガンドとの
結合に、そして、アフィニティー担体との結合に使用す
ることになる。

リガンドであるホスホリルコリン類を可溶性蛋白質に結
合させる方法は種々あるが、アミノ基もしくはカルボキ
シル基のどちらが一方にだけ結合させる方法が好ましい
、また、ホスホリルコリンを結合させることに使われな
い基を使って担体に結合するのが好ましい。

ホスホリルコリンの誘導体でアルデヒド基を有するコリ
ンホスホリルグリコアルデヒドは、蛋白質の７ミノ基と
、還元的アミノ化反応により反応し、炭素原子２個分の
スペーサーのついた形でホスホリルコリンが導入でき、
他のカルボキシル基やＳＨ基には影響しないので良好な
結合方法である。

次の式（Ｉ）で表される ○ リ− コリンホスホリルグリコアルデヒドと可溶性蛋白質、例
えば市販の牛血清アルブミンとを緩衝液中で還元アミノ
化反応を行なえばよい、還元剤としては、ジメチルアミ
ンボラン、シアノ水素化はう素ナトリウムなどがあるが
、シアノ水素化はう素ナトリウムが一般的である０反応
は３７℃程度に加温し、１０〜３０時間の反応によって
、可溶性蛋白質のアミン基に式（１）の化合物が結合す
る。　反応後は、水に対して透析し、未反応低分子化合
物を除去し、透析内液を凍結乾燥し、ホスホリルコリン
誘導体（ＰＣ−誘導体）を粉末で得ることができる。

ここに得られたホスホリルコリン誘導体を結合させるア
フィニティー担体としては、多糖体を骨格とするセルロ
ース、セファデックス、セファロース、合成樹脂を骨格
とするトリスアクリル、ト−ヨーパール、ガラスを骨格
とするもの、その他種々のものがあげられる。

アフィニティー担体にホスホリルコリン誘導体を結合さ
せる方法としてはブロムシアン活性化法。

エポキシ活性化法、活性化チオール法など、アフィニテ
ィー担体に種々の官能基を導入して行なわれることが多
いが、これらのいずれの方法を用いてもアフィニティー
担体にホスホリルコリン誘導体を結合させることができ
る。

ホスホリルコリン類をリガンドとし、可溶性蛋白質をス
ペーサーとして結合させたアフィニティー担体は、これ
をＣａＣｎ２を含むリン酸バッファーで平衡化して、こ
こにＣＲＰ含有液１例えばＣＲＰＩＳ性ヒト血清を加え
て、ＣＲＰを吸着させ、非吸着の蛋白質を洗い流し１次
いでＥＤＴＡを含むリン酸バッファーを流下することに
よって吸着しているＣＲＰを溶離させることができる。

ここに、きわめて純度の高いＣＲＰを得ることができる
。

次に本発明の製造例及び実施例を示す。

以下に示すのは、スペーサーにウシ血清アルブミンを用
い、そこにホスホリルコリンを結合させたホスホリルコ
リン−ＢＳＡ結合物を用いてＣＲＰを精製する方法であ
る。

製造例１゜ＰＣ５５ＢＳＡの製造：５０ｗＭのＬ−グリセロホスホリルコリン水溶液５２ｍ
Ωにメタ過ヨウ素酸ナトリウムを終濃度１００ｍＭとな
るように溶解し、室温で３０分間放置することにより、
コリンホスホリルグリコアルデヒドとホルムアルデヒド
の混合生成物を得た１次に、この混合生成物を水浴中で
２時間冷却し、加えた過ヨウ素酸と等モル量のエチレン
グリコールを加え乾固した。得られた白色の粉末を０．
１Ｍの酢酸Ｌｏｗ（ｌに溶解し０．１Ｍ酢酸であらかじ
め平衡化しておいたセファデックスＧ−７５（ファルマ
シア社農）カラムでゲルロ力を行なった。ネオカブロイ
ン法で確認したコリンホスホリルグリコアルデヒド溶出
画分を集め濃縮した０分子内リン酸残基を定量すること
によりコリンホスホリルグリコアルデヒドのＬ−グリセ
ロホスホリルコリンよりの収率を求めたところ８０％で
あった。

ここに得られたコリンホスホリルグリコアルデヒド１０
８ｍｇを０．２Ｍリン酸バッファー　（ｐＨ７，０）の
溶液７０ｍΩに溶解し、さらに牛血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）を４０ｍｇ加えた１次にシアノ水素化ホウ素ナトリ
ウム９０　、３ｍｇを加え、３７℃で２０時間インキュ
ベートした。

インキュベート後、反応液を水に対して透析し、透析内
液を凍結乾燥することによりホスホリルコリンとＢＳＡ
の結合した誘導体を得た。　ＢＳＡ　１分子につき平均
５５分子のホスホリルコリンが結合した誘導体であった
。この誘導体をＰＣ５５ＢＳＡとした。

製造例２゜アフィニティー担体の製造：８ｍＭのチオプロビルト−ヨーパール）１ｗ−６５を１
ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸バッファーでｐＨ
６，０に平衡化し、そこにＮ、　Ｎ−ジメチルフォルム
アミド１ｍｆｌに溶解したＮ、　Ｎ’−０−フェニレン
ジマレイミド６７ｍｇを加え、さらに１０ｄの上記バッ
ファーを加え３０℃２０分間インキュベートし、マレイ
ミド化トーヨーバールＨトロ５とする。

上記バッファーで洗浄後、製造例１で得たＰＣ５５ＢＳ
Ａ　６３．２４ｍｇを含む上記バッフ　７３４ｄを加え
４℃４０時間インキュベートする。得られたＰＣ５５Ｂ
ＳＡ　−トーヨーパールＨトロ５は、１ｖ２のゲル当り
５．３ｍｇのＰＣ５５ＢＳＡを結合している。

実施例１゜ＣＲＰの精製：製造例２で得たＰＣ５５ＢＳＡ　−トーヨーパールＨＷ
−６５１ｍΩを１鱈のＣａＣらを含むリン酸バッファー
（ＰＢＳ）（１０ｍＭ、ＰＨ７，２）で平衡化した後、
１ｍＭのＣａＣｆ１．を含むＣＲＰ陽性ヒト血清１００
ｆｆｉΩを添加する６次いで５０ｍｎの１ｍＭ　ＣａＣ
ｎ、を含むリン酸バッファ　−（ＰＢＳ）　（１０ｍＭ
、ｐＨ７，２）を添加し、非吸着の蛋白質を洗い流す、
そこに３０−の１ｍＭ　ＥＤＴＡを含むリン酸バッファ
（ＰＢＳ）　（１０ｍＭ、ｐＨ７，２）を添加し、吸着
しているＣＲＰを溶出する。その結果９．５６ｍｇのＣ
ＲＰを得た。

本実施例の溶出曲線は第１図に示される通りであり、純
度の高いＣＲＰが得られるのが分る。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１におけるＣＲＰの精製に際しての溶出
曲線を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】

ホスホリルコリン類をリガンドとし、可溶性蛋白質をス
ペーサーとして結合させたアフィニティー担体を用いて
Ｃ−反応性蛋白質を吸着、溶離せしめることを特徴とす
るＣ−反応性蛋白質の精製方法。