JP2005300313A - 蛋白質吸着防止方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 常にホスホリルコリン基を効率良く材質表面に出現させることにより、より優れた吸着防止効果を有する蛋白質及び／又はポリペプチドに対する非特異的吸着防止方法を提供すること。
【解決手段】材質表面にブロッキング剤としての蛋白質を有し、該蛋白質に下記式（１）で示されるホスホリルコリン基を化学結合させることにより、検体中の蛋白質及び／又はポリペプチドが該材質表面に非特異的に吸着することを防止する蛋白質及び／又はポリペプチドに対する吸着防止方法である。

【選択図】なし

Description

本発明は蛋白質及び／又はポリペプチドの吸着防止方法に関する。さらに詳しくは、蛋白質及び／又はポリペプチドを用いる研究開発に使用する理化学機器を構成する材質表面に、ホスホリルコリン基を導入した蛋白質を吸着或いは化学結合させることにより、検体中の蛋白質及び／又はポリペプチドが該材質表面に非特異的に吸着することを防止する方法に関する。

従来、蛋白質及び／又はポリペプチドを用いる研究開発に使用する理化学機器は、ポリスチレン、ポリプロピレン等のプラスチックやガラス、あるいは金属やセラミック等の基材で構成されている。

蛋白質及び／又はポリペプチドはこれらの基材に対して強い吸着作用を持っているため、試薬や検査液の保存、希釈、分析中に、検体中の蛋白質及び／又はポリペプチドが理化学機器表面に吸着して、その濃度低下や、吸着による蛋白質及び／又はポリペプチド構造の変化、活性の低下等の問題が生じている。

一方、抗原抗体反応を用いる免疫学的活性物質の測定においては、これらの非特異的吸着を防止するために、(1)イムノアッセイをｐＨ５〜６の弱酸性の緩衝液で行う方法、
(2)抗体などを吸着させた後で、固相の余分な蛋白質結合部位を卵白アルブミン、ウシ血清アルブミン、ウシ胎児血清、正常血清等を用いてブロックする方法、(3)有機酸を主成分とするバッファーに乳蛋白質を溶解し、減菌処理した非特異的吸着防止剤を用いる方法（特許文献１）が行われている。

しかしながら、これらの方法によっては、その蛋白質及び／又はポリペプチド非特異的吸着防止能は十分ではない。したがって、特に臨床診断等の分野ではより優れた蛋白質の非特異的吸着防止剤やその防止方法の開発が望まれている。

このような観点から、免疫学的活性物質を測定するにあたり、蛋白質及び／又はポリペプチド非特異的吸着を十分に抑制し得る方法として、特定のホスホリルコリン基を有する重合体で表面処理する方法が提案されている（特許文献２）。

しかしながら、この方法はホスホリルコリン基及び被覆基板に親和性の高い成分から成る水溶性の共重合体で被膜するため、必ずしも効率良くホスホリルコリン基のみを表面に出現させることが困難であり、結果として検体中の蛋白質の吸着を完全には抑えられないという問題点がある。

特開平０１−２１７２６６号公報 特開平１０−１１４８００号公報

本発明は、蛋白質が本来有する基材への高い吸着能を利用し、さらに基材を効率良くホスホリルコリン基で覆うという新しい考え方により、より優れた吸着防止効果を有する、蛋白質及び／又はポリペプチドに対する非特異的吸着防止方法を提供するものである。

すなわち、本発明は、基材表面にブロッキング剤としての蛋白質を有し、該蛋白質に下記式（１）で示されるホスホリルコリン基を化学結合させることにより、検体中の蛋白質及び／又はポリペプチドが該材質表面に非特異的に吸着することを防止する蛋白質吸着防止方法を提供するものである。

また、本発明は、ブロッキング剤としての蛋白質のアミノ基またはカルボキシル基に、下記式（１）で示されるホスホリルコリン基を化学結合させる工程を有する蛋白質及び／又はポリペプチドに対するブロッキング剤の調製方法を提供するものである。

さらに、本発明は、蛋白質のアミノ基またはカルボキシル基に、下記式（１）で示されるホスホリルコリン基が化学結合してなる、蛋白質及び／又はポリペプチドに対するブロッキング剤を提供するものである。

本発明の蛋白質ブロッキング剤は、上記の調製方法により製造される。

本発明により、蛋白質を用いる研究開発に使用する理化学機器を構成する基材表面に検体中の蛋白質が非特異的に吸着する現象を、極めて効率良く抑制することが可能である。

本発明の方法は、様々な基材表面を修飾できるという大きな利点がある。そして、基材に対するホスホリルコリン基の導入効率に優れている。その結果、重合体被膜によりホスホリルコリン基を導入することによる吸着防止方法と比較して、非特異吸着防止効果は大きく、さらに優れたものとなる。

以下に本発明を詳細に説明する。

本発明においては、基材表面に（例えば蛋白質及び／又はポリペプチドを用いた研究開発に使用する理化学機器を構成する材質表面や生化学試験用プレート表面等）、蛋白質を吸着或いは化学的に結合させ、次に、上記式（１）で示されるホスホリルコリン基含有化合物を該蛋白質に反応させて、該材質表面の蛋白質に直接的に上記式（１）のホスホリルコリン基を化学結合させる工程により、ホスホリルコリン基を化学結合した蛋白質からなるブロキング剤が調製される。そして、このブロッキング剤によって、研究開発に使用する検体中の蛋白質及び／又はポリペプチドが該材質表面に非特異的に吸着することを防止するものである。

本発明は下記のステップにより行われる。
ステップ１：任意の材質表面に、公知の方法若しくは今後開発される方法にて蛋白質を吸着或いは化学的に結合させる。

ステップ２：吸着または化学的に結合させた蛋白質に対し、グリセロホスホリルコリンの酸化的解裂反応により得られたアルデヒド体あるいはハイドレート体を、還元的アミノ化反応によって、式（１）のホスホリルコリン基を材質表面に付加させる。或いは、吸着または化学的に結合させた蛋白質に対し、アミノ基若しくはカルボキシル基を有するホスホリルコリン誘導体を定法によりアミド結合させ、ホスホリルコリン基を材質表面の蛋白質に付加させる。

本発明で使用する材質とは、理化学機器を構成できる材質であり、プラスチック、ゴム、ガラス、セラミック、金属等である。

「具体例」
これらの材質表面に蛋白質を吸着または化学的に結合させる方法（ステップ１）は、具体的には下記１や２のように行なわれる。

１．ウシ血清アルブミンのリン酸バッファー溶液（１％）を９６穴ウェルプレート（ポリスチレン）に添加（３００μｌ／ｗｅｌｌ）し、室温で１晩放置した後、上記溶液を廃棄し、余分なウシ血清アルブミンをリン酸バッファーで洗浄し、ウシ血清アルブミンが表面に吸着したウェルプレートを得る。ウシ血清アルブミンの代わりにカゼイン、リゾチーム、チトクロームＣ、フィブリノーゲン、トランスフェリンなど各種蛋白質を用いることも可能である。

２．ウシ血清アルブミンのリン酸バッファー溶液（１％）を９６穴ウェルプレート（活性エステル表面）に添加（３００μｌ／ｗｅｌｌ）し、室温で１晩放置した後、上記溶液を廃棄し、余分なウシ血清アルブミンをリン酸バッファーで洗浄し、ウシ血清アルブミンが表面に化学的に結合したウェルプレートを得る。ウシ血清アルブミンの代わりにカゼイン、リゾチーム、チトクロームＣ、フィブリノーゲン、トランスフェリンなど各種蛋白質を用いることも可能である。
また、活性エステル表面の代わりにアミノ基表面或いはカルボキシル基表面を有するプレートを用い、定法によりアミド結合を形成させて蛋白質とプレートを化学的に結合させることも可能である。

次に、吸着或いは化学的に結合した蛋白質表面にホスホリルコリン基を導入する方法（ステップ２）は、具体的には下記３や４のように行なわれる。

３．上記１または２の方法により処理した９６穴ウェルプレートに、ホスファチジルグリセロアルデヒド（リン酸バッファー溶液）を添加し、室温で６時間放置する。そして、シアノホウ素酸ナトリウムを室温で添加、一晩室温放置し、アミノ基にホスホリルコリン基を導入する。材質をリン酸バッファーで洗浄後、乾燥し、ホスホリルコリン基を表面に直接有する材質が得られる。反応溶媒はリン酸バッファー以外にもメタノール、水、エタノール、２−プロパノール等プロトン性溶媒であれば使用可能であるが、メタノールを用いた場合の導入率が高い傾向にある。上記のシアノホウ素酸ナトリウムを添加するプロセスは必要に応じて省略しても効果に影響はない。

４．上記１または２の方法により処理した９６穴ウェルプレートに、下記式（２）または（３）で示すホスホリルコリン誘導体水溶液及びカップリング剤を添加し、室温で６時間放置する。水で洗浄後、乾燥し、ホスホリルコリン基を表面に直接有する材質が得られる。反応溶媒は水以外にもテトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド及びそれらの混合液などを使用可能である。

ｎ＝１〜１２までの整数

ｎ＝１〜１２までの整数

上記で説明したように、蛋白質を吸着或いは化学的に結合させ、その表面に上記式（１）のホスホリルコリン基が付加した材質を製造することによって、検体中の蛋白質が該材質表面に非特異的に吸着することを防止する蛋白質吸着防止方法が行われる。
すなわち、蛋白質のアミノ基またはカルボキシル基に、下記式（１）で示されるホスホリルコリン基が化学結合している蛋白質ブロッキング剤が材質表面に設定することにより、蛋白質の吸着防止が達成される。この蛋白質ブロッキング剤は、ブロッキング剤としての蛋白質のアミノ基またはカルボキシル基に、下記式（１）で示されるホスホリルコリン基を化学結合させる工程を有する蛋白質ブロッキング剤の調製方法によって製造できる。なお、蛋白質と式（１）のホスホリルコリン基とを化学結合させるスペーサーは任意であり、メチレン鎖、オキシエチレン鎖などの他、アミノ基を１つまたは複数含むアルキレン鎖でも良い。

本発明の方法により、該材質表面に非特異的に吸着することを防止した理化学機器が製造される。本発明の方法は、ホスホリルコリン基の導入効率が良く、また、様々な材質の表面を修飾できるという大きな利点がある。

上記の方法において、グリセロホスホリルコリンの酸化的解裂反応により得られるアルデヒド体を含有する化合物は、公知のグリセロホスホリルコリン基を、公知の方法により酸化的解裂を行わせるもので、極めて簡単なステップである。この反応は、１，２−ジオールを過ヨウ素酸、或いは過ヨウ素酸塩、或いは三酸化ビスマスを用いて酸化することにより結合を開裂させ、２つのアルデヒド体を得るものであり、本法の場合、ホスホリルコリンアルデヒド体とホルムアルデヒドを生成する。反応は通常水中または水を含む有機溶媒中で行われる。反応温度は０℃から室温である。アルデヒド体は水中で平衡反応を経てハイドレートとなることもあるが、続くアミンとの反応には影響しない。下記にホスホリルコリン基を含有する一官能のアルデヒド体を調製するスキーム１を示す。

上記スキームにより得られるアルデヒド体は蛋白質が有するアミノ基と反応し、結合を形成する。

グリセロホスホリルコリンの酸化的解裂反応により得られるアルデヒド体(若しくはハイドレート体)を蛋白質のアミノ基に結合させる還元的アミノ化反応は、溶媒中静置或いは振とうすることにより容易に行うことが出来る。この反応は両者を水或いはアルコール中に溶解または分散し（第三成分の有機溶媒を混合しても良い）、イミンを形成させた後、これを還元剤により還元して２級アミンを得るものである。還元剤としてはシアノホウ素酸ナトリウム等マイルドな還元剤が好ましいが、ホスホリルコリンが安定な限り、他の還元剤を用いることも可能である。反応は通常０℃から室温で行われるが、場合により加熱することもある。また、シアノホウ素酸ナトリウム等による還元は行わなくても結合は形成されるため、必要に応じて省略しても問題はない。

上記の方法により、親水性のホスホリルコリン基を任意の量で含有する、理化学機器の材質あるいは生化学試験用プレートが簡単に得られる。

本発明の方法により処理された材質からなる理化学機器は、蛋白質及び／又はポリペプチドがその表面に非特異的に吸着することを防止する。理化学機器の種類は問わない。例えば、ビーカー、フラスコ、ピペット、各種容器等の実験器具、分析装置やカラム、その充填剤等である。
そして、本発明の方法により処理された材質からなる理化学機器は、蛋白質及び／又はポリペプチドの吸着が極めて少ないので、例えばヒト血清中の蛋白質の分離、または、蛋白質をトリプシン消化して得られた試料に含まれるポリペプチドの分離などの研究に好ましく使用出来る。

次に、本発明を実施例に基づきさらに詳しく説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

合成例１ ホスホリルコリン基を含有するアルデヒド体
Ｌ−α−グリセロホスホリルコリン（４５０ｍｇ）を蒸留水１５ｍｌに溶解し、氷水浴中で冷却する。過ヨウ素酸ナトリウム（７５０ｍｇ）を添加し、２時間攪拌する。更にエチレングリコール（１５０ｍｇ）を添加して１晩攪拌する。反応液を減圧濃縮、減圧乾燥し、メタノールにより目的物を抽出する。
構造式及びＮＭＲスペクトルを図１に示す。

「実施例１ ホスホリルコリン基を結合したウシ血清アルブミンと、特許文献２（特開平１０−１１４８００号公報）記載技術との比較」
ウシ血清アルブミンのリン酸バッファー溶液（１％）を９６穴ウェルプレート（活性エステル 住友ベークライト社製）に加え（３００μＬ／ｗｅｌｌ）、室温で６時間吸着させた後、リン酸バッファー洗浄し、合成例１のアルデヒド体のリン酸バッファー溶液（１％）を添加、室温で一晩放置した後リン酸バッファーで洗浄して実施例１とした。特開平１０−１１４８００号公報技術が商品化された日本油脂社製ブロッキング剤Ｎ１０２をリン酸バッファーで５倍希釈し、同様に９６穴ウェルプレート（活性エステル 住友ベークライト社製）に加え（３００μＬ／ｗｅｌｌ）、室温で一晩吸着させた後、リン酸バッファー洗浄し、比較例１とした。実施例１及び比較例１に対し、西洋わさびペルオキシダーゼ４０μｇ／ｍｌリン酸バッファー溶液１００μＬ／ｗｅｌｌを添加、２時間室温放置し、リン酸バッファー洗浄、ペルオキシダーゼ発色用キット（住友ベークライト社製）を用いた発色試験（反応時間３０分）により吸着した西洋わさびペルオキシダーゼ量を比較した。結果を図２に示した。図２の縦軸は吸光度であり、数値が大きい程蛋白質吸着が起こっていることを示しており、本発明の効果が高いことを確認できた。

「実施例２〜７ ホスホリルコリン基を結合した各種蛋白質の蛋白質吸着阻害効果」
ウシ血清アルブミン（比較例２）、カゼイン（比較例３）、トランスフェリン（比較例４）、フィブリノーゲン（比較例５）、リゾチーム（比較例６）、チトクロムＣ（比較例７）に関して同様にリン酸バッファー溶液（１％）を９６穴ウェルプレート（活性エステル 住友ベークライト社製）に加え（３００μＬ／ｗｅｌｌ）、室温で６時間吸着させた後、リン酸バッファー洗浄し、各比較例とした。また上記各比較例に対し、合成例１のアルデヒド体のリン酸バッファー溶液（１％）を添加、室温で一晩放置した後リン酸バッファーで洗浄して各実施例とした（ウシ血清アルブミン（実施例２）、カゼイン（実施例３）、トランスフェリン（実施例４）、フィブリノーゲン（実施例５）、リゾチーム（実施例６）、チトクロムＣ（実施例７）。これに対し、西洋わさびペルオキシダーゼ４０μｇ／ｍｌリン酸バッファー溶液１００μＬ／ｗｅｌｌを添加、２時間室温放置し、リン酸バッファー洗浄、ペルオキシダーゼ発色用キット（住友ベークライト社製）を用いた発色試験（反応時間１０分）により吸着した西洋わさびプルオキシダーゼ量を比較した。結果を図３に示した。いずれの場合も蛋白質のみをブロッキング剤として用いた比較例よりも、ホスホリルコリン基により表面処理した実施例の蛋白質吸着抑制効果が向上した。

「実施例８〜９ ホスホリルコリン基を結合した蛋白質の蛋白質吸着阻害効果」
ウシ血清アルブミンのリン酸バッファー溶液（１％）を９６穴ウェルプレート（活性エステル 住友ベークライト社製）に加え（３００μＬ／ｗｅｌｌ）、室温で６時間吸着させた後、リン酸バッファー洗浄し、比較例８とした。これに対し式（２）及び（３）で示されるホスホリルコリン誘導体１％水溶液２００μＬ／ｗｅｌｌ、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（１％水溶液）１００μＬを添加し、室温で６時間放置後、リン酸バッファー洗浄し実施例８、９とした。これに対し、西洋わさびペルオキシダーゼ４０μｇ／ｍｌリン酸バッファー溶液１００μＬ／ｗｅｌｌを添加、２時間室温放置し、リン酸バッファー洗浄、ペルオキシダーゼ発色用キット（住友ベークライト社製）を用いた発色試験（反応時間１０分）により吸着した西洋わさびペルオキシダーゼ量を比較した。結果を図４に示した。ホスホリルコリン処理により、ホスホリルコリン基を結合した蛋白質ウシ血清アルブミンの蛋白質非特異吸着抑制効果が向上した。

本発明の蛋白質吸着防止方法に処理された材質からなる理化学機器は、蛋白質の吸着作用を効率良く防止できるので、蛋白質を含む試薬や検査液の保存、希釈、分析中に、該蛋白質の吸着による濃度変化や吸着による変性等の問題が生じることがない。
特に、抗原抗体反応を用いる免疫学的活性物質の測定に使用される理化学機器の材質表面に、本発明の方法を実施することは極めて有用である。

合成例１のホスホリルコリン基を含有するアルデヒド体の構造式及びＮＭＲスペクトルである。 本発明の方法と、特許文献２記載の方法の効果を比較した説明図である（実施例１）。 本発明の方法によって、ホスホリルコリン基を結合した各種蛋白質（ブロッキング剤）の蛋白質非特異吸着抑制効果が向上していることを示した説明図である（実施例２〜７）。 本発明のホスホリルコリン基を結合したウシ血清アルブミンの蛋白質非特異吸着抑制効果が向上していることを示した説明図である（実施例８〜９）。

Claims (3)

1. 材質表面にブロッキング剤としての蛋白質を有し、該蛋白質に下記式（１）で示されるホスホリルコリン基を化学結合させることにより、検体中の蛋白質及び／又はポリペプチドが該材質表面に非特異的に吸着することを防止する蛋白質吸着防止方法。
   

   
2. ブロッキング剤としての蛋白質のアミノ基またはカルボキシル基に、下記式（１）で示されるホスホリルコリン基を化学結合させる工程を有する蛋白質及び／又はポリペプチドに対するブロッキング剤の調製方法。
   

   
3. 蛋白質のアミノ基またはカルボキシル基に、下記式（１）で示されるホスホリルコリン基が化学結合してなる、蛋白質及び／又はポリペプチドに対するブロッキング剤。
   

   

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